JP5054687B2 - 乳糖不耐症を改善するための乳酸菌 - Google Patents
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Description
本発明は、ラクトバチルス属乳酸菌から、腸管付着性およびラクトース分解酵素活性が共に増強された菌を選抜することにより、乳糖不耐症の改善能を有する乳酸菌をスクリーニングする方法に関する。
アナライト溶液(サンプル)の添加量:20μl
流速:3μl/分
反応温度:25℃
再生溶液:1Mグアニジン塩酸塩溶液 5μl
このような測定で得られた結合/解離曲線に基づき、アナライト結合後のRU値からアナライト結合前のRU値を差し引いたRU値を、アナライトである乳酸菌とプローブである各腸管ムチンとの1mm2当たりの結合量(pg)、すなわちその乳酸菌の腸管ムチンへの結合能を示す値として用いることができる。本発明では、乳酸菌の腸管ムチンへの結合能が、ヒトA型腸管ムチン、B型腸管ムチン、O型腸管ムチンのうち少なくとも1つに対して100 RU以上の値を示した場合、「腸管付着性が増強された」または「腸管付着性が高い」と判断することとする。
(2)寄託機関の連絡先:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8
(3)寄託日(原寄託日):平成18年(2006年)6月9日付
(4)受託番号および受領番号:
・ラクトバチルス・ガセリ(Lactobacillus gasseri)OLL2836株:
受託番号NITE BP-241(原寄託の受領番号NITE AP-241)
・ラクトバチルス・ガセリ(Lactobacillus gasseri)OLL2948株:
受託番号NITE BP-242(原寄託の受領番号NITE AP-242)、
・ラクトバチルス・ムコサエ(Lactobacillus mucosae)OLL2848株:
受託番号NITE BP-243(原寄託の受領番号NITE AP-243)。
本発明に係る乳酸菌は、経口投与により、生存した状態で腸に届き、腸に定着し、強力なラクトース分解酵素活性を発揮することができ、その結果として乳糖不耐症を改善することができる。また本発明に係る乳酸菌を用いて製造される発酵物では、高いラクトース分解活性によりラクトース(乳糖)の分解率が向上している。
本発明は、上記スクリーニング方法を用いて得られる腸管付着性とラクトース分解酵素活性が共に顕著に増強されたラクトバチルス属乳酸菌を含有する、飲食品にも関する。本発明の飲食品は、限定するものではないが、特に乳糖不耐症改善用の飲食品であることが特に好適である。「乳糖不耐症改善用」とは、乳糖不耐症を示しているかまたはその疑いがある被験体を投与対象とし、乳糖不耐症の不快な消化器症状(腹痛、下痢、おなかのゴロゴロ感など)が現れる頻度を低減させるかもしくは発症を完全に阻止すること、または乳糖不耐症の症状の重篤度を軽減することを目的としていることを意味する。
以下で用いる供試乳酸菌としては、明治乳業株式会社から提供を受けたヒト由来乳酸菌株、米国American Type Culture Collection(ATCC)、理化学研究所微生物系統保存施設(JCM)、農林水産省畜産試験場(NIAI)、および英国National Collections of Food Bacteria(NCFB)より入手した乳酸菌株、ならびに本発明者らにより幼児糞便より変法LBSアガーを用いて分離した乳酸菌株の合計104株を使用した。これら供試乳酸菌には、ラクトバチルス・ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、ラクトバチルス・ガセリ(Lactobacillus gasseri)、ラクトバチルス・クリスパタス(Lactobacillus crispatus)、ラクトバチルス・ジョンソニー(Lactobacillus johnsonii)、およびラクトバチルス・ムコサエ(Lactobacillus mucosae)に属する様々な菌株の他、菌種未同定の株が含まれていた。なお、菌株名にOLLまたはMEPと記載された菌株は、明治乳業株式会社保有菌株を示す。
上記の供試乳酸菌株の中から、本発明者らによって開発された腸管ムチンへの結合能を調べるアッセイ系を用いて、腸管付着性の高い(RU値が100以上)菌株を選抜した。使用したアッセイ系については国際出願WO2006/067940にも詳細に記載されている。
まず各菌株を、起菌後、MRS培地にて3回継代し、37℃で12時間培養した後、1.5ml容チューブに500μl分注した。この培養液を遠心分離(6,000rpm、4℃、10分)し、上清を除去して得た菌体をPBSバッファー(pH7.2)中で2回洗浄後、蒸留水に懸濁し、凍結乾燥した。本菌体をHBS-EPバッファー(0.01M HEPES(pH7.4)、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005% Surfactant P20)を用いて0.1mg/ml濃度に調製し、アナライト溶液とした。
