JPS63185373A

JPS63185373A - ビフイドバクテリウム菌の増殖促進剤の製造法

Info

Publication number: JPS63185373A
Application number: JP62142106A
Authority: JP
Inventors: Munehiko Donpou; 宗彦鈍寳; Isao Tomioka; 富岡　功; Ryoichi Tsuruya; 良一鶴谷; Kazutsugu Kitahata; 北畠　千嗣; Hiroshi Nakajima; 宏中島
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 1986-09-27
Filing date: 1987-06-04
Publication date: 1988-07-30
Anticipated expiration: 2013-02-10
Also published as: JP2711095B2; US5294546A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ビフィドバクテリウム菌（以下ビフ　　　　
−イズス菌という。）の増殖促進剤の製造法に関するも
のである。

（従来の技術）ビフィズス菌は９人間の腸内に生育する有用菌であり、
腸管内にビフィズス菌叢が形成されると、これが乳酸、
酢酸及び蟻酸を産生じ、腸管内のｐＨを低下させ、有害
菌の腸管内定着を防止することが知られている。このよ
うに有用なビフィズス菌の増殖を促進する活性をもつ化
合物は、粉乳、ドリンク剤の他、各種の食品に添加して
利用されている。

従来、このビフィズス菌の増殖促進剤（以下ビフィズス
因子という。）については多くの研究がなされており、
ラクチュロース、フラクトオリゴ糖、一般式：　Ｇａ　
１−（Ｇａ　ｕ）ｌｌ−ＧＩ！、ｃ（式中。

Ｇａβはガラクトース残基、Ｇｌ！ｃはグルコース残基
、ｎは１〜４の整数を表す。）で示されるガラクトオリ
ゴ糖１人参エキス、Ｎ−アセチルラクトサミンなどのビ
フィズス因子が報告されている。

乳糖を原料とする酵素あるいは微生物によるガラクトオ
リゴ糖の製造法としては、アスペルギルス・オリゼ（ハ
肌■旦旦と躾Ｕ耗）の生産するβ−ガラクトシダーゼを
用いる方法（特公昭５８−２０２６６号公報参照。）、
バチルス属（Ｂａｃｉｌ−Ｉｕｓ　ｓｐ、）の細菌を乳
糖を含む培地で培養し、培養濾液よりビフィズス因子を
分離・採取する方法（特開昭５６−１）５７９６号公報
参照。）、クリプトコツカス（Ｃｒｙ　ｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属の酵母を乳糖を含む培地で培養し、培養濾液より
ガラクトオリゴ糖を分離・採取する方法（特開昭６０−
２５１８９６号公報参照。）、サツカロマイセス・フラ
キＩＪス（鎖匹仙見監憇し旦Ｕ旦旦）のラクターゼを用
いてガラクトオリゴ糖を生成させる方法〔アグリカルチ
ュラル・アンド・フード・ケミストリー　（Ａｇｒｉｃ
、　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ、）　５　、１３０　（１９５
７））、ビヒヤ・シンギュラリス（Ｓ　ｏｒｏｂｏｌｏ
ｍ　ｃｅｓｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）を乳糖含有培地で培
養することにより、培地中にガラクトオリゴ糖を生成さ
せる方法〔カナディアン・ジャーナル・オブ・ケミスト
リー　（Ｃａｎ、　Ｊ、　ｏｆ　Ｃｈｅｍ、）　　４２
．１３４１　　（１９６４））。

ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
　ｃｈｒｙ−ｓｏｇｅｎｕｍ）を乳糖含有培地で培養す
ることにより。

培地中にガラクトオリゴ糖を生成させる方法〔テトラヘ
ドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）　　９．１２５　（
１９６０））。

乳酸菌より得たβ−ガラクトシダーゼを用いてガラクト
オリゴ糖を生成させる方法〔ジャーナル・オブ・ディリ
ー・サイエンス（Ｊ、　ｏｆ　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ、）
■↓、　１８５　（１９８１））、バチルス・サーキュ
ランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）のβ
−ガラクトシダーゼを用いてガラクトオリゴ糖をイ成さ
せる方法〔アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミ
ストリー　（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）
　　４８．３０５３　（１９８４））などが知られてい
る。

（発明が解決しようとする問題点）上記の乳糖を原料とするビフィズス因子製造法は、菌体
から抽出した酵素を用いる方法と、乳糖を含有する培地
で菌体を培養し、培養濾液にガラクトオリゴ糖を生成せ
しめ、これを採取する方法の２つに大別される。これら
２つの方法のうち。

