CN109089421A - 新型双歧杆菌益生菌菌株 - Google Patents

Abstract

本发明提供了新型双歧杆菌益生菌菌株，特别是假小链双歧杆菌菌株，及其在食品、饲料产品、膳食补充剂和药物制剂中的用途。该细菌适用于治疗肥胖、糖尿病及相关病症。

Description

新型双歧杆菌益生菌菌株

技术领域

本发明涉及新型双歧杆菌菌株及它们的用途，涉及包含它们的食品、饲料产品、膳食补充剂和药物制剂，并涉及制备和使用这些组合物的方法。

背景技术

益生菌，通常被理解为意指“当以适当量施用时对宿主发挥健康益处的活微生物”，已被广泛应用于预防和治疗多种疾病，并且它们的效力在某些临床情境中有有力的证据。例如，WO 2007/043933记载了将益生菌用于制造食品、饲料产品、膳食补充剂，以控制体重增加、预防肥胖、提高饱腹感、延长饱腹感、降低食物摄入量、降低脂肪沉积、改善能量代谢、增强胰岛素敏感性、治疗肥胖和治疗胰岛素抵抗。

WO 2009/024429记载了基本组合物在治疗或预防代谢失调和/或支持体重管理中的用途，所述基本组合物包含降低变形菌(proteobacteria)特别是肠道中脱铁杆菌(deferribacteres)和/或肠细菌(enterobacteria)的数量的药剂。

WO 2009/004076记载了益生菌在使血浆葡萄糖浓度正常化、改善胰岛素敏感度、降低孕妇中的发育风险和预防妊娠糖尿病中的用途。

WO 2009/021824记载了益生菌、特别是鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)在治疗肥胖、治疗代谢失调以及支持减肥和/或维持体重中的用途。

WO 2008/016214记载了益生乳酸菌的格氏乳杆菌BNR17(Lactobacillus gasseriBNR17)菌株及其在抑制体重增加中的用途。

WO 02/38165记载了乳杆菌菌株(特别是胚芽乳杆菌(Lactobacillusplantarum))在降低参与代谢综合征的风险因子中的用途。

US 2002/0037577记载了诸如乳杆菌的微生物通过降低可被吸收入体内的单糖或二糖量、通过将这样的化合物转化成无法被肠吸收的聚合材料在治疗或预防肥胖或糖尿病中的用途。

Lee等(J.Appl.Microbiol.2007，103，1140-1146)记载了产生反式-10、顺式-12-缀合亚油酸(trans-10，cis-12-conjugated linoleic acid，CLA)的细菌的胚芽乳杆菌PL62(Lactobacillus plantarum PL62)菌株在小鼠中的抗肥胖活性。

Li等(Hepatology，2003，37(2)，343-350)记载了益生菌和抗-TNF抗体在非酒精性脂肪肝病小鼠模型中的用途。

US2014/0369965公开了从健康的母乳饲喂小鼠粪便中分离的假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatem)菌株。该文件进一步公开了该菌株及其细胞组分、代谢物、所分泌分子、及其与其它微生物的组合在预防和/或治疗以下中的用途：肥胖、超重、高血糖症和糖尿病、肝性脂肪变性或脂肪肝、血脂异常、代谢综合征、与肥胖和超重相关的免疫系统功能障碍以及与肥胖和超重相关的肠道菌群组成失衡。然而，此菌株并非来源于人类。

PCT/CN2015/082887公开了假小链双歧杆菌菌株，其被发现富含于经历以基于全谷类、传统中国药膳和益生元的建立的膳食(WTP膳食)进行住院干预之个体的粪便样品中。这些个体经过30天的膳食干预后，遗传型和单纯性肥胖儿童的代谢恶化均得到了显著缓解。然而，尽管发现这些菌株富含于那些干预后个体中，但是并未确定这些菌株是通过干预显著增加，还是导致患者健康状况改善。

换句话说，目前存在的益生菌具有很多局限性，需要新的益生微生物菌株。

发明内容

人类肠道有益菌响应于膳食干预的基因组基础依然不清楚，这阻碍了对用于人类健康的肠道菌群的精确操作。在接受富含不易消化的碳水化合物的膳食干预105天后，患有小胖-威利综合征(Prader-Willi Syndrome)的遗传型肥胖儿童的体重减轻了18.4％，并显示出其生物临床参数的显著改善。从干预后粪便样品获得了丰度最大幅提高的菌种之一假小链双歧杆菌的5个分离株(称为PERFECT-2017-0001，保藏编号为CGMCC 13650；PERFECT-2017-0002，保藏编号为CGMCC 13651；PERFECT-2017-0003，保藏编号为CGMCC 13653；PERFECT-2017-0004，保藏编号为CGMCC 13654；和C95)。有趣的是，这5种假小链双歧杆菌菌株在干预期间表现出不同的响应。两种菌株几乎没有受到影响，而另外三种则因饮食碳水化合物源中的变化不同程度地增加。这些菌株的差异响应与基于COG(Cluster ofOrthologous Group，直系同源聚类组)(包括参与ABC型糖转运系统的那些)的功能聚类一致，表明菌株特异性基因组变异可能有助于生态位适应(niche adaption)。特别地，具有最多样化类型和最高基因拷贝数的靶向植物多糖的碳水化合物活性酶的假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0002在干预后具有最高丰度。

因此，一方面，本发明提供了双歧杆菌属细菌或其混合物在制备用于在哺乳动物中治疗肥胖、控制体重增加和/或诱导体重降低的食品、膳食补充剂或药物中的用途。

另一方面，本发明公开了组合物，其包含：(1)假小链双歧杆菌菌株PERFECT-2017-0001或PERFECT-2017-0002或高度类似的菌株，或者(2)由其衍生的菌株；(3)药物可接受的载体或饮食载体。

另一方面，本发明公开了制备本发明组合物的方法，其包括将假小链双歧杆菌菌株PERFECT-2017-0001或PERFECT-2017-0002或高度类似的菌株配制成适当的组合物。

另一方面，本发明公开了预防和/或治疗选自以下的疾病的方法：超重、肥胖、高血糖症、糖尿病、脂肪肝、血脂异常、代谢综合征、肥胖或超重对象中的感染和/或脂肪细胞肥大，所述方法包括向有需要的对象施用本发明的组合物。

另一方面，本发明公开了在有需要的对象中降低单纯性肥胖或遗传型肥胖、缓解代谢恶化或者降低炎症和脂肪堆积(fat accumulation)的方法，其包括向有需要的对象施用本发明的组合物。

另一方面，本发明公开了建立限定健康肠道生态系统结构的基础菌种、导致对致病细菌和有害细菌不利的肠道环境、降低肠细菌在肠内容物中相对于未处理对照的浓度的方法，所述方法包括向有需要的对象施用本发明的组合物。

另一方面，本发明公开了在有需要的对象中治疗糖尿病的方法，其包括向有需要的对象施用本发明的组合物。

附图说明

图1示出了干预后生物临床参数和炎症状况的改善。(红色)人体测量标志物。(绿色)血浆脂质内稳态。(蓝色)血浆葡萄糖内稳态。(紫色)炎症相关标志物。BMI(body massindex)：体重指数；OGTT(Oral glucose tolerance test)：口服葡萄糖耐量测试；LBP(Lipopolysaccharide-binding protein)：脂多糖结合蛋白。

