JPS6243666B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はガラクトース酸化酵素の製造法に関す
る。さらに詳しくは、本発明はジベレラ属に属
し、ガラクトース酸化酵素を生産する能力を有す
る微生物を培地に培養し、培養液中にガラクトー
ス酸化酵素を蓄積せしめ、該培養液から該酵素を
採取することを特徴とするガラクトース酸化酵素
の製造法に関する。 従来、ガラクトース酸化酵素（EC1.1.3.9）は
ポリポラス・サルシナツス
（Polyporuscircinatus）に属する微生物から得ら
れるものが知られている〔J.A.D.Cooperet.at.；
J.Biol.Chem.、234、445（1959）、特公昭41−
5900号公報等〕。 また、ガラクトース酸化酵素は血清等生体中の
ガラクトースの定量に用いられることはよく知ら
れており、ガラクトース酸化酵素を安価に工業的
に製造する方法を提供することが望まれている。 本発明者らは工業的に安価にガラクトース酸化
酵素を製造する方法について種々検討した結果、
ジベレラ属に属する微生物を培地に培養した時に
培養液中にガラクトース酸化酵素が著量に生産さ
れることを見出し、本発明を完成した。 本酵素単糖類であるガラクトースに特異的に作
用する以外にメリビオース、ラフイノース等の多
糖類、ダイハイドロキシアセトン等にも特異的に
作用する。 以下に本発明を詳細に説明する。 本発明に使用する微生物としては、ジベレラ属
に属し、ガラクトース酸化酵素を生産する能力を
有するものであればいかなる菌株も用いることが
できる。具体的に好適な菌株の一例としてはジベ
レラ・フジクロイ（Gibberella fujikuroi）Ｙ−
530929（微工研菌寄第5066号）、Ｔ−280530（微
工研菌寄託受理番号第5067号）およびジベレラ・
ゼアエ（Gibberella zeae）Ｋ−240319（微工研
菌寄託受理番号第5068号）があげられる。 これらの微生物の菌学的性質は次の文献に記載
がある。 ジベレラ・フジクロイDictonary of The
Fungi ジベレラ・ゼアエ第６版、241頁上記微
生物の培地としては炭素源、窒素源、無機物その
他の栄養素を程よく含有するものであれば天然培
地、合成培地のいずれも用いることができる。 炭素源としては、ガラクトース、グルコース、
フラクトース、シユークロース、マルトース、マ
ンノース、メリビオース、ラフイノース、澱粉、
澱粉加水分解液、糖蜜などの種々の炭水化物、あ
るいはグリセロール、ソルビトール、マンニトー
ルなど種々の糖アルコールが使用でき、また酢
酸、乳酸、ピルビン酸、フマール酸、クエン酸な
どの各種有機酸、メタノール、エタノールなどの
各種アルコール、エチレングリコール、プロピレ
ングリコールなどの各種グリコール、各種アミノ
酸、あるいはｎ−ヘキサデカンなどの炭化水素も
使用可能である。本酵素の収量増加のためには、
ガラクトース、グリセロール、フラクトース、シ
ユークロース、グルコース、メリビオースおよび
ラフイノースが特に好適である。 窒素源としてはアンモニア、あるいは塩化アン
モニウム、炭酸アンモニウム、燐酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなど各
種無機および有機アンモニウム塩、あるいは尿
素、アミノ酸およびその他の窒素化合物、ならび
にペプトン、NZ−アミン、肉エキス、酵母エキ
ス、ソリユブル・ベジタブル・プロテイン、コー
ンスチープリカー、カゼイン加水分解物、蛹加水
分解物、フイツシユミールあるいはその消化物、
脱脂大豆あるいはその消化物などの窒素性有機物
質などが使用できる。本酵素の収量増加のために
は、肉エキス、酵母エキスおよびソリユブル・ベ
ジタブル