菌体から抽出した酵素を用いる方法は、菌体からの酵素
の抽出に労力を要することは言うまでもないが、目的と
するガラクトオリゴ糖の他に乳糖の加水分解反応が起こ
り、グルコース、ガラクトースが反応の副生成物として
蓄積し１反応の原料であるところの乳糖を無駄に消費し
、ガラクトオリゴ糖の反応収率を低下させるという欠点
がある。

一方、培養濾液中にガラクトオリゴ糖を生成せしめる方
法では、菌体の増殖が伴うため、菌体由来の分泌物も培
養濾液中に蓄積し、目的とするガラクトオリゴ糖を分離
・精製する際に問題となるばかりでなく、培地に加えた
菌体の生育に必要な窒素源やビタミン類、微量元素など
から、目的とするガラクトオリゴ糖を分離・精製する必
要がある。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、このような問題点を解決するために鋭意
研究の結果、乳糖を原料とするビフィズス因子の製造に
乳糖資化能を有する酵母の静止菌体が利用できることを
見出し１本発明に到達した。

すなわち２本発明は、乳糖を原料としてビフィズス菌の
増殖促進剤を製造するに際し、乳糖を乳糖資化能を有す
る酵母の静止菌体で処理することを特徴とするビフィズ
ス菌の増殖促進剤の製造法を要旨とするものである。

本発明に用いられる酵母は、乳糖資化能を有し。

転移活性をもつものならばいかなる菌株でもよく。

その中でも、ロドトルラ属、ピヒヤ属、ビヒヤ属、スボ
ロボロミセス属、デバリオミセス属、キャンデイダ属、
トルロブシス属、クリプトコツカス属、トリコスポロン
属、リポマイセス属、ブレラ属、ブレタノミセス属に属
する乳糖資化能を有する酵母を使用することが好ましい
。

そのような具体例としては、ロドトルラ・ラクトーザ（
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　１ａｃｔｏｓａ）　　Ｉ　Ｆ
　Ｏ１４２３。

ＩＦＯ１４２４，クリプトコツカス・ローレンテイ　　
（Ｃｒ　　　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　　１ａｕｒｅｎｔｉｉ
）　　　Ｉ　　Ｆ　　ＯＯ３７２。

ＩＦＯＯ３８４，ＩＦＯＯ９３０，ＩＦＯ１３７６、Ｉ
ＦＯ１４８７，ビヒヤ・ポリモルファ（Ｐｉｃｈｉａ　
　ｏｌｙｍｏｒ　ｈａ）　　Ｉ　ＦＯＩ　１６６．　　
Ｉ　ＦＯ１３５７、ビヒヤ・シンギュラリス（Ｓ　ｏｒ
ｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）　Ａ　
Ｔ　ＣＣ２４１９３、スボロボロミセス・ラクテイス（
Ｋｌｕｙｖｅｒｏ−’ｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ）　　
Ｉ　Ｆ　ＯＯ４３３，Ｉ　ＦＯ０６４８゜ＩＦＯ１０９
０，ＩＦＯ１２６７、ＩＦＯ１９０３、デバリオミセス
・カンタレリイ（Ｄｅｂａｒｙｏ−ｍｙｃｅｓ　ｃａｎ
ｔａｒｅｌｌｉｉＮ　ＦＯＩ　１８９＋　　Ｉ　ＦＯＩ
　３６３、ＩＦＯ１７１６，ＩＦＯ１７１７，キャンデ
イダ・キュルバータ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｃｕｒｖａｔａ
）　　Ｉ　Ｆ　００７３２、ＩＦＯ１）５９，リポマイ
セス・リポ−ファー（Ｌｉ　ｏｍ　ｃｅｓ　ｌｉ　ｏｆ
ｅｒ）　　Ｉ　ＦＯ０６７３゜ＩＦＯ１２８Ｂ、）ルロ
ブシス・キャンデイダ（Ｔｏｒｕｌｏ　ｓｉｓ　ｃａｎ
ｄｉｄａ）　　Ｉ　ＦＯＯ３８０，Ｉ　Ｆ００６６４、
ＩＦＯＯ７６８，）リコスポロン・プルランス（Ｔｒｉ
ｃｈｏｓ　ｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）　　Ｉ　Ｆ
００１）４、ブレラ・アルバ（Ｂｕｌｌｅｒａ　ａｌｂ
ａ）ＩＦＯ１）９２，ブレラノミセス・アノマラス（Ｂ
ｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ　ａｎｏｍａｌｕｓ）　　Ｉ
　Ｆ　Ｏ０６４２があげられる。