图2示出了膳食干预期间肠道菌群的转变。(A)7个时间点的属水平肠道菌群组成。顶部图示出了香农指数(Shannon index)值，底部图示出了每个属的百分比。根据平均丰度，前15个属通过其分类学名称标记。(B)5种假小链双歧杆菌菌株的差异丰度。阶段I：第0天至第60天，基础膳食干预；阶段II：第60天至第75天，基础干预+多100g 3号配方；阶段III：较少的1号配方+多100g 3号配方)。

图3示出了临床参数的变化与五种假小链双歧杆菌菌株的丰度之间的相关性。执行斯皮尔曼相关性。*校正P＜0.05；＊＊校正P＜0.01(Benjamini&Hochberg 1995)。

图4示出了假小链双歧杆菌的直系同源基因的直系同源聚类(COG)分类。对于每个COG，指出了六个完整假小链双歧杆菌基因组的平均百分比。

图5示出了假小链双歧杆菌菌株之间的基因组变异。(A)六个完整假小链双歧杆菌基因组之间基于利用MUMmer进行的基因组序列比对的配对点图比较。(B)维恩图(Venndiagram)示出了每种菌株中核心独特基因组的数目。

图6：具有至少2个拷贝的拷贝数差异的核心COG的分布。热图示出了标注为特定COG功能的基因的拷贝数。将菌株利用欧几里得距离(Euclidean distance)和离差平方和(Ward linkage)法聚类。

具体实施方式

本发明人已经发现了假小链双歧杆菌的菌株，其可以在哺乳动物中降低单纯性肥胖或遗传型肥胖、缓解代谢恶化以及降低炎症和脂肪堆积。当在肠道中构建时，本发明的假小链双歧杆菌菌株单独或与其它益生微生物相组合，充当基础菌种，所述基础菌种通过例如可能经由提高乙酸盐/酯的产生导致对致病细菌和有害细菌不利的肠道环境来限定健康肠道生态系统的结构。

如下文更详细描述的，本发明的假小链双歧杆菌菌株分离自经历了以基于全谷类、传统中国药膳和益生元的先前公开的膳食(WTP膳食)进行住院干预的个体(S.Xiao等，Agut microbiota-targeted dietary intervention for amelioration of chronicinflammation underlying metabolic syndrome.FEMS Microbiol Ecol87，357(Feb，2014))。这些个体经过30天的膳食干预后，遗传型和单纯性肥胖儿童的代谢恶化均得到了显著缓解。

如下文的实施例中详细描述的，本发明人成功地获得了本发明基础菌种的大量菌株，经鉴定为假小链双歧杆菌。代表性分离株是PERFECT-2017-0001和PERFECT-2017-0002菌株，于2017年1月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center，CGMCC)，保藏编号分别为CGMCC 13650和CGMCC 13651。

本发明的益生菌菌株可以使用本领域普通技术人员熟知的既定方法进行培养、维持和繁殖，其中的某些方法在下文的实施例中例示。

本发明中所用的细菌为假小链双歧杆菌菌株或其混合物。优选地，本发明所用的双歧杆菌是假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0001或PERFECT-2017-0002菌株。

可以以能够发挥本文所述作用的任何形式来利用该细菌。优选地，该细菌是活菌。

该细菌可以包含整个细菌，或者可以包含细菌组分。这样的组分的实例包括诸如肽聚糖的细菌细胞壁组分、诸如DNA和RNA的细菌核酸、细菌膜组分、以及细菌结构组分，如蛋白质、碳水化合物、脂类及这些的组合，如脂蛋白、糖脂和糖蛋白。

细菌还可包含或者替代地包含细菌代谢物。在本说明书中，术语“细菌代谢物”包括在哺乳动物中益生产物产生和运输期间以及胃肠道转运期间由于细菌生长、存活、持续、转运或存在期间的细菌代谢而被(益生)细菌生产或修饰的所有分子。实例包括所有有机酸、无机酸、碱、蛋白质和肽、酶和辅酶、氨基酸和核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、糖脂、维生素、所有的生物活性化合物、含有无机组分的代谢物、以及所有的小分子，例如含氮分子或含亚硫酸的分子。优选地，该细菌包含整个细菌，更优选整个活菌。

优选地，根据本发明使用的双歧杆菌是适用于人和/或动物摄取的双歧杆菌。在本发明中，所用的双歧杆菌可以是同一类型的(菌种和菌株)或者可以包含菌种和/或菌株的混合物。

适当的双歧杆菌选自以下菌种：乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidium)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、假小链双歧杆菌、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)和角形双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)以及它们的任意组合。

如下文的实施例所示，粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)，尤其是与粘膜乳杆菌菌株32高度类似的那些，在膳食干预后显著上升。因此，与本发明的假小链双歧杆菌菌株组合使用的一种优选菌是粘膜乳杆菌，尤其是菌株32。

在一个实施方案中，本发明所使用的细菌是益生菌。在本说明书中，术语“益生菌”被定义为涵盖当以适量的量以活菌施用时对宿主产生健康益处的任何非致病细菌。这些益生菌菌株一般能够在消化道的上部通过中存活下来。它们是非致病性、无毒的，一方面通过与消化道中的常居菌(resident flora)进行生态相互作用，另一方面通过经由“GALT”(肠道相关淋巴组织)以积极的方式影响免疫系统的能力来发挥它们对健康的有益作用。根据益生菌的定义，这些细菌，当以足够的数量提供时，有能力活着行进通过肠道，但它们不能穿过肠屏障，因此它们的主要作用在胃肠道的腔和/或壁中被诱发。然后，它们在施用期间形成常居菌的一部分。这种定植(或短暂的定植)使该益生菌发挥有益的作用，如抑制存在于菌群中的潜在致病微生物和与肠道的免疫系统相互作用。

在某些实施方案中，该双歧杆菌在本发明中与乳杆菌属细菌联用。根据本发明的双歧杆菌与乳杆菌的组合在某些应用中表现出协同效应(即效应大于单独使用时细菌的叠加效应)。例如，除了作为单一组分对哺乳动物发挥作用外，联用可以对该组合的其它组分产生有益效果，例如通过产生随后转而被该组合的其它组分用作能量来源的代谢物或保持对其它组分有利的生理条件。

通常，乳杆菌选自以下菌种：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、双叉乳杆菌(Lactobacillus bifidus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、沙克乳酸杆菌(Lactobacillus sakei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbreuckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gassed)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、及其任意组合。

在一些优选实施方案中，本发明所用的乳杆菌是益生乳杆菌。优选地，本发明所用的乳杆菌是嗜酸乳杆菌菌种。

剂量和施用.可以通过任何能将生物体引入消化道的方法完成益生菌的施用。可将该细菌与载体混合，以及将其施加至液体或固体饲料或饮用水。载体材料应是对细菌和动物无毒的。优选地，该载体含有提高细菌在储存期间的生存力的成分。也可以将细菌配制成待直接注入动物口中的接种体糊(inoculant paste)。该制剂可以包含另外的成分以改善可口性、提高保质期、赋予营养益处等。如果期望剂量可重复和经测量，可以通过瘤胃插管(rumen cannula)施用细菌。待施用的益生菌的量由影响效力的因素控制。当在饲料或饮用水中施用时，可以将剂量在数天或者甚至数周的时间段内分散开。数日内施用较低剂量的累积效应可能大于单次施用较大剂量的效应。通过监测施用优势益生菌之前、期间和之后粪便中导致人类沙门氏菌病的沙门氏菌菌株的数量，本领域技术人员可以很容易地确定减少动物携带的导致人类沙门氏菌病的沙门氏菌菌株量所需的剂量水平。优势益生菌的一个或更多种菌株可以一起施用。菌株的组合可能是有利的，因为各个动物可能在给定个体中最持久的菌株方面不同。

