CN111979145B

CN111979145B - 人源的粘膜乳杆菌及其用途

Info

Publication number: CN111979145B
Application number: CN202010790851.6A
Authority: CN
Inventors: 张晨虹; 姜天翌; 赵立平
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-08-07
Filing date: 2020-08-07
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2040-08-07
Also published as: CN111979145A

Abstract

本发明提供了人源的粘膜乳杆菌及其用途。具体地，本发明提供了一种人源的粘膜乳杆菌。本发明还提供了用于治疗和预防肥胖及其相关疾病的组合物，以及降低体重和/或血脂的方法。实验表明，本发明的粘膜乳杆菌可降低血脂，降低动脉粥样硬化，从而可用于治疗和预防肥胖以及肥胖相关疾病(如心血管疾病)中的应用。

Description

人源的粘膜乳杆菌及其用途

技术领域

本发明涉及微生物领域。具体地，本发明涉及人源粘膜乳杆菌 (Lactobacillusmucosae)及其用途，包括在治疗和预防肥胖及其相关疾病中的应用。

背景技术

肥胖是一种系统性的慢性代谢性疾病，通常伴随着脂代谢异常、糖稳态失衡和慢性炎症等等。肠道菌群与肥胖的发生密切相关，失衡的肠道菌群是诱发肥胖的重要因素。随着组学技术的发展，那些与肥胖发展相关的肠道微生物不断被发掘，成为肥胖治疗的潜在有效靶点。

药物治疗是目前主要的临床治疗肥胖及其肥胖相关疾病(如糖尿病)的方法。药物治疗的机制包括抑制食欲、增加能量消耗、刺激脂肪移动、降低甘油三酯合成和抑制脂肪吸收。目前虽然有一些药物用于治疗肥胖及其肥胖相关疾病，但是这些药物也常常有一些副作用。某些病人的高血脂通过饮食和/或锻炼疗法或使用治疗化合物仍然不能得到适当控制。使用药物还可能发生对药物的局部或全身过敏或免疫抗性。

目前本领域还没有一种有效的、副作用小的治疗和预防肥胖及其相关疾病的方法和药物。因此本领域迫切需要开发一种新的、安全有效的用于治疗和预防肥胖及其相关疾病的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的、安全有效的用于治疗和预防肥胖及其相关疾病的药物。

具体地，本发明提供了一种人源的粘膜乳杆菌及其在治疗和预防肥胖等疾病方面的应用。

在本发明第一方面，提供了一种人源粘膜乳杆菌，所述的人源粘膜乳杆菌的 16srDNA的序列如SEQ ID NO.:5所示或与SEQ ID No:5所述的序列的相同性≥ 99.9％。

在另一优选例中，所述人源粘膜乳杆菌为人源粘膜乳杆菌为粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)A1菌株，保藏号为CCTCC NO:M2020401。

在另一优选例中，所述的人源粘膜乳杆菌包括原代的保藏菌株或其传代的菌株或培养的菌株。

在另一优选例中，所述的传代的菌株或培养的菌株与保藏菌株具有相同的遗传特性。

在本发明第二方面，提供了一种组合物，所述组合物包括：(a)安全有效量的本发明第一方面所述的粘膜乳杆菌和/或其代谢产物；以及(b)食品上可接受的载体或药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述组合物选自下组：食品组合物、膳食补充剂组合物 (dietsupplemental composition)、保健组合物、药物组合物。

在另一优选例中，所述的组合物为口服制剂。

在另一优选例中，所述的组合物为液态制剂、固态制剂、半固态制剂。

在另一优选例中，所述的组合物的剂型选自下组：粉末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、和滴剂。

在另一优选例中，所述的食品组合物包括乳品、乳粉、溶液制品、粉末制品、或悬浮液制品。

在另一优选例中，所述的液态制剂选自下组：溶液制品或悬浮液制品。

在另一优选例中，所述组合物含有1×10³-1×10¹⁸cfu/mL或cfu/g，较佳地 1×10⁴-1×10¹⁵cfu/mL或cfu/g，更佳地1×10⁶-1×10¹²cfu/mL或cfu/g的 Lactobacillusmucosae A1菌株，按所述组合物的总体积或总重量计。

在另一优选例中，所述的组合物中，含有0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-90wt％所述的粘膜乳杆菌和/或其代谢产物，以所述组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述的组合物为单元剂型(一片、一粒胶囊或一小瓶)，每个单元剂型中所述组合物的质量为0.05-10g，较佳地为0.1-2g。

在另一优选例中，所述的组合物还含有其它益生菌和/或益生元。

在另一优选例中，所述的益生菌选自下组：乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、或其组合。

在另一优选例中，所述的益生元选自下组：低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖 (GOS)、低聚木糖(XOS)、低聚乳果糖(LACT)、大豆低聚糖(SOS)、菊粉(Inulin)、或其组合。

在本发明第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述粘膜乳杆菌、或本发明第二方面所述组合物的用途，用于制备药物，所述药物用于选自下组的一种或多种用途：

