JPS6128389A - ラクタ−ゼ調製物の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はラクターゼ調製物の精製に関連している。ラク
ターゼ又はベーターガラクトシダーゼはラクトース全グ
ルコースとガラクトースに加水分解するのに効果的な酵
素である。従ってラクターゼは酪農工業において有益で
ある。例えばチーズ製造においてチーズ乳にラクターゼ
を添加すると、ラクトース加水分解の速度がはやマり熟
成時間が短縮され、生成能が増加し、改良された生成物
ができる。ラクターゼは又、ラクトースに対し生理的に
不耐性の人に投与するのに有益である。

ラクターゼは従来の醗酵法で容易に生産される数イ重の
微生物における細胞内成分である。これらの微生物の例
としては、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙ
ｃｅｓ　）　（従来からサッカ（＋？イセスｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ　１ａｔｉｓ）、の種及び、カンジグ（Ｃａｎ
ｄｌｄａ）ｔ’トルーラ（Ｔｏｒｕｌａ　）またはトル
ロビス（Ｔｏｒｕｌｏｐｉｓ　）の属である。過去にお
いてこのような微生物の細胞は、適当な栄養培地中で培
養し、収穫し乾燥した後金乾燥細胞を、目的の適応物に
ラクターゼ活性を与えるために用いられた。この方法は
、他の細胞成分もチーズ乳に加えられる事になり、望ま
しくない味と香りを与えてしまうので良い方法ではない
。この問題点を克服するための従来の方法は、細胞の内
部から２クターゼを放出させる方法であシ、特に細ｆ＠
壁をホモジエナイズ、粉砕、又は化学的な手段を用いて
破壊していた。しかしながら、これらの方法は一般に長
時間全必要とし、高価であって、この方法によシラクタ
ーゼばかりでなく他の細胞内酵素、タンパク質及びそれ
らの分解生成物等も放出されるためラクターゼを分離せ
ねばならない。この点に関して、微生物細胞から分子内
ラクターゼの放出においてプロテアーゼも同時に放出さ
れ、このラクターゼ調製物中からプロテアーゼ活性を除
去するのが困難でちるという問題があった。チーズ熟成
全促進させるためにチーズ乳に加えたラクターゼ調製物
中にプロテアーゼが混在していれば、乳タンパク質のタ
ンノξり分解により啄プチト９が形成されるために、不
快な苦味で香りのなり１ものが生成してしまう。従って
、上述の見解に２いて、微生物中からラクターゼを放出
せしめる改良法が必要であシ、更に、゛こうして製した
ラクターゼ調製物の精製、とくにラクターゼ調製物中か
らプロテアーゼ活性を選択的に除去する方法が必要であ
る。

ラクターゼ含有イースト細胞からラクターゼを、好収率
で、しかも比較的短時間で好純度で放出せしめる方法は
下記工程からなる。すなわち（ａ）ラクターゼ含有イー
スト細胞を、約２０ル９５が炭素数１−４のジアルキル
ケトン、よシ選んだ化合物（この場合、上述の細胞とア
ルコール又はケ）ンの全重量に基ずく濃度である）と、
約５〜３５℃、（２０〜３０℃が良好）で接触せしめる
。（１））“アルコール又はケトン処理細胞をｐＨ約５
．５〜８．０（約６．４〜７．Ｑが良好）を有する水溶
液と約５〜３５℃（約２０〜３０℃が良好）で接触せし
める。工程（ａ）で用いる良好な化合物はメタノール、
エタノール、インゾロパノール、又はそれらの混合物で
、最も良好なものは、エタノールである。アルコール又
はケトンは全重量の約６０〜９０重量パーセントの範囲
で用いる。この方法に用いる良好なイースト細胞は、次
の属のものである。すなわち、りる。