根据本发明使用的假小链双歧杆菌可包含10⁶至10¹²CFU细菌/g支持物，其更优选10⁸至10¹²CFU细菌/g支持物，对于冻干形式而言优选10⁹至10¹²CFU/g。

适当地，可以以约10⁶至约10¹²CFU微生物/剂量、优选约10⁸至约10¹²CFU微生物/剂量的剂量施用假小链双歧杆菌。术语“每剂量”意指每天或每次摄入、优选每天向对象提供该量的微生物。例如，如果要在食品(如酸奶)中施用该微生物-则酸奶会优选包含约10⁸至10¹²CFU的微生物。或者，然而，可以将该微生物量分多次施用，每次施用由少量微生物负载组成--只要对象在任何特定时间(例如每24小时内)内接受的微生物总量为约10⁶至约10¹²CFU的微生物，优选10⁸至约10¹²CFU的微生物。

根据本发明，至少一株微生物的有效量可以为至少10⁶CFU微生物/剂量，优选约10⁶至约10¹²CFU微生物/剂量，优选约10⁸至约10¹²CFU微生物/剂量。

在一实施方案中，可以以约10⁶至约10¹²CFU微生物/天，优选约10⁸至约10¹²CFU微生物/天的剂量施用假小链双歧杆菌菌株。因此，该实施方案中的有效量可为约10⁶至约10¹²CFU微生物/天，优选约10⁸至约10¹² CFU微生物/天。

CFU表示“菌落形成单位”。“支持物”是指食品、膳食补充剂或药物可接受的支持物。

当在本发明中将双歧杆菌与另一种益生菌联用时，该细菌可以能够实现本文所述的本发明期望效果的任意比例存在。

对象/医学适应症

将假小链双歧杆菌菌株施用至哺乳动物，包括例如牲畜(包括牛、马、猪、鸡和羊)和人类。在本发明的某些方面中，哺乳动物是伴侣动物(包括宠物)，例如狗或猫。在本发明的某些方面中，对象可以适当地是人。

该假小链双歧杆菌菌株可适用于在哺乳动物(特别是人)中治疗多种疾病或病症。在本说明书中，术语“治疗”是指在(1)防止哺乳动物中特定的疾病发生，所述哺乳动物可能易患该疾病但还没有经历或显示该疾病的病理或症状(包括与该疾病相关的一个或更多个风险因素的预防)；(2)在正在经历或显示该疾病的病理或症状的哺乳动物中抑制该疾病，或者(3)在正在经历或显示该疾病的病理或症状的哺乳动物中缓解该疾病中本发明的假小链双歧杆菌菌株的任何施用。

本发明的假小链双歧杆菌菌株适用于施用至兼患糖尿病和肥胖的哺乳动物。它们也适用于患有糖尿病和非肥胖的哺乳动物以及具有糖尿病风险因素但尚未处于糖尿病状态的肥胖哺乳动物。这方面在下面更详细地讨论。

如下文的实施例更详细描述的，本发明的假小链双歧杆菌菌株具有多种生物学活性。具体地，本发明所用的双歧杆菌能够在哺乳动物中使胰岛素敏感性正常化、提高进食后胰岛素的分泌(fed insulin secretion)、降低空腹胰岛素分泌、改善糖耐量。这些作用赋予用于治疗糖尿病和糖尿病相关病症(特别是2型糖尿病和糖耐量受损)的潜力。

此外，本发明所用的双歧杆菌能诱导体重降低和降低身体脂肪重量(特别是肠系膜脂肪重量)。这些作用赋予用于在哺乳动物中治疗肥胖和控制体重增加和/或诱导体重降低的潜力。

具体地，如下文的实施例更详细描述的，根据本发明与乳杆菌(特别是嗜酸乳杆菌)联用的双歧杆菌能够诱导体重降低和降低身体脂肪重量(特别是肠系膜脂肪重量)。这些作用赋予用于在哺乳动物中治疗肥胖和控制体重增加和/或诱导体重降低的潜力。

在本说明书中，术语肥胖与体重指数(body mass index，BMI)相关。体重指数(BMI)(按以千克表示的体重除以以米表示的身高的平方计算)是最常被接受的超重和/或肥胖的量度。BMI超过25被认为是超重。肥胖被定义为BMI为30或更多，BMI为35或以上被认为是严重的合并症肥胖(comorbidity obesity)，BMI为40或以上被认为是病态肥胖。

如上文所指出的，本文所用的术语“肥胖”包括肥胖、合并症肥胖和病态肥胖。因此，此处所用的术语“肥胖”可定义为BMI大于或等于30的对象。在某些实施方案中，肥胖对象可适当地具有大于或等于30、适当地35、适当地40的BMI。

虽然本发明组合物特别适用于兼患糖尿病和肥胖的患者，但该组合物也适合于那些患有糖尿病但不肥胖的患者。还可以适用于具有糖尿病风险因素但尚未处于糖尿病状态的肥胖患者，因为可以预期，肥胖(但无糖尿病)的人可限制其肥胖的代谢后果，即糖尿病或至少胰岛素抗性发展。

此外，本发明所用的双歧杆菌可用于在哺乳动物中治疗代谢综合征。代谢综合征是提高发展心血管疾病和糖尿病风险的医学疾病的组合。代谢综合征也被称为代谢综合征X、X综合征、胰岛素抵抗综合征、莱特尔氏综合征(Reaven′s syndrome)或CHAOS(澳大利亚)。

遗传型肥胖

在另一些实施方案中，本发明所用的双歧杆菌(以及如果存在的话，乳杆菌)可用于在哺乳动物中降低组织炎症(特别是但不仅限于，肝组织炎症、肌肉组织炎症和/或脂肪组织炎症)。

可使用根据本发明的双歧杆菌(以及如果存在的话，乳杆菌)治疗的心血管疾病的实例包括动脉瘤、心绞痛、动脉粥样硬化、脑血管意外(中风)、脑血管疾病、充血性心力衰竭(CHF)、冠心病、心肌梗死(心脏病发作)和外周血管疾病。

预期在本发明的范围内，本发明的实施方案可以组合，使得本文所述的任何特征的组合包括在本发明的范围之内。具体地，预期在本发明的范围内，该细菌的任何的治疗作用均可伴随显现。

组合物

虽然根据本发明可以单独施用本发明的假小链双歧杆菌菌株(即没有任何支持物、稀释剂或赋形剂)，本发明的假小链双歧杆菌菌株通常且优选作为产品的一部分在支持物上或支持物内施用，特别是作为食品、膳食补充剂或药物制剂的组分。这些产品通常含有本领域技术人员熟知的额外组分。

可从该组合物受益的任何产品都可用于本发明。这些包括但不限于食物，特别是水果蜜饯、乳制品和乳制品的衍生产品，以及医药产品。本发明的假小链双歧杆菌菌株在本文中可以称作“本发明的组合物”或“该组合物”。

食物

在一实施方案中，本发明的假小链双歧杆菌菌株应用于食品，如食品补充剂、饮料或乳粉。在此，术语“食物”以广义使用，并且涵盖人类的食物以及动物的食物(即饲料)。在优选的方面中，食物用于人类消耗。

