JPS6013668B2 - グルタチオン・パ−オキシダ−ゼの製造法 - Google Patents
グルタチオン・パ−オキシダ−ゼの製造法Info
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- JPS6013668B2 JPS6013668B2 JP55132301A JP13230180A JPS6013668B2 JP S6013668 B2 JPS6013668 B2 JP S6013668B2 JP 55132301 A JP55132301 A JP 55132301A JP 13230180 A JP13230180 A JP 13230180A JP S6013668 B2 JPS6013668 B2 JP S6013668B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、グルタチオン・パーオキシダーゼの製造法に
関する。
関する。
さらに詳しくは、本発明はムコ−ル属に属し、グルタチ
オン・パーオキシダーゼを生産る能力を有する微生物を
培地に培養し、培養中にグルタチオン・パーオキシダー
ゼを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
グルタチオン・パーオキシダーゼの製造法に関する。グ
ルタチオン・パーオキシダーゼ(EC1、11、1、9
)は、Mmsによって初めてウシの赤血球中にその存在
が報告され、〔G.C.Mills;J.Biol.C
hem.、229 189(1957)〕、その後肝臓
等の組織中にも存在することが報告されている〔G.C
.Mills;Arch.Biochem.Bjoph
ys.86、1(1960)〕。しかしながら、微生物
起源のグルタチオン・パーオキシダーゼついての報告は
ない。
オン・パーオキシダーゼを生産る能力を有する微生物を
培地に培養し、培養中にグルタチオン・パーオキシダー
ゼを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
グルタチオン・パーオキシダーゼの製造法に関する。グ
ルタチオン・パーオキシダーゼ(EC1、11、1、9
)は、Mmsによって初めてウシの赤血球中にその存在
が報告され、〔G.C.Mills;J.Biol.C
hem.、229 189(1957)〕、その後肝臓
等の組織中にも存在することが報告されている〔G.C
.Mills;Arch.Biochem.Bjoph
ys.86、1(1960)〕。しかしながら、微生物
起源のグルタチオン・パーオキシダーゼついての報告は
ない。
また、グルチオン・パーオキシダーゼは過酸化水素の定
量に用いられることはよく知られており〔R,L,He
ath and AL,L,Tappel;A船,Bi
oChem,、70184(1976)〕、グルタチオ
ン・バーオキシダーゼを安価に工業的に製造する方法を
提供することが望まれている。
量に用いられることはよく知られており〔R,L,He
ath and AL,L,Tappel;A船,Bi
oChem,、70184(1976)〕、グルタチオ
ン・バーオキシダーゼを安価に工業的に製造する方法を
提供することが望まれている。
本発明者らは、グルタチオン・パーオキシダーゼの製造
方法について種々検討した結果、ムコール属に属する微
生物を培地に培養したときもこ培養物中主として菌体中
にグルタチオン・パーオキシダーゼが著量に生産される
ことを見出し、本発明を完成した。
方法について種々検討した結果、ムコール属に属する微
生物を培地に培養したときもこ培養物中主として菌体中
にグルタチオン・パーオキシダーゼが著量に生産される
ことを見出し、本発明を完成した。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明に使用する微生物としては、ムコール属に属し、
グルタチオン・パーオキシダーゼを生産する能力を有す
るものであればいずれの菌株でもよい。
グルタチオン・パーオキシダーゼを生産する能力を有す
るものであればいずれの菌株でもよい。
具体的に好適な菌株の例はムコール・ヒェマリス(Mu
corhiemalis)YR−0929(徴工研菌寄
第5708号)(NRRL12293)、ムコール・シ
ルシネロイデス(Mucorcircinelloid
es)〔ムコール・ジヤバニカス(MucorJava
nic聡)〕ATCCI5242およびムコール・ルキ
シアヌス(Mucorrouxlan船)YR−031
9(徴工研菌寄第2709号)(NRRL12294)
である。これらの菌の属する種の菌学的性質は、次の文
献に記載されている。
corhiemalis)YR−0929(徴工研菌寄
第5708号)(NRRL12293)、ムコール・シ
ルシネロイデス(Mucorcircinelloid
es)〔ムコール・ジヤバニカス(MucorJava