特に１本発明においては、リポマイセス・スターキイー
（Ｌｈ史」任旦乞」↓但を旦ハエ）、その中でもリホマ
イセスキ印竺匹照）ＮＫＤ−１４（微工研菌寄第８９４
８号）が１反応の基質である乳糖の無駄な分解が生じる
ことなく、転移反応のみが起こり、目的物を高収率で得
ることができるので好ましい。

この菌株は、静岡県熱用温泉の土壌中から採取したもの
であり、その菌学的諸性質をＪ、　Ｌｏｄｄｅｒ著ｒＴ
ｈｅ　ｙｅａｓｔｓＪ　　（１９８４）　、飯塚弘、後
藤昭二共著［酵母の分類同定法Ｊ　　（１９６９）に記
載の実験法に従って調べ２分類・同定を行った。その菌
学的諸性質を以下に示す。

（１）各種培地における生育状態（ａ）ＭＹ液体培地３０℃、３〜７日間培養。細胞の大きさは（３，７５〜
５）×５ミクロン。球形あるいは楕円形。被膜の形成が
見られる。分裂子は形成せず、多極出芽で増殖する。

（ｂ１ＭＹ寒天培地３０℃、４日培養。集落はクリーム色で不透明。集落の
性状は粘稠である。

（Ｃ）　　コーンミール寒天培地によるスライド培養３
０℃で培養。菌糸及び偽菌糸の形成は見られない。

（２）子嚢胞子の形成無窒素培地で８〜１０個の胞子を形成する。

（３）射出胞子の形成ＭＹ寒天平面培養で射出胞子の形成は認められなかった
。

Ｔ４）　　生理的性質（ａｌ　　最適生育条件２６〜３２℃でよく生育し、２４〜３５℃でもかなりよ
く生育する。ｐＨ５〜７で良好な生育が見られる。

山）生育の範囲５℃以下、３７℃以上では生育は見られない。ｐＨ２以
下、ｐＨ１０以上では生育は見られない。

（Ｃ１硝酸塩の同化性　　　：　なしくｄ）　　脂肪の分解性　　　　：　なしくｅｌ　　尿
素の分解性　　　　：　なしくｆｌ　　ゼラチンの液化
性　　：　なしく相　カロチノイドの生成　：　なしくｈｌ　　デンプン様物質の生成：　あり＋１）　　ビ
タミンの要求性ビタミン欠乏培地で生育しない。

Ｕ）　　アルブチンの分解性　：　あり（５）糖類の醗
酵性「−」は醗酵性のないことを示す。

Ｄ−グルコース　　　　− Ｄ−ガラクトース　　　− ラクトース　　　　　　− シュークロース　　　　− マルトース　　　　　　− ラフィノース　　　　　− （６）各種炭素源の資化性「＋」はよく資化する。「±」は資化能が弱い、「−」
は全く資化しないことをそれぞれ示す。

Ｄ−グルコース　　　　＋Ｄ−ガラクトース　　　＋Ｌ−ソルボース　　　　＋マルトース　　　　　　＋シュークロース　　　　士Ｄ−リボース　　　　　± Ｌ−ラムノース　　　　＋エタノール　　　　　　＋エリスリトール　　　　　＋トレハロース　　　　　＋メリビオース　　　　　＋メレジトース　　　　　＋イヌリン　　　　　　　士可溶性デンプン　　　　士Ｄ−キシロース　　　　＋Ｌ−アラビノース　　　＋Ｄ−アラビノース　　　士Ｄ−マンニトール　　　＋ α−メチル−Ｄ−グルコシド　＋ＤＬ−乳酸　　　　　　〜コハク酸　　　　　　　士クエン酸　　　　　　　− イノシトール　　　　　＋デキストリン　　　　　＋本菌株は１以上の菌学的性質から、バーシイのマニュア
ル・オプ・デターミネーティプ・バクテリオロジー（Ｂ
ｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版に基づ
き検索した結果、リポマイセス・スターキイー（Ｕ匹粒
些し１肛順汀）に属することが判明したが、既存菌株と
は異なっており、新菌株と判定できるので、リポマイセ
スＮＫＤ−１４と命名し、昭和６１年９月１日に通産省
工業技術院微生物工業技術研究所へ寄託したものである
。その微生物受託番号は、微工研菌寄第８９４８号であ
る。

これらの菌体を得るための条件としては、何ら限定され
るものではなく、乳糖を含む培地で培養することにより
、乳糖を原料とするビフィズス因子の合成活性の高い静
止菌体を得ることができる。