ヒト腸管ムチンの調製およびセンサーチップヘの固定化を行った。ヒトA型腸管(血液型A型のヒト由来の大腸)、ヒトB型腸管(血液型B型のヒト由来の大腸)、およびヒトO型腸管(血液型O型のヒト由来の大腸)は、東北大学大学院医学系研究科より、標本採取試料として分譲を受けた。なお、この試料採取は、東北大学大学院医学系研究科の倫理委員会を経て実施し、また患者の同意を得て行われたものである。それら腸管の大腸正常部位から、粘液ムチン層を表層掻き取り法で採取した。粘液ムチン層は、Folch溶媒(クロロホルム-メタノール混液(2:1(v/v));J. Folch et al., :J. Biol. Chem. (1957) 226, p.497-500)およびジエチルエーテルにより脱脂後乾燥させ、4M塩酸グアニジン溶液により37℃で2時間抽出した。次いで、この抽出物についてゲルろ過により精製を行った。ゲルろ過精製法は、Purushothaman S. S. et al, "Adherence of Shigella dysenteriae 1 to Human Colonic Mucin." Curr. Miorobiol., 42(6), p.381-387 (2001)に記載されたヒト大腸ムチンの精製方法に基づき実施した。移動層は4M塩酸グアニジン溶液、ゲルろ過クロマトグラフィー用のカラムはToyopearl HW-65F(90cm×2.6cm, Tosoh. Tokyo. Japan)を用いた。得られたカラム抽出液について、中性糖をフェノール硫酸法(反応後に490nmの吸光度を測定する)で、タンパク質を280nmの吸光度を測定し、その結果、タンパク質吸収(280nmの吸光度)があり、かつ中性糖含量の最も高いピークを選択し、さらにゲルろ過クロマトグラフィーにおける分子量約200万以上を目安として大腸ムチン画分を分取した。こうして得られた精製物を、由来するヒトの血液型に対応して、それぞれヒトA型腸管ムチン、ヒトB型腸管ムチン、ヒトO型腸管ムチンとした。以下、それらのヒト腸管ムチン(human colon mucin:HCM)のうち、A型腸管ムチンをA-HCM、B型腸管ムチンをB-HCM、O型腸管ムチンをO-HCMと呼ぶことがある。得られた各HCMについては、それぞれの血液型のヒト血液型基質抗原性を抗原抗体反応により確認した。
バイオセンサーBIACORE1000(BIACORE社)をさらに用いて、各HCM固定化センサーチップ上のHCMと、上記アナライト溶液中の乳酸菌菌体との結合量を解析した。この解析に使用したBIACORE1000の測定条件を下記に示す。
アナライト溶液(サンプル)の添加量:20μl
流速:3μl/分
反応温度:25℃
再生溶液:1Mグアニジン塩酸塩溶液 5μl
BIOACOREシステムによる解析においては、アナライトとプローブとの結合量(相互作用)は、レゾナンスユニット(RU)を単位とした値で表される。1レゾナンスユニット(RU)とは、センサーチップの表面上1mm2当たりに物質1pgが結合したことを意味する。すなわち、この解析で得られた結合/解離曲線に基づき、結合後のRU値から結合前のRU値を差し引いた値が、アナライトである各乳酸菌とプローブである各腸管ムチンとの1mm2当たりの結合量に相当する。この結合量は、その乳酸菌と各腸管ムチンとの結合能に相当する。
以下では、腸管付着性が高く、かつ高いラクトース分解酵素活性をも有する菌株をさらに選抜することを試みた。そこで本実施例では、まず、その活性測定に用いるONPGlc-6Pの調製を行った。
フォスフォ-β-グルコシダーゼ(P-β-glc)活性の測定に用いるo-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド-6-ホスフェート(o-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside 6-phosphate;ONPGlc-6P)は、HengstenbergとMorseの合成方法(Hengstenberg, W. and M.L.Morse、Synthesis of o-Nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside 6-phosphate, Carbohydr. Res、10、 pp.463-465 (1969))の改良法に従って化学合成した。具体的には、まず、o-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド(ONPGlc、Sigma、St. Louis、USA)の0.9gを、予め氷上で冷却してから混合した54μl蒸留水と840μlのオキシ塩化リンを含むリン酸トリメチル7.5mlに溶解した。次いで本混合液を氷上で5時間撹拌しながら反応させた。反応後、氷片(蒸留水)を加え、濃アンモニア水を滴下しながらpHメーターを用いて溶液を中和(pH7.0)し、反応を停止させた。