nic聡)〕ATCCI5242およびムコール・ルキ
シアヌス(Mucorrouxlan船)YR−031
9(徴工研菌寄第2709号)(NRRL12294)
である。これらの菌の属する種の菌学的性質は、次の文
献に記載されている。
“A ManualofSoilF血g”第2版(19
57)。ムコール・ヒヱマリス(M比orhiemal
is)p38 ムコール・シルシネロイデス(Muco
rcircinelloides)〔ムコール・ジヤバ
ニカス(Mucorねvanic聡)〕p33、ムコー
ル.ルキシヌス(Muc0rro似lanus)p33
本発明に使用される培地としては、炭素凝、窒秦源、無
機物その他の栄養素を程よく含有するものであれば、天
然培地、合成培地のいずれも用いることができる。炭素
源としては、グルコース、フラクトース・シュークロー
ス、マルトース、マンノース、磯粉、澱粉加水分解後、
糖蜜などの種々の炭水化物、あるいはグリセロール、ソ
ルビトール・マンニトールなど種々の糠アルコール、酢
酸、乳糖、ビルビン酸、フマール酸、クエン酸などの各
種有機酸、メタノール、エタノールなどの各種アルコー
ル、エチレングリコール、プロピレングリコールなど各
種グリコール、各種アミノ酸、あるいはn−へキサデカ
ンなどの炭化水素が使用可能である。
57)。ムコール・ヒヱマリス(M比orhiemal
is)p38 ムコール・シルシネロイデス(Muco
rcircinelloides)〔ムコール・ジヤバ
ニカス(Mucorねvanic聡)〕p33、ムコー
ル.ルキシヌス(Muc0rro似lanus)p33
本発明に使用される培地としては、炭素凝、窒秦源、無
機物その他の栄養素を程よく含有するものであれば、天
然培地、合成培地のいずれも用いることができる。炭素
源としては、グルコース、フラクトース・シュークロー
ス、マルトース、マンノース、磯粉、澱粉加水分解後、
糖蜜などの種々の炭水化物、あるいはグリセロール、ソ
ルビトール・マンニトールなど種々の糠アルコール、酢
酸、乳糖、ビルビン酸、フマール酸、クエン酸などの各
種有機酸、メタノール、エタノールなどの各種アルコー
ル、エチレングリコール、プロピレングリコールなど各
種グリコール、各種アミノ酸、あるいはn−へキサデカ
ンなどの炭化水素が使用可能である。
窒素源としてはアンモニア、あるいは塩化アンモニウム
、炭酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、酢酸アンモニウムなど各種無機および有機アンモ
ニウム塩、尿素、アミノ酸およびその他の窒素化合物、
ならびにべプトン、NZーアミン、肉エキス、コーンス
チープリカ−、カゼイン加水分解物、蟻加水分解物、フ
ィッシュミールあるいはその消化物、脱脂大豆あるいは
その消化物などの窒素含有有機物質などが用いられる。
、炭酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、酢酸アンモニウムなど各種無機および有機アンモ
ニウム塩、尿素、アミノ酸およびその他の窒素化合物、
ならびにべプトン、NZーアミン、肉エキス、コーンス
チープリカ−、カゼイン加水分解物、蟻加水分解物、フ
ィッシュミールあるいはその消化物、脱脂大豆あるいは
その消化物などの窒素含有有機物質などが用いられる。
無機物としては燐酸第一カリウム、燐酸第二カリウム、
塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸
第一鉄、塩化ナトリウム、炭酸カルシウムなどが用いら
れる。培養はPH6.0〜7.0、温度25〜3yCで
4〜5日間、通気燈拝しながら行う。
塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸
第一鉄、塩化ナトリウム、炭酸カルシウムなどが用いら
れる。培養はPH6.0〜7.0、温度25〜3yCで
4〜5日間、通気燈拝しながら行う。
このようにして培養することにより、培養物中、主とし
て菌体中にグルタチオソ・パーオキシダーゼが生成蓄積
する。
て菌体中にグルタチオソ・パーオキシダーゼが生成蓄積
する。
培養物中からのグルタチオン・パーオキシダーゼの採取
は次のごとく行なつo培養終了後、培養物から菌体を遠
0分離などにより取得し、ついでこの菌体を適当な主段
、例えば超音波処理、磨砕、機械的圧縮、自己消化など
の手段で破砕し、破砕液から遠心分離等によって上清液
を得る。
は次のごとく行なつo培養終了後、培養物から菌体を遠
0分離などにより取得し、ついでこの菌体を適当な主段
、例えば超音波処理、磨砕、機械的圧縮、自己消化など
の手段で破砕し、破砕液から遠心分離等によって上清液
を得る。
上蒲液を通常酵素精製に用いられる方法、例えば、塩析
、有機溶媒沈殿、透析、イオン交換セルロースカラムク
。
、有機溶媒沈殿、透析、イオン交換セルロースカラムク