本発明はラクターゼ調製物を含有する水溶液を約３０〜
９０重量ノξ−セン）　（４０〜６０３ｉｉパーセント
が良好）のグリセロール（水−グリセロール溶液の全重
量に基づいた濃度）と約３５〜６０℃（４５〜５５℃が
良好）で、ｐＨ約５．５〜８．０　（　６．、４〜７、
０が良好）で、プロテアーゼ活性が本質的に無くなるま
で加熱する事を特徴とするプロテアーゼ含有ラクターゼ
調製物中よシブロチアーゼ活性を選択的に無くす方法を
供給する。もしも必要なら、水−グリセロール溶液にマ
ンガンイオン−＜１ｏ−’〜１０　濃度で加え、加熱工
程中のラクターゼの安定性を高める事ができる。

本発明の方法は、この分野で良く知られたラクターゼ含
有イースト細胞から放出せしめたラクターゼを精製する
のに利用する事かできる。適当な微生物は、クルイベロ
マイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　）属、特にク
ルイベロマイセスフラギリス（Ｋ：ｉｕｙｖｅ−ｒｏｍ
ｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）、一般にカルチャーコレ
クションより入゛手できるような多くの菌株、例えば、
クルイベロマイセ　フラギリス（　Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅＳｆｒａｇｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ１００２２，ＡＴ
ＣＣ８６０８，ＡＴＣＣ８５８２、ＡＴＣＣ１２４２４
，及びクルイベロマイセスラクテイス（Ｋ＋．ｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ）である。ラクターゼを
放出せしめる事のできる他の微生物はカンジグＣ　Ｃａ
ｎｄｉｄａ　）　、　　）ルーラ（　Ｔｏｒｕｌａ　）
の属で特に１米国カリフォルニア州のカリフォルニア大
学デービス校から一般に入手できる培養番号Ｕ．ＣＤ５
５−３１の株菌であるトルーラ　クレモＩ７２　（Ｔｏ
三二ｃｒｅｍｏｒｉｓ　）である。良好なイースの種で
ある。これら既知で、一般に入手できるものの変異株で
、従来のＸ線照射、ＵＶ光照射、ナイトロージエンマス
タード処理して得るような変異株を用いるのも良好であ
る事を理解されたい。

ラクターゼ含有イースト細胞は一般に、適当な栄養培地
、例えば、ラクトーズ含有の水性培地で、リン酸アンモ
ニウム、リン酸カリウム、等のリン、窒素及びカルシウ
ム源と共に乳しようを含んだ培地中通気培養することに
よシ得られる。このような栄養培地はこの分野に精通す
る者にとってはよく知られた培地である。

この分野で既知の従来からの醗酵法を用い、イースト細
胞を、十分な濃度の細胞がこの栄養培地中で得られる姥
で培養する。例えば、栄養培地中、約２０〜３５℃（２
５℃〜３５℃が良好）で約４８〜１００時間培養する。

次に細胞を、濾過又は遠心分離等の方法で取る。

分子内ラクターゼを放出せしめるために、初め、イース
ト細胞を炭素数１−４のアルキルアルコール、炭素数１
−４のアルキル基を持つジアルキルケトンと、５℃〜３
５℃（２０℃〜３０℃が良好）で接触せしめる。アルコ
ール又はケトンは、細胞とアルコール又はケトンの全重
量に基づき、２０２０−９Ｏバーセン）　（６０〜９０
重量パーセントが良好）濃度用いる。細胞はアルコール
、又はケトンと２分〜２０時間（３０分〜２時間）接触
せしめる。次にアルコール又はケトンを細胞から、細胞
の濾過、溶媒留去、凍結乾燥等によシ分離する。

しかしアルコール、ケトンを約７５〜８０重量パーセン
ト以下用いた場合、アルコール又はケトンの除去は本質
的でなく、この細胞を次の工程で、アルコール又はケト
ンの存在のまま、ｐＨ約５．５〜８．０の水溶液と処理
する事ができる。