食物可以为溶液或固体的形式--取决于用途和/或应用方式和/或施用途径。当用作或用于制备食物如功能性食品时，本发明的组合物可与以下的一种或多种一起使用：营养可接受的载体，营养可接受的稀释剂、营养可接受的赋形剂、营养可接受的辅助剂、营养活性成分。

例如，本发明的组合物可用作以下各项的成分：软饮料、果汁或含有乳清蛋白的饮料、保健茶、可可饮料、乳饮料和乳酸菌饮料、酸乳和饮用型酸乳、奶酪、冰淇淋、冰糕(waterices)和甜点、糖果、饼干糕点和蛋糕混合料、休闲食品、均衡的食物和饮料、水果馅料、careglaze、巧克力面包馅、乳酪蛋糕味夹心饼馅(cheese cake flavoured filling)、水果味蛋糕馅(fruit flavoured cake filling)、蛋糕和甜甜圈酥皮(cake and doughnut icing)、瞬间面包填充膏(instant bakery filling creams)、饼干馅(fillings for cookies)、即用型焙烤食品馅、减少热量的馅(reduced calorie filling)、成人营养饮料、酸化大豆/果汁饮料(acidified soy/juice beverage)、无菌/杀菌巧克力饮料(aseptic/retortedchocolate drink)、棒混合物(bar mixes)、饮料粉末(beverage powders)、钙强化大豆/纯巧克力牛奶(calcium fortified soy/plain and chocolate milk)、钙强化咖啡饮料。

该组合物还可以用作诸如以下的食品中的成分：美国奶酪酱(American cheesesauce)、乳酪粉&起司丝防结块剂、薯条酱(chip dip)、奶油干酪(cream cheese)、干混合植脂奶油脱脂酸奶油(dry blended whip topping fat free sour cream)、冻融动物性鲜奶油(freeze/thaw dairy whipping cream)、冻融稳定性搅打发泡顶端附加物(freeze/thawstable whipped tipping)、低脂轻天然切达干酪(low fat and light natural cheddarcheese)、低脂瑞士风格的酸奶、充气冷冻甜品(aerated frozen desserts)、硬盒冰淇淋(hard pack ice cream)、标签友好且经济/放纵改善的硬包装冰淇淋(label friendly，improved economics&indulgence of hard pack ice cream)、低脂冰淇淋、软冰淇淋、烧烤酱(barbecue sauce)、奶酪蘸酱(cheese dip sauce)、生干酪上的稀奶油(cottagecheese dressing)、干拌阿尔弗雷多酱(dry mix Alfredo sauce)、混合奶酪酱(mixcheese sauce)、干拌番茄酱等。

本文所用的术语“乳制品”意在包括含有动物和/或植物来源的乳的介质。作为动物来源的乳，可以提及的是源自奶牛、绵羊、山羊或水牛的乳。作为植物来源的乳，可以提及的是可以根据本发明使用的源自植物的任何可发酵的物质，特别是源自大豆、大米或谷物的乳。

对于某些方面而言，优选本发明可用于酸乳生产，如发酵酸乳饮料、酸乳、饮用型酸乳、奶酪、发酵乳、牛奶基甜点(milk based desserts)等。

适当地，该组合物还可用作以下一种或更多种中的成分：干酪应用、肉类应用，或包含保鲜菌(protective cultures)的应用。

本发明还提供了制备食物或食物成分的方法，该方法包括将根据本发明的组合物与另一食物组分混合。

有利地，本发明涉及已经与本发明组合物(以及任选地与其它组分/成分)相接触的产品，其中该组合物以能够改善产品的营养和/或健康益处的量使用。

本文使用的术语“接触”是指将本发明的组合物间接或直接应用于产品。可以使用的应用方法的实例包括但不限于，在包含该组合物的材料中处理该产品，通过将该组合物与该产品混合直接应用，将该组合物喷至该产品表面，或将该产品浸入该组合物的制剂中。

如果本发明的产品是食品，则优选将本发明的组合物与该产品混合。或者，该组合物可包括在食品的原料成分或乳液中。再或者，该组合物可作为调味品、蛋浆、着色剂混合物等应用。

可将本发明的组合物以控制量的微生物应用于点缀、涂覆和/或注入产品。

优选地，将该组合物用于发酵乳或蔗糖强化乳(sucrose fortified milk)或者具有蔗糖和/或麦芽糖的乳酸介质，如果含有该组合物所有组分-即根据本发明的所述微生物-的所得介质可以作为成分以适当浓度添加至酸乳中，例如在最终产品中提供10⁶-10¹⁰CFU的日剂量的浓度。根据本发明的微生物可以在酸乳发酵前或发酵后使用。

对于某些方面，根据本发明的微生物被用作或用于制备动物饲料，例如家畜饲料，特别是家禽(如鸡)饲料，或宠物食品。

有利地，如果产品是食品，那么本发明的假小链双歧杆菌菌株应该在零售商销售该食品的正常“最迟销售”或“有效期”内保持有效。优选地，有效的时间应该延长至超过这样的日期直至食物腐败变得明显的正常新鲜期结束时。期望的时间长度和正常的保质期随食品而变化，并且本领域技术人员会意识到保质期会随食品类型、食品大小、储存温度、加工条件、包装材料和包装设备而变化。

食物成分、食物补充剂和功能性食物

本发明的组合物可用作食物成分和/或饲料成分。本文所用的术语“食物成分”或“饲料成分”包括为营养补充剂或者可以作为营养补充剂添加至功能性食物或食料中的制剂。食物成分可为溶液或固体的形式--取决于用途和/或应用方式和/或施用方式。

本发明的组合物可以是--或可以添加至--食物补充剂(本文中也称为膳食补充剂)中。

本发明的组合物可以是--或可以添加至--功能性食物中。本文所用术语“功能性食物”意指不仅能够为消费者提供营养作用，而且还能够提供进一步的有益效果的食物。

因此，功能性食物是并入了赋予食物除了纯营养作用之外的特定功能--如医药或生理益处--的组分或成分(如本文所述的这些)的普通食物。某些功能性食品是保健品。在此，术语“保健品”是指不仅能够向消费者提供营养作用和/或味觉上的满足感，还能提供治疗(或其它有益的)的作用的食物。保健品跨越食物与药物之间的传统分界线。

药剂(medicament)

本文所用的术语“药剂”涵盖在人和兽医学上用于人和动物的药剂。此外，本文所用的术语“药剂”指提供治疗和/或有益效果的任何物质。本文所用的术语“药剂”不局限于需要上市许可的物质，还可包括可用于化妆品、保健品、食物(包括例如饲料和饮料)、益生菌培养物(probiotic cultures)和自然疗法的物质。此外，本文所用的术语“药剂”涵盖设计用于并入动物饲料(例如家畜饲料和/或宠物食品)的产品。

药物(pharmaceuticals)

本发明的组合物可用作--或用于制备--药物。在此，术语“药物”以广义使用--并且涵盖用于人的药物和用于动物的药物(即兽医应用)。在优选的方面中，该药物用于人类用途和/或畜牧业。该药物可用于治疗目的--在性质上可以是治疗性或缓解性或预防性的。该药物甚至可以用于诊断目的。