。
マト、セフアデツクスカラムクロマト、凍結乾燥などの
方法にて処理する。かくして精製グルタチオン・パーオ
キシダーゼを採取することができる。本発明で得られる
酵素合有する性質をムコール・ヒェマリスYR−092
9から生産されるグルタチオン・パーオキシダーゼを代
表として以下に述べるが、ムコール・シルシネロイデス
ATCCI5242およびムコール・ルキシアヌスYR
−0319から生産されるグルタチオン・パーオキシダ
−ゼもほぼ同機の性質をする。
方法にて処理する。かくして精製グルタチオン・パーオ
キシダーゼを採取することができる。本発明で得られる
酵素合有する性質をムコール・ヒェマリスYR−092
9から生産されるグルタチオン・パーオキシダーゼを代
表として以下に述べるが、ムコール・シルシネロイデス
ATCCI5242およびムコール・ルキシアヌスYR
−0319から生産されるグルタチオン・パーオキシダ
−ゼもほぼ同機の性質をする。
グルタチオン・パーオキシダーゼの酵素活性の測定は、
酵素によって生成する酸化型グルタチオンを、グルタチ
オン・レダクターゼの存在下にNADPHと反応させ、
NADPEの34仇のにおける吸光度の減少速度を分光
光度計で測定することによって行なう。
酵素によって生成する酸化型グルタチオンを、グルタチ
オン・レダクターゼの存在下にNADPHと反応させ、
NADPEの34仇のにおける吸光度の減少速度を分光
光度計で測定することによって行なう。
反応式は次式{1’、‘2}で示される。
‘ィ)試薬
■ 基質:30mMクメン・ハイドロパーオキサィド水
溶液 0.2の‘■ 緩衝液:
100mMリン酸緩衝液(pH7.0)44mM ED
HAを含む) 1.5の‘■ 還元型グル
タチオン:10のM水溶液0.3の‘■ アジ化ナトリ
ウム:lowM水溶液 0.3の‘■ NADPH:1
6MM水溶液 0.3の‘■ グルタチオン
・レダクターゼ溶液:100mM
〇.3の‘リン酸緩衝液くpH7
.0)でlu′の‘になる様希釈調製■ 酵素溶液
0.1私(o)操作上記試薬■〜
■をキュベット(d=1.0の)にとり25℃、5分間
予備加溢する。
溶液 0.2の‘■ 緩衝液:
100mMリン酸緩衝液(pH7.0)44mM ED
HAを含む) 1.5の‘■ 還元型グル
タチオン:10のM水溶液0.3の‘■ アジ化ナトリ
ウム:lowM水溶液 0.3の‘■ NADPH:1
6MM水溶液 0.3の‘■ グルタチオン
・レダクターゼ溶液:100mM
〇.3の‘リン酸緩衝液くpH7
.0)でlu′の‘になる様希釈調製■ 酵素溶液
0.1私(o)操作上記試薬■〜
■をキュベット(d=1.0の)にとり25℃、5分間
予備加溢する。
次いで酵素液を加えて25℃で34血肌の吸光度を2〜
3分間記録し、直線部分から1分間当りの吸光度の変化
を求める(△ODにst)。一方コントロールとして基
質の代りに、水を用いたものを上記の操作を行なし、吸
光度の変化を求める(△ODBlank)。
3分間記録し、直線部分から1分間当りの吸光度の変化
を求める(△ODにst)。一方コントロールとして基
質の代りに、水を用いたものを上記の操作を行なし、吸
光度の変化を求める(△ODBlank)。
し一 力価の計算法
グルタチオン・パーオキシダーゼの1単位は2yoで1
分間に1〆moleのグルタチオン(GSH)を酸化す
る(又は0.別moleのNADPHを酸化する)酵素
量と定義する。
分間に1〆moleのグルタチオン(GSH)を酸化す
る(又は0.別moleのNADPHを酸化する)酵素
量と定義する。
一方、lmMのNADPHの吸光係数は6.22と報告
されている(TheMerkIMex、9版、P824
)から、求める酵素溶液1の【当りの力価■はA=のD
test−△ODblank)×3=(△ooにst−
△○Dblank)x9.65(unit′似)6.2
2×★×0.1より求められる。
されている(TheMerkIMex、9版、P824
)から、求める酵素溶液1の【当りの力価■はA=のD
test−△ODblank)×3=(△ooにst−
△○Dblank)x9.65(unit′似)6.2
2×★×0.1より求められる。
次に本発明で得られたグルタチオン・パーオキシダーゼ
の諸性質を示す。
の諸性質を示す。
‘1’作用
本酵素は、還元型グルタチオンの存在下にハィドロ・パ
ーオキサィドを還元し、対応するアルコールと酸化型グ
ルタチオンを生成する反応を触媒する。
ーオキサィドを還元し、対応するアルコールと酸化型グ
ルタチオンを生成する反応を触媒する。
■ 基質特異性
本酵素は、クメン・ハイドロパーオキサィド、tーブチ
ル・ハイドロ/ゞーオキサイド、リノレィン酸・ハイド
ロパーオキサイド、過酸化水素等に作用する。
ル・ハイドロ/ゞーオキサイド、リノレィン酸・ハイド
ロパーオキサイド、過酸化水素等に作用する。
‘31 至適pH
本酵素の至適pHは2500、1分間の反応でPH6.
