SU1406160A1 - Способ получени эндонуклеазы рестрикции Fок1 из FLаVовастеRIUм океаNокоIтеS - Google Patents
Способ получени эндонуклеазы рестрикции Fок1 из FLаVовастеRIUм океаNокоIтеS Download PDFInfo
- Publication number
- SU1406160A1 SU1406160A1 SU864097789A SU4097789A SU1406160A1 SU 1406160 A1 SU1406160 A1 SU 1406160A1 SU 864097789 A SU864097789 A SU 864097789A SU 4097789 A SU4097789 A SU 4097789A SU 1406160 A1 SU1406160 A1 SU 1406160A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- enzyme
- cultivation
- purification
- cells
- peptone
- Prior art date
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к микробиологии , в частности к способу получени рестриктаз. Целью изобретени вл етс повьшение выхода рект- риктазы Fok I. Дл этого штамм-продуцент Flavobacterium okeanokoites В-2835 культивируют на жидкой питательной среде, содержащей, г/л: пептон 9,0-11,0; дрожжевой экстракт 4,0-6,0; NaCl 25,0-30,0; КС1 0,5- 1,0; ,,20 2,0-3,0; MgS04 7H20 6,0-7,5; глюкоза 0,5-1,5, до достижени стационарной фазы роста с последующим вьщелением и очисткой рест- риктазы, включающей 3 хроматографи- ческие стадии. Способ позвол ет увеличить выход фермента в 8-10 раз.. Выход фермента 2000 ед. на 1 г биомассы , активность препарата 3000 ед./мл. 1 табл. с . (Л 4ik О Од а о
Description
Изобретение относитс к микробиологии и касаетс способа получени ферментов нуклеинового обмена, в частности рестриктаз.
Целью изобретени вл етс повышение выхода фермента.
Способ заключаетс в том, что штамм F.okeanokoites выращивают на жидкой среде следующего состава,г/л:
Пептон 9,0 - 11,0
Дрожжевой
экстракт 4,0 - 6,0
NaCl 25,0 - 30,0
КС10,5 - 1,0
CaCl2-6 Н,20 . 2,0 - 3,0 MgS04-7 6,0 - 7,5
Глюкоза 0,5-1,5
р-Н7,2,
культивирование провод т при 27-29°С до стационарной фазы роста, что соответствует оптической плотности 2,2- 2,6 о.е. при нМ. Клетки разрушают ультразвуком и целевой продукт получают последовательной хроматогра фической очисткой на фосфоцеллюлозе Р-11, бензил-ДЕАЕ-целлюло36 и фосфоцеллюлозе Е-11 .
Культивирование бактерий на среде имеющей сбалансированный состав со- лей, ,и при оптимальной температуре 27-29 С приводит не к увеличению выхода биомассы, а к ее обогащению именно ферментом рестрикции и повышению выхода целевого продукта в 8-10
раз по сравнению с известным способом .
Выбор температуры культивировани обусловлен следующими эксперименталь ными фактами: изменение на 4-5°С в любую сторону от оптимального интервала (27-29 с) уменьшает скорость роста F.okeanokoites в 2 раза и не позвол ет получить более высокий вы- ход фермента.
Результаты экспериментов по подбору компонентов питательной среды дл культивировани F.okeanokoites представлены в таблице.
Наиболее оптимальной и сбалансированной по составу солей вл етс среда 15.
Выход фермента в логарифмической фазе роста повышаетс в 1,1-1,2 раза по сравнению со стационарной фазой, однако полученный препарат фермента не стабилен при хранении (50% инактиваци за 1 н еделю) .
о
5
0 5
O
5
„ с
0
5
Установлено, что дл получени стабильного при хранении препарата фермента сбор урожа бактерий наиболее технологично производить на стадии стационарной фазы роста.
Пример. Получение рестрикта- зы Fok I.
Культивирование F.okeanokoites.
При культивировании клеток используют химреактивы отечественного производства без дополнительной очистки.
Дл выращивани бактерий готов т растворы пита-т ельной среды.
Раствор 1: Пептон 10 г Дрожжевой
экстракт 5 г NaCl 27 г КС10,7 г
Вода 900 мл Раствор кип т т 5 мин, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через фильтровальную бумагу, довод т рН до 7,2 с помощью 5 н. раствора NaOH.