上記で反応を停止させた溶液について、ロータリーエバポレーター(東京理科機械、東京)を用いて40℃での濃縮乾固を繰り返すことにより、反応で生じたo-ニトロフェニル(ONP)を除去した。次いで、濃縮した反応液を活性炭(50g)と混合し、4℃下で2時間静置することにより、化学合成されたONPGlc-6Pおよび未反応のONPGlcを活性炭に吸着させた後、それを20倍量の蒸留水(2L)で洗浄し、脱塩を行った。活性炭に吸着したONPGlc-6Pの溶出は、ピリジン:水:エタノール混液(1:1:1(v/v)、600ml)を用いて行った。溶出液は40℃下でのロータリーエバポレーターで濃縮を繰り返し、ピリジンの除去を行った。続いて、調製ペーパークロマトグラフィー(PPC)に供した。すなわち、PPC用濾紙(Whatman、3MM、46×57cm、Maidstone、England)上に、100μlマイクロピペットを用いて上記の粗精製ONPGlc-6Pを直線状に塗布し、展開溶媒としてブタノール:ピリジン:水(6:4:3(v/v/v))を用いて上昇法で単展開させた。2日間を要する展開終了後、ドラフトチャンバー内でその濾紙を乾燥させてから、UVトランスイルミネーター(302nm、フナコシ、東京)を用いてONPGlc-6PおよびONPGlcのバンドを確認し、ONPGlc-6Pのバンドのみを切り出した。切り出した濾紙を蒸留水に浸し、一晩、4℃で撹拌することで、ONPGlc-6Pの抽出を行った。抽出後、濾紙を除去し、水層をロータリーエバポレーターで濃縮した後、混在している反応副産物を、蒸留水を移動相とするTOYOPEARL HW40Sカラム(2.6φ×90cm、東ソー、東京)を用いたゲルろ過により除去した。ゲルろ過後、各溶出画分を薄層クロマトグラフィー(TLC、Silicagel 60、10×10cm、Merck、Darmstadt、Germany)を用いてONPGlc-6P画分を回収した。TLCの展開溶媒には、ブタノール:2−プロパノール:水(3:12:4(v/v/v))を用いて単展開した。風乾後、5%(v/v)硫酸-メタノール溶液を薄層板に均等に噴霧し、150℃に加温した乾燥器(Yamato、東京)内で3分間加熱して検出した。回収したONPGlc-6P画分の凍結乾燥を行い、精製ONPGlc-6Pとした。この精製品については、TLCにより純度を確認し、1H-NMRにより構造の確認を行った。
実施例1で調製した供試乳酸菌104株について、Fisher法を用いて、β-gal、P-β-galおよびP-β-glcのラクターゼ活性の測定を行った。すなわち、各菌株について、凍結乾燥菌体0.5mgを0.05Mリン酸緩衝液(pH6.8)1.0mlに懸濁し、トルエン-アセトン混液(1:9(v/v))50μlを加えて3分間激しく撹拌した。この懸濁液25μlに、o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド(ONPGal)、o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド-6-ホスフェート(ONPGal-6P)または上記で調製したo-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド-6-ホスフェート(ONPGlc-6P)を含む0.05Mリン酸緩衝液(pH6.8)100μlを加えて、37℃で15分間反応させた。反応後、0.5M 炭酸ナトリウム溶液125μlを加えて反応を停止させ、遠心分離(6,000×rpm、10分間、4℃)により菌体成分を除去し、上清の405nmにおける吸光度をMultiskan MS-UV(Labsystems、Helsinki、Finland)を用いて測定した。1分間に遊離するo-ニトロフェノール(ONP)1μmolを1ユニットとして定義し、該ユニットを単位として、菌体1mg当たりの活性値および培養上清に含まれるタンパク質1mg当たりの活性値をそれぞれ算出した。
上記実施例において示された腸管付着性およびβ-gal、P-β-galおよびP-β-glc活性の測定結果に基づき、腸管付着性が高く、かつラクターゼ活性も高い乳酸菌株の選抜を行った。その結果、腸管付着性が高く、かつβ-gal、P-β-galおよびP-β-glcのうちいずれかのラクターゼ活性について顕著に高い活性を示す菌株として3つの乳酸菌株(OLL2836株、OLL2948株、およびOLL2848株)が選抜された(図1〜3)。一方で、ラクターゼ活性が比較的高い乳酸菌株の多くは、腸管付着性が低い(A型、B型、O型のいずれのヒト腸管ムチンに対してもRU値が100 RU未満)ために排除される結果となった。
実施例5で選抜された3つの乳酸菌株 OLL2836株、OLL2948株およびOLL2848株について、菌種の同定を行った。同定は、V3領域の増幅・配列決定に基づく16S rDNA塩基配列解析によって行った。以下ではOLL2848株およびOLL2948株で行った同定試験を例として記載するが、OLL2836株についても基本的に同様にして同定がなされた。