药物可接受的支持物可以是例如压制片、片剂、胶囊、软膏、栓剂或可饮用溶液(drinkable solutions)形式的支持物。其它适当形式如下。

当用作--或用于制备--药物时，本发明的组合物可与以下的一种或更多种联用：药物可接受的载体、药物可接受的稀释剂、药物可接受的赋形剂、药物可接受的辅助剂、药物活性成分。药物可以为溶液或固体的形式--取决于用途和/或应用方式和/或施用方式。

用于制备这些形式的营养可接受载体的实例包括例如水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉(amylose)、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和甘油二酯、石化(petroethral)脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

对于水性悬浮剂和/或酏剂，本发明的组合物可与各种甜味剂或调味剂、着色剂或染料相组合，与乳化剂和/或悬浮剂相组合，以及与诸如水、丙二醇和甘油的稀释剂相组合，及其组合。剂型还可包括明胶胶囊、纤维胶囊、纤维片等，或者甚至纤维饮料。剂型的其它实例包括乳膏。对于某些方面，本发明所用的微生物可用于药物和/或化妆品的乳膏，如防晒霜和/或晒后润肤膏(after-sun creams)。

与益生元组合

本发明的组合物还可以包含一种或更多种益生元。益生元是一类功能性食物，定义为通过选择性刺激结肠内一种或少数细菌的生长和/或活性来对宿主产生有益作用，从而改善宿主健康的不易消化的食物成分。通常，益生元是碳水化合物(如寡糖)，但该定义不排除非碳水化合物。益生元最普遍的形式在营养学上分类为可溶性纤维。在某种程度上，许多形式的膳食纤维表现出一定程度的益生作用。

在一实施方案中，益生元是选择性发酵成分，其允许胃肠道微生物群落组成和/或活性的对宿主健康产生益处的特定变化。

适当地，根据本发明，益生元可以0.01至100克/天的量使用，优选0.1至50克/天，更优选0.5至20克/天。在一实施方案中，根据本发明，可以1至100克/天的量使用益生元，优选2至9克/天，更优选3至8克/天。在另一实施方案中，根据本发明，可以5至50克/天的量使用益生元，优选10至25克/天。

益生元的膳食来源的实例包括大豆、菊糖源(如菊芋、豆薯和菊苣根)、生燕麦、未纯化小麦、未纯化大麦和雪莲果。适当的益生元的实例包括藻酸盐、黄原胶、果胶、刺槐豆胶(LBG)、菊糖、瓜尔豆胶、低聚半乳糖(GOS)、低聚果糖(FOS)、聚右旋糖(即)、乳糖醇、低聚乳果糖、大豆低聚糖、异麦芽酮糖(Palatinose.TM.)、异麦芽寡糖、低聚葡萄糖、低聚木糖、低聚甘露糖、β-葡聚糖、纤维二糖、棉子糖、龙胆二糖、蜜二糖、木二糖、环糊精、异麦芽糖、海藻糖、水苏糖、潘糖、普鲁兰多糖、毛蕊花糖、半乳甘露聚糖和所有形式的抗性淀粉。益生元的特别优选实例是聚右旋糖。

在某些实施方案中，根据本发明的本发明假小链双歧杆菌菌株与益生元的组合在某些应用中表现出协同效应(即效应大于单独使用时细菌的叠加效应)。

实施例

最近的证据表明，肠道微生物群的菌群失调在诸如肥胖和糖尿病的人类疾病中起关键作用(1，2)。对疾病/健康表型造成影响的肠道菌群的特定成员不仅可作为疾病诊断的有力工具(3，4)，而且还可作为靶标通过诸如药物(5)、粪便微生物移植(6)和饮食(7)的多种方法用于疾病缓解/治疗。然而，由于肠道菌群本身的复杂性和个体间差异以及其与宿主和饮食的相互作用(8)，用于实现最佳人类健康而对肠道微生物群的精确操作需要在基因组和分子水平更深入的理解。

在我们之前的一项膳食干预研究中，我们发现由全谷类、传统中国药膳和益生元组成的富含不易消化但可发酵的碳水化合物的膳食(WTP膳食)不仅显著改变肠道菌群，还改善患有小胖-威利综合征的遗传型肥胖儿童的生物临床参数和炎症状况(9)。一种特定的有益菌假小链双歧杆菌在干预后显著富集，其与其它潜在有害菌种负相关，并且与宿主临床参数的改善正相关(9)。

来自该群组的一名儿童完成了105天的干预。他的生物临床参数得到改善，初始体重损失超过25.8kg，同时肠道微生物群落发生显著转变，例如，粪便菌(Faecalibacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)属增多。此外，我们发现干预后假小链双歧杆菌是双歧杆菌属中的最优势菌种。有趣的是，我们已经在第105天从他的粪便样品中分离出五种菌株(10)，这些菌株对富含碳水化合物的干预具有差异响应。为了解参与肠道生态系统中细菌生态位适应的遗传特性以及与宿主和膳食的相互作用(11)，我们对假小链双歧杆菌进行了比较基因组学研究。

结果和讨论

改善的生物临床参数和转变的肠道菌群

在干预期间该肥胖儿童的生物临床变量得到改善(图1和图7)。体重从140.1kg降至114.3kg，并且血浆葡萄糖和脂质内稳态二者改善至正常范围。干预后，两种全身性炎症标志物C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)和血清淀粉样蛋白A(serum amyloid Aprotein，SAA)降低。脂联素从2.17μg/ml提高至5.39μg/ml，瘦素从63.82ng/ml降低至34.47ng/ml，表明“风险”表型(12)的缓解。此外，血液中细菌抗原负载的替代标志物脂多糖结合蛋白(LBP)(13)降低。

我们通过宏基因组测序在7个时间点(0、15、30、45、60、75和105天)获得了每个粪便样品25.2±4.8百万(平均值±s.d.)个高质量双端读长(paired-end reads)。干预期间肠道菌群的组成发生转变(图2A)，并且响应于三个干预阶段(阶段I：第0天至第60天的基础干预；阶段II：第60天至第75天的基础干预+多100g 3号配方；阶段III：第75天至第105天的减少的1号配方+多100g 3号配方，详见方法)表现出不同模式。该肥胖儿童在不同阶段的排便频率类似(平均每天3至4次)，未发生腹泻。干预期间群落的多样性下降，其与群组的变化一致(9)。在基线时，瘤胃球菌属(Ruminococcus)和布劳特氏菌属(Blautia)是两个最丰富的属，分别占26.95％和18.41％。同时，拟杆菌属(Bacteroides)和普雷沃氏菌属(Prevotella)具有低丰度，表明该群落可能属于肠类型3(14)。干预后，瘤胃球菌属和布劳特氏菌属降至低丰度，而拟杆菌属和普雷沃氏菌属几乎未受干预影响。与基线相比，被报道为抗炎菌种(15，16)和有益的(5)共生细菌的粪便菌在阶段I增多，在第15天丰度达到41.95％。前15天粪便菌的急剧增多可能有助于缓解炎症，因为在该阶段，CRP和SAA分别下降33.37％和50.85％。当提供更多寡糖时，粪便菌在阶段II和阶段III中下降至低丰度。另一方面，良好配备以代谢寡糖(17)的乳杆菌属在基线和阶段I期间具有低丰度，但是从阶段II开始变成最优势属之一。多个研究已经报道了乳杆菌属菌株对胰岛素抵抗的有益作用(18，19)。乳杆菌属的急剧增多可有助于来自阶段II的胰岛素敏感性改善，如通过该时期期间OGTT胰岛素AUC(area under the curve，曲线下面积)的显著降低和稳定的OGTT葡萄糖AUC所指示的。能够通过细胞内和细胞外途径来代谢多种碳水化合物(20)的双歧杆菌的丰度从第15天开始是显著的，并且在整个干预期间仍然是优势属：从该儿童接受基础干预时的27.47％升高到第75天时的65.53％，然后当提供较少的包含复合膳食纤维的1号配方时降低至36.41％。这些结果表明，双歧杆菌种群响应于三个阶段中提供的碳水化合物源的变化，并且在每个阶段，其占据优势生态位。考虑到双歧杆菌菌株对肥胖的已知有益作用(21，22)，其在我们以前的群组研究相互作用网络中的重要作用(9)，以及其在干预期间的持续高丰度，我们推测它们可能有助于持续降低体重、BMI、腰围和臀围。因此，我们对该属进行了更深入的分析。