また、炭素源としてグルコース、ソルビトール。

マルトース、シヨ糖、廃糖蜜などを用い、菌体を充分増
殖させた後に乳糖を添加し、さらに培養を続け、β−ガ
ラクトシダーゼが充分誘導された後に菌体を遠心、濾過
などの通常用いられる方法によって回収することもでき
る。培養に用いる窒素源としては１例えばペプトン、カ
ゼイン、コーンステイープリカー９肉エキス、酵母エキ
スなどの有機窒素源や、硫安、塩化アンモニウム、尿素
などの無機窒素源を用いることができる。

また、培養の方法としては１通常用いられる液体培地、
固体培地で、静置培養９通気攪拌培養。

振盪培養のいずれの方法でもよい。培養液から遠心、濾
過などの通常の方法により回収した菌体は。

何ら処理を施すことなく、菌体のまま反応の触媒として
用いることができる。さらに、菌体を各種の固定化法に
より固定化することにより用いることもできる。

その固定化方法は、特に限定されるものではなく、アク
リルアミドゲル、アルギン酸カルシウムゲルなどによる
包括法、グルタルアルデヒド、トルエンジイソシアナー
トなどによる菌体量架橋法。

Ｄｏｗｅｘ　５０　（ダウ・ケミカル社製）、ＣＭ−セ
ルロース、Ｐ−セルロース、ＤＥＡＥ−セルロース。

ＥＣＴＥＯＬＡ−セルロース（ワットマン社製）などに
結合させて固定化する方法、おがくずなどに吸着させる
方法などがあげられる。この固定化された酵母菌体は、
カラム型反応器として用いることができる。また、成型
反応器内部に酵母菌体又は固定化した酵母菌体を浮遊さ
せ１反応生成物のみを反応器外へ連続的に取り出すこと
も可能である。

本発明において、乳糖を上記の菌体で処理するときの乳
糖の濃度としては、１％（ｗ／ｖ）以上が適当であり、
５％（ｗ／ｖ）以上が好ましく、特に１０％（ｗ／ν）
以上が好ましい。また、そのときのｐＨとしては、３〜
９が適当であり、５〜７が好ましく、使用する酵母菌体
の溶菌が起こりにり＜、シかも目的とするビフィズス因
子の合成能が最も高くなるｐＨが望ましいことは言うま
でもない。

また、必要に応じて緩衝液を使用することもできる。さ
らにそのときの温度としては、１０°Ｃ〜５０℃が適当
であり２２５℃〜４５℃が好ましい。

このような条件で反応を行うと、目的とするビフィズス
因子であるオリゴ糖が生成してくる。反応終了後、必要
に応じて濾過、遠心分離、デカンテーションなどにより
菌体を除去し、オリゴ糖を含む糖液を得３通常、この糖
液をイオン交換樹脂に通液し、脱塩を行い、さらに、オ
リゴ糖のみを精製するためには、活性炭吸着、ゲル濾過
などを用いれば達成できる。

（実施例）次に２本発明を実施例により具体的に説明する。

参考例１５００ｍＡ！容三角フラスコに下記組成の培地１００ｍ
Ｎを入れたものを、１０本オートクレーブした。

乳糖　　　５ｇ硫安　　　　　０．２ｇ酵母エキス　　　　　　　　０．０２　　ｇＫＨ２ＰＯ
４０，０８ｇＮ　ａ　ｔＨＰ　０ａ４２Ｈ２００，０３ｇＭ　ｇ　Ｓ
　Ｏａ・７Ｈ２Ｏ０，００２ｇ水　　　　　　　　　　
　　　　　１００ｍＩ！ｐＨ５，６次に、この培地にロドトルラ・ラクトーザ（Ｒｈｏｄｏ
ｔｏｒｕｌａ　１ａｃｔｏｓａ）　　Ｉ　Ｆ　０１４２
３株を一白金耳接種し、３０℃で３日間ロータリーシェ
ーカーで培養を行った。培養終了後、遠心により菌体を
回収し、５．２ｇの湿菌体を得た。

参考例２５００　ｍ　Ｉ！容三角フラスコに下記組成の培地１０
０ｍｆｆを入れたものを、１０本オートクレーブした。

乳糖　　　５ｇポリペプトン　　　　０．５ｇ酵母エキス　　　　　０．３　ｇ水　　　　　　　１００　ｍ　ｌｐ　Ｈ５，６次に、この培地にクリプトコツカス・ローシンテイ　（
Ｃｒｙ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｕｒｅｎｔｉｉ）　　
Ｉ　Ｆ　ＯＯ３７２株を一白金耳接種し、３０℃で２日
間ロータリーシェーカーで培養を行った。培養終了後、
遠心により菌体を回収し、７．５ｇの湿菌体を得た。

