KR20190116248A

KR20190116248A - 신규한 프로바이오틱스 비피도박테리움 균주

Info

Publication number: KR20190116248A
Application number: KR1020197018116A
Authority: KR
Inventors: 리핑 자오; 구오준 우; 맹후이 장; 첸홍 장; 후안 우
Original assignee: 퍼펙트 (차이나) 씨오., 엘티디
Priority date: 2017-02-10
Filing date: 2017-02-10
Publication date: 2019-10-14
Also published as: CN109089421A; MY197201A; TWI744479B; EP3580326A1; WO2018145294A1; US20200069746A1; CA3046705A1; JP6974483B2; JP2020507324A; US11607435B2; TW201834674A; EP3580326A4

Abstract

본 발명은 신규한 프로바이오틱 비피도박테리움 균주, 특히 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주, 그리고 이들이 식품, 사료제품, 식이보충제와 약물제제에서의 용도를 제공한다. 당해 세균은 비만, 당뇨병 및 관련 병증의 치료에 적합하다.

Description

신규한 프로바이오틱스 비피도박테리움 균주

본 발명은 신규한 비피더스균 균주 및 이들의 용도에 관한 것으로, 이들을 포함하는 식품, 사료제품, 식이보충제와 약물제제에 관한 것이며, 또한 이런 조성물을 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

프로바이오틱스는 흔히 “적당량으로 투여될 때, 숙주에게 건강상의 이익을 제공하는 살아있는 미생물”을 뜻하는 것으로 이해되는데, 이미 다양한 질병을 예방하고 치료하는데 널리 이용되고 있으며, 일부 임상 상황에서 그 효능에 대한 유력한 증거가 있다. 예를 들어, WO 2007/043933에는 프로바이오틱 박테리아를 식품, 사료제품, 식이보충제를 제조하는데 사용하여 체중 증가를 통제하고, 비만을 예방하며, 포만감을 높이고, 포만감을 연장하며, 음식 섭취량을 낮추고, 지방 축적을 낮추며, 에너지 대사를 개선하고, 인슐린 민감도를 높이며, 비만을 치료하고 인슐린 저항을 치료한다고 기재되었다.

WO 2009/024429에는 기본 조성물이 대사장애 치료 또는 예방 및/또는 체중 관리 지원에서의 용도가 기재되었는데, 상기 기본 조성물은 프로테오박테리아(proteobacteria), 특히 장내 탈철간균(deferribacteres) 및/또는 장내세균(enterobacteria)의 수량을 낮추는 약제를 포함한다.

WO 2009/004076에는 프로바이오틱 박테리아가 혈장 포도당 농도를 정상화하고, 인슐린 민감도를 개선하며, 임신부에서의 발육 위험을 낮추고, 임신성 당뇨병을 예방하는데 사용되는 용도가 기재되었다.

WO 2009/021824에는 프로바이오틱 박테리아, 특히 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)가 비만 치료, 대사장애 치료, 그리고 다이어트 지원 및/또는 체중 유지에 사용되는 용도가 기재되었다.

WO 2008/016214에는 프로바이오틱 락트산균의 락토바실러스 가세리 BNR17(Lactobacillus gasseri BNR17) 균주 및 그것이 체중증가 억제에 사용되는 용도가 기재되었다.

WO 02/38165에는 락토바실러스 균주 (특히 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum))가 대사증후군에 관여하는 위험인자를 낮추는데 사용되는 용도가 기재되었다.

US 2002/0037577에는 락토바실러스와 같은 미생물이 체내에 흡입될 수 있는 단당 또는 이당의 양을 낮추는 것에 의해, 이러한 화합물을 장이 흡수할 수 없는 고분자 물질로 전환시킴으로써 비만 또는 당뇨병을 치료하거나 예방하는데 사용되는 용도가 기재되었다.

Lee 외 J. Appl. Microbiol. 2007, 103, 1140-1146에는 트랜스-10, 시스-12-공액리놀레산(trans-10, cis-12-conjugated linoleic acid, CLA)의 세균을 생성하는 락토바실러스 플란타럼 PL62 (Lactobacillus plantarum PL62) 균주가 마우스에서의 항비만 활성이 기재되었다.

Li 외 Hepatology, 2003, 37(2), 343-350에는 프로바이오틱스와 항-TNF항체가 비알콜성 지방간병 마우스 모델에서의 용도가 기재되었다.

US2014/0369965는 건강한 모유사육 마우스 분변에서 분리된 비피도박테리움 슈도카테눌라툼(Bifidobacterium pseudocatenulatem) 균주를 공개하였다. 당해 문서는 당해 균주 및 그 세포 구성물질, 대사산물, 분비된 분자, 그리고 기타 미생물과의 조합이 비만, 과체중, 고혈당증과 당뇨병, 간성 지방증 또는 지방간, 이상지질혈증, 대사증후군, 비만 및 과체중과 관련된 면역계통 기능장애 그리고 비만 및 과체중과 관련된 장내 균군구성의 불평형을 예방 및/또는 치료하는데 사용되는 용도를 더 공개하였다. 그러나, 이 균주는 인간에서 유래된 것이 아니다.

PCT/CN2015/082887은 전곡류, 전통적인 중국 약선과 프리바이오틱스에 기초한 식이(WTP 식이)로 입원 개입을 받은 개체의 분변 샘플에 다량 함유된 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주를 공개하였다. 이 개체들은 30일간의 식이 개입을 받은 후, 유전형과 단순성 비만 아동의 대사 악화가 모두 뚜렷하게 완화되었다. 그러나, 이 균주들이 개입을 받은 후의 개체들에 다량 함유된 것이 발견되었지만, 이 균주들이 개입을 통해 뚜렷이 증가되었는지 아니면 환자의 건강상황을 개선시켰는지는 확인된바 없다.

다시 말하여, 현재 존재하는 프로바이오틱스는 많은 한계를 갖고 있기에 새로운 프로바이오틱 미생물 균주가 필요하게 되었다.

인간 장내 유익한 균이 식이 개입에 반응하는 유전체 기초는 여전히 불분명하여, 인간의 건강에 사용되는 장내 균군에 대한 정확한 조작을 저해한다. 쉽게 소화되지 않는 탄수화물이 풍부한 식이 개입 105일 후, 프라더-윌리증후군(Prader-Willi Syndrome)을 앓고 있는 유전형 비만 아동의 체중은 18.4% 줄었고, 생물 임상 매개변수가 뚜렷하게 개선된 것으로 나타났다. 개입 후의 분변 샘플로부터 풍도가 가장 크게 향상된 균종의 하나인 비피도박테리움 슈도카테눌라툼의 5개 분리주(PERFECT-2017-0001, 수탁번호 XXX; PERFECT-2017-0002, 수탁번호 XXX; PERFECT-2017-0003, 수탁번호 XXX; PERFECT-2017-0004, 수탁번호 XXX; 및 C95라 칭함)를 얻었다. 흥미롭게도, 이 5종 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주는 개입 기간에 서로 다른 반응을 보였다. 2종 균주는 거의 영향을 받지 않은 반면, 다른 3종 균주는 음식 탄수화물원의 변화에 따라 정도가 다르게 증가되었다. 이 균주들의 차이 반응은 COG(Cluster of Orthologous Group, 이종상동성 그룹 클러스터) (ABC형 당류수송시스템에 관여하는 것들 포함) 기반의 기능 클러스터링과 일치하며, 균주 특이성 유전체 변이가 생태적 지위 적응(niche adaption)에 도움이 될 수 있음을 보여준다. 특히, 식물 다당류를 표적으로 하는 탄수화물 활성효소의 종류가 가장 다양하고 유전자 복제수가 가장 높은 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0002가 개입 후 가장 높은 풍도를 갖는다.

따라서, 한 측면에서 본 발명은 비피도박테리움속 세균 또는 그 혼합물이 포유동물에서 비만 치료, 체중증가 통제 및/또는 체중 감소를 유도하는데 사용되는 식품, 식이보충제 또는 약물을 제조하기 위한 용도를 제공한다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 (1)비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주 PERFECT-2017-0001 또는 PERFECT-2017-0002 또는 매우 유사한 균주, 또는 (2)이로부터 파생된 균주; (3)약제학적으로 허용되는 담체 또는 음식담체를 공개한다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주 PERFECT-2017-0001 또는 PERFECT-2017-0002 또는 매우 유사한 균주를 적당한 조성물로 조제하는 방법을 포함하는 본 발명의 조성물을 제조하는 방법을 공개한다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 필요한 대상체에게 본 발명의 조성물을 투여하는 방법을 포함하는, 과체중, 비만, 고혈당증, 당뇨병, 지방간, 이상지질혈증, 대사증후군, 비만 또는 과체중 대상에서의 감염 및/또는 지방세포의 비대에서 선별된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법을 공개한다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 필요한 대상체에게 본 발명의 조성물을 투여하는 방법을 포함하는, 필요한 대상체에서 단순성 비만 또는 유전형 비만을 낮추고, 대사 악화를 완화하거나 또는 염증과 지방 축적(fat accumulation)을 낮추는 방법을 공개한다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 필요한 대상체에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 건강한 장내 생태계 구조를 확정하는 기초 균종을 만들어, 발병 세균과 유해 세균에 불리한 장내 환경을 조성하고, 미처리 대조군에 대하여 장내세균이 장내 내용물에서의 농도를 낮추는 방법을 공개한다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 필요한 대상체에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 필요한 대상체에서 당뇨병을 치료하는 방법을 공개한다.