上記方法において、細胞をアルキルアルコール、又はジ
アルキルケトンと処理する場合、これはアルコール又は
ケトンによシ分子内ラクターゼを溶媒抽出するのではな
い事を認められたい。本方法の条件下では、ラクターゼ
は、殆んど、アルコールやケトンにより細胞中から抽出
されない。本方法の機構を理論と結びつげるりもシはな
いがアルコール又はケトンは、細胞壁の透過性をよシ良
くし、以後に述べる如＜　ｐＨ約５．５〜８．０の水溶
液中に細胞を懸濁させた場合に分子内ラクターゼを放出
せしめるように作用するものと考えられる。

上述の如くアルコール又はケトンと処理した後アルコー
ル又は、ケトン−処理細胞をｐＨ約５．５〜８０の水溶
液（約６４〜７．０が良好であシロ、６が最も良い）中
に懸濁せしめる。この場合、例えば、０．１Ｍリン酸ナ
トリウム又はカリウム水溶液又は０゜１Ｍクエン酸−リ
ン酸水溶液等の適当な緩衝液を用いる方が良い。溶液は
攪拌、振とり、等によシラクターゼの放出を促進させる
のが良好である。

この溶液は約５℃〜３５℃（２０℃〜３０℃）に保つ。

水溶液中の細胞の濃度は限定されないが１リツトル中、
約１０〜８０グラム（約３０〜５０グラム／リツトルが
良好）の範囲が良い。細胞は水溶液中に懸濁させるが０
．１Ｍリン酸ナトリウム、カリウム等の緩衝液が良く、
約１〜２０時間、特に約１０〜２０時間で放出によるラ
クターゼの収量が最大になる。これが約２０時間以上に
なると酵素による微生物分解が起ぎるためラクターゼの
収量が悪くなる。このようなラクターゼ損失は無菌条件
下又は防腐剤の使用で最少にする事ができる。ラクター
ゼは細胞から他の細胞内酵素又はタンパク質（例えばプ
ロテアーゼ）と共に水溶液中に放出されるが、これら、
望ましくない細胞構成体の抽出量は細胞壁を機械的に破
壊するためのホモゲナイズ、細胞の機械的粉砕等による
従来のラクターゼ放出法よシ本質的に少い。

細胞中から放出されるラクターゼの量は従来から用いら
れている如くラクターゼ単位で測定される。Ｏ−ニトロ
フェニル−ベーターローガラクトピラノシド（ＯＮＰＣ
）のＯ−ニトロフェニル（ＯＮＰ）及びＤ−ガラク、ト
ビラノシドへの分解速度でラクターゼ単位を決定する。

例えばウエンドルフ（Ｗｅｎａｏｒｆ　）等のＪ、　Ｍ
ｉｌｋ　Ｆｏｏｄ　Ｔｅｃｈ、　３４．４５１（１９７
１）　’ｘ参照の事。さらに特異的に言えば、本発明の
目的のために、０１％牛血清アルブミンを含む０．１Ｍ
！Ｊン酸カリウム緩衝液７−１）０　　Ｍ硫酸マンガン
１水相物の水浴液１−１０．０２Ｍの０ＮＰＣ溶液２ｒ
ｎｌ、検定用のラクターゼ含有溶液、全混合して製した
溶液中で４２０　ｎｍでの吸収を分光光度計で、０ＮＰ
Ｃの分解速度全決定する。検定は３７℃で２０分間行い
、反応は２Ｘ１０ＭＥＤＴＡジナトリウム、を含む２Ｍ
水酸化アンモニウム水１ｍ１ｉ−加えて止める。ラクタ
ーゼ単位ば４２０ｎｍでの吸収における変化により決定
する。

１ラクタ一ゼ単位は、１分間に生成するＯＮＰの１マイ
クロモルに等しい。溶液中のプロテアーゼの量は、同様
に、本発明の目的のために、染色コラーゲンポリマーで
あるアゾコールの分解速度として測定したプロテアーゼ
単位として表わされる。