在干预后样品中鉴定了总共9种双歧杆菌属菌种(图8)。其中，假小链双歧杆菌最占优势，第105天在整个肠道菌群中的丰度为29.36％。长双歧杆菌、短双歧杆菌和青春双歧杆菌分别占9.94％、7.61％和3.75％，其它5个菌种的丰度低于1％。

假小链双歧杆菌菌株对干预的差异响应

为了详细研究假小链双歧杆菌群，我们从在第105天自我们的对象收集的粪便样品中分离了5种假小链双歧杆菌菌株(下文定义为菌株PERFECT-2017-0001、PERFECT-2017-0002、PERFECT-2017-0003、PERFECT-2017-0004和C95(23))并进行了完整测序(10)。通过将宏基因组数据与完整基因组进行比对，利用Sigma(24)鉴定了这五种菌株在每个时间点的丰度变化(图2B)。干预前，所有菌株具有低丰度(最大值＝0.5％，假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0001)。假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0003和假小链双歧杆菌C95的丰度似乎不响应于膳食干预，因为前者在整个试验期间保持低丰度，后者仅在阶段II和阶段III期间显示小的增加。相比之下，假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0001、假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0004和假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0002菌株响应于膳食干预，它们的丰度变化与对于双歧杆菌属所观察的一致，表明这些假小链双歧杆菌菌株主要造成这些变化。事实上，在干预后这三种菌株显著增多，尤其是假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0002。

与先前的研究(9)中的发现一致，生物临床变量的改善与假小链双歧杆菌菌株的增多相关(图3)。假小链双歧杆菌C95与人体测量标志物(包括体重、BMI、腰围和臀围)负相关。此外，假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0002也与炎症标志物的改善(包括瘦素的减少和脂联素的增加)相关。

假小链双歧杆菌的泛基因组分析

基于我们的五个完整假小链双歧杆菌基因组以及可用的公共数据(包括5个假小链双歧杆菌基因组草图和假小链双歧杆菌JCM1200^T的完整基因组(25))，泛基因组分析中包括总共11个假小链双歧杆菌基因组。泛基因组曲线显示，PERFECT-2017-0001的生物临床变量呈渐近趋势，在前六个迭代中平均生长速率为每个基因组100个基因，然后降低到低得多的速率(图9A)。曲线最终达到2,482个基因。这表明进一步并入额外的基因组可能仅导致泛基因组大小的轻微增加。核心基因组曲线显示出前六个迭代中更明显的渐近趋势以及更清楚的下降(图9B)。曲线最终达到1,427基因。泛基因组和核心基因组的趋势表明，假小链双歧杆菌表现出封闭泛基因组，并且六个基因组几乎足以描述假小链双歧杆菌的基因特征。基于这些结果并且为了避免基因组草图造成的模糊不清，我们在随后的分析中仅使用六个完整基因组来探索假小链双歧杆菌的基因组特征。

假小链双歧杆菌的一般特征

我们的五种菌株和假小链双歧杆菌JCM1200^T的基因组显示平均2,355,185bp和56.63G+C％，这与双歧杆菌属的G+C％范围一致(26)。在假小链双歧杆菌的基因组中鉴定了5或6个rRNA操纵子基因座，并且在每个基因组中，有5S rRNA rRNA基因的一个额外拷贝(表1)。此外，16S rRNA基因的异质性存在于除了假小链双歧杆菌JCM1200^T的基因组以外的所有基因组中(表S1)。每个假小链双歧杆菌基因组中平均包含54个tRNA基因。

表1.假小链双歧杆菌的六个完整全基因组的一般特征

表S1.16S rRNA基因的异质性

预测每个基因组平均1,871个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，其中80％检测出的ORF基于在NCBI数据库上的BLAST通过计算机预测(silico prediction)进行功能性分配，其余的20％预测为假定蛋白(表1)。根据COG(直系同源聚类组)(27)鉴定直系同源基因表明，假小链双歧杆菌基因组中的大部分基因参与各种管家功能(housekeepingfunction)，尤其是用于碳水化合物转运和代谢(12.54％)以及氨基酸转运和代谢(10.23％)的那些(图4)。这些百分比与其它双歧杆菌基因组的那些一致(28，29)。

基于基因组分析并由实验证据支持，已经鉴定了双歧杆菌的多种宿主定殖因子，包括参与胆汁抗性和粘附素的功能(11)。胆汁抗性对于许多肠道细菌的定植是重要的，因为胆汁酸在生理浓度下可具有抗微生物活性(30)。在全部6种假小链双歧杆菌菌株中鉴定出了赋予胆汁抗性的胆汁盐水解酶和/或胆汁酸转运蛋白。在粘附方面，所有基因组具有编码烯醇化酶和DnaK的基因，而DnaK已被证明是动物双歧杆菌乳酸菌亚种BI07(B.animalissubsp.lactis BI07)中的纤溶酶原结合相关蛋白(31，32)。此外，编码参与存在于四个双歧双歧杆菌(B.bifidum)菌株中的粘蛋白结合的转醛醇酶(33)以及已被报道促进与细胞外基质的粘附的血管性血友病因子A(von Willebrand factor A)(34)的基因也存在于每个基因组中。这些功能基因的存在表明，类似于其它双歧杆菌菌种，假小链双歧杆菌具有在人肠中定殖的基因组基础。

假小链双歧杆菌的基因组微多样性

六个完整假小链双歧杆菌基因组中的平均核苷酸同一性(average nucleotideidentity，ANI)满足菌种分界的阈值(35)，因为最小值为97.76％。当与从不同生境分离的假小链双歧杆菌JCM1200^T相比时(最大ANI＝97.80％)，观察到从相同生境分离的菌株内稍微更高的相似性(假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0001、PERFECT-2017-0002、PERFECT-2017-0003、PERFECT-2017-0004和C95，最小ANI＝99.88％)。这些结果表明所有这些基因组中的高度同线性，这通过基因组的点图比对来证实(图5A)，尽管在点图中在假小链双歧杆菌JCM1200^T与其它五种菌株之间存在较小共线性和一些差异(包括插入缺失)。这种变异的一个值得注意的实例是编码胞外多糖(EPS)的eps基因簇。EPS可以形成粘附在细胞上的粘液层，也可以释放到环境中(36)。双歧杆菌产生的一些EPS被认为潜在地有助于其宿主的多种有益的活性，包括调节免疫系统、抵抗病原体、作为清除剂以及调节微生物群落(37)。在假小链双歧杆菌的每个完整基因组中鉴定了eps基因簇的一个拷贝(图S4)，并且这些eps簇在我们的五种假小链双歧杆菌菌株中是相同的，但是与在假小链双歧杆菌JCM1200^T中发现的完全不同。