도 1은 개입 후 생물 임상 매개변수와 염증 상황의 개선을 도시한다. (적색) 인체 측정 표지자. (녹색) 혈장 지질 항상성. (남색) 혈장 포도당 항상성. (자색) 염증 관련 표지자. BMI(body mass index): 신체질량 지수; OGTT(Oral glucose tolerance test): 경구 포도당부하시험; LBP(Lipopolysaccharide-binding protein): 지질다당류 결합단백질.
도 2는 식이 개입 기간 장내 균군의 변화를 도시한다. (A) 7개 시점에서의 속 수준(Genus-level) 장내 세균 구성. 상단 패널은 샤논 지수(Shannon index) 값을 도시하고, 하단 패널은 각 속의 백분율을 도시한다. 평균 풍도에 따라 앞 15개 속은 이들의 분류학 명칭에 의해 표기된다. (B) 5종 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주의 차이 풍도. 단계 I: 0일째부터 60일째까지, 기초 식이 개입; 단계 II: 60일째부터 75일째까지, 기초 개입+ 3번 조제법 100g 추가; 단계 III: 비교적 적은 1번 조제법 + 3번 조제법 100g 추가).
도 3은 임상 매개변수의 변화와 5종 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주의 풍도 사이 관련성을 도시한다. 스페어만 상관성을 수행한다. * 조정된 P < 0.05; **조정된 P < 0.01 (Benjamini & Hochberg 1995).
도 4는 비피도박테리움 슈도카테눌라툼의 이종상동성 유전자의 이종상동성 클러스터(COG) 분류를 도시한다. 각 COG에 대하여, 여섯 개의 완전한 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 유전체의 평균 백분율을 나타낸다.
도 5는 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주 사이의 유전체 변이를 도시한다. (A) 여섯 개의 완전한 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 유전체 사이 MUMmer 이용을 기반으로 진행한 유전체 서열 정렬의 쌍별 점 도표 비교. (B)벤 도표(Venn diagram)는 각 균주에서 핵심적인 독특한 유전체의 수를 도시한다.
도 6: 적어도 2개의 복제 수 차이를 갖는 핵심 COG의 분포. 히트맵은 특정 COG 기능으로 주석된 유전자의 복제 수를 도시한다. 유클리디안 거리(Euclidean distance)와 와드 연결법(Ward linkage)을 이용하여 균주를 클러스터링한다.

본 발명자는 포유동물에서 단순성 비만이나 유전형 비만을 낮추고 대사 악화를 완화하며 염증과 지방 축적을 낮출 수 있는 비피도박테리움 슈도카테눌라툼의 균주를 이미 발견했다. 장내에서 구축될 때, 본 발명의 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주는 단독으로 또는 다른 프로바이오틱 미생물과 결합되어 기초균종 역할을 하며, 상기 기초균종은, 예를 들어 가능하게 아세테이트/에스테르의 생성을 통해 발병 세균과 유해 세균에 불리한 장내 환경을 조성하여 건강한 장내 생태계 구조를 확정한다.

아래에서 보다 상세하게 설명된 바와 같이, 본 발명의 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주는 전곡류, 전통 중국 약선과 프리바이오틱스의 선공개된 식이(WTP식이)를 기반으로 입원 개입을 받은 개체(S. Xiao등, A gut microbiota-targeted dietary intervention for amelioration of chronic inflammation underlying metabolic syndrome. FEMS Microbiol Ecol87, 357 (Feb, 2014))로부터 분리되었다. 이 개체들은 30일간의 식이 개입을 받은 후, 유전형과 단순성 비만 아동의 대사 악화가 모두 뚜렷하게 완화되었다.

아래 실시예에서 상세하게 설명된 바와 같이, 본 발명자는 본 발명 기초균종의 대량 균주를 성공적으로 얻었으며, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼으로 감별되었다. 대표적인 분리주는 PERFECT-2017-0001과 PERFECT-2017-0002 균주로서, 2017년1월23일 중국보통미생물균종보존센터(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)에 기탁되었으며, 수탁번호는 각각 ……와 ……이다.

본 발명의 프로바이오틱 균주는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 숙지한 표준화된 방법을 이용하여 배양, 유지와 번식될 수 있으며, 그 중 일부 방법은 아래 실시예에서 예시된다.

본 발명에 사용되는 세균은 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주 또는 그 혼합물이다. 바람직하게, 본 발명에 사용되는 비피도박테리움은 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0001 또는 PERFECT-2017-0002 균주이다.

당해 세균은 여기에 설명된 역할을 발휘할 수 있는 어떤 형태로든 이용될 수 있다. 바람직하게, 당해 세균은 생균이다.

당해 세균은 전체 세균을 포함하거나 세균 구성물질을 포함할 수 있다. 이러한 구성물질의 실례는 이를테면 펩티도글리칸과 같은 세균 세포벽 구성물질, DNA와 RNA와 같은 세균 핵산, 세포막 구성물질, 그리고 단백질, 탄수화물, 지질류와 같은 세균구조 구성물질, 그리고 이들의 조합인 지단백질, 당지질과 당단백질 같은 것들을 포함한다.

세균은 또한 세균 대사산물을 포함하거나 대신 포함할 수 있다. 본 명세서에서, 용어 “세균 대사산물”은 포유동물에서 프로바이오틱 산물의 생성과 저장 기간 및 위장 수송 기간에 세균의 생장, 생존, 지속, 수송 또는 존재 기간의 세균 대사로 인해 (프로바이오틱)세균에 의해 생성 또는 변형된 모든 분자를 포함한다. 실례는 모든 유기산, 무기산, 알칼리, 단백질과 펩타이드, 효소와 보효소, 아미노산과 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 당지질, 비타민, 모든 생체활성 화합물, 무기 구성물질을 함유한 대사산물, 그리고 질소를 함유한 분자 또는 아류산을 함유한 분자와 같은 모든 소분자를 포함한다. 바람직하게, 당해 세균은 전체 세균을 포함하며, 더욱 바람직하게 전체 생균이다.

바람직하게, 본 발명에 의해 사용되는 비피도박테리움은 인간 및/또는 동물의 섭취에 적합한 비피도박테리움이다. 본 발명에 사용되는 비피도박테리움은 같은 유형(균종과 균주) 일 수 있거나 균종 및/또는 균주를 포함하는 혼합물일 수 있다.

적합한 비피더스균은 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidium), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 애니멀리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 카테눌라툼(Bifidobacterium catenulatum), 비피도박테리움 슈도카테눌라툼, 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis)와 비피도박테리움 안구라툼(Bifidobacterium angulatum) 및 이들의 임의 조합의 균종에서 선별된다.

아래 실시예에서 볼 수 있다시피, 락토바실러스 뮤코세(Lactobacillus mucosae), 특히 락토바실러스 뮤코세 균주(32)와 매우 유사한 것들은 식이 개입 후 현저하게 증가되었다. 따라서, 본 발명의 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주와 결합하여 사용되는 바람직한 균은 락토바실러스 뮤코세, 특히 균주(32)이다.

일 실시방안에서, 본 발명에 사용되는 세균은 프로바이오틱 박테리아이다. 본 명세서에서, 용어 “프로바이오틱 박테리아”는 적절한 양의 생균으로 투여될 때 숙주에게 건강상의 이익을 제공하는 모든 비발병 세균을 포함하는 것으로 정의된다. 이 프로바이오틱 균주들은 일반적으로 소화기관의 상부를 통과할 때 살아 남을 수 있다. 이들은 비발병적이고 독이 없으며, 소화기관에 있는 상재균(resident flora)과 생태적 상호작용을 하는 한편, “GALT”(장 관련 림프조직)를 경유하여 면역계통에 긍정적인 영향을 미치는 능력을 통해 건강에 이로운 역할을 한다. 프로바이오틱스의 정의에 따르면, 이 세균들은 충분한 양으로 제공될 때 살아서 장을 행진 통과할수 있지만 장 장벽을 통과할 수 없으므로, 이들의 주요 작용은 위장강 및/또는 위장벽에서 유발된다. 그리고, 이들은 투여기간에 상재균의 일부를 형성한다. 이런 정착(또는 일시적인 정착)은 당해 프로바이오틱 박테리아로 하여금 균군에 존재하는 잠재적인 발병 미생물과 장내 면역계통의 상호 작용을 억제하는 것과 같은 이로운 역할을 하도록 한다.

일부 실시방안에서, 당해 비피도박테리움은 본 발명에서 락토바실러스속 세균과 함께 사용된다. 본 발명에 따른 비피도박테리움과 락토바실러스 박테리아의 결합은 일부 응용에서 시너지 효과(즉, 효과가 단독 사용 시 세균의 상기 효과보다 큼)를 나타낸다. 예를 들어, 단일 구성물질로서 포유동물에게 작용하는 경우를 제외하고, 결합 사용은 당해 결합의 다른 구성물질의 생성에도 이로운 효과가 있는데, 이를테면, 뒤이어 도리어 당해 결합의 기타 구성물질의 에너지원으로 사용되는 대사산물을 생성하거나 다른 구성물질에 유리한 생리적 조건을 유지하는 것이다.

통상적으로, 락토바실러스 박테리아는 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri), 락토바실러스 비피더스(Lactobacillus bifidus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 커베투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파르시미니스(Lactobacillus farciminis), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 락토바실러스 델브루에스키(Lactobacillus delbreuckii), 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii)와 락토바실러스 젠센이(Lactobacillus jensenii), 및 이들의 임의 조합에서 선별된다.

일부 바람직한 실시방안에서, 본 발명에 사용되는 락토바실러스 박테리아는 프로바이오틱 락토바실러스이다. 바람직하게, 본 발명에 사용되는 락토바실러스 박테리아는 락토바실러스 에시도필러스 균종이다.

투여량과 투여. 생물체를 소과기관에 끌어들일 수 있는 모든 방법으로 프로바이오틱 박테리아의 투여를 완성할 수 있다. 당해 세균을 담체와 혼합할 수 있고, 이를 액체나 고체 사료 또는 음용수에 응용할 수 있다. 담체 재료는 세균과 동물에 대해 독이 없어야 한다. 바람직하게, 당해 담체는 세균의 저장기간 생존력을 높이는 성분을 함유한다. 세균을 동물의 입에 직접 주입될 접종 페이스트(inoculant paste)로 조제할 수 있다. 당해 제제는 입맛 개선, 품질 보증기간 향상, 영양적인 이점 부여 등을 위해 다른 성분을 포함할 수 있다. 중복 가능한 투여량과 측정 가능한 투여량을 원할 경우, 전위 투관(rumen cannula)을 통해 세균을 투여할 수 있다. 투여될 프로바이오틱 박테리아의 양은 효능에 영향을 미치는 요소에 의해 지배된다. 사료나 음용수에 투여할 때 투여량을 며칠 또는 몇 주간의 시간대에 분산시킬 수 있다. 며칠 내 비교적 적은 양을 투여하는 누적효과는 한 번에 비교적 많은 양을 투여하는 것보다 효과가 클 수 있다. 당업자들은 우세적인 프로바이오틱 박테리아 투여 전, 투여 기간과 투여 후의 분변에서 인간 살모넬라병을 일으키는 살모렐라 균주의 수를 모니터링함으로써, 동물이 지닌 인간 살모렐라병을 일으키는 살모렐라 균주의 양을 줄이는데 필요한 투여량 수준을 쉽게 확인할 수 있다. 우세적인 프로바이오틱 박테리아는 하나 또는 그 이상 종류의 균주과 함께 투여될 수 있다. 각 동물마다 주어진 개체에서 가장 오래가는 균주가 다를 수 있으므로, 균주의 조합이 유리할 수 있다.