例えばヘイム（Ｈｅｙｌｌｌ）によるＡｒｃｈ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

１２７、８．９　（１９６２）の報告を参照せよ。さら
に特異的に言えば、アゾコールの分解速度は分光光度計
を用い５２０　ｎｍの吸収変化を３−の０．１ＭＩＪン
酸ナトジナトリウム緩衝液ｒｎｌのアゾコール、１ｆｎ
ｌのプロテアーゼ含有検定溶液の混合により製した溶液
中で測定して決定する。この溶液を３７℃で３０分間振
とうしてインキュベートし、残りのアゾコールを沢過し
て反応を止める。次に１分間当りの５２０　ｎｍにおけ
る吸光度の変化からプロテアーゼ単位を決定する。

イースト細胞中から抽出水溶液中にラクターゼ及び少量
のプロテアーゼ及び他のタンパク質が放出された後、残
りの固形細胞物質ヲ沢過して除きラクターゼと少量のプ
ロテアーゼ不純物を含む溶液を得る。必要ならラクター
ゼは従来の、凍結乾燥、アセトンの如き非溶媒を加えて
ラクターゼを沈澱させるか蔗糖を加えてスプレー乾燥等
の方法で単離する事ができる。しかしこれらの方法で単
離（〜ｆｃラクターゼはプロテアーゼ不純物を含んでお
シ、これをチーズ製造に用いると望ましくない香と味に
なる事は明らかである。従って、イースト細胞から本発
明の方法で得たラクターゼは上述の如くプロテアーゼ活
性を除かねばならない。

本発明によれば、これらプロテアーゼ活性はプロテア−
ぜ不純物を含むラクターゼ調製物の水溶？＆に約３ｏ〜
９０重量パーセントのグリセロール（この場合水−グリ
セロール溶液の全重量にもとすく濃度）と約３５〜６０
℃でｐＨ約５．５〜８．０で加熱して除く事ができる。

それ故、アルコール−又はケトン−処理イースト細胞か
ら上述の方法に従って得たラクターゼ及びプロテアーゼ
不純物を含む水溶液はグリセロ−Ｊｖｆ加え、加熱する
事によって、水溶液中からラクターゼ全単離せずに直接
精製する事ができる。精製工程（を忘ける水−グリセロ
ール溶液中のラクターゼの濃度は限定されないが一般的
には１ｒｎｌ当シ約１．０００〜２５．０００ラクタ一
ゼ単位（約２，０００〜２５，０００単位／ゴが良好）
の範囲である。それ故、前述のアルコール−又はケトン
−処理細胞の抽出工程で得た、ラクターゼ含有水溶液は
グリセロールを加える前に、濃縮して適当な濃度にする
のが良い。

精製工程は約・１５〜５５℃でｐＨ６，４〜７．０（約
６６が最も良好である）にて行うのが良く、この条件下
ではラクターゼは安ホである。精製工程でのラクターゼ
の安定性は、もし必要なら、例えば塩化マンガン、硝酸
マンガン、硫酸マンガン等可溶性二価マンガン塩を、１
０〜１０″′Ｍマンガンイオン濃度にするのに十分な量
加えると、これが促進される。

ラクターゼ含有水−グリセロール溶液はプロテアーゼ活
性が本質的に減少するまで加熱する。これに必要な時間
は反応温度に依存するが、一般には、６０℃で約３時間
〜３５℃で約１０日間であシ、５０℃で約６〜１２時間
が最適である。この条件下でプロテアーゼ不純物は急速
に不活性化され、プロテアーゼ活性は初期の１０％以下
になる。これに比してラクターゼはグリセロールで選択
的に安定化され、マンガンイオンを加えると、初期のラ
クターゼ活性の９０％以上が保持される。加熱中に、不
活性化されたプロテアーゼを含む不活性化されたタンパ
ク質の沈澱ができ、これを例えば沢過して除き目的のラ
クターゼ精製溶液を得る。ラクターゼは所望なら溶液か
ら慣用的な方法によシ≠離することかできる。