将在六种完整基因组上鉴定的所有ORF与BLASTP进行比较，并用MCL算法进一步聚类，显示存在2,115个基因组(图5B)。其中～72％(1,520)是所有六种假小链双歧杆菌基因组共有的，其代表了假小链双歧杆菌的核心基因组。鉴定出了仅存在于所测试的假小链双歧杆菌基因组的子集中的总共312个非必需基因组。超过61.48％的独特组为假小链双歧杆菌JCM1200^T所特有。基于COG分配获得了类似结果，从六个完整假小链双歧杆菌基因组中鉴定出1,101个COG家族。其中59个COG家族仅存在于所检查的假小链双歧杆菌基因组的子集中，并且37个另外的COG是单一菌株独特的，其中35个仅在假小链双歧杆菌JCM1200^T中鉴定出(图S5)。还有46个COG家族存在于我们的分离株中，但不存在于假小链双歧杆菌JCM1200^T基因组中。有趣的是，这些差异中的至少一些与移动基因组(mobilome)和DNA重排有关，我们的分离株具有更多与前噬菌体功能、细胞过程和信号传导有关的独特的COG，而假小链双歧杆菌JCM1200^T具有的更多独特COG包括参与CRISPR/Cas系统的那些。

特别地，我们的分离株和假小链双歧杆菌JCM1200^T暴露于不同的碳水化合物源。前者来自干预后儿童的粪便样品，所述儿童接受来自富含膳食纤维和包含低聚果糖和低聚异麦芽糖的粉末的全谷类和TCM食用植物的混合材料，而后者分离自推测接受相对更简单的碳水化合物的婴儿的粪便。相应地，发现了参与碳水化合物转运和代谢的遗传变异，例如假小链双歧杆菌JCM1200^T缺少COG0383(α-甘露糖苷酶)、COG3594(岩藻糖4-O-乙酰酯酶或相关乙酰基转移酶)、COG4209(ABC型多糖转运系统，通透酶组分)和COG4214(ABC型木糖转运系统，通透酶组分)，但独特地具有COG1554(海藻糖和麦芽糖水解酶(可能有磷酸化酶))。

核心COG的不同拷贝数也有助于假小链双歧杆菌的微多样性。在存在于每种完整假小链双歧杆菌基因组中的1,005个核心COG中，51个参与多种功能类别的COG在拷贝数方面具有至少2个拷贝的不同(图6)。根据这些COG的分布，与我们的5种菌株相比假小链双歧杆菌JCM1200^T是最不同的。

以前的研究已经报道了来自相同生境的相同菌种中不同菌株的微多样性(38-40)。在我们的五种假小链双歧杆菌菌株中，差异似乎是由分配给特定核心COG家族的基因的拷贝数的变异引起的，而不是独特和/或非必需COG的存在/不存在方面的差异。聚类结果(图6)与菌株对碳水化合物干预的差异性响应一致。在这种情况下，几乎不受干预影响的假小链双歧杆菌C95和假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0003与三种响应菌株明显分开；对干预具有适度响应的假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0001和假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0004两者一起分组；而对干预响应最高的菌株假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0002可与其它4种菌株进一步分开，但与假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0001和假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0004最相似。

关于碳水化合物转运和代谢，假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0002具有COG2814(预测的阿拉伯糖流出通透酶，MFS家族)和COG3250(β-半乳糖苷酶/β-葡糖醛酸糖苷酶)的最高拷贝数。此外，在5种菌株中，鉴定出106±2(平均值±s.d.)个ORF为碳水化合物活性酶(CAZy)基因，占41个CAZy家族。假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0002基因组具有所有鉴定的CAZy家族，并具有这些基因的最大拷贝数。其还具有编码碳水化合物酯酶之基因的最高拷贝数，所述酶据报道使植物多糖脱乙酰化以克服复杂性，并在植物多糖降解中与糖苷水解酶协作(41)。据推测，这些特征是造成假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0002对膳食干预之响应的主要差异，因此其占据全部假小链双歧杆菌的超过50％，并且在整个干预期间占整个双歧杆菌群体的很大比例。

结论

在研究WTP膳食如何导致遗传型肥胖者体重减轻的以前研究中，假小链双歧杆菌被鉴定是最丰富的双歧杆菌菌种。在本文中，我们表明，假小链双歧杆菌的特定菌株对膳食干预的响应表现出变化，我们使用比较基因组学鉴定了这些动态背后的可能原因。作为本研究的一部分分离的五种假小链双歧杆菌菌株显示出相对于从婴儿粪便中分离的假小链双歧杆菌JCM1200^T的一些差异，这显示出不同的环境参数对基因组微多样性的影响(42)。在我们的五种分离株中观察到的微多样性大部分是核心COG家族的拷贝数的变化，并且这些差异为干预期间五种菌株的种群变化提供了猜测性解释。具体地，假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0002在遗传上具有更多样化和植物多糖基因的更多拷贝数，具有响应于膳食干预的最大丰度。多种菌株的共存和分布是直观的，因为这会支持整个群体比同基因群体在更广泛的环境条件下存活(43)。因此，对膳食干预具有不同响应的五种菌株的共存可以作为一种机制来保证人肠道中重要的有益菌种如假小链双歧杆菌的稳定和恢复。但是重要的是，本研究中鉴定的五种假小链双歧杆菌菌株也被发现与宿主生物临床参数具有不同的相关性，表明至少一些归因于肠道菌群之变化的有益功能是菌株特异性的(44)。本文介绍的这种类型的更多研究将是必要的，以确保从肠道微生物群的饮食操作中获得的健康益处的全部潜力得以实现。

材料和方法

临床研究

该研究在上海交通大学生命科学与生物技术学院伦理委员会(Ethics Committeeof the School of Life Sciences and Biotechnology，Shanghai Jiao TongUniversity)的批准(No.2012-2016)下进行。临床试验在中国临床试验注册中心(ChineseClinical Trial Registry)注册(No.ChiCTR-ONC-12002646)。从肥胖儿童的监护人处获得了书面知情同意书。

在中国广东省广州市妇女儿童医院(GuangDong Women and Children Hosiptal，Guanzhou，Chian)，该肥胖儿童接受了住院膳食干预105天。该志愿者没有实施任何锻炼计划。根据营养师的建议，与适量蔬菜、水果和坚果组合地施用了基于全谷类、传统中国药膳和益生元的膳食(WTP膳食)(7)(膳食中的三种即食预制食品1号配方、2号配方和3号配方由完美(中国)有限公司生产)。干预分为三个阶段。在阶段I(第0天至第60天)，该儿童接受了基础干预(9)。在阶段II(第60天至第75天)，他消耗了多100g的3号配方。在阶段III(第75天至第105天)期间，他仍然消耗了多100g的3号配方，但提供了较少1号配方。

在7个时间点(0、15、30、45、60、75和105天)获得了生物样品、人体测量数据和临床实验室分析。生物临床参数的测量结果与我们以前的研究(9)相同。

宏基因组测序和分析

如以前的描述(45)，进行从粪便样品中提取DNA用于宏基因组测序。在上海Genergy生物技术有限公司(Shanghai Genergy Bio-technology Co.，Ltd)使用IlluminaHiseq 2000平台对7个样品进行了测序。DNA文库制备遵循Illumina的说明书。根据供应商指示的工作流程进行了聚类生成、模板杂交、等温扩增、线性化、封闭和变性以及测序引物的杂交。构建文库，然后在正向和反向方向进行高通量测序，获得具有151bp的双端读长。