본 발명에 의해 사용되는 비피도박테리움 슈도카테눌라툼은 106 내지 1012 CFU 세균/g의 지지물(support)로 구성될 수 있으며, 108 내지 1012 CFU 세균/g의 지지물이 더욱 바람직하고, 동결건조 형태인 경우 109 내지 1012 CFU/g가 바람직하다.

적절하게, 약 106 내지 약 1012 CFU 미생물/투여량으로 비피도박테리움 슈도카테눌라눔을 투여할 수 있으며, 약 108 내지 약 1012 CFU 미생물/투여량이 바람직하다. 용어 “1회분 투여량”은 매일 또는 매번 섭취하는 양, 바람직하게는 매일 대상체에게 제공되는 당해 양의 미생물을 뜻한다. 예를 들어, 식품(예컨대 요구르트)에 당해 미생물을 투여하는 경우, 요구르트는 바람직하게 약 108 내지 1012 CFU의 미생물을 함유한다. 그러나, 선택적으로, 당해 미생물을 여러 번에 걸쳐 투여할 수 있는데, 매번 투여는 소량 미생물 부하로 구성되도록, 대상체가 어떤 특정 시간(예컨대 매 24시간내) 내 받아들이는 미생물 총량이 약 106 내지 약 1012 CFU의 미생물이면 되고, 108 내지 약 1012 CFU의 미생물이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 적어도 한 미생물 균주의 효과적인 양은 적어도 106 CFU 미생물/투여량일 수 있고, 약 106 내지 약 1012 CFU 미생물/투여량이 바람직하며, 약 108 내지 약 1012 CFU 미생물/투여량이 바람직하다.

일 실시방안에서, 약 106 내지 약 1012 CFU 미생물/일, 바람직하게 약 108 내지 약 1012 CFU 미생물/일의 투여량으로 비피도박테리움 슈도카테눌라툼이 투여될 수 있다. 따라서, 당해 실시방안에서 효과적인 양은 약 106 내지 약 1012 CFU 미생물/일, 바람직하게 약 108 내지 약 1012 CFU 미생물/일이 될 수 있다.

CFU는 “균락 형성 단위”를 표시한다. “지지물”은 식품, 식이보충제 또는 약제학적으로 허용되는 지지물을 가리킨다.

본 발명에서 비피도리박테리움을 다른 한 종류의 프로바이오틱 박테리아와 함께 사용하는 경우, 당해 세균은 여기서 설명된 기대 효능의 임의 비례의 존재를 달성할 수 있다.

대상체/의학 적응증

비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주는 이를테면 가축(소, 말, 돼지, 닭과 양 포함)과 인간을 포함하는 포유동물에게 투여된다. 본 발명의 일부 측면에서, 포유동물은 개나 고양이와 같은 반려동물(애완동물 포함)이다. 본 발명의 일부 측면에서, 대상체는 적당하게 인간일 수 있다.

당해 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주는 포유동물(특히 인간)에서 다양한 질병 또는 병증을 치료하는데 적합할 수 있다. 본 명세서에서, 용어 ”치료”라함은, (1)특정적인 질병에 취약하지만 아직 그 질병을 경험하지 않았거나 당해 질병의 병리 또는 증상이 나타나지 않은 포유동물에서 특정적인 질병이 발생하는 것을 막고(당해 질병과 관련된 하나 또는 더 많은 여러 위험요소의 예방 포함); (2)당해 질병의 병리 또는 증상을 겪고 있거나 당해 질병의 병리 또는 증상이 나타나고 있는 포유동물에서 당해 질병을 억제하거나; 또는 (3)당해 질병의 병리 또는 증상을 겪고 있거나 당해 질병의 병리 또는 증상이 나타나고 있는 포유동물에서 당해 질병을 완화하는 본 발명의 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주의 모든 투여를 가리킨다.

본 발명의 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주는 당뇨병과 비만을 동시에 앓고 있는 포유동물에 적합하다. 당뇨병과 비-비만을 앓고 있는 포유동물 및 당뇨병 위험요소가 있으나 아직 당뇨병 상태에 처하지 않은 비만 포유동물에도 적합하다. 이에 대해서 아래에 더욱 상세하게 토론한다.

아래 실시예에서 보다 상세하게 설명된 바와 같이, 본 발명의 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주는 다양한 생물학 활성을 갖는다. 구체적으로, 본 발명에 사용된 비피더스균은 포유동물에서 인슐린 민감성을 정상화 할 수 있고, 식후 인슐린 분비(fed insulin secretion)를 향상할 수 있으며, 공복 인슐린 분비를 개선하고, 포도당 내성을 개선한다. 이 역할들은 당뇨병과 당뇨병 관련 병증(특히 2형 당뇨병과 내당능장애)을 치료할 수 있는 잠재력을 부여한다.

또한, 본 발명에 사용된 비피더스균은 체중 감소와 신체 지방 중량(특히 장간막 지방 중량)의 감소를 유도할 수 있다. 이 역할들은 포유동물에서 비만을 치료하고 체중 증가 통제 및/또는 체중 감소를 유도하기 위한 잠재력을 부여한다.

구체적으로, 아래 실시예에서 보다 상세하게 설명된 바와 같이, 본 발명에 따라 락토바실러스 박테리아(특히 락토바실러스 에시도필러스 박테리아)와 함께 사용된 비피도박테리움은 체중 감소와 신체 지방 중량(특히 장간막 지방 중량)의 감소를 유도할 수 있다. 이 역할들은 포유동물에서 비만을 치료하고 체중 증가 통제 및/또는 체중 감소를 유도하기 위한 잠재력을 부여한다.

본 명세서에서, 용어 비만은 신체질량 지수(body mass index, BMI)와 관련된다. 신체질량지수(BMI)(킬로그램으로 표시된 몸무게를 미터로 표시된 키의 제곱으로 나누어서 계산)는 가장 흔히 접수되는 과체중 및/비만의 척도이다. BMI가 25를 초과하면 과체중으로 간주된다. 비만은 BMI가 30 또는 그 이상인 것으로 정의되는데, BMI가 35 또는 그 이상이면 심각한 비만 합병증(comorbidity obesity), BMI가 40 또는 그 이상이면 병적 비만으로 인정된다.

위에서 언급한 바와 같이, 여기서 사용되는 용어 “비만”은 비만, 비만 합병증과 병적 비만을 포함한다. 따라서, 여기서 사용되는 용어 “비만”은 BMI가 30보다 크거나 같은 대상체로 정의될 수 있다. 일부 실시방안에서, 비만 대상체의 BMI가 적절하게 30보다 크거나 같고, 적절하게 35, 적절하게 40이 될 수 있다.

본 발명의 조성물은 당뇨병과 비만을 동시에 앓고 있는 환자한테 특히 적합하지만, 당뇨병을 앓고 있으나 비만은 아닌 환자한테도 적합하다. 비만(하지만 당뇨병이 없는) 사람에서 그 비만의 대사 결과인 당뇨병 또는 적어도 인슐린 저항성의 발달을 제한할 수 있음을 예측 가능하기에, 당뇨병 위험요소를 갖고 있지만 아직 당뇨병 상태에 처하지 않은 비만 환자한테도 적합할 수 있다.

또한, 본 발명에 사용된 비피더스균은 포유동물에서 대사증후군을 치료하는데 사용될 수 있다. 대사증후군은 심혈관질병과 당뇨병의 발생 위험을 증가시키는 의학 질병의 조합이다. 대사증후군은 대사증후군X, X증후군, 인슐린저항증후군, 리븐증후군(Reaven's syndrome) 또는 CHAOS(오스트레일리아)라고도 불리운다.

유전형 비만

다른 일부 실시방안에서, 본 발명에 사용된 비피더스균 (그리고 존재한다면 락토바실러스)은 포유동물에서 조직염증(간조직 염증, 근육조직 염증 및/또는 지방조직 염증을 특히 포함하지만 이에 국한되지 않음)을 감소하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 비피더스균 (그리고 존재한다면 락토바실러스)을 사용하여 치료할 수 있는 심혈관질병의 실례는 동맥류, 협심증, 동맥 경화증, 뇌혈관 사고(중풍), 뇌혈관질병, 울혈성 심부전(CHF), 관상동맥성 심질환, 심근경색(심장병 발작)과 말초혈관 질병을 포함한다.

본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 실시방안은 조합이 가능하여 본 문서에서 설명된 모든 특징의 조합이 본 발명의 범위에 포함될 것으로 예상된다. 구체적으로, 본 발명의 범위 내에서, 당해 세균의 모든 치료 역할은 동시에 나타날 수 있을 것으로 예상된다.

조성물

본 발명에 따라 본 발명의 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주(즉 아무런 지지물, 희석제 또는 부형제가 없이)를 단독으로 투여할 수 있지만, 본 발명의 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주는 흔히 또한 바람직하게 제품의 일부로 되어 지지물 또는 지지물 내에 투여되는데, 특히 식품, 식이보충제 또는 약물제제의 구성물질로 된다. 이 제품들은 통상적으로 당업자들이 익숙히 알고 있는 별도의 구성물질을 함유한다.

당해 구성물질로부터 혜택을 받을 수 있는 어떤 제품이든 본 발명에 사용될 수 있다. 여기에는 음식물, 특히 과일 미?, 유제품과 유제품의 파생제품 및 의약제품이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주는 본 문서에서 “본 발명의 조성물” 또는 “당해 조성물”이라 칭할 수 있다.