Раствор 2: MgS04-7H,0 7 г
Вода 50 мл
Раствор 3: 2,2 г Вода 40 мл
Раствор 4: Глюкоза 1 г
Вода 10 мл
Все растворы стерилизуют в автоклаве при 40 мин, затем сливают в стерильных услови х непосредственно перед приготовлением питательной среды.
Клетки бактерий подращивают на твердой питательной среде при 28 С в течение суток, затем готов т иноку- л т дл засева ферментера. Объем ино- кул та 1/10 часть от объема ферментера . Культивирование провод т в ферментере (объем 20 л) при 28 С и аэрации 20 л/ч. Величина рН в процессе роста поддерживаетс автоматически на уровне 7,2 добавлением 0,2 н. NaOH.
Клетки выращивают до стационарной .фазы (оптическа плотность 2,5 при нм). Клетки собирают центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин. Выход биомассы 3,5 г/л.
Выделение и очистка рестриктазы.
Все процедуры по выделению и очистке фермента провод т при О - 4°С. 4 г клеток суспендируют в 20 мл 0,01М трис-НС1 буфера, рН 7,5, содержащего 0,1% тритона Х-100, разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе 4 раза по 40 с, клеточный дебрис отдел ют
центрифугированием при 5000xg в течение 20 мин. Полученный грубый экстракт нанос т на колонку с фосфоцеллю- лозой Р-11 размером 1, см, уравновешенную 0,02 М трис-HGl буфером, рН 7,5, содержащим 1 мМ 2-меркаптоэта- нола, 0,5 мМ ЭДТА и 5% глицерина (буфер А). Несорбированный на колонке материал элюируют 50 мл буфера А. Фермент эхооируют 20 мл буфера А, содержащего 1 М NaCl и диализуют лротив буфера Б (0,02 М калий фосфатный буфер, рН 7,5, содержащий 1 мМ 2-мер- каптоэтанола, 0,5 мМ ЭДТА и 5% глице- рина).
После диализа раствор фермента осветл ют центрифугированием при в течение 5 мин и супернатант нанос т на колонку размером 0, см с бензил-ДЕАЕ-целлюлозой.
Несорбированный материал, содержащий фермент, собирают и нанос т на колонку размером 0,9 х2 см с фосфо- целлюлозой Р-11, уравновешенной буфе- ром Б, .Фермент элюируют 40 мл линейного градиента NaCl (0,1 М) в буфере Б. Фракции, содержащие растриктазу (элюируемые при 0,4 - 0,45 М NaCl), собирают и диализуют против буфера Б содержащего 50% глицерина. Выход продукта составл ет 2000 ед./г биомассы . Полученный препарат имеет активность 3000 ед./мл. Активность фермента определ ют в реакционной смеси котора в 20 мкл содержит 1 мкг ДНК фага Л, 0,02 М трис-НС1 буфера, рН 7,5, 0,01 М MgCl, 0,02 М КС1, 1 мМ 2-меркаптоэтанола.
Реакцию провод т при 37 С в течение 1 ч, затем пробы подвергают элекрофорезу в 1%-ном агарозном геле. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое дл полного расщеплени 1 мкг ДНК фаза А при данных услови х реакции .
Отсутствие неспецифических эндо- нуклеаз и фосфотаз подтверждаетс
высокоэффективным лигированием фрагментов ДНК фага Д, полученных в результате гидролиза полученным препаратом фермента. Правильность лйгиро- вани подтверждаетс повторным гидролизом рестриктазой Fok I с образованием аналогичных фрагментов.