参考例３参考例１に記載した培地に、ピヒヤ・ポリモルファ（Ｐ
ｉｃｈｉａ　ｐｏｔ　ｎｏｒ　ｈａ）　　Ｉ　Ｆ　Ｏ１
）６６株を一白金耳接種し、３０℃で３日間ロータリー
シェーカーで培養を行った。培養終了後、遠心分離して
５．５ｇの湿菌体を得た。

参考例４参考例２に記載した培地に、ビヒヤ・シン−ｔ’　ニラ
’）　ス（錘ｙ遼的違遍匹朋工１町叫ａｒｔ（転）−Ａ
ＴＣＣ２４１９３株を一白金耳接種し、３０℃で２日間
ロータリーシェーカーで培養を行った。

培養終了後、遠心分離して３．２ｇの湿菌体を得た。

へ１７− 参考例５参考例２に記載した培地に、スボロボロミセス・ラクテ
イス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ）　
　Ｉ　Ｆ　００４３３株を一白金耳接種し、３０°Ｃで
２日間ロータリーシェーカーで培養を行った。培養終了
後。

遠心分離して５．３ｇの湿菌体を得た。

参考例６参考例２に記載した培地に、デバリオミセス・カンタレ
リイ（助動り空咲視しり囮」１則ｉｆ）’ＩＦ０１）８
９株を一白金耳接種し、３０℃で２日間ロータリーシェ
ーカーで培養を行った。培養終了後、遠心分離して３ｇ
の湿菌体を得た。

参考例７参考例２に記載した培地に、キヤンデイダ・キュルバー
タ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｃｕｒｖａｔａ）　　Ｉ　Ｆ　０
０７３２株を一白金耳接種し、３０℃で３日間ロータリ
ーシェーカーで培養を行った。培養終了後、遠心分離し
て２．５ｇの湿菌体を得た。

参考例８参考例２に記載した培地に、トルロブシス・キ〜１８− ヤンデイダ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　ｃａｎｄｉｄａ）
　Ｉ　Ｆ　ＯＯ３８０株を一白金耳接種し、３０℃で２
日間ロータリーシェーカーで培養を行った。培養終了後
、遠心分離して３．２ｇの湿菌体を得た。

参考例９参考例２に記載した培地に、トリコスポロン・７”　Ｊ
Ｌ／う７ス（Ｔｒ丼勲生阻匹り月刀工国ｎ５）ＩＦ００
１）４株を一白金耳接種し、３０℃で２日間ロータリー
シェーカーで培養を行った。培養終了後。

遠心分離して３．１ｇの湿菌体を得た。

参考例１０参考例２に記載した培地に、ブレラ・アルバ（Ｂｕｌｌ
ｅｒａ　ａｌｈａ）　　Ｉ　Ｆ　０１）９２株を一白金
耳接種し、３０℃で３日間ロータリーシェーカーで培養
を行った。培養終了後、遠心分離して２．８ｇの湿菌体
を得た。

参考例１）５００ｍｌ容三角フラスコに下記組成の培地１００ｍｊ
！を入れたものを、１０本オートクレーブした。

グルコース　　　　　２ｇポリペプトン　　　　０．２ｇ酵母エキス　　　　　０．１ｇ水　　　　　　　　　　１００ｍ７！ｐＨ５，６次に、この培地にブレラノミセス・アノマラス（紅蛙ハ
把粒些し憇匣１川）ＩＦＯＯ６４２株を一白金耳接種し
、３０℃で２日間ロータリーシェーカーで培養を行った
後、滅菌した乳糖を２％になるように添加し、さらに１
日間培養を行った。

培養終了後、遠心分離して３．９ｇの湿菌体を得た。

参考例１２参考例２に記載した培地に、リボマイセス・リボ−ファ
ー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　１ｉｐｏｆｅｒ）　　Ｉ　Ｆ
　ＯＯ６７３株を一白金耳接種し、３０℃で２日間ロー
タリーシェーカーで培養を行った。培養終了後、遠心分
離して３．５ｇの湿菌体を得た。

参考例１３下記組成の培地を３０４容ジャーファーメンタ−に入れ
、殺菌した。

乳糖　　　　４００ｇ硫安　　　　　４０ｇＫＨｚＰＯ４１０ｇＮａｚＨＰＯａ・１２ＨｇＯ１０ｇＭ　ｇ　Ｓ　０４　’　７　Ｈ２Ｏ１０ｇ酵母エキス　
　　　　　　　２０ｇ水道水　　　　　　　　　　２０Ｉ！次に、同組成の培地で３０　”ｃで２４時間前培養した
りボマイセス共釦竺匹ｅｓ）　ＮＫＤ　−１４（徽工研
菌寄第８９４８号）１）を接種し、ｐＨ６，５゜３０℃
２通気量２０１２　／ｌｌ１ｉｎ　、インペラー回転数
４０　Ｏｒ、ｐ、ｍで１８時間培養を行った。培養終了
後、α−ラバル社製遠心機ＬＡＰＸ２０２型で遠心分離
を行って湿菌体２．８ｋｇを得た。