음식물

일 실시방안에서, 본 발명의 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주는 식품, 이를테면 식품보충제, 음료 또는 분유에 응용된다. 여기서, 용어 “음식물”은 넓은 의미로 사용되며, 인간의 음식물 및 동물의 음식물(즉 사료)를 포함한다. 바람직한 측면에서, 음식물은 인간의 소모에 사용된다.

음식물은 용액 또는 고체 형태일 수 있는데, 용도 및/또는 응용 형태 및/또는 투여 경로에 의해 결정된다. 기능식품과 같은 음식물로 사용되거나 이를 제조하는데 사용되는 경우, 본 발명의 조성물은 영양적으로 허용되는 담체, 영양적으로 허용되는 희석제, 영양적으로 허용되는 부형제, 영양적으로 허용되는 보조제, 영양활성성분과 같은 한 가지 또는 여러 가지와 함께 사용될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 조성물은 청량음료, 과일주스 또는 락트알부민이 함유된 음료, 건강차, 코코아 음료, 유음료와 유산균 음료, 요구르트와 요구르트 음료, 치즈, 아이스크림, 빙과(water ices)와 디저트, 과자류, 비스킷 케이크와 케이크 믹스, 스낵 식품, 균형적인 음식물과 음료, 과일 필링, care glaze, 쵸콜렛 베이커리 필링, 치즈케익맛 필링(cheese cake flavoured filling), 과일맛케익 필링(fruit flavoured cake filling), 케익과 도넛 당의(cake and doughnut icing), 즉석 베이커리 크림 필링(instant bakery filling creams), 쿠키 필링(fillings for cookies), 즉석용 베이커리 식품 필링, 칼로리를 낮춘 필링(reduced calorie filling), 성인 영양음료, 산성화 대두/주스 음료(acidified soy/juice beverage)무균/살균 쵸콜렛 음료(aseptic/retorted chocolate drink), 바 믹스(bar mixes), 음료 분말(beverage powders), 칼슘 강화 대두/순 쵸콜렛 우유(calcium fortified soy/plain and chocolate milk), 칼슘 강화 커피 음료의 성분이 될 수 있다.

당해 조성물은 아메리칸 치즈 소스(American cheese sauce), 입자상 치즈&조각 치즈 케이킹방지제, 칩 딥(chip dip), 크림 치즈(cream cheese), 건조 혼합 휘프 토핑 무지방 사워크림(dry blended whip topping fat free sour cream), 동결융해 동물성 휘핑크림(freeze/thaw dairy whipping cream), 동결융해 안정적인 휘프트 티핑(freeze/thaw stable whipped tipping), 저지방 저칼로리 천연 체다치즈(low fat and light natural cheddar cheese), 저지방 스위스 스타일 요구르트, 탄산가스가 든 냉동 디저트(aerated frozen desserts), 하드팩 아이스크림(hard pack ice cream), 라벨이 친환경적이고, 경제성과 기호가 향상된 하드팩 아이스크림(label friendly, improved economics & indulgence of hard pack ice cream), 저지방 아이스크림, 연질 아이스크림, 바비큐 소스(barbecue sauce), 치즈 딥 소스(cheese dip sauce), 코티지 치즈 드레싱(cottage cheese dressing), 건조믹스 알프레도 소스(dry mix Alfredo sauce), 믹스 치즈 소스(mix cheese sauce), 건조믹스 케첩과 같은 식품의 성분으로도 사용될 수 있다.

여기서 사용된 용어 “유제품”은 동물 및/또는 식물을 공급원으로 하는 밀크를 함유한 매개체를 포함하려는 의도이다. 동물 공급원에서 유래한 밀크로서 언급 가능한 것은 젖소, 면양, 산양 또는 물소로부터 공급된 밀크이다. 식물을 공급원으로 하는 밀크로서 언급 가능한 것은 본 발명에 의해 사용되는 식물을 공급원으로 하는 모든 발효 가능한 물질, 특히 대두, 쌀 또는 곡물을 공급원으로 하는 밀크이다.

일부 측면에서, 바람직하게 본 발명은 요구르트, 이를테면 발효 요구르트 음료, 요구르트, 음용 요구르트, 치즈, 발효유, 우유 기반 디저트(milk based dessert)의 생산에 사용될 수 있다.

적절하게, 당해 조성물은 치즈 응용, 육류 응용 또는 보호균을 포함하는 응용에서 한 가지 또는 여러 가지의 성분으로도 사용될 수 있다.

본 발명은 음식물 또는 음식물 성분을 제조하는 방법을 더 제공하는데, 당해 방법은 본 발명에 따른 조성물과 다른 음식물 구성물질을 혼합하는 방법을 포함한다.

유리한 것은, 본 발명은 본 발명의 조성물 (및 임의로 선택된 다른 구성물질/성분)과 이미 접촉한 제품과 관련되는데, 당해 조성물은 제품의 영양 및/또는 건강상의 이익을 개선할 수 있는 양으로 사용된다.

본 문서에 사용되는 “접촉”은 본 발명의 조성물이 간접적 또는 직접적으로 제품에 응용되는 것을 가리킨다. 사용 가능한 응용방법의 실례는, 당해 조성물의 재료에서 당해 제품을 처리하고, 당해 조성물과 당해 제품을 혼합하여 직접 응용하며, 당해 조성물을 당해 제품의 표면에 분사하거나 당해 제품을 당해 조성물의 제제에 담그는 것을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

본 발명의 제품이 식품이면, 본 발명의 조성물과 당해 제품을 혼합하는 것이 바람직하다. 또는, 당해 조성물은 식품의 원료 성분이나 유액에 포함될 수 있다. 또는, 당해 조성물은 조미료, 글레이즈(glaze), 착색제 혼합물과 같은 것으로 응용될 수 있다.

본 발명의 조성물을 통제된 양의 미생물로 제품에 점철, 코팅 및/또는 주입할 수 있다.

바람직하게, 당해 조성물은 발효유 또는 수크로스 강화 우유(sucrose fortified milk) 또는 수크로스 및/또는 맥아당을 구비한 요구르트 매개체에 사용되며, 당해 조성물을 함유한 모든 구성물질, 즉 본 발명에 따른 상기 미생물로 얻은 매개체를 적절한 농도의 성분으로 요구르트에 첨가할 때, 최종제품에 106-1010 CFU 일 투여량과 같은 농도를 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 미생물은 요구르트 발효 전 또는 발효 후에 사용될 수 있다.

일부 측면에서, 본 발명에 따른 미생물은 가축사료와 같은 동물 사료, 특히 가금류(예컨대 닭) 사료 또는 애완동물의 사료로 사용되거나 동물사료를 제조하는데 사용된다.

유리한 것은, 제품이 식품인 경우, 본 발명의 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주는 소매상에서 당해 식품이 정상적으로 판매되는 “ 판매 마감일” 또는 “유효기간”내에 유효함을 유지해야 한다. 바람직하게, 유효기간은 음식물의 부패가 명백해지는 정상적인 신선 기간이 끝날 때까지 연장되어야 한다. 원하는 시간과 정상적인 품질보증 기간은 식품에 따라 다르며, 당업자들은 품질보증 기간이 식품의 종류, 식품의 크기, 저장 온도, 가공 조건, 포장 재료와 포장 설비에 따라 다르다는 것을 인식하게 된다.

음식물 성분, 음식물 보충제와 기능 음식물

본 발명의 조성물은 음식물 성분 및/또는 사료 성분으로 사용될 수 있다. 본 문서에 사용되는 용어 “음식물 성분” 또는 “사료 성분”은 영양보충제 또는 영양보충제로서 기능 음식물 또는 식품에 첨가 가능한 제제를 포함한다. 음식물 성분은 용액 또는 고체 형태일 수 있는데, 용도 및/또는 응용 방식 및/또는 투여 방식에 의해 결정된다.

본 발명의 조성물은 식물보충제(본 문서에서 식이보충제라고도 불리움)일 수 있거나 식물보충제에 첨가될 수 있다.

본 발명의 조성물은 기능 음식물일 수 있거나 기능 음식물에 첨가될 수 있다. 본 문서에 사용되는 용어 “기능성 음식물”은 소비자한테 영양 역할 뿐만 아니라 더한층 유익한 효과를 제공하는 음식물을 가리키려는 것이다.

따라서, 기능성 음식물은 순수한 영양 효능 이외의 특정 기능, 이를테면 의약 또는 생리적 이점을 음식물에 전달하는 구성물질 또는 성분(본 문서에 설명된 것과 같은 것)을 포함하는 일반 음식물이다. 일부 기능식품은 보건품이다. 여기서, 용어 “보건품”은 소비자한테 영양 효능 및/또는 미각 상의 만족감뿐만 아니라 치료(또는 다른 유익한) 효능을 제공할 수 있는 음식물을 가리킨다. 보건품은 음식물과 약물 사이의 전통적인 경계선을 뛰어 넘는다.

약제(medicament)

본 문서에 사용되는 용어 “약제”는 인간과 수의학에서 인간과 동물에게 사용되는 약제를 포함한다. 또한, 본 문서에 사용되는 “약제”는 치료 및/또는 유익한 효과를 제공하는 모든 물질을 가리킨다. 본 문서에 사용되는 용어 “약제”는 출시 허가가 필요한 물질에만 국한되지 않고, 화장품, 보건품, 음식물(예를 들어 사료와 음료 포함), 프로바이오틱 배양물(probiotic cultures)과 자연요법에 사용되는 물질도 포함할 수 있다. 또한, 본 문서에서 사용하는 용어 “약제”는 동물사료(예를 들어 가축사료 및/또는 애완동물 식품)에 편입되도록 설계되는 제품을 포함한다.

약물(pharmaceuticals)

본 발명의 조성물은 약물로 사용되거나 약물을 제조하는데 사용될 수 있다. 여기서, 용어 “약물”은 넓은 의미로 사용되며, 인간에게 사용되는 약물과 동물에게 사용되는 약물(즉 수의 응용)을 포함한다. 바람직한 측면에서, 당해 약물은 인간 용도 및/또는 축목업에 사용된다. 당해 약물은 성질상 치료 또는 완화 또는 예방적인 치료 목적에 사용될 수 있다. 당해 약물은 심지어 진단 목적에 사용될 수 있다.

약물적으로 허용되는 지지물은 압축 정제, 정제, 캡슐, 연고, 좌제 또는 마실 수 있는 용액(drinkable solutions) 형태의 지지물일 수 있다. 다른 적절한 형태는 이하와 같다.