0〜7.の寸近にある。
0〜7.の寸近にある。
t4} 安定pH範囲
本酵素の安定pH領域は400、2畑時間の処理でPH
6.0〜8.0の間にある。
6.0〜8.0の間にある。
【5} 作用温度の範囲
本酵素の最適温度は解7.0、1分間の反応において3
0〜35℃付近にある。
0〜35℃付近にある。
‘61 温度安定性
本酵素は、pH6.0、1び分間の処理で37q0まで
安定、45qoでは80%程度失活する。
安定、45qoでは80%程度失活する。
{7} 阻害
25℃、pH7.0で反応させた場合、下詑の物質によ
って阻害される。
って阻害される。
※POMBニパラクロロマーキューリーベンゾエイト職
分子量セファロースCL−蟹ゲルo適法により、本酵
素の分子量は約55000と算出された。
分子量セファロースCL−蟹ゲルo適法により、本酵
素の分子量は約55000と算出された。
■ 結晶構造および元素分析値は、本酵素が結晶化され
ていないので測定していない。(10)コハクター(C
。
ていないので測定していない。(10)コハクター(C
。
factor)X線蟹光分析によれば本酵素は検出でき
るほどのセレンを含まない。
るほどのセレンを含まない。
(11)沈殿係数
超遠心分離により測定した本酵素の沈殿係数はS沙、w
=2.24Sである。
=2.24Sである。
(12)等露点
ampholi肥を用いる等露点電気泳動法により測定
した本酵素の等露点はpH5.20である。
した本酵素の等露点はpH5.20である。
(13)アミノ酸分析本酵素に含まれる種々のアミノ酸
の量を、ラットの肝臓に由来するグルタチオン・パーオ
キシダーゼと比較して以下に示す。
の量を、ラットの肝臓に由来するグルタチオン・パーオ
キシダーゼと比較して以下に示す。
注)a)Biochem.Biophys.Acta,
繁盛,2510野心b)酵素1分子に含まれるアミノ酸
残基の数c)検出されず以下実施例をあげて本発明を具
体的に説明する。
繁盛,2510野心b)酵素1分子に含まれるアミノ酸
残基の数c)検出されず以下実施例をあげて本発明を具
体的に説明する。
実施例 1
ムコール−ヒェマリスYR−0929(徴工研菌寄第5
708号)をグルコース1タ′d‘、酵母エキス0.3
夕/d‘、麦芽エキス0.3夕/d‘、からなる培地(
pH6.0)300Mを含む2そエルレンマヤーフラス
コに桶菌し、3000で4観音間振顔培養する。
708号)をグルコース1タ′d‘、酵母エキス0.3
夕/d‘、麦芽エキス0.3夕/d‘、からなる培地(
pH6.0)300Mを含む2そエルレンマヤーフラス
コに桶菌し、3000で4観音間振顔培養する。
この培養液600机を上記培地と同じ組成の培地15夕
を含む30クジヤーフアーメンタ一に入れ、通気櫨拝(
30仇pm)しつつ、30こ0で4日間培養を行う。こ
の培養液15夕を大型ヌッチェで炉過し、菌体100夕
(wet)を集める。
を含む30クジヤーフアーメンタ一に入れ、通気櫨拝(
30仇pm)しつつ、30こ0で4日間培養を行う。こ
の培養液15夕を大型ヌッチェで炉過し、菌体100夕
(wet)を集める。
この菌体を0.01Mリン酸緩衝液(pH6.0)5そ
で洗浄した後、同緩衝液2〆に懸濁する。
で洗浄した後、同緩衝液2〆に懸濁する。
この懸濁液をDYNO−MILL(WmyA.舷cho
fen社製、スイス)にかけ菌体を磨砕する。磨砕した
後、冷凍遠心機にて遠心分離(12000×夕、2び分
)し、上清液をうる。
fen社製、スイス)にかけ菌体を磨砕する。磨砕した
後、冷凍遠心機にて遠心分離(12000×夕、2び分
)し、上清液をうる。
この上清液に硫安を加え、硫安50〜90%飽和で沈殿
する部分を採取する。
する部分を採取する。