OLL2848株およびOLL2948株を、MRS培地で上述の通り継代培養した後、ダイレクトPCRを行った。0.6ml容マイクロチューブにミリQ水を4μlずつ分注し、これに、滅菌楊枝を用いて掻き取った菌体をそれぞれ懸濁した。この懸濁液に、Taq DNAポリメラーゼ(TaKaRa、京都)、10×PCRバッファー、dNTP Mix(TaKaRa、京都)、一組のプライマーを加えてPCR反応液とした。一組のプライマーとしては、ユニバーサルプライマー27F(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、配列番号1)、および518R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'、配列番号2)を用いた。PCR条件は、〔95℃10分間、55℃3分間、72℃1分間〕を1サイクル、〔95℃30秒間、55℃30秒間、72℃30秒間〕を39サイクル、および〔72℃1分間〕1サイクルとして、行った。
以上のPCR反応により増幅したDNA断片を、次に電気泳動にかけた。電気泳動は、泳動ゲルに2%アガロースゲルを、泳動バッファーには1×TBEバッファー(90mM Tris-ホウ酸、2mM EDTA、pH8.0)を用い、100Vの定電圧下で行った。泳動装置は、Mupid-2(コスモバイオ、東京)を用いた。分子量マーカーは、100b DNAラダー(TaKaRa、京都)を用いた。泳動後のゲルの染色は、エチジウムブロマイド(EB)溶液(0.5μg/ml)に10分間浸すことにより行った。
アガロースゲル電気泳動および染色後のゲルに、UVトランスイルミネーターTRANSILLMINATOR TM-20(フナコシ薬品株式会社、東京)でUVを照射し、目的のDNA断片を確認して、切り出した。DNA断片精製キットMagExtractor(TOYOBO、大阪)によりDNAを抽出した。すなわち、切り出したアガロースゲルを1.5ml容チューブに移した後、400μlの吸着液を加え、55℃に加温して完全に溶解させた。次いで、その反応液に15μlの磁性ビーズを加えて撹拌した後、1分間室温で放置した。遠心分離(6,000 rpm、5秒間、4℃)した後、上清を除去し、500μlの洗浄液を加え撹拌した。再び遠心分離(6,000 rpm、5秒間、4℃)した後、1mlの75%エタノールを加え撹拌して、遠心分離(15,000rpm、1分間、4℃)した後、上清を除去した。15μlの蒸留水を加え撹拌した後、遠心分離(15,000 rpm、1分間、4℃)により回収した上清を精製DNA溶液とした。
精製したDNAについて、プライマー27F(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’、配列番号3)を用い、塩基配列決定を行った。塩基配列決定はオペロン・バイオテクノロジー株式会社にて行った。こうしてOLL2848株について決定された16S rDNAのV3領域の塩基配列を配列番号4として、OLL2948株について決定された16S rDNAのV3領域の塩基配列を配列番号5として示した。これらの塩基配列について、日本DNAデータバンク(DDBJ)のウェブ上でプログラムBLASTNにより相同性解析を行った。
Claims (6)
- ラクトバチルス・ガセリ OLL2836株(受託番号NITE BP-241)、ラクトバチルス・ガセリ OLL2948株(受託番号NITE BP-242)、およびラクトバチルス・ムコサエ OLL2848株(受託番号NITE BP-243)のうちのいずれかである、腸管付着性およびラクトース分解酵素活性が共に増強された乳酸菌。
- 請求項1に記載の乳酸菌を少なくとも1つ含有する乳糖不耐症改善剤。
- ラクトバチルス・ガセリ OLL2836株(受託番号NITE BP-241)、ラクトバチルス・ガセリ OLL2948株(受託番号NITE BP-242)、およびラクトバチルス・ムコサエ OLL2848株(受託番号NITE BP-243)の3つの乳酸菌を含有する、請求項2に記載の乳糖不耐症改善剤。
- 請求項1に記載の乳酸菌を少なくとも1つ含有する飲食品。
- ラクトバチルス・ガセリ OLL2836株(受託番号NITE BP-241)、ラクトバチルス・ガセリ OLL2948株(受託番号NITE BP-242)、およびラクトバチルス・ムコサエ OLL2848株(受託番号NITE BP-243)の3つの乳酸菌を含有する、請求項4に記載の飲食品。
- 乳児用食品、幼児用食品、授乳婦用食品、高齢者用食品、病者用食品、保健機能食品、サプリメント、発酵乳および乳酸菌飲料からなる群から選択される、請求項4または5に記載の飲食品。
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