グリセロールの存在下で加熱する事に、［：＃）プロテ
アーゼ活性を選択的に減少せしめる、上述の精製工程は
、アルコール又はケトンでイースト細胞を処理し、、ｐ
Ｈ５，５〜８．０で水溶液中に抽出せしめて得たラクタ
ーゼの精製には特に適当である事は明白である。しかし
プロテアーゼ活性を選択的１で減少せしめるこの方法は
、上述以外の方法、例えば従来の機械的破壊又はホモゲ
ナイズ等により得たラクターゼ調製物中のプロテアーゼ
活性を減するのに用いることができる。

本発明は次の実施例で例示するが、本発明はこれらの実
施例の特異的詳細に限定するものでないことを理解され
たい。

参考例　１゜ 米国カリフォルニア州、カリフォルニア大学デービス校
、から得た培養番号ＵＣＤ’５５−３１のトルーラクレ
モリス（Ｔｏｒｕｌａ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ）（カンジダ
プソイドトロピカリスｆ：ｃａｎｄｌａ　ｐｅｅｕｄｔ
ｒｏ−ｐｉｃａｌｉｓ　）　’ｌ：次に示す組成の栄養
培地１リツトル中に接種し１２時間２８℃で培養する。

乳しよう　　　　　　　　　４０．０？／１（ＮＨ４）
２８０４　　　　　　　　５．Ｃ１ｐＫ２ＨＰＯ４５，
□　　ｒｒ トウモロコシ浸出液　　　　１．０〃 Ｍｇ５ｏ４・７Ｈ２００，５ｐ 硫酸でｐＨ４，５に調節しオートクレーブ中１）０℃゛
で４５分間滅菌する。

１４リットルフアーメンタ−中に８リツトルの次の組成
の培地を入れる。

ＫＨ２ＰＯ４１，８ｊ／７ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１，０／ｒ （ＮＨ４）２ＨＰＯ４１０〃 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００１〃 ＦｅＳＯ４−７Ｈ２０５，ｏｖｒｙｙｔＭｎＳＯ４”　
７Ｈ２０５，Ｏｔｔ これを１２１℃、３０分間滅菌し上述の前培養菌を入れ
る（１０チｖ／ｖ）。

組成： ラクトース　　　　　　　３６３１／ｌイースト抽出物
　　　　　　６．Ｑｔ／Ａｌ・ウモロコシ浸出液　　　
　３．Ｏｆ？、／ｌニコチン酸　　　　　　　６．０ｍ
ｇ／Ｌを有する培地（２，６＋、１ツ）・ル）を１）０
℃で４５分間滅菌し、これを６０時間以上連続的に加え
て培養する。溶存酸素は培養中空気を送シ込み０．５容
量／容量／分から０．、７５容量／容量／分に増加させ
、攪拌金３１ＯＲＰ　Ｍから３８ＯＲＰＭに増加させる
事によシ約１０俤に保つ。培養温度は３０℃でｐＨは４
．５に保つ。

６０時間後、細胞濃度は１８　ｔ、／Ａ、細胞中のラク
ターゼ含量は４２００単位／グラムである。ラクターゼ
の多くなった細胞を沢過して取る。

上述の培養から得た１８グラムの細胞を含むイースト細
胞イーストを６．３グラムのエタノールで処理する。９
０分後エタノールを沢過己て除き、細胞をＱ、１Ｍリン
酸カリウム緩衝液、ｐＨ６，６、中に再び懸濁せしめる
。この緩衝液中の細胞濃度は４０グ／ｌに調節する。エ
タノール処理細胞を抽出緩衝液中で１５時間攪拌してラ
クターゼを放出せしめる。次に、抽出した細胞をラクタ
ーゼに富む緩衝液中から沢過して除き、約６■’／ｍｌ
タンパク質と６５単位／ｌｒｔのラクターゼ活性を有す
る酵素溶液を畿終的に得る。収率は培養して得た細胞の
分子内ラクターゼ含有量に、もとづき４５％である。