(a)预防和/或治疗肥胖；

(b)降低血脂；

(c)预防或治疗心血管疾病；和/或

(d)预防和/或治疗糖尿病。

在另一优选例中，所述心血管疾病选自下组：动脉粥样硬化、高脂血症、或其组合。

在另一优选例中，所述药物用于减少哺乳动物的动脉粥样硬化斑块面积占总管腔面积比。

在另一优选例中，所述的动脉包括心脏主动脉。

在本发明第四方面，提供了一种本发明第一方面所述粘膜乳杆菌或本发明第二方面所述组合物的用途，它们被用于制备药物或制剂，所述药物或制剂用于： (i)降低哺乳动物血液和肝脏中甘油三酯的水平；和/或(ii)降低脂肪组织、肝脏和主动脉窦的脂质积累。

在另一优选例中，所述的药物或制剂还独立地或额外地用于选自下组的一种或多种用途：

(iii)抑制哺乳动物的体重增长；

(iv)降低哺乳动物的体脂比(脂肪重量/体重之比)；

(v)缓解哺乳动物的脂代谢异常；

(vii)降低哺乳动物中的血脂水平。

在另一优选例中，所述哺乳动物包括人、啮齿动物(如大鼠、小鼠)。

在另一优选例中，所述降低哺乳动物的血脂水平包括降低甘油三酯的水平。

在本发明第五方面，提供了一种本发明第二方面所述组合物的制法，包括步骤：

将本发明第一方面所述的粘膜乳杆菌和/或其代谢产物、与食品上可接受的载体或药学上可接受的载体混合，从而形成本发明第二方面所述的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物为口服制剂。

在本发明第六方面，提供了一种生产方法，包括步骤：

(a)在适合培养的条件下，对本发明第一方面所述的粘膜乳杆菌进行培养，从而获得培养产物；

(b)任选地，从所述培养产物分离粘膜乳杆菌的菌体和/或其代谢产物；和

(c)任选地，将上一步骤分离获得的粘膜乳杆菌的菌体和/或其代谢产物与食品上可接受的载体或药学上可接受的载体混合，从而制得组合物。

在本发明第七方面，提供了一种降低体重和/或血脂的方法，给所述对象施用本发明第一方面所述的粘膜乳杆菌或本发明第二方面所述的组合物。

在另一优选例中，所述的施用包括口服。

在另一优选例中，所述的施用剂量为0.01-5g/50kg体重/天，较佳地， 0.1-2g/50kg体重/天。

在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，如人。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)A1菌株的ERIC PCR图谱。

图2显示了本发明粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)A1菌株16S rRNA 基因全长序列的进化树。

图3显示了粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)A1菌株的生长曲线。

图4显示了ApoE^-/-小鼠动物的实验方案。

图5显示了粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)A1菌株能够减轻西方饮食(WD)环境下ApoE^-/-小鼠的体重和脂肪积累。其中,A图显示了实验最终时刻各组小鼠的体重增长率；B图显示了各组小鼠脂肪组织重量占体重比；C图显示了各组小鼠在实验4/8/13周时血清中总胆固醇含量；D图显示了各组小鼠在实验4/8/13周时血清中甘油三酯含量；E图显示了各组小鼠脂肪细胞横截面积大小；F图显示了各组小鼠具有代表性的附睾脂肪HE染色切片照片(比例尺： 100μm)。

图6显示了粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)A1菌株能够减缓西方饮食环境下ApoE^-/-小鼠的肝脏脂肪变性程度。其中，A图显示了各组小鼠肝脏重量占体重比；B图显示了各组小鼠肝脏总胆固醇含量；C图显示了各组小鼠肝脏甘油三酯含量；D图显示了各组小鼠肝脏脂肪变性指数；E图显示了各组小鼠具有代表性的肝脏HE染色切片照片(比例尺：100μm)。

图7显示了粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)A1菌株的扫描电镜照片 (比例尺：5.00μm)。

图8显示了粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)A1菌株对鼠主动脉窦脂质积累的影响。A图显示了各组小鼠心脏主动脉窦切片的动脉粥样硬化斑块面积染色图；B图显示了各组小鼠心脏主动脉窦切片的动脉粥样硬化斑块面积占总管腔面积比。

各图中，WD表示西方饮食；NC表示阴性对照；LM表示给予粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)A1菌株。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究和实验，通过大量筛选，首次分离获得了一种人源的粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)。本发明人研究意外地发现，该人源的粘膜乳杆菌具有预防和治疗肥胖及其相关疾病(如心血管疾病)的作用。实验表明，将含有本发明粘膜乳杆菌的活性组合物饲喂食小鼠，能够显著抑制体重增加，降低血脂，降低肝脏和主动脉窦的脂质积累，从而有效治疗和预防肥胖及其相关疾病(如心血管病症等)。在此基础上完成本发明。

具体地，经本发明菌株治疗的被投喂可导致肥胖的高脂肪高胆固醇的西方饮食的ApoE^-/-基因背景的C57BL/6J雄性小鼠，与未接受治疗的对照组相比，其体重增加幅度减缓且血脂下降，并且各种与肥胖或心血管疾病相关的指标也下降，如血清甘油三酯、肝脏甘油三酯。因此，所述本发明菌株能够用于预防和治疗肥胖及由肥胖引起的疾病，如心血管疾病等。