약물로 사용되거나 이를 제조하는데 사용되는 경우, 본 발명의 조성물은 약물적으로 허용되는 담체, 약물적으로 허용되는 희석제, 약물적으로 허용되는 부형제, 약물적으로 허용되는 보조제, 약물활성성분과 같은 한 가지 또는 여러 가지와 함께 사용될 수 있다. 약물은 용액 또는 고체 형태일 수 있는데, 용도 및/또는 응용 방식 및/또는 투여 방식에 의해 결정된다.

이 형태의 영양적으로 허용되는 담체의 제조에 사용되는 실례는 이를테면 물, 식염수, 알콜, 실리콘, 밀랍, 바셀린, 식물유, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 리포솜, 당류, 젤라틴, 유당, 아밀로오스(amylose), 마그네슘스테아레이트, 활석분, 표면활성제, 규산, 점착성 파라핀, 방향유, 지방산 모노글리세리드와 디글리세리드, 석화(petroethral)지방산에스터, 히드록시메틸섬유소(hydroxymethylcellulose), 폴리비닐피로리돈 등과 같은 것들이다.

수성 현탁제 및/또는 엘릭서에 대해, 본 발명의 조성물은 다양한 감미료 또는 조미료, 착색제 또는 염료와 서로 결합될 수 있고, 유화제 및/또는 현탁제와 서로 결합될 수 있으며, 그리고 물, 프로필렌 글리콜과 글리세린의 희석제와 서로 결합될 수 있고, 이들의 조합과 결합될 수 있다. 약제 형태는 젤라틴 갭슐, 섬유 캡슐, 섬유제 등, 또는 심지어 섬유 음료도 포함할 수 있다. 약제 형태의 다른 실례는 크림을 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명에 사용되는 미생물은 선크림 및/또는 애프터선크림(after-sun creams)과 같은 약물 및/또는 화장품의 크림에 사용될 수 있다.

프리바이오틱스와의 결합

본 발명의 조성물은 한 가지 또는 한 가지 이상의 프리바이오틱스를 더 포함할 수 있다. 프리바이오틱스는 일종의 기능성 음식물로서, 결장 내 한가지 또는 소수 세균의 생장 및/또는 활성을 선택적으로 자극하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 미침으로써, 숙주의 건강을 개선하는, 쉽게 소화되지 않는 음식물의 성분으로 정의된다. 통상적으로, 프리바이오틱스는 탄수화물(예컨대 올리고당)이지만, 당해 정의는 비탄수화물을 배제하지 않는다. 프리바이오틱스의 가장 보편적인 형태는 영양학에서 가용성 섬유로 분류된다. 일정한 정도에서, 많은 형태의 식이섬유는 어느 정도 프리바이오틱 효능을 나타낸다.

일 실시방안에서, 프리바이오틱은 선택적 발효성분으로서, 이는 위장내 미생물 군락의 조성 및/또는 활동에서 숙주건강에 이로운 특정 변화를 허용한다.

적절하게, 본 발명에 따르면, 프리바이오틱은 0.01 내지 100그램/일의 양으로 사용될 수 있는데, 바람직하게 0.1 내지 50그램/일, 더욱 바람직하게 0.5 내지 20그램/일의 양으로 사용될 수 있다. 일 실시방안에서, 본 발명에 따르면, 1 내지 100그램/일의 양으로 프리바이오틱을 사용할 수 있는데, 바람직하게 2 내지 9그램/일, 더욱 바람직하게 3 내지 8그램/일의 양으로 사용할 수 있다. 다른 일 실시방안에서, 본 발명에 따르면, 5 내지 50그램/일의 양으로 프리바이오틱을 사용할 수 있는데, 바람직하게 10 내지 25그램/일의 양으로 사용할 수 있다.

프리바이오틱스의 식이 공급원의 실례는 대두, 이눌린 공급원(예컨대 뚱딴지, 히카마와 뿌리치거리), 생귀리, 정제되지 않은 밀, 정제되지 않은 보리와 야콘을 포함한다. 적절한 프리바이오틱스 실례는 알지네이트, 크산탄, 펙틴, 로커스트콩검(LBG), 이눌린, 구아검, 갈락토올리고당(GOS), 프락토올리고당(FOS), 폴리덱스트로스(즉 Litesse®), 락티톨, 유과올리고당, 대두올리고당, 이소말툴로스(Palatinose.TM.), 아이소말토올리고당, 글루코 올리고당, 자일로올리고당, 만노올리고당, β-글루칸, 셀로비오스, 라피노오스, 겐티오비오스, 멜리바이오스, 자이로비오스, 사이클로덱스트린, 이소말토오스, 트리할로오스, 스타키오스, 파노오스, 풀루란, 베르바스코오스, 갈락토만난과 모든 형태의 저항전분을 포함한다. 프리바이오틱의 특별한 바람직한 실례는 폴리덱스트로스이다.

일부 실시방안에서, 본 발명에 따른 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주와 프리바이오틱스의 결합은 일부 응용에서 시너지 효과(즉, 효과가 단독 사용 시 세균의 상가 효과보다 큼)를 나타낸다.

실시예

가장 최근의 증거는 장내 미생물군의 균군 불균형이 비만 및 당뇨병과 같은 인간 질병에서 관건적인 역할을 한다는 것을 보여준다(1, 2). 질병/건강 표현형에 대해 발병작용을 하는 장내 균군의 특정 구성원은 질병 진단의 유력한 도구(3, 4)로 활용될 뿐만 아니라, 약물(5), 분변 미생물군 이식(6) 및 음식(7)과 같은 다양한 방법에 의해 질병 완화/치료에서 표적으로도 사용될 수 있다. 그러나, 장내의 균군 자체의 복잡성과 개체간의 차이 그리고 숙주 및 음식과의 상호작용(8)으로 하여 최적의 인간건강을 실현하기 위해 장내 미생물군에 대한 정밀한 조작이 유전체과 분자의 수준에서 더욱 깊이 이해되어야 한다.

이전에 진행된 식이 개입 연구에서, 우리는 전곡류, 전통적인 중국 약선과 프리바이오틱스로 구성된, 소화하기 어렵지만 발효가 가능한 탄수화물이 다량 함유된 식이(WTP 식이)가 장내 균군을 뚜렷하게 개변시켰을 뿐만 아니라, 프라더-월리증후군을 앓고있는 유전형 비만아동의 생물임상 매개변수와 염증상황(9)도 개선하였음을 발견하였다. 일종의 특정적인 이로운 세균인 비피도박테리움 슈도카테눌라툼은 개입 후 뚜렷하게 농축되는데, 이는 잠재된 다른 해로운 균종과 역상관을 이루고, 숙주 임상 매개변수의 개선과 정상관을 이룬다.

당해 그룹의 한 아동이 105일간의 개입을 완성했다. 그의 생물 임상 매개변수는 개선되어, 초기 체중 손실이 25.8 kg을 초과하는 한편, 장내 미생물 군락에서 피칼리박테리움(Faecalibacterium), 락토바실러스(Lactobacillus)와 비피도박테리움(Bifidobacterium)속이 증가된 것과 같은 뚜렷한 변화가 일어났다. 또한, 개입 후 비피도박테리움 슈도카테눌라툼이 비피도박테리움 속에서 가장 우세적인 균종임을 우리는 발견했다. 흥미롭게도, 105일째에 그의 분변 샘플에서 5종 균주(10)를 분리해내었는데, 이 균주들은 탄수화물이 대량 함유된 개입에 대해 차별화한 반응을 보였다. 장내 생태계에 존재하는 세균의 생태적 지위 적응에 관여하는 유전특성, 그리고 숙주와 식이의 상호작용(11)을 요해하기 위해, 우리는 비피도박테리움 슈도카테눌라툼에 대해 비교유전체학연구를 진행하였다.

결과와 토론

개선된 생물 임상 매개변수와 변화된 장내 균군

개입 기간 당해 비만 아동의 생물 임상 변수는 개선되었다(도 1과 도 7). 체중이 140.1 kg에서 114.3 kg으로 줄었고, 혈장 포도당과 지질 항상성 양자가 정상 범위로 개선되었다. 개입 후, 두 가지 전신적인 염증 표지자인 C-반응단백질 (C-reactive protein, CRP)과 혈청아밀로이드A단백질(serum amyloid A protein, SAA)이 감소되었다. 아디포넥틴은 2.17 μg/ml에서 5.39 μg/ml로 향상되었고, 렙틴은 63.82 ng/ml에서 34.47 ng/ml로 감소되어, “위험” 표현형(12)이 완화되었음을 나타냈다. 또한, 혈액 내 세균 항원이 적재한 대체표지자인 지질다당류결합단백질(LBP)(13)이 감소되었다.