参考例１４参考例１３と同様にして得られた湿菌体５０ｇに、５ｇ
のアルギン酸ナトリウムを加え、さらに２００ｍ７！の
水道水を加え、均一になるまでミキサーで攪拌した。次
に、これを注射針の先から０．２Ｍの塩化カルシウム溶
液に滴下し、ビーズ状のアルギン酸カルシウム固定化菌
体１）０ｇｔｌ−１％た。

参考例１５参考例１３と同組成の培地を５００　ｍ　ｊ！容の坂ロ
フラスコに１００ｍｊ２ずつ分注し、殺菌したものを１
０本作成した。坂ロフラスコ１本当り、−白金耳のりポ
マイセス−７μ＝ｓ）ＮＫＤ−１４（微工研菌寄第８９
４８号）を接種し、３０℃で３日間振盪培養した。培養
終了後、遠心分離して２．５ｇの湿菌体を得た。

実施例１．比較例１参考例１で得られたロドトルラ・ラクトーザ（Ｒｈｏｄ
ｏｔｏｒｕｌａ　１ａｃｔｏｓａ）　　Ｉ　Ｆ　０１４
２３株の湿菌体５．２ｇに乳糖１０ｇを加え、液の全量
を１００ｍＪとした。この液のｐＨを６．５とした後、
３０℃で３日間放置した。

放置後の液の遠心上澄み液を、ウォーターズ社製高速液
体りロマトグラフィー用カラムマイクロ＝２２− ボンダバック／　Ｎ　Ｈ２（移動相アセトニトリル／水
−７／３）で分析したところ２反応基質である乳糖とと
もに、３糖の溶出位置にガラクトオリゴ糖のピークが検
出された。

一方、乳糖の加水分解物であるグルコース及びガラクト
ースのピークは、全く検出されなかった。

このときのガラクトオリゴ糖の収率は４０％であった。

また、比較のため、乳ｔ！ｉ　１０　ｇを１００ｍｊ＋
の１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）に溶解し、市販の
アスペルギルス・オリゼ（＾ｓ　ｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏ
ｒｙｚａｅ）由来のβ−ガラクトシダーゼ（シグマ社製
）２００ユニツトを加えた後、３０℃で２４時間放置し
た。

次に、放置後の混合物を実施例１と同じ方法で分析した
ところ、３糖の溶出位置にガラクトオリゴ糖のピークが
検出された。また２反応の基質である乳糖の一部は、加
水分解を受け、グルコースとガラクトースに変化してい
た。このときのガラクトオリゴ糖の収率は１９％であっ
た。

さらに、実施例１の生成物のｔｉ組成と比較例１の反応
生成物の糖組成とを比較したものを表１に示す。

表　　　１実施例２参考例２で得られたクリプトコツカス・ローシンテイ　
（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｕｒｅｎｔｉｉ）　
　Ｉ　Ｆ　ＯＯ３７２株の湿菌体５ｇに乳糖Ｌｏｇを加
え、液の全容量を１００ｍＡとした。この液のｐＨを７
．５とした後、３０℃で２日間放置した。

放置後の混合物の遠心上澄みをオートクレーブで殺菌し
た後、凍結乾燥したもののビフィズス活性を調べた。

なお、対照区としては、クリプトコツカス・ローシンテ
イ　（Ｃｒ　　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｕｒｅｎｔｉｉ
）　　Ｉ　Ｆ　００３７２株の湿菌体５ｇに乳糖Ｌｏｇ
を加え、全容量を１００ｍＡとし、ｐＨ７，５にして、
３０℃で２日間放置せずに、直ちにオートクレーブで殺
菌した後、凍結乾燥したもの（未処理混合物という。）
を用いた。

ビフィズス活性の比較試験は、上記試料の凍結乾燥物を
各々ギョルギー（ＧｙＯｒｇｙ）のビフィズス・ペン株
の標準培地（小児科臨床第９巻、８３９頁、昭和３１年
）に５％の量で添加し、各々に同量のビフィズス・ペン
株を接種し、流動パラフィンを重層し、嫌気的に３７℃
で４８時間培養して行い、ビフィズス菌の増殖度を酸度
、ｐＨを測定することにより求めた。