参考例　２゜ 参考例１で用いたエタノールによる細胞処理の代りに、
他のアルコール類又はケトン類を用い、実施例１で得た
他の細胞群で、参考例１の方法をくシ返し次の結果を得
た。

化　合　物　　　　　　収　率　　　　ラクターゼ活性
メタノール　　　　　　　　４５　　　　６６インプロ
パノール　　　　　３７　　　　５２シタノール　　　
　　　　　１）．５ ｔ−ブタノール　　　　　４５　　　　６６アセトン　
　　　　　　　１０１３ メチルエチルケトン　　　　１０　　　　　１３メチル
イソブチルケトン　　　７５　　　　１０参考例　３゜ 参考例１で述べた方法に従い、細胞をエタノールで処理
し０．１ＭＩＪン酸ナトジナトリウム緩衝液する事によ
るラクターゼ放出を菌株クルイベロマを用いて行う。２
リツトルフラスコ中、参考例１の接種培地１リツトル中
で３０℃、２４時間培養し１細胞′ｆｆ：濾過して取る
。細胞１５グラムを参考例１の方法に従いエタノール処
理し、次に０．１ＭＩＪン酸カリウム緩衝液で抽出して
放出せしめたラクターゼの量は次のとおシである。

Ｋ＋７ラギリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ８６０８
５，ＯＫ、７ラギリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）　Ａ’ｒｃ
ｃ　８５８２　　　　　１．５に＋７５ギリス（ｆｒａ
ｇｉｌｉｓ）　ＡＴｃ；Ｃ１００２２，１，５に、７．
ｙギリｘ（ｆｒａｇｉｌｉｓ）　ＡＴＣＣ１２４２４２
，０実施例　ｌ。

３０００単位／ゴのラクターゼ、０２４プロテア一ゼ単
位／ゴ及び硫酸マンガンとして加えた１Ｏ−３１Ａマン
ガンイオンを含む３リットルの１：１グリセロール：０
１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ６，６）を５０℃で６時
間加熱する。加熱中に不活性化したタンパク質の白色沈
澱ができ、これｋ濾過して除く。溶液中に残存するプロ
テアーゼ活性は０．０３単位／ｄであシ初期のプロテア
ーゼ活性の９０％が除去された事を示す。これに比べ、
溶液中のラクターゼ活性は、２．７６０単位／ｒｎｌで
あシ、初期のラクターゼ活性の９０％以上が保持されて
いる事を表わしている。

実施例　２゜ 実施例１の方法を用い温度を５０℃の代りに３７℃で行
う。９日間加熱後、初期のプロテアーゼ活性の９０％が
除去され、初期の２クターゼ活性の９５％（２，８５０
単位／−）が保持される。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロテアーゼ含有ラクターゼ調製物及びグリセロ
   ール約３０〜９０重量パーセント（溶液の全重量に基づ
   く）を含有する水溶液を約３５℃〜約６０℃でｐＨ約５
   ．５〜８にてプロテアーゼ活性が充分に低下するまで加
   熱することを特徴とするプロテアーゼ含有ラクターゼ調
   製物中からプロテアーゼ活性を選択的に低下せしめる方
   法。
2. （２）温度が約４５〜約５５℃であり上記溶液中のグリ
   セロール濃度が約４０−６０重量パーセントで、ｐＨが
   約６．４〜７．０である特許請求の範囲第（１）項の方
   法。
3. （３）上記溶液がマンガンイオンを１０＾−＾４〜１０
   ＾−＾２モルの濃度で含有する特許請求の範囲第（１）
   項の方法。