우리는 7개 시점(0, 15, 30, 45, 60, 75, 105일)에서 메타유전체 시퀀싱을 진행하여 각 분변 샘플당 25.2±4.8백만(평균치±s.d.)개의 고품질 페어드 엔드 리드(paired-end reads)를 획득했다. 개입 기간 장내 균군의 구성이 변화(도 2A)하고, 세 개입 단계(단계 I: 0일째부터 60일째까지, 기초 식이 개입; 단계 II: 60일째부터 75일째까지, 기초 개입+ 3번 조제법 100g 추가; 단계 III: 1번 조제법 감소 + 3번 조제법 100g 추가, 상세한 내용은 방법 참조)의 반응에 서로 다른 패턴을 나타냈다. 당해 비만 아동은 단계별 배변 빈도가 비슷(하루 평균 3 내지 4차)했고 설사는 하지 않았다. 개입 기간 군락은 다양성이 떨어지고, 이와 그룹의 변화는 일치(9)했다. 시작시점에서, 루미노코쿠스 속(Ruminococcus)과 블라우티아 속(Blautia)은 두 개의 가장 풍부한 속으로서, 각기 26.95%와 18.41%를 점했다. 동시에, 박테로이데스 속(Bacteroides)과 프레보텔라 속(Prevotella)은 낮은 풍도로, 당해 군락이 가능하게 장 유형3(14)에 속함을 나타내었다. 개입 후, 루미노코쿠스 속과 블라우티아 속은 낮은 풍도로 감소된 반면, 박테로이데스 속과 프레보텔라 속은 거의 개입 영향을 받지 않았다. 시작시점과 비교할 때, 항염균종(15, 16)과 유익한 (5) 공생세균으로 보고된 피칼리박테리움은 단계 I 에서 증가되어 15일째 풍도가 41.95%에 달했다. 앞 15일 동안 피칼리박테리움의 급격한 증가는 염증을 완화하는데 도움이 될 수 있는데, 이는 당해 단계에서 CRP는 33.37%, SAA는 50.85% 감소되었기 때문이다. 올리고당이 더욱 많이 제공될 때, 피칼리박테리움은 단계 II 와 단계 III 에서 낮은 풍도로 감소된다. 다른 한 측면에서, 올리고당(17)을 대사하기 위해 잘 준비된 락토바실러스 속은 시작시점과 단계 I 기간에 낮은 풍도를 갖다가, 단계 II부터 가장 우세적인 속의 하나로 된다. 몇몇 연구에서 락토바실러스 속 균주가 인슐린 저항에 대한 유익한 역할(18, 19)을 보고한 바 있다. 락토바실러스 속의 급격한 증가는, 이 시기 동안 OGTT 인슐린 AUC(area under the curve, 곡선 아래 면적)의 뚜렷한 감소와 안정적인 OGTT 포도당 AUC가 나타난 것과 같이, 단계 II 의 인슐린 민감성 개선에 도움이 될 수 있다. 세포내와 세포외 경로를 통해 다양한 탄수화물(20)을 대사할 수 있는 비피도박테리움의 풍도는 15일째부터 뚜렷해졌으며, 당해 아동이 기초 개입을 받을 때의 27.47%에서 75일째의 65.53%로 증가된 후, 복합식이섬유가 함유된 1번 조제법이 비교적 적게 제공될 때 36.41%로 감소된 것으로, 전체 개입 기간에 줄곧 우세적인 속을 유지하였다. 이 결과들은 비피도박테리움 군체가 세 단계에서 제공되는 탄수화물원의 변화에 반응하고, 단계별로 우세적인 생태적 지위를 점하는 것을 보여준다. 비만에 대한 비피도박테리움 균주의 알려진 유익한 작용(21, 22)과, 이전 그룹에서 연구한 상호작용 네트워크에서의 중요한 역할(9) , 그리고 개입 기간 지속된 높은 풍도를 고려하면, 이들이 체중, BMI, 허리 둘레, 엉덩이 둘레를 지속적으로 줄이는데 도움이 될 것으로 추측된다. 따라서, 우리는 당해 속에 대하여 심층된 분석을 진행하였다.

개입 후의 샘플에서 총 9종의 비피도박테리움 균종(도 8)이 검출되었다. 그 중, 비피도박테리움은 가장 우세적인 것으로, 105일째 전체 장내 균군에서의 풍도가 29.36%에 달했다. 비피도박테리움 롱검은 9.94%, 비피도박테리움 브레베는 7.61%, 비피도박테리움 아돌레센티스는 3.75%를 점하고, 다른 5개 균종의 풍도는 1%보다 낮았다.

비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주가 개입에 대한 차별화 반응

비피도박테리움 슈도카테눌라툼 군을 상세하게 연구하기 위해, 우리는 105일째부터 대상체에서 수집한 분변 샘플에서 5종 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주(이하 균주 PERFECT-2017-0001, PERFECT-2017-0002, PERFECT-2017-0003, PERFECT-2017-0004와 C95(23)로 정의됨)를 분리하고 완전한 시퀀싱(10)을 진행했다. 메타유전체 데이터를 완전한 유전체와 비교함으로써, Sigma(24)를 이용하여 이 5종 균주가 각 시점에서의 풍도 변화(도 2B)를 검출했다. 개입 전, 모든 균주는 낮은 풍도(최대치=0.5%, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0001)를 갖는다. 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0003과 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 C95의 풍도는 식이 개입에 반응하지 않는 것 같아 보이는데, 이는 전자는 전반 시험기간에 낮은 풍도를 유지하고, 후자는 단계 II 와 단계 III 기간에만 낮은 증가를 나타내기 때문이다. 이와는 대조적으로, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0001, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0004와 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0002 균주는 식이 개입에 반응하며, 이들의 풍도 변화는 비피도박테리움 속에 대한 관찰과 일치한 것으로, 이 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주들이 주로 이런 변화를 가져왔음을 나타낸다. 사실상, 개입 후 이 세 가지 균주, 특히 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0002는 뚜렷하게 증가되었다.

선행 연구(9)에서의 발견과 일치하게, 생물 임상 변수의 개선은 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주의 증가와 관련이 있다(도 3). 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 C95는 인체 측정 표지자(체중, BMI, 허리 둘레와 엉덩이 둘레)와 역상관된다. 또한, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0002도 염증표지자의 개선(렙틴의 감소와 아디포넥틴의 증가)과 관련이 있다.

비피도박테리움 슈도카테눌라툼의 범유전체 분석

다섯 개의 완전한 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 유전체 및 사용가능한 공공데이터(5개 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 유전체 약도와 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 JCM1200T의 완전한 유전체(25) 포함)를 기반으로, 범유전체 분석에는 총 11개의 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 유전체가 포함된다. 범유전체 곡선은, PERFECT-2017-0001의 생물 임상 변수는 점근 추세를 보이고, 앞 여섯 개의 반복에서 평균 생장속도는 매 유전체당 100개의 유전자로 된 후 훨씬 작은 속도(도 9A)로 감소됨을 나타낸다. 곡선은 최종 2,482개의 유전자에 달했다. 이는 추가 유전체를 더 도입하면 가능하게 범유전체 크기의 경미한 증가만 일으킴을 나타낸다. 핵심유전체 곡선은 앞 여섯 개 반복에서 더욱 뚜렷한 점근 추세 및 더욱 뚜렷한 감소(도 9B)를 나타낸다. 곡선은 최종 1,427개의 유전자에 달했다. 범유전체와 핵심유전체의 추세는, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼이 폐쇄형 범유전체를 보여주고, 여섯 개의 유전체가 비피도박테리움 슈도카테눌라툼의 기본 특징을 설명하기에 거의 충분하다는 것을 나타낸다. 이 결과들을 바탕으로, 또한 유전체 약도가 판독 불가능한 것을 피하기 위해, 이후 분석에서 우리는 여섯 개의 완전한 유전체만을 사용해 비피도박테리움 슈도카테눌라툼의 유전체 특징을 탐색했다.

비피도박테리움 슈도카테눌라툼의 일반 특징

우리의 5종 균주와 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 JCM1200T의 유전체는 평균 2,355,185 bp와 56.63 G+C%를 나타내는데, 이는 비피도박테리움 속의 G+C% 범위와 일치하다(26). 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 유전체에서 5 또는 6개의 rRNA 오페론 유전자자리가 검출되었고, 각 유전체마다 5S rRNA rRNA 유전자의 추가 복제가 하나 있었다(표 1). 또한, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 JCM1200T 유전체를 제외한 모든 유전체에 16S rRNA 유전자의 이질성이 존재한다(표 S1). 평균 54개의 tRNA 유전자가 각 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 유전체에 포함되었다.

표 1. 비피도박테리움 슈도카테눌라툼의 여섯 개 완전한 유전체의 일반 특징

표 S1. 16S rRNA 유전자의 이질성

각 유전체는 평균 1,871개의 개방형 해독틀(Open Reading Frame, ORF)로 예측되는데, 이 중 80%는 NCBI 데이터베이스에 있는 BLAST를 기반으로 인실리코 예측 기술(silico prediction)에 의해 기능적으로 할당되고, 나머지 20%는 가설 단백질(표 1)로 예측된다. COG(이종상동성 클러스터 그룹)(27)에 의해 이종상동성 유전자를 검출한데 따르면, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 유전체의 대부분 유전자가 다양한 하우스 키핑 기능(housekeeping function), 특히 탄수화물의 수송과 대사(12.54%) 및 아미노산의 수송과 대사(10.23%)에 관여하는 것으로 나타났다. 이 백분율들은 다른 비피도박테리움 유전체의 백분율들과 일치하다(28, 29).

유전체 분석을 기반으로 하고, 실험 증거의 지원에 의해, 내담즙성과 부착분자의 기능에 관여하는 기능이 포함된 비피도박테리움의 다양한 숙주 정착인자가 검출되었다. 담즙산이 생리 농도에서 항미생물 활성을 가질 수 있기에, 내담즙성은 많은 장내 세균의 정착에 중요하다. 전체 6종 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주에서 내담즙성이 부여된 담즙산염가수분해효소 및/또는 담즙산수송단백질이 검출되었다. 부착면에서, 모든 유전체는 에놀라아제와 Dnak를 암호화하는 유전자를 갖는데, Dnak는 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스(B. animalis subsp. lactis Bi07)의 플라스미노겐 결합 관련 단백질(31,32)로 판명된바 있다. 또한, 각 유전체에는, 네 개 비피도박테리움 비피둠(B. Bifidum)균주의 뮤신 결합에 관여하는 알돌전이효소(33) 및 세포외 기질(34)과의 부착을 촉진하는 것으로 보고된 혈관성 혈우병 인자 A(von Willebrand factor A)(34)를 암호화하는 유전자도 존재한다. 이 기능 유전자들의 존재는, 다른 비피도박테리움 균종과 유사하게, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼이 인간 장도에 정착 가능한 유전체 기초를 갖고 있음을 나타낸다.