术语

如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有” 中。

如本文所用，所述“体脂比”是指脂肪重量/体重的比值。

粘膜乳杆菌及其应用

如本文所用，术语“本发明菌株”、“本发明的粘膜乳杆菌”，“本发明的乳杆菌”、“本发明的人源粘膜乳杆菌”可互换使用，指分离自人的粘膜乳杆菌(Lactobacillusmucosae)A1菌株。应理解，所述术语还包括原代的粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)A1菌株(原始菌株)或其传代的菌株或培养的菌株，只要这些传代或培养的菌株与原始菌株具有相同或基本相同的遗传特性和/或相同或基本相同的生理功能，例如(i)抑制体重增加；(ii)降低血脂；和(iii)降低体脂比的能力。

在一个优选例中，本发明的粘膜乳杆菌是分离自人的粪便中。

典型地，本发明的粘膜乳杆菌具有以下生理特性：扫描电镜观察菌株呈现 (2.3-3.0)×(0.6-0.7)μm的杆状结构，没有鞭毛或其他附属物。

本发明的粘膜乳杆菌可在MRS培养基进行厌氧培养，通常至约11h到达平台期，平台期菌液的菌体可达2.2×10⁸CFU/100μL。此外，MRS培养基的pH 值也随着菌株的生长而降低，例如从约5.66降至约4.33。

组合物及其应用

本发明的研究表明，本发明的粘膜乳杆菌具有(i)抑制体重增加；(ii)降低血脂；和(iii)降低体脂比的能力。

因此，本发明还提供了本发明的粘膜乳杆菌的应用，包括用于治疗和预防肥胖及其相关疾病(如心血管疾病)。

本发明还提供了一种用于所述应用的组合物，优选地，所述组合物包括食品组合物、膳食补充剂组合物(diet supplemental composition)、保健组合物、药物组合物。

本发明的所述组合物包括有效量的粘膜乳杆菌，在一个优选例中，所述组合物还包括选自下组的益生菌：乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、或其组合；并且所述组合物还包括选自下组的益生元：低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、低聚乳果糖(LACT)、大豆低聚糖(SOS)、菊粉(Inulin)、或其组合。

在一优选例中，所述的组合物为液态制剂、固态制剂、半固态制剂。

在一优选例中，所述的液态制剂选自下组：溶液制品或悬浮液制品。

在一优选例中，所述的组合物的剂型选自下组：粉末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、和舌下含片。

本发明药物组合物可以以药物片剂，针剂或胶囊的任一种形式给药，所述药物制剂包括赋形剂、药物允许的媒介和载体，这些物质可根据给药途径进行选择。本发明中药物制剂可进一步包含辅助的活性组份。

乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油等都可用作本发明中药物组合物的载体、赋形剂或稀释剂等。

此外，本发明的药物组合物可进一步包括润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂、防腐剂、甜味剂和香料等。本发明的药物组合物可通过多种公知的方法以肠衣制剂生产，以便于药物组合物的活性成分即微生物能顺利通过胃而不被胃酸所破坏。

另外，本发明的微生物可以常规方法制备的胶囊形式使用。例如，标准赋形剂和本发明的冷干微生物混合制成小球药丸，然后将药丸装填入明胶胶囊中。此外，本发明的微生物和药物允许使用的赋形剂如液体胶、纤维素、硅酸盐或矿物油等混合制作悬浮液或分散液，这种悬浮液或分散液可装入软的明胶胶囊中。

本发明的药物组合物可制成肠衣片供口服使用。本申请中的术语“肠衣”，包括所有常规药物允许使用的包衣，这些包衣不被胃酸降解，但在小肠中能充分分解并快速释放出本发明的微生物。本发明的肠衣能在合成胃酸如pH＝1的 HCl溶液中在36-38℃维持2小时以上，并优选在合成肠液如pH＝7.0的缓冲液中在1.0小时内分解。

本发明的肠衣为以每片约16-30mg进行包衣，较佳地16-25mg，更佳地 16-20mg进行包衣。本发明中肠衣厚度为5-100μm，理想的厚度为20-80μm。肠衣成分选自己公开知晓的常规聚合物。

本发明优选的肠衣由纤维素乙酸邻苯二甲酸酯聚合物或偏苯三酸酯聚合物以及异丁烯酸的共聚物(例如，含有40％以上异丁烯酸和含有甲基纤维素邻苯二甲酸羟丙酯或其酯类衍生物的异丁烯酸的共聚物)制备。

本发明中肠衣所使用的纤维素乙酸邻苯二甲酸酯的粘度为约45-90cp，乙酰含量17-26％，邻苯二甲酸含量30-40％。用于肠衣中的纤维素乙酸偏苯二酸酯粘度为约5-21cs，乙酞含量17-26％。纤维素乙酸偏苯三酸酯由Eastman科达公司生产，可用于本发明中的肠衣材料。

用于本发明肠衣中的羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酷，分子量一般为20, 000-130,000道尔顿，理想分子量为80,000-100,000道尔顿，羟丙基含量为5-10％，甲氧基含量为18-24％，邻苯二甲酰基含量为21-35％。

用于本发明肠衣中的羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酷为HP50，由日本 Shin-EtsuChemidnl Co.Ltd.生产。HP50含有6-10％羟丙基，20-24％甲氧基， 21-27％的丙基，其分子量为84,000道尔顿。另一种肠衣物质为HP55，HP55 含有5-9％的羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，18-22％甲氧基，27-35％的邻苯二甲酸，其分子量为78,000道尔顿。