この沈殿のグルタチオン・パーオキシダーゼ活性収率は
約75%で、比活性は約3倍に上昇している。
約75%で、比活性は約3倍に上昇している。
この沈殿を約100叫の0.01Mリン酸緩衝液(pH
6.0)に溶解する。
6.0)に溶解する。
この溶液を同緩衝液10そで2餌時間透析する。
透析液を同緩衝液で平衡化したDEAE−セルロースカ
ラム(1〆、口径6伽)に通塔する。この操作で、グル
タチオン・/ゞーオキシダーゼはDEAE−セルロース
に吸着される。さらに、同緩衝液で不純蛋白質を洗い流
す。次に、0.01Mリン酸緩衝液(pH6.0)から
0.1Mリン酸緩衝液(pH6。
ラム(1〆、口径6伽)に通塔する。この操作で、グル
タチオン・/ゞーオキシダーゼはDEAE−セルロース
に吸着される。さらに、同緩衝液で不純蛋白質を洗い流
す。次に、0.01Mリン酸緩衝液(pH6.0)から
0.1Mリン酸緩衝液(pH6。
0)までの濃度勾配液で溶出を行う。
グルタチオン・パーオキシダーゼの活性画分は単一のピ
ークとして溶出してくる。
ークとして溶出してくる。
この活性画分をあわせ、これに硫安を加えて、硫安90
%飽和で沈殿する部分を遠心分離(12000×夕、2
M分)で集め、0.01Mリン酸緩衝液(pH6.0)
10の‘に溶解する。この溶液を同緩衝液5そで24時
間透析する。透析後「酵素液を同緩衝液で平衡化したセ
フアロースCL−述のカラム(500の‘、口径3.5
伽)に通す。
%飽和で沈殿する部分を遠心分離(12000×夕、2
M分)で集め、0.01Mリン酸緩衝液(pH6.0)
10の‘に溶解する。この溶液を同緩衝液5そで24時
間透析する。透析後「酵素液を同緩衝液で平衡化したセ
フアロースCL−述のカラム(500の‘、口径3.5
伽)に通す。
溶出液を分画回収し、比活性の高い分画を集め凍結乾燥
し、グルタチオン・パーオキシダ−ゼの粉末精製酵素標
品50の9(比活性IS単位/机9)を得る。精製酵素
は細胞抽出液に比べて比活性は約100倍に上昇し、活
性の収率は50%である。
し、グルタチオン・パーオキシダ−ゼの粉末精製酵素標
品50の9(比活性IS単位/机9)を得る。精製酵素
は細胞抽出液に比べて比活性は約100倍に上昇し、活
性の収率は50%である。
実施例 2
実施例1において使用菌株をムコール・シルシネロィデ
スATCCI5242に替えて行う以外は実施例1と同
様に行い、比活性12単位/雌の精製グルタチオン・パ
ーオキシダーゼ約40の9を得る。
スATCCI5242に替えて行う以外は実施例1と同
様に行い、比活性12単位/雌の精製グルタチオン・パ
ーオキシダーゼ約40の9を得る。
活性の収率は50%である。実施例 3
実施例1において使用菌株をムコール・ルキシアヌスY
R−0319(徴工研菌寄第570少号)に替えて行う
以外は実施例1と同様に行い、比活性1の単位/の9の
精製グルタチオン・パーオキシダーゼ約25肌9を得る
。
R−0319(徴工研菌寄第570少号)に替えて行う
以外は実施例1と同様に行い、比活性1の単位/の9の
精製グルタチオン・パーオキシダーゼ約25肌9を得る
。
Claims (1)
- 1 ムコール属に属し、グルタチオン・パーオキシダー
ゼを生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養
中にグルタチオン・パーオキシダーゼを生成蓄積せしめ
、これを採取することを特徴とするグルタチオン・パー
オキシダーゼの製造法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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