使用Flexbar(46)调整来自读长的适配器。使用Prinseq(47)，a)以20的质量阈值从3′端调整读长直到达到第一个核苷酸；b)如果读长短于75bp或包含‘N’碱基，则去除读长对，以及c)对读长进行去重。去除可与人类基因组(H.sapiens，UCSC hg19)对齐的读长(与Bowtie2(48)对齐，使用-重排-无hd-不包含--吻合(-reorder--no-hd--no-contain--dovetail))。平均每个样品保留25.3±4.1百万(平均值±s.d.)双端读长，并用于进一步分析。

在第105天使用MetaPhlan(49)(--bt2_ps非常敏感的局部)来计算双歧杆菌种的丰度。使用Sigma来计算我们的五种假小链双歧杆菌菌株的丰度(24)。

全基因组测序和数据组装

通过PacBio RS II测序仪对假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0001、假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0002、假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0003、假小链双歧杆菌PERFECT-2017-0004和假小链双歧杆菌C95的基因组进行了测序，分别具有约245、415、285、459和198倍的覆盖率(Nextomics Biosciences，Wuhan 430000，China)。使用HGAP/Quiver(50)从头重新组装子读长，然后是miniums2(51)和Quiver。将每种菌株组装成对应于其染色体的一个重叠群。

一般特征预测

通过Prodigal v2_60(52)和BLAST比对的组合进行了开放阅读框(Open ReadingFrame，ORF)预测。然后在NCBI nr数据库上使用BLASTP对鉴定的ORF进行了注释。使用Rnammer v1.2(53)检测了核糖体RNA基因，并用tRNAscan-SE v.14(54)鉴定了转运RNA基因。使用USEARCH v8.0.1517(55)计算了所有16S rRNA基因之间的同一性矩阵。使用COGtriangles(ftp：//ftp.ncbi.nih.gov/pub/wolf/COGs/COGsoft/)完成了COG的分配。

泛基因组计算

使用PGAPv1.12(56)计算了假小链双歧杆菌的泛基因组。通过GF(Gene Family，基因家族)方法进行了功能基因聚类，然后构建了泛基因组谱。

基因组比较

使用软件包MUMmer v3.0(57)在核苷酸水平进行了全基因组序列比对。对于每个基因组对，使用程序JSpecies版本1.2.1(35)计算了平均核苷酸同一性(ANI)。在蛋白质水平上，使用BLASTP(对于每一蛋白质，最大E值1e-10，最小比对同一性50％以及最小比对覆盖率50％)以全对全方式(all against all way)对序列进行了比较，然后在PGAP v1.12中使用马尔可夫聚类算法(Markov Cluster Algorithm，MCL)聚类到基因家族。

胞外多糖(Exoplysaccharide，EPS)基因簇的鉴定

通过在每个基因组(37)中搜索推定的引发-GTF(p-gtf)基因rfbP(NP_695444)和cpsD(NP_695447)然后手动检查p-gtf周围的基因进行了Bifido-eps簇的计算机分析。

碳水化合物活化酶(CAZys)的鉴定

下载了dbCAN v3.0(58)的本地版本数据库。使用HMMscan(59)将每个基因组中的基因与数据库进行比对。用dbCAN提供的hmmscan-parser.sh对比对进行解析，并保留最好的命中。

数据和材料的可获得性

本研究中产生的所有基因组和宏基因组数据以收录号PRJEB18557保藏在欧洲核苷酸文库(European Nucleotide Archive，ENA)(www.ebi.ac.uk/ena)中。用于我们的分析的假小链双歧杆菌的所有其它基因组均以以下收录号从NCBI数据库下载：AP012330.1、CDPW00000000.1、ABXX02000001、JEOD01000001、JGZF01000001，假小链双歧杆菌D2CA从MetaHIT(http：//www.sanger.ac.uk/resources/downloads/bacteria/metahit/)下载。

以上的说明书中提及的所有出版物均并入本文作为参考。在不偏离本发明范围和精神的情况下，所记载的本发明方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员而言会是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，请求保护的发明不应当不适当地限于这样的具体实施方案。事实上，预期所记载的实施本发明的方式的对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员来说显而易见的各种修改均在下述权利要求的范围内。

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Claims (21)

1.组合物，其包含：

(1)假小链双歧杆菌(Bifidobactgerium pseudocatenulatem)菌株，其选自保藏编号为CGMCC 13650的Perfect-2017-0001、保藏编号为CGMCC 13651的Perfect-2017-0002、保藏编号为CGMCC 13653的Perfect-2017-0003、保藏编号为CGMCC 13654的Perfect-2017-0004和C95，

(2)由其衍生的菌株，以及

(3)药物可接受的载体或饮食载体。

2.权利要求1所述的组合物，其包含保藏编号为CGMCC 13650的Perfect-2017-0001菌株。

3.权利要求1所述的组合物，其包含保藏编号为CGMCC 13651的Perfect-2017-0002菌株。

4.权利要求1所述的组合物，其包含保藏编号为CGMCC 13653的Perfect-2017-0003菌株。

5.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。

6.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是营养补充剂或营养组合物。

7.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在每克或每毫米组合物中包含至少10³至10¹⁴个菌落形成单位的所述菌株或高度类似的菌株。

8.权利要求5所述的组合物，其还包含粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)菌株。

9.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含所述菌株或高度类似的菌株的细胞组分、代谢物、所分泌分子、或其任意组合。

10.制备权利要求1所述组合物的方法，其包括将所述假小链双歧杆菌菌株或高度类似的菌株配制成适当的组合物。

11.权利要求10所述的方法，其中所述组合物还包含所述菌株和粘膜乳杆菌菌株。

12.预防和/或治疗选自以下的疾病的方法：超重、肥胖、高血糖症、糖尿病、脂肪肝、血脂异常、代谢综合征、肥胖或超重对象中的感染和/或脂肪细胞肥大，所述方法包括向有需要的对象施用权利要求1所述的组合物。

13.权利要求12所述的方法，其中所述组合物包含所述菌株和粘膜乳杆菌菌株。

14.在有需要的对象中降低单纯性肥胖或遗传型肥胖、缓解代谢恶化或者降低炎症和脂肪堆积的方法，其包括向有需要的对象施用权利要求1所述的组合物。

15.权利要求14所述的方法，其中所述组合物还包含粘膜乳杆菌菌株。

16.建立限定健康肠道生态系统结构的基础菌种、导致对致病细菌和有害细菌不利的肠道环境、降低肠细菌在肠内容物中相对于未处理对照的浓度的方法，所述方法包括向有需要的对象施用权利要求1所述的组合物。

17.权利要求16所述的方法，其中所述组合物还包含所述菌株和粘膜乳杆菌菌株。

18.在有需要的对象中治疗糖尿病的方法，其包括向有需要的对象施用权利要求1所述的组合物。

19.权利要求18所述的方法，其中所述糖尿病是II型糖尿病。

20.权利要求14所述的方法，其中所述肥胖是单纯性肥胖。

21.权利要求14所述的方法，其中所述对象患有小胖-威利综合征。