本发明肠衣如下制备：使用常规方法将肠衣溶液喷雾到核心上。该肠包衣方法中所有溶剂为醇类(如乙醇)、酮类(如丙酮)、卤代烃化合物(如二氯甲烷)、或其组合物。将软化剂如二-正丁基邻苯二甲酸酯和三乙酸甘油酯加入到肠衣溶液中，其比例为1份包衣物对约0.05份或约0.3份软化剂。喷雾方法优选连续执行，所喷雾的料量可根据包衣所采用的条件进行控制。喷雾压力可随意调节，一般而言，能在平均1-1.5巴压力下获得理想的结果。

说明书中“药物有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。比如，在本发明中，可制备含有1×10³-1× 10¹⁸cfu/ml(特别的，可含有1×10⁴-1×10¹⁵cfu/mL；更特别地，可含有1×10⁶-1× 10¹²cfu/ml)的粘膜乳杆菌和/或其代谢产物的制剂。

当用于制备药物组合物时，所用的本发明粘膜乳杆菌或其代谢产物的有效剂量可随施用的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体密切混合的约1×10-1× 10¹⁸cfu/ml(特别的，可含有1×10⁴-1×10¹⁵cfu/mL；更特别地，可含有1×10⁶-1× 10¹²cfu/ml)的活性粘膜乳杆菌或发酵产生的活性成分。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

所述的粘膜乳杆菌或其代谢产物可通过口服等途径给予。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括：培养基、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合粘膜乳杆菌或其代谢产物特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。

从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。口服给药是优选的。

将本发明组合物施用给所述个体，每天给药1次或多次。给药剂量单位表示其形式上能分开且适用于人类或其他所有哺乳动物个体的剂量。每一单位含有药物允许的载体和有效治疗量的木发明微生物。给药量随病人的体重和肥胖严重程度、所包括的补充活性组份和所使用的微生物而变化。此外如可能，可分开给药，并且如需要可连续给药。因此，所述给药量不会对本发明造成限制。此外，本发明中的“组合物”不仅意味着药品而且表示可作为功能性食品和健康补充食品。在一个优选例中，所述组合物包括：食品组合物、保健组合物、药物组合物等。

在一优选例中，所述的食品组合物包括乳品、乳粉、溶液制品、粉末制品、或悬浮液制品。

在一优选例中，所述组合物含有1×10³-1×10¹⁸cfu/mL或cfu/g，较佳地1 ×10⁴-1×10¹⁵cfu/mL或cfu/g，更佳地1×10⁶-1×10¹²cfu/mL或cfu/g本发明的粘膜乳杆菌，按所述组合物的总体积或总重量计。

在一优选例中，所述的组合物中，含有0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-90wt％所述的粘膜乳杆菌和/或其代谢产物，以所述组合物的总重量计。

在一优选例中，所述的组合物为单元剂型(一片、一粒胶囊或一小瓶)，每个单元剂型中所述组合物的质量为0.05-10g，较佳地为0.1-2g。

本发明所述的组合物(包括药物组合物等各种不同的组合物)可以用于：(a) 预防和/或治疗肥胖；(b)降低血脂；和/或(c)预防或治疗心血管疾病。

在一优选例中，本发明的组合物还可以用于制备药物或制剂，所述药物或制剂用于(i)降低哺乳动物血液和肝脏中甘油三酯的水平(ii)降低脂肪组织、肝脏和主动脉窦的脂质积累。

(iii)抑制哺乳动物的体重增长；

(iv)降低哺乳动物的体脂比(脂肪重量/体重之比)；

(v)缓解哺乳动物的脂代谢异常；

(vii)降低哺乳动物中的血脂水平。

在另一优选例中，所述降低哺乳动物的血脂水平即甘油三酯水平。

优选地，本发明的粘膜乳杆菌或组合物可用于降低体脂和/或减缓脂质积累。

优选地，本发明的粘膜乳杆菌或组合物可用于降低体重和/或血脂。

粘膜乳杆菌的生产方法

本发明还提供了一种能够大规模生产粘膜乳杆菌的方法。

典型地，本发明的生产方法包括如下步骤：

(a)在适合培养的条件下，对所述的粘膜乳杆菌进行培养，从而获得培养产物；

(b)任选地，从所述培养产物分离粘膜乳杆菌菌体和/或其代谢产物；和

(c)任选地，将上一步骤分离获得的粘膜乳杆菌菌体和/或其代谢产物与食品上可接受的载体或药学上可接受的载体混合，从而制得组合物。

降低体重和/或血脂的方法

本发明提供了一种降低哺乳动物(如人)的降低体重和/或血脂的方法，具体地，包括如下步骤：

给所述对象施用本发明所述的粘膜乳杆菌或本发明所述的组合物(包括药物组合物、食品组合物等)。

在一优选例中，所述的施用包括口服。

在本发明中，所述的施用剂量没有特别限制，典型地可以为0.01-5g/50kg 体重/天，较佳地，0.1-2g/50kg体重/天。

在一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，如人。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的粘膜乳杆菌能够显著降低体重、降低血脂、降低体脂比。