その結果を表２に示す。

実施例３参考例３で得られたピヒヤ・ポリモルファ−仕１０１糺
１彬ｌル猛枦翌）ＩＦＯ１）６６株の湿菌体５ｇを用い
る以外は、実施例２と同様にしてビフィズス活性を調べ
た。

その結果を表２に示す。

実施例４参考例４で得られたビヒヤ・シンギュラリス袋長μ〜山
遍匹亜」力１佳吐林）ＡＴＣＣ２４１９３株の湿菌体３
ｇを用いる以外は、実施例２と同様にしてビフィズス活
性を調べた。

その結果を表２に示す。

実施例５参考例５で得られたスボロボロミセス・ラクテイス（■
Φ！」…吐巾μ匝）ＩＦＯＯ４３３株の湿菌体５ｇを用
いる以外は、実施例２と同様にしてビフィズス活性を調
べた。

その結果を表２に示す。

実施例６参考例６で得られたデバリオミセス・カンタレリイ（Ｄ
ｅｂａｒ　ｏｍｙｃｅｓ　ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ）　
　Ｉ　Ｆ　０１）８９株の湿菌体２ｇを用いる以外は、
実施例２と同様にしてビフィズス活性を調べた。

その結果を表２に示す。

実施例７参考例７で得られたキャンデインダ・キュルバータ（Ｃ
ａｎｄｉｄａ　ｃｕｒｖａｔａ）　　Ｉ　Ｆ　ＯＯ７３
２株の湿菌体２ｇを用いる以外は、実施例２と同様にし
てビフィズス活性を調べた。

その結果を表２に示す。

実施例８参考例８で得られたトルロブシス・キャンデイイダ（Ｔ
ｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　ｃａｎｄｉｄａ）　　Ｉ　Ｆ　０
０３８０株の湿菌体２ｇを用いる以外は、実施例２と同
様にしてビフィズス活性を調べた。

その結果を表２に示す。

実施例９参考例９で得られたトリコスポロン・プルランス（Ｗ遵
匹匣匹１旦ψ…）ＩＦＯＯ１）４株の湿菌体３ｇを用い
る以外は、実施例２と同様にしてビフィズス活性を調べ
た。

その結果を表２に示す。

実施例１０参考例１０で得られたブレラ・アルバ（Ｂｕｌｌｅｒａ
１画）ＩＦＯ１）９２株の湿菌体２．５ｇを用いる以外
は、実施例２と同様にしてビフィズス活性を調べた。

その結果を表２に示す。

実施例１）参考例１）で得られたブレラノミセス・アノマラス（Ｂ
ｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ　ａｎｏｍａｌｕｓ）　　Ｉ
　Ｆ　ＯＯ６４２株の湿菌体３ｇを用いる以外は、実施
例２と同様にしてビフィズス活性を調べた。

その結果を表２に示す。

表　　　　２表２より１本発明品にビフィズス活性があることが明ら
かである。

実施例１２参考例１２で得られたりボマイセス・リボ−ファー（Ｌ
ｉ　ｏｍｙｃｅｓ　１ｉｐｏｆｅｒ）　　Ｉ　Ｆ　ＯＯ
６７３株の湿菌体１ｇを４ｍ７！の生理食塩水に懸濁し
、この懸濁液にアクリルアミド７５０■、架橋剤として
Ｎ。

Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド４０■を加え。

さらに１重合促進剤として５％β−ジメチルアミノプロ
ピオニトリル０．５ｍＣ重合開始剤として２．５％ベル
オキソニ硫酸カリウム０．５ｍｊ！を加え。

よく混合して３０℃で３０分間放置した。得られたゲル
を生理食塩水で洗浄して、固定化酵母菌体を得た。

次に、この固定化酵母菌体に乳糖１０ｇを加え。

液の全容量を１００ｍｊ！とし、ｐＨを７．５として。

３０℃で２４時間放置した後、遠心分離して固定化酵母
菌体を含まない上澄みを得た。この上澄みを凍結乾燥し
た。

なお、対照区として９３０℃で２４時間放置しなかった
以外は、上記と同様に遠心分離して上澄みを凍結乾燥し
たもの（未処理混合物）を用いた。

これらの凍結乾燥品について、実施例２と同様にビフィ
ズス活性の比較試験を行い、ビフィズス菌の増殖度を酸
度、ｐＨで測定することにより求めた。

その結果を表３に示す。

表　　　　３表３より１本発明品にビフィズス活性があることが明ら
かである。

また、上記で得た固定化酵母菌体は、ビフィズス因子の
製造を同条件で１０回繰り返し行っても。

ビフィズス因子の合成活性の低下は認められず。

固定化酵母菌体の繰り返し使用が可能であった。

実施例１３２００ｇの乳糖に、参考例１３で得られたりボマイセス
ー仙力榎ジμ臣’）ＮＫＤ−１４（徽工研菌寄第８９４
８号）株の湿菌体を乾燥重量でｌＯｇ加え、さらに水道
水を加えて１）とした。この反応液を３０℃に保温し、
ｐＨ６，５で６日間反応を行った。