Claims (1)
- Формула изобретениСпособ получени эндонуклеазы рестрикции Fok I из Flavobacterium okeanokoites, включаюш11Й культивирование клеток в жидкой питательной среде, содержащей в качестве источника азота белковый гидролизат,-в качестве источника витаминов - дрожжевой экстракт, хлористый натрий, глюкозу и воду, разрушение клеток ультразвуком, хроматографию полученного экстракта на фосфоцеллюлозе и очистку целевого продукта ионообменной хроматографией, отличающийс тем, что, с целью noBbmie- ни выхода фермента, в качестве продуцента используют Flavobacterium okeanokoites ВКПМ-2835, в среду дл культивировани дополнительно ввод т хлористый кальций, хлористый калий и сульфат магни , в качестве белкового гидролизата используют пептон приследующем соотношении комопнентов,/г/л:ПептонДрожжевой экстракт Хлористый натрий Хлористый калий Хлористый кальций Сульфат магни Глюкоза ВодаОстальное45культивирование ведут при 27-29 С до достижени стационарной фазы роста, а при очистке целевого продукта ионообменную хроматографию провод т на бензил-ДЭАЭ-целлюлоза с последующей рехроматографией на фосфоцеллюлозе.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU864097789A SU1406160A1 (ru) | 1986-05-15 | 1986-05-15 | Способ получени эндонуклеазы рестрикции Fок1 из FLаVовастеRIUм океаNокоIтеS |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU864097789A SU1406160A1 (ru) | 1986-05-15 | 1986-05-15 | Способ получени эндонуклеазы рестрикции Fок1 из FLаVовастеRIUм океаNокоIтеS |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1406160A1 true SU1406160A1 (ru) | 1988-06-30 |
Family
ID=21249085
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU864097789A SU1406160A1 (ru) | 1986-05-15 | 1986-05-15 | Способ получени эндонуклеазы рестрикции Fок1 из FLаVовастеRIUм океаNокоIтеS |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU1406160A1 (ru) |
-
1986
- 1986-05-15 SU SU864097789A patent/SU1406160A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Holdeman L.V., Gate Е.Р. Мог- ore W.E.C. Anaerobe laboratory manual 4- eg. Virginia Polytechnic Institute and State University, Black- burg, 1977. Sugisaki H., Kanazawa S. New restriction endonucleases from Flavobac- terium okeanokoites (Fok I) and Mic- rococus luteus (Mlu I), Gene, 16, 73- 78, 1981. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPS6033474B2 (ja) | 新規なヒアルロニダ−ゼbmp−8231およびその製造法 | |
JPS59156282A (ja) | 新規耐熱性リパーゼおよびその製造法 | |
JP3523285B2 (ja) | 糖分解酵素の製造法 | |
JPS6013668B2 (ja) | グルタチオン・パ−オキシダ−ゼの製造法 | |
SU1406160A1 (ru) | Способ получени эндонуклеазы рестрикции Fок1 из FLаVовастеRIUм океаNокоIтеS | |
Mahesh et al. | Optimization for the production of extracellular alkaline phosphatase from Proteus mirabilis | |
JPH0480675B2 (ru) | ||
JPS6243671B2 (ru) | ||
JP3040976B2 (ja) | トレハロースを含有する糖化液の製造方法 | |
JP3014950B2 (ja) | トレハロースの製造方法 | |
US4463091A (en) | Method of producing amylase inhibitor AI-B | |
JPH0244510B2 (ru) | ||
JPH0998779A (ja) | トレハロース合成酵素、その製法及びそれを用いたトレハロースの製造法 | |
JPH03224485A (ja) | フルクトース‐1,6‐ビスホスフアート‐アルドラーゼ、その製造方法及びその使用方法 | |
RU2077577C1 (ru) | Штамм бактерии delcya marina - продуцент щелочной фосфатазы и способ получения щелочной фосфатазы | |
RU2032743C1 (ru) | Способ получения дрожжевой алкогольоксидазы | |
JPS6243666B2 (ru) | ||
JPH0515387A (ja) | 細菌によるアルギン酸の分解法 | |
JPS6326991B2 (ru) | ||
JPH06189779A (ja) | トレハロースの製造法 | |
JPS62275694A (ja) | ジフルクト−ス、ジアンヒドリド▲iii▼の製造法 | |
SU1440919A1 (ru) | Штамм бактерий кURтнIа ZopFII-продуцент рестрикционной эндонуклеазы кZо 91 | |
JPS6349097A (ja) | イプシロン−ポリ−l−リシンの製造法 | |
JPS5843075B2 (ja) | α−D−ガラクトシダ−ゼの製造方法 | |
US3810822A (en) | Process for obtaining a phosphodiesterase from dictyostelium discoideum |