(b)本发明的粘膜乳杆菌能够显著降低与肥胖及其相关疾病(如心血管疾病)相关的指标(如甘油三酯)

(c)本发明的粘膜乳杆菌能够显著降低血液与肝脏中甘油三酯的含量。

(d)本发明的粘膜乳杆菌能够显著减轻宿主的脂质积累、缓解脂代谢异常。

(e)本发明的粘膜乳杆菌能够缓解脂肪组织、肝脏与主动脉窦的脂质积累。

(f)本发明的粘膜乳杆菌是分离自人的，具有安全性，无毒副作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York： Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照《微生物：实验手册》(James Cappuccino和Natalie Sherman编，Pearson Education 出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)A1菌株的分离鉴定

1.1人源粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)A1菌株的分离

切取0.6g GD02儿童营养干预105天后的粪便样品，于厌氧培养箱中加入 30mLRinger工作液(0.1％L-Cysteine)，涡旋震荡至充分混匀。200g离心5min，取1mL上清用Ringer(0.1％L-Cysteine)工作液进行梯度稀释。吸取10^-1-10^-5这5个稀释梯度的稀释液200μL涂布于MRS琼脂平板上，每个梯度重复涂布3 块，37℃厌氧条件下倒置培养18h。选择菌落生长较多且清晰的平板,随机挑取平板上生长的200个单菌落于MRS琼脂平板上进行两次划线纯化。

将纯化后的各单菌分离物分别接种于MRS肉汤培养基中，37℃厌养条件下培养24h，对其中DNA进行提取，具体步骤为：将菌液9000g离心5min；将沉淀的菌体悬浮于475μL1×TE缓冲液中(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0)；加入25μL 50mg/ml的溶菌酶，置于37℃摇床1.5h；溶菌酶消化后加入50μL 20％SDS和5μL蛋白酶(10mg/mL)，震荡混匀，55℃金属浴放置45min；分别用等体积的Tris-饱和酚、酚-氯仿-异戊醇(v：v：v，25：24：1)、氯仿-异戊醇(v：v，24：1)各抽提一次；加入1/10体积的乙酸钠(3mol/L，pH 5.2)调节离子浓度，再加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃冰箱沉淀过夜；15000g离心 15min，200μL 70％乙醇轻轻颠倒洗盐2次；析出的DNA进行真空冷冻抽干，并溶于50μL 1×TE缓冲液中；加入10μL RNA酶(10mg/mL)，于37℃金属浴消化30min。

以上述DNA为模板，对上述200个单菌落的16S rRNA基因V3区进行PCR 扩增，引物信息如下：

上游引物P2(SEQ ID No.:1)：

5'-AATACCGDGGCTGDTGG-3'

下游引物P3(SEQ ID No.:2)：5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'

PCR反应体系(25μL)如下：

1×PCR buffer(无Mg²⁺)，2mM MgCl₂，P2、P3引物各25pmol,四种脱氧核苷酸(dNTP)各200μM，0.75U Taq DNA聚合酶，10ng的细菌DNA作为模板。PCR 扩增程序如下：94℃变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸 30sec，共20个循环；最后72℃终延伸7min。

对上述PCR产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)，与GD02儿童干预后肠道内被富集乳杆菌对应的DGGE条带进行比对，发现200个单菌落中有91个属于干预后丰度增加的乳杆菌。

DGGE条件如下：样品16S rRNA基因V3区PCR产物在添加了变性剂的8％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳；变性剂浓度梯度为30％-60％；电泳缓冲液为1× Tris-acetate-EDTA(pH 8.4)；单菌分离物的PCR产物上样量为30ng，原始粪便样品的PCR产物上样量为250ng；60℃，200V电压条件下电泳240min；电泳结束后采用染料SYBR GREENI进行染色，使用UVI凝胶成像仪进行成像。本研究采用Bio-Rad公司的Dcode DGGE系统(Bio-Rad,Hercules,Calif.)。

将挑选出来的91个单菌落通过ERIC PCR(肠杆菌基因间重复一致序列-聚合酶链反应技术)在菌株水平上进行分型，引物信息如下：

上游引物E1(SEQ ID No.:3)：5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'

下游引物E2(SEQ ID No.:4)：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'

PCR反应体系(25μL)如下：1×PCR buffer(Mg²⁺free)，2mM MgCl2，E1、 E2引物各25pmol,四种脱氧核苷酸(dNTP)各200μM，1.5U Taq DNA聚合酶， 10ng的细菌DNA作为模板。PCR反应程序如下：94℃预变性7 min；94℃变性 60sec，52℃退火60sec，65℃延伸60sec，共30个循环；最后65℃终延伸16min。取300ng PCR产物于1.5％琼脂糖凝胶中100V条件下电泳120min，使用UVI凝胶成像系统照胶。

结果显示，91个单菌落可以被分为6种ERIC型，其中Lactobacillus mucosae A1菌株代表的E1型拥有分离物数量最多，Lactobacillus mucosae A1 菌株ERIC PCR产物电泳成像如图1所示。

1.2 16S rDNA鉴定

培养得到的Lactobacillus mucosae A1菌株，提取基因组DNA，用引物对 8f/1492r PCR扩增16S rDNA。对得到的的16S rRNA基因全长进行Sanger测序，核酸序列如下：