反応後の液の遠心上澄み液を、実施例１と同様にして分
析したところ２反応基質である乳糖とともに、　　３ｆ
ｔＭの溶出位置にガラクトオリゴ糖のピークが検出され
た。

このときの乳糖の濃度は６．６％、ガラクトオリゴ糖の
濃度は１０．０％であり１反応の原料である乳糖に対す
るガラクトオリゴ糖の収率は５０％であった。

また、このとき乳糖の加水分解物であるグルコース及び
ガラクトースのピークは全く検出されず。

ガラクトオリゴ糖を副生成物の生成なしに製造すること
が可能であった。

次に、ガラクトオリゴ糖のみを単離するために。

反応液上澄み液を活性炭カラムにかけ、８５ｇのガラク
トオリゴ糖を単離した。単離したガラクトオリゴ糖は、
前述の高速液体クロマトグラフィーによる分析で単一ピ
ークを与えた。本物質の構造を明らかにするために、　
１３ＣＮＭＨによる分析を行い、その解析より０−β−
Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−０−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコースである
ことが判明した。

実施例１４参考例１４で得られた固定化菌体８０ｇをカラムにつめ
、このカラムに２００ｍＡの３０％乳糖を循環させた。

ｐＨ６，５，４０℃で５日間反応させることにより、１
３．５％のガラクトオリゴ糖が生成した。

このとき、グルコース及びガラクトースの生成は認めら
れなかった。

また、５日間を１バツチとする反応を１０回繰り返して
も、活性の低下は認められなかった。

実施例１５参考例１５で得られたりボマイセス７…並）ＮＫＤ−１
４（微工研菌寄第８９４８号）株の湿菌体１ｇを４ｍβ
の生理食塩水に懸濁し、この懸濁液にアクリルアミド７
５０■、架橋剤としてＮ。

Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド４０■を加え。

さらに９重合促進剤として５％β−ジメチルアミノプロ
ピオニトリル９．５ｍｊ！、重合開始剤として２．５％
ベルオキソニ硫酸カリウム０．５　ｍ　７！を加え。

次に、この固定化酵母菌体に乳Ｆｉ１ｇを加え。

液の全容量をｌ　Ｑｍｊ！とし、ｐＨ６，０，４０℃で
３日間反応させた。

反応後の上澄み液を、実施例１と同様にして分析したと
ころ、５．２％のガラクトオリゴ糖が生成しており、グ
ルコース及びガラクトースの生成は認められなかった。

このときの乳糖に対するガラクトオリゴ糖の収率は５２
％であった。

（発明の効果）本発明によれば、菌体より酵素を抽出する操作が必要な
く、一般に用いられる培地で培養した後。

菌体を遠心あるいは濾過などの通常用いられる分離手段
により分離し、直接使用することができる。

この際、酵母菌体はエンザイム・バッグとして使用して
おり、これに反応の基質である乳糖のみを加えるだけで
よい。

また１本発明によれば２反応の基質である乳糖の無駄な
分解が生じることがなく、転移反応のみが起こることか
ら、ビフィズス因子の収率が向上し、さらに、使用する
酵母菌体を繰り返し使用することができ、ビフィズス因
子を効率よく生産することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）乳糖を原料としてビフィドバクテリウム菌の増殖
促進剤を製造するに際し、乳糖を乳糖資化能を有する酵
母の静止菌体で処理することを特徴とするビフィドバク
テリウム菌の増殖促進剤の製造法。
（２）乳糖資化能を有する酵母が、ロドトルラ属、ビヒ
ヤ属、スボロボロミセス属、クルイベロミセス属、デバ
リオミセス属、キヤンデイダ属、トルロブシス属、クリ
プトコツカス属、トリコスポロン属、リポマイセス属、
ブレラ属、ブレタノミセス属からなる群から選ばれた酵
母である特許請求の範囲第１項記載の製造法。
（３）乳糖資化能を有する酵母の静止菌体が、担体によ
り固定化された固定化酵母菌体である特許請求の範囲第
１項記載の製造法。