비피도박테리움 슈도카테눌라툼의 유전체 마이크로다이버시티

여섯 개의 완전한 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 유전체의 염기서열 평균 유사도(average nucleotide identity, ANI)는 최소치가 97.76%이기때문에 균종 분계의 한계치(35)를 만족시킨다. 상이한 서식지로부터 분리해낸 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 JCM1200T과 비교할 때(최대 ANI = 97.80%), 같은 서식지로부터 분리해낸 균주가 약간 더 높은 유사도(비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0001, PERFECT-2017-0002, PERFECT-2017-0003, PERFECT-2017-0004와 C95, 최소 ANI= 99.88%)를 갖는 것이 관찰되었다. 이러한 결과는 모든 이런 유전체들의 고도의 신터니를 보여주며, 비록 점도표에서 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 JCM1200T와 다른 5종 균주 사이에 비교적 적은 공직선성과 일부 차이(삽입-결실 포함)가 존재하지만, 이 결과는 유전체의 점도표 비교에 의해 증실(도 5A)된다. 이런 변이의 주목할만한 실례는 세포외다당체(EPS)를 암호화하는 eps 유전자 클러스터이다. EPS는 세포에 부착된 점액층을 형성할 수 있으며, 환경에 방출될 수도 있다(36). 비피도박테리움에서 생성된 일부 EPS는 면역계통 조절, 병원체 저항, 제거제로서의 기능 및 미생물 군락 조절을 포함하는, 숙주에 이로운 다양한 활성에 잠재적으로 기여하는 것으로 간주된다(37). 비피도박테리움 슈도카테눌라툼의 각 완전한 유전체에서 하나의 eps 유전자 클러스터가 검출되었는데, 이 eps 클러스터들은 우리의 5종 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주에서와 같지만, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 JCM1200T에서 발견된 것과는 상당히 달랐다.

6종의 완전한 유전체에서 검출된 모든 ORF와 BLASTP를 비교하고, MCL 알고리즘을 이용하여 더한층 클러스터링하면, 2,115개 유전체가 존재하는 것으로 나타난다(도 5B). 이 중, 72%(1,520)는 모든 6종 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 유전체가 공유하는 것으로, 이는 비피도박테리움 슈도카테눌라툼의 핵심유전체를 대표한다. 측정된 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 유전체의 서브셋에만 존재하는 총 312개의 불필요한 유전체가 검출되었다. 61.48%를 넘는 독특한 그룹은 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 JCM1200T에 특유한 것이다. COG 할당을 기반으로 유사한 결과를 얻었으며, 6개의 완전한 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 유전체에서 1,101개의 COG 패밀리가 검출되었다. 이 중 59개 COG 패밀리는 검사된 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 유전체의 서브셋에만 존재하며, 37개의 다른 COG는 단일 균주에 독특한 것이며, 이 중 35개는 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 JCM1200T에서만 검출되었다(도 S5). 또한 46개의 COG 패밀리가 우리의 분리주에 존재하지만 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 JCM1200T 유전체에는 존재하지 않는다. 흥미롭게도, 이 차이점들에서 적어도 일부는 모바일롬 및 DNA 재배열과 관련이 있는데, 우리의 분리주가 프로파지 기능, 세포 과정 및 신호 전달과 관련된 더욱 독특한 COG를 갖고 있는 반면, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 JCM1200T는 CRISPR/Cas 계통에 관여하는 것을 포함하는 더욱 독특한 COG를 갖는다.

특히, 우리의 분리주와 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 JCM1200T는 상이한 탄수화물원에 노출된다. 전자는 프락토올리고당과 올리고이소말토오스가 포함된 식이섬유와 분말이 다량 함유된, 전곡류와 TCM 식용 식물로부터 혼합물을 공급받은, 개입을 받은 후의 아동 분변 샘플에서 비롯된 것이고, 반면 후자는 비교적 단순한 탄수화물을 섭취한 것으로 추측되는 유아의 배설물에서 분리된 것이다. 이에 따라, 탄수화물 수송과 신진대사에 관여한 유전변이, 예컨대 COG0383(α-만노시다아제)이 결여된 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 JCM1200T, COG3594(푸코오스4-0-아세틸레이스 또는 관련 아세틸 전달효소), COG4209(ABC형 다당류수송시스템, 투과효소 구성물질)와 COG4214(ABC형 자일로스 수송시스템, 투과효소 구성물질)가 발견되었는데, 독특하게 COG1554(트리할로오스와 맥아당 가수분해효소(포스포릴라아제가 있을 수 있음))가 있었다.

핵심 COG의 상이한 복제 수는 비피도박테리움 슈도카테눌라툼의 마이크로다이버시에 도움이 된다. 각 완전한 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 유전체의 1, 005개 핵심 COG에서, 다양한 기능 유형에 관여하는 51개 COG는 복제 수에 있어서 적어도 2개의 복제가 다르다(도 6). 이 COG들의 분포에 따르면, 우리의 5종 균주와 비교할 때 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 JCM1200T가 가장 달랐다.

이전 연구에서는 같은 서식지의 같은 균종에서 유래된 상이한 균주의 마이크로다이버시가 보고되었다(38-40). 우리의 5종 비피도박테리움 카테눌라툼 균주에서, 그 차이는 독특 및/또는 불필요한 COG의 존재/부재에서의 차이가 아니라, 특정 핵심 COG 패밀리에 할당된 유전자의 복제 수의 차이에서 비롯되는 것으로 보여졌다. 클러스터링 결과(도 6)는 균주가 탄수화물 개입에 대한 차별 반응과 일치하다. 이런 상황에서, 개입 영향을 거의 받지 않은 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 C95과 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0003은 3종 반응 균주와 명확하게 분리되었으며, 개입에 적당한 반응을 갖는 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0001과 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0004 양자는 한 그룹에 배치되고, 개입에 가장 잘 반응하는 균주인 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0002를 다른 4종 균주와 더한층 분리시킬 수 있지만, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0001 및 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0004와 가장 유사하다.

탄수화물 수송과 대사에 있어서, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0002는 COG2814(예측된 아라비노오스 유출 투과효소, MFS 패밀리)와 COG3250(β-갈락토시다아제/β-글루쿠로니데이스)의 최고 복제 수를 갖는다. 또한, 5종 균주에서, 106 ± 2(평균치 ± s.d.)개의 ORF가 탄수화물 활성효소(CAZy) 유전자로 검출되어, 41개 CAZy 패밀리를 차지했다. 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0002 유전체는 검출된 전체 CAZy 패밀리를 가지며, 이 유전자들의 최대 복제 수를 갖는다. 이는 또한 탄수화물 에스테라아제를 암호화하는 유전자의 최대 복제 수를 갖는데, 상기 효소는 식물다당류를 탈아세틸화하여 복잡성을 극복하게 하고, 식물다당류의 분해에서 글리코사이드 하이드로레이즈와 협동한다(41). 추측에 따르면, 이 특징들은 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0002가 식이 개입 반응에 대한 주요한 차이를 조성하는 것으로서, 이는 전체 비피도박테리움 슈도카테눌라툼의 50%를 초과하며, 전반 개입 기간 전체 비피도박테리움 군체에서 매우 큰 비율을 점한다.

결론

WTP 식이가 유전형 비만자의 체중을 경감하는 방법을 조사하는 이전의 연구에서, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼은 가장 풍부한 비피도박테리움 균종으로 검출되었다. 본 문서에서, 우리는 비피도박테리움 슈도카테눌라툼의 특정 균주가 식이 개입에 대한 반응 변화를 보여주며, 우리는 비교유전체학을 사용하여 이러한 동태 배후의 가능한 원인을 감별한다. 본 연구의 한 부분인 분리된 5종 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주는, 영아 분변에서 분리된 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 JCM1200^T에 상대해 일부 차이를 보여주는데, 이는 상이한 환경 매개 변수의 영향, 또는 유전체의 마이크로다이버시티를 나타난다. 우리의 5종 분리주에서 관찰된 마이크로다이버시티는 대다수가 핵심 COG 패밀리의 복제 수의 변화이며, 이 차이들은 개입 기간 5종 균주의 변화에 추측적 해석을 제공한다. 구체적으로, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0002는 유전적으로 보다 많은 다양성과 식물다당류 유전자의 보다 많은 복제 수를 가지며, 식이 개입에 반응하는 최대 풍도를 갖는다. 전반 군체가 같은 유전자 군체에 비해 더욱 광범위한 환경 조건에서 생존할 수 있기에, 다양한 균주의 공존과 분포는 직관적이다(43). 따라서, 식이 개입에 상이하게 반응하는 5종 균주의 공존은 일종 메커니즘으로서 비피도박테리움 슈도카테눌라툼과 같은 인간 장내 중요한 이로운 균종의 안정과 회복을 보장할 수 있지만, 중요한 것은, 본 연구에서 검출된 5종 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주는 또한 숙주 생물 임상 매개변수와 상이한 관련성을 가진 것으로 밝혀져, 적어도 일부 장내 균군의 변화로 인한 이로운 기능은 균주의 특이성임을 나타낸다(44). 여기서 소개된 유형에 대해 더 많은 연구를 진행하여, 장내 미생물군의 식이성 조작으로부터 얻을 수 있는 건강 이익의 충분한 잠재력이 실현되도록 할 필요가 있다.

재료와 방법

임상 연구

당해 연구는 상하이교통대학 생명과학 및 생물기술학원 윤리위원회(Ethics Committee of the School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University)의 승인(No. 2012-2016)을 받아 진행되었다. 임상시험은 중국임상시험등록센터(Chinese Clinical Trial Registry)에 등록(No. ChiCTR-ONC-12002646)되었다. 비만아동의 보호자로부터 서면동의서를 받았다.

당해 비만아동은 중국 광동성 광주시 부녀아동병원(GuangDong Women and Children Hosiptal, Guanzhou, Chian)에 입원하여 105일 동안 식이 개입을 받았다. 당해 지원자는 어떠한 운동프로그램에도 참가하지 않았다. 영양사의 조언에 따라, 적절한 양의 야채, 과일 및 견과류가 결합된 전곡류, 전통 중국 약선과 프리바이오틱스 기반의 식이(WTP 식이)(7)(식이에서 세 가지 조리된 식품, 1번 조제법, 2번 조제법과 3번 조제법은 퍼펙트(차이나)유한공사에서 제조)가 투여되었다. 개입은 세 단계로 나뉜다. 단계 I (0일째부터 60일째까지)에서, 당해 아동은 기초 개입을 받았다(9). 단계 II (60일째부터 75일째까지)에서, 당해 아동은 3번 조제법 100g을 더 소모했다. 단계 III (75일째부터 105일째까지)에서, 당해 아동은 3번 조제법 100g을 더 소모했지만, 보다 적은 1번 조제법이 제공되었다.

7개 시점(0, 15, 30, 45, 60, 75와 105일)에서 생물 샘플, 인체 측정 데이터와 임상 실험실 분석을 얻었다. 생체 임상 매개변수의 측정 결과는 우리의 이전 연구(9)와 같았다.