1.3人源粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae A1)的进化分析

利用NCBI数据库对A1菌株的16S rRNA基因全长序列进行比对分析，使用MEGA 6软件基于neighbor-joining方法构建系统发育树(如图2所示)，结果显示，本发明分离的A1菌株属于粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)。

此外，结果还显示，本发明的粘膜乳杆菌A1菌株与Lactobacillus mucosae S32菌株的16S rRNA基因相似度达到99.87％。

1.4人源粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae A1)的微生物学特征

对菌株进行扫描电镜观察。

结果如图7所示。本发明菌株呈现(2.3-3.0)×(0.6-0.7)μm的杆状结构，没有鞭毛或其他附属物。

实施例2 Lactobacillus mucosaeA1菌株的生长曲线

在本实施例中，测定该Lactobacillus mucosae A1菌株在MRS培养基中的生长曲线。

具体方法为：将-80℃冻存的Lactobacillus mucosae A1菌株于MRS平板上进行划线活化，挑取单克隆于5mL MRS液体培养基中培养过夜，按1％接种量 (v/v)转入150mlMRS液体培养基中；混匀后分装入10只15mL EP管中，每管 14ml菌液，在观察到平台期出现前大约每2小时取出一管测量OD₆₀₀值，之后大约每8小时取出一管测量OD₆₀₀值。培养过程均在厌氧环境下进行，每个生长曲线测量时间点设置3个重复，测定结果表示为平均值±标准误。

生长曲线测定结果如图3所示，Lactobacillus mucosae A1在MRS培养基中的生长于11h达到平台期，对平台期菌液进行平板涂布计数，其中菌体浓度可达2.2×10⁸CFU/100μL。MRS培养基的pH值也随着菌株的生长而降低，从 5.66降至4.33。

实施例3 Lactobacillus mucosaeA1菌株对西方饮食环境下的ApoE^-/-小鼠脂代谢异常的缓解作用

3.0实验材料:

小鼠：本实施例使用ApoE^-/-基因背景的C57BL/6雄性小鼠，小鼠饲养过程在上海交通大学实验动物中心SPF屏障内完成。ApoE(载脂蛋白E)是血浆中重要的载脂蛋白之一,参与血液中脂质运输。

菌株：实施例1所述的分离得到的Lactobacillus mucosae A1菌株

高脂饲料：高脂肪高胆固醇的西方饮食，含21％的脂肪和0.15％的胆固醇，购自上海帆泊生物技术有限公司。

正常维持饲料：含4.8％脂肪，购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司。

3.1实验方法：

将24只8-10周龄ApoE^-/-雄性小鼠随机分为3组：

第一组为NC组(阴性对照组)，分有7只小鼠，该组小鼠由正常饲料喂养并且每天灌胃200μL含有2.5％甘油的PBS缓冲液；

第二组为WD组(高脂肪高胆固醇的西方饮食组)，分有8只小鼠，该组小鼠由高脂肪高胆固醇的西方饮食饲喂并且每天灌胃200μL含有2.5％甘油的PBS 缓冲液；

第三组为WD+LM组(高脂肪高胆固醇的西方饮食+给予粘膜乳杆菌A1菌株组)，分有9只小鼠，该组小鼠由高脂肪高胆固醇的西方饮食饲喂并且每天灌胃200μL含有10⁹CFULactobacillus mucosae A1菌株的灌胃液，菌体由含有 2.5％甘油的PBS缓冲液重悬。

实验干预维持13周，实验终点采集小鼠的脂肪、肝脏、心脏、血清进行后续分析。动物实验设计如图4所示。实验数据处理的组间差异采用One-way ANOVA方法进行检验，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。

Lactobacillus mucosae A1菌株灌胃液的制备流程如下，菌株培养过程均在厌氧环境中进行：将-80℃冻存的Lactobacillus mucosae A1菌株于MRS平板上进行划线活化，挑取单克隆于5mL MRS液体培养基中培养过夜，按1％接种量(v/v)转入20ml MRS液体培养基中培养至11h，再按1％接种量(v/v)转入400ml MRS液体培养基中培养至11h；菌液6000g离心15min，去除培养基上清；PBS 缓冲液重悬菌体，8000g离心15min，去除上清，留下菌体；用2mL PBS缓冲液重悬菌体，充分混匀后分装于5mL EP管中，每管200μL,再向每管加入200 μL含50％甘油的PBS缓冲液；将EP管中的液体混匀后冻存于-80℃备用，实验过程中每天取出一管加入3600μL PBS缓冲液进行10倍稀释，混匀后给小鼠灌胃。灌胃液每两星期制备一次。

3.3实验结果：

(1)Lactobacillus mucosae A1菌株对鼠的体重和体脂的影响。

经历了13周的饮食干预，WD组较NC组小鼠的体重增长率和体脂比显著提高，而灌胃Lactobacillus mucosae A1能够减缓体重的大幅度增长并减轻宿主的脂肪积累，如图5A和5B所示。

(2)Lactobacillus mucosae A1菌株对鼠的血清甘油三酯的影响。

实验进行至4周、8周和13周(实验终点)时，采集小鼠的血清，对其中的总胆固醇和甘油三酯含量进行检测。

结果如图5C和5D所示，灌胃Lactobacillus mucosae A1能够减轻西方饮食引起的血清甘油三酯积累。

(3)Lactobacillus mucosae A1菌株对鼠脂质积累的影响。

对附睾脂肪进行苏木精-伊红(HE)染色，使用Image Pro Plus6.0软件对脂肪细胞平均横截面积大小进行统计(每只小鼠取5个不连续的100倍镜下视野)，发现WD组小鼠的脂肪细胞面积显著大于NC组，WD+LM组小鼠的脂肪细胞大小介于两组之间。

实验结果如图5E和5F所示，说明了灌胃Lactobacillus mucosae A1能够减轻宿主的脂质积累。

(4)Lactobacillus mucosae A1菌株对鼠肝脏脂质含量的影响。

除脂肪组织外，肝脏是宿主进行脂质积累的另一个重要的场所。WD+LM组小鼠的肝脏重量显著低于WD组，如图6A所示。

进一步对肝脏的脂质含量进行检测，结果如图6B和6C所示，灌胃 Lactobacillusmucosae A1菌株能够减缓宿主因西方饮食造成的肝脏甘油三酯积累。

对肝脏组织进行苏木精-伊红(HE)染色，并采用Catta等人方法 (Catta-Preta M,Mendonca L S,Fraulob-Aquino J,et al.A critical analysis of three quantitativemethods of assessment of hepatic steatosis in liver biopsies[J].virchowsarchiv,2011,459(5):477-485.) 对肝脏脂肪变性指数进行统计。

结果如图6D和6E所示，灌胃Lactobacillus mucosae A1菌株能够减轻西方饮食引起的肝脏异常脂肪变性程度。

(5)Lactobacillus mucosae A1菌株对鼠主动脉窦纸质积累的影响。

对心脏主动脉窦切片进行油红染色，对主动脉窦的油红面积进行统计。

结果如图8所示，灌胃Lactobacillus mucosae A1菌株能够减轻西方饮食引起的动脉粥样硬化(P＝0.0853)。

以上实验结果，证实灌胃Lactobacillus mucosae A1菌株能够缓解西方饮食环境下ApoE^-/-小鼠的脂代谢异常。由于血脂中的主要成份是胆固醇和甘油三酯，血浆中胆固醇和甘油三脂水平的升高与动脉粥样硬化的发生有关。因此，粘膜乳杆菌(Lactobacillusmucosae)A1菌株可降低血脂，降低动脉粥样硬化相关疾病(如心血管疾病)的相关指标。

讨论

在这项研究中，本发明人首次获得了一种具有优异性能的人源粘膜乳杆菌 A1菌株，该菌可显著改善宿主的脂代谢。人源粘膜乳杆菌A1能够减轻西方饮食喂养的ApoE^-/-小鼠的血清和肝脏中甘油三酸酯的积累，减轻小鼠动脉粥样硬化的发展。因此，粘膜乳杆菌A1作为益生菌用于改善高脂血症和动脉粥样硬化。

人源粘膜乳杆菌A1分离自接受了高膳食纤维饮食干预的人，该菌在人肠道中的丰度与宿主脂代谢的改善呈现正相关性。此外，本发明人利用动物模型对人源的粘膜乳杆菌A1改善高血脂症的功能进行了验证。

本发明中，这种基于肠道微生物与宿主生理指标相关性的益生菌开发过程，克服了传统益生菌挑选过程中以分类地位为依据、忽视菌可能在宿主体内发挥的功效的缺点，被认为是“新一代益生菌”的开发策略。在这样“新一代益生菌”的开发策略的指引下，本发明的粘膜乳杆菌A1是一种经实验证实的可改善或治疗与肠道菌群相关的疾病的益生菌。

在本发明人的实验中，西方饮食喂养的ApoE^-/-小鼠在人源粘膜乳杆菌A1 的干预下，不仅血脂下降，而且血液中的脂多糖结合蛋白(LBP)含量也降低，这反映了小鼠的内毒素血症水平被改善。脂多糖(LPS)能激活多种血管细胞和血管周围脂肪组织中表达的Toll样受体4，刺激促炎性细胞因子的释放，抑制胆固醇从巨噬细胞流出，促进泡沫细胞形成。过度的LPS渗入血循环会引发周身性的慢性炎症，并促进动脉粥样硬化的形成。减轻这种细菌抗原负荷所致的慢性炎症，可能是粘膜乳杆菌A1减轻ApoE^-/-小鼠高脂血症和动脉粥样硬化的潜在途径之一。但其分子机制仍需进一步研究。

综上所述，本发明的人源的潜在益生菌-粘膜乳杆菌A1，可改善或减轻因高脂饮食(如西方饮食)、遗传因素、环境因素、和/或缺乏锻炼等不同因素所导致的动物血脂过高(例如可显著改善ApoE^-/-小鼠的严重脂质积累)。这为开发采用粘膜乳杆菌A1作为益生菌，用以预防或治疗高血脂症和动脉粥样硬化提供了理论依据。

菌株保藏

本发明的分离的粘膜乳杆菌A1 Lactobacillus mucosae A1，已于2020 年8月7日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCC NO:M2020401。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 人源的粘膜乳杆菌及其用途