메타유전체 시퀀싱과 분석

이전에 설명(45)한 바와 같이, 분변 샘플에서 DNA를 추출하여 메타유전체 시퀀싱에 사용한다. 상하이Genergy생물기술유한공사(Shanghai Genergy Bio-technology Co., Ltd)에서 Illumina Hiseq 2000 플랫폼을 이용하여 7개 샘플을 시퀀싱했다. DNA 라이브러리 제조는 Illumina 설명서를 따른다. 공급업체에서 지시한 작업과정에 따라, 클러스터 생성, 템플릿 혼성화, 등온 증폭, 선형화, 차단 및 변성, 그리고 시퀀싱 시발체의 혼성화가 수행되었다. 라이브러리를 구축한 다음, 정방향과 반대방향으로 대용량 시퀀싱을 진행하여, 151 bp의 페어드 엔드 리드를 얻는다.

Flexbar(46)를 이용하여 리드의 어댑터를 트리밍한다. Prinsq(47)를 이용하여, a)3' 엔드에서 질량 한계치 20에 도달할 때까지 첫 번째 뉴클레오티드 리드를 자르고, b)리드가 75 bp보다 짧거나 염기를 포함하는 경우 리드 페어를 제거하며, c)리드의 중복을 제거한다. 인간 유전체(H. sapiens, UCSC hgi9)와 정렬될 수 있는 리드를 제거한다(재배열 - hd 없음 - 불포함 - 더브테일을 이용하여 Bowtie2(48)와 정렬)(^-reorder --no-hd --no-contain --dovetail). 샘플당 평균 25,3土4.1백만만(평균치 ± s,d.)의 페어드 엔드 리드를 보류하여 추가 분석에 사용한다.

105일째에 MetaPhlan(49)(--bt2_ps의 매우 민감한 국부)을 이용하여 비피도박테리움 균종의 풍도를 계산한다. Sigma를 이용하여 5종 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주의 풍도(24)를 계산한다.

메타유전체 시퀀싱과 데이터 어셈블리

PacBio RS II 시퀀싱 기기에 의해 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0001, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0002, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0003, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 PERFECT-2017-0004와 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 C95의 유전체를 시퀀싱하는데, 각각 약 245, 415, 285, 459와 198배의 폴드 커버리지를 갖는다(Nextomics Biosciences, Wuhan 430000, China). HGAP/Quiver(50)를 이용하여 신규로 서브리드를 에셈블리한 다음은 miniums2(51)와 Quiver이다. 각 균주를 그 염색체에 대응되는 하나의 콘티그로 어셈블리한다.

일반 특징 예측

개방형 해독틀(Open Reading Frame)의 예측은 ProDigal v2_60(52)와 BLAST 비교의 결합에 의해 수행되었다. 그리고 NCBI nr 데이터베이스에서 BLAST를 이용하여 검출된 ORF에 주석을 달았다. Rnammer v1.2(53)를 이용하여 리보솜 RNA 유전자를 검측했으며, tRNAscan-SE v. 14(54)를 이용하여 수송 RNA 유전자를 검출했다. USEARCH v8.0.1517(55)을 이용하여 전체 16S rRNA 유전자 사이 단위 행렬을 계산했다. COG의 할당은 COGtriangles(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/wolf/COGs/COGsoft/)에서 완성되었다.

범유전체 계산

PGAPv1.12(56)를 이용하여 비피도박테리움 슈도카테눌라툼의 범유전체를 계산했다. GF(Gene Family, 유전자 패밀리)방법을 이용하여 기능적 유전자 클러스터링을 진행한 다음, 범유전체 프로파일을 구축했다.

유전체 비교

MUMmer v3.0(57) 소프트웨어 패키지를 이용하여, 뉴클레오티드 수준에서 전체 유전체 시퀀스 비교를 진행했다. 각 유전체 쌍에 대해, Jspecies 버전1.2.1(35) 프로그램을 이용하여 염기서열 평균 유사도(ANI)를 계산했다. 단백질 수준에서 BLASTP(각 단백질, 최대 E값 1e-10, 최소 대비 동일성 50%, 최소 대비 비율 50%)를 이용하여 모든 방식(all against all way)으로 시퀀스를 비교한 다음, PGAP v1.12에서 마르코프 클러스터 알고리즘(Markov Cluster Algorithm, MCL)을 이용하여 유전자 패밀리로 클러스터링했다.

세포외다당체(Exoplysaccharide, EPS) 유전자 클러스터의 검출

Bifido-eps 클러스터의 인실리코 예측 기술 분석은, 각 유전체(37)에서 추정되는 프라이밍-GTF(p-gtf) 유전자인 rfbP(NP_695444)와 cpsD(NP_695447)를 검색한 다음, p-gtf 주변의 유전자를 수동으로 검사하여 수행되었다.

탄수화물 활성화 효소(CAZys)의 검출

dbCAN v3.0(58)의 현지 버전 데이터 베이스를 다운로드했다. HMMscan(59)을 이용하여 각 유전체의 유전자를 데이터 베이스와 비교한다. dbCAN이 제공한 hmmscan-parser.sh를 이용하여 비교를 분석하고, 최상의 적중을 보류한다.

데이터와 재료의 가용성

본 연구에서 생성된 모든 유전체와 메타유전체 데이터는 수탁번호 PRJEB18557로 유럽뉴클레오티드기록보관소(European Nucleotide Archive, ENA)(www.ebi.ac.uk/ena)에 기탁되었다. 우리가 분석하는 비피도박테리움 슈도카테눌라툼에 이용되는 모든 다른 유전체는 수탁번호 AP012330.1, CDPW00000000.1, ABXX02000001, JEOD01000001, JGZF01000001로 NCBI 데이터 베이스에서 다운로드되며, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 D2CA는 MetaHIT(http://www.sanger.ac.uk/resources/downloads/bacteria/metahit/)에서 다운로드된다.

이상의 명세서에 언급된 모든 출판물은 본 문서에 편입되어 참고로 된다. 본 발명의 범위와 사상을 벗어나지 않는 한, 기재된 본 발명 방법과 시스템의 다양한 수정과 변화는 당업자들에게 명백할 것이다. 구체적인 바람직한 실시방안과 결합하여 본 발명을 설명했지만, 보호를 청구하는 발명은 부당하게 이러한 구체적인 실시방안에만 한정되지 말아야 한다는 것이 이해되어야 할 것이다. 실제로, 생물화학과 생물기술 또는 관련 분야의 기술자에게 있어서 명백한, 본 발명의 실현방식에 대한 다양한 수정은 다음과 같은 청구범위에 포함되어야 할 것이다.

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Claims

(1) 수탁번호가 XXX인 Perfect-2017-0001, 수탁번호가 XXX인 Perfect-2017-0002, 수탁번호가 XXX인 Perfect-2017-0003, 수탁번호가 XXX인 Perfect-2017-0004로부터 선별된 비피도박테리움 슈도카테눌라툼(Bifidobactgerium pseudocatenulatum) 균주;
(2) 이로부터 파생된 균주; 및
(3) 약제학적으로 허용되는 담체 또는 음식담체를 포함하는 조성물.
청구항 1에 있어서,
수탁번호가 XXX인 Perfect-2017-0001 균주를 포함하는 조성물.
청구항 1에 있어서,
수탁번호가 XXX인 Perfect-2017-0002 균주를 포함하는 조성물.
청구항 1에 있어서,
수탁번호가 XXX인 Perfect-2017-0003 균주를 포함하는 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 조성물은, 약물 조성물인 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 조성물은, 영양보충제 또는 영양조성물인 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 조성물은, 그램 당 또는 밀리미터 당 조성물에 적어도 10³ 내지 10¹⁴개의 균락 형성 단위인 상기 균주 또는 매우 유사한 균주를 포함하는 조성물.
청구항 5에 있어서,
락토바실러스 뮤코세(Lactobacillus mucosae)를 더 포함하는 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 조성물은, 상기 균주 또는 매우 유사한 균주의 세포 구성물질, 대사산물, 분비된 분자 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 조성물.
청구항 1에 따른 상기 조성물을 제조하는 방법에 있어서,
상기 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 균주 또는 매우 유사한 균주를 적당한 조성물로 조제하는 방법을 포함하는 방법.
청구항 10에 있어서,
상기 조성물은 상기 균주와 락토바실러스 뮤코세 균주를 더 포함하는 방법.
과체중, 비만, 고혈당증, 당뇨병, 지방간, 이상지질혈증, 대사증후군, 비만 또는 과체중 대상체에서의 감염 및/또는 지방세포의 비대에서 선별된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 있어서,
필요한 대상체에게 청구항 1에 따른 조성물을 투여하는 방법을 포함하는 방법.
청구항 12에 있어서,
상기 조성물은 상기 균주와 락토바실러스 뮤코세 균주를 포함하는 방법.
필요한 대상체에서 단순성 비만 또는 유전형 비만을 낮추고, 대사 악화를 완화하거나 또는 염증과 지방 축적을 낮추는 방법에 있어서,
필요한 대상체에게 청구항 1에 따른 조성물을 투여하는 방법을 포함하는 방법.
청구항 14에 있어서,
상기 조성물은 락토바실러스 뮤코세 균주를 더 포함하는 방법.
건강한 장내 생태계 구조를 확정하는 기초 균종을 만들어, 발병 세균과 유해 세균에 불리한 장내 환경을 조성하고, 미처리 대조군에 대하여 장내세균이 장내 내용물에서의 농도를 낮추는 방법에 있어서,
필요한 대상체에게 청구항 1에 따른 조성물을 투여하는 방법을 포함하는 방법.
청구항 16에 있어서,
상기 조성물은 상기 균주와 락토바실러스 뮤코세 균주를 더 포함하는 방법.
필요한 대상체에서 당뇨병을 치료하는 방법에 있어서,
필요한 대상체에게 청구항 1에 따른 조성물을 투여하는 방법을 포함하는 방법.
청구항 18에 있어서,
상기 당뇨병은, II 형 당뇨병인 방법.
청구항 14에 있어서,
상기 비만은, 단순성 비만인 방법.
청구항 14에 있어서,
상기 대상체가 프라더-윌리증후군을 앓고 있는 방법.