<130> P2020-1445

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aataccgdgg ctgdtgg 17

<210> 2

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg cctacgggag gcagcag 57

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtaagctc ctggggattc ac 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagtaagtga ctggggtgag cg 22

<210> 5

<211> 1499

<212> DNA

<213> 粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)

<400> 5

gatgaacgcc ggcggtgtgc ctaatacatg caagtcgaac gcgttggccc aactgattga 60

acgtgcttgc acggacttga cgttggttta ccaacgagtg gcggacgggt gagtaacacg 120

taggtaacct gccccaaagc gggggataac atttggaaac agatgctaat accgcataac 180

aatttgaatc gcatgattca aatttaaaag atggcttcgg ctatcacttt gggatggacc 240

tgcggcgcat tagcttgttg gtagggtaac ggcctaccaa ggctgtgatg cgtagccgag 300

ttgagagact gatcggccac aatggaactg agacacggtc catactccta cgggaggcag 360

cagtagggaa tcttccacaa tgggcgcaag cctgatggag caacaccgcg tgagtgaaga 420

agggtttcgg ctcgtaaagc tctgttgtta gagaagaacg tgcgtgagag caactgttca 480

cgcagtgacg gtatctaacc agaaagtcac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 540

acgtaggtgg caagcgttat ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggtttgat 600

aagtctgatg tgaaagcctt tggcttaacc aaagaagtgc atcggaaact gtcagacttg 660

agtgcagaag aggacagtgg aactccatgt gtagcggtgg aatgcgtaga tatatggaag 720

aacaccagtg gcgaaggcgg ctgtctggtc tgcaactgac gctgaggctc gaaagcatgg 780

gtagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccatgccgta aacgatgagt gctaggtgtt 840

ggagggtttc cgcccttcag tgccgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac 900

gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 960

gtttaattcg aagctacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcttgcg ccaaccctag 1020

agatagggcg tttccttcgg gaacgcaatg acaggtggtg catggtcgtc gtcagctcgt 1080

gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgttacta gttgccagca 1140

ttcagttggg cactctagtg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggta gggacgacgt 1200

cagatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggac ggtacaacga 1260

gtcgcgaact cgcgagggca agctaatctc ttaaaaccgt tctcagttcg gactgcaggc 1320

tgcaactcgc ctgcacgaag tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga 1380

atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gagagtttgc aacacccaaa 1440

gtcggtgggg taacccttcg gggagctagc cgcctaaggt ggggcagatg attagggtg 1499

Claims

1.一种人源粘膜乳杆菌，其特征在于，所述人源粘膜乳杆菌为粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)A1菌株，保藏号为CCTCC NO:M2020401。

2.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括：(a)安全有效量的权利要求1所述的人源粘膜乳杆菌；以及(b)食品上可接受的载体或药学上可接受的载体。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物选自下组：食品组合物、保健组合物或药物组合物。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物为膳食补充剂组合物。

5.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有1×10³-1×10¹⁸cfu/mL或cfu/g的所述的人源粘膜乳杆菌，按所述组合物的总体积或总重量计。

6.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述的组合物中，含有0.0001-99wt％所述的人源粘膜乳杆菌，以所述组合物的总重量计。

7.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还含有其它益生菌和/或益生元。

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的益生菌选自下组：乳酸菌、双歧杆菌、或其组合。

9.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的益生菌为嗜酸乳杆菌。

10.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的益生元选自下组：低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚乳果糖、大豆低聚糖、菊粉、或其组合。

11.一种权利要求1所述的人源粘膜乳杆菌或权利要求2所述组合物的用途，其特征在于，用于制备药物，所述药物用于选自下组的一种或多种用途：

(a)预防和/或治疗肥胖；

(b)降低血脂；和/或

(c)预防或治疗心血管疾病。

12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述心血管疾病选自下组：动脉粥样硬化、高脂血症、或其组合。

13.一种权利要求1所述的人源粘膜乳杆菌或权利要求2所述组合物的用途，其特征在于，用于制备药物，所述药物用于：(i)降低哺乳动物血液和肝脏中甘油三酯的水平；和/或(ii)降低脂肪组织、肝脏和主动脉窦的脂质积累。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的药物还独立地或额外地用于选自下组的一种或多种用途：

(iii)抑制哺乳动物的体重增长；

(iv)降低哺乳动物的体脂比；

(v)缓解哺乳动物的脂代谢异常。

15.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的药物还独立地或额外地用于降低哺乳动物中的血脂水平。

16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述降低哺乳动物的血脂水平包括降低甘油三酯的水平。

17.一种权利要求2所述组合物的制法，其特征在于，包括步骤：

将权利要求1所述的人源粘膜乳杆菌、与食品上可接受的载体或药学上可接受的载体混合，从而形成权利要求2所述的组合物。

18.一种生产方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在适合培养的条件下，对权利要求1所述的人源粘膜乳杆菌进行培养，从而获得培养产物；

(b)从所述培养产物分离人源粘膜乳杆菌的菌体；和

(c)将上一步骤分离获得的人源粘膜乳杆菌的菌体与食品上可接受的载体或药学上可接受的载体混合，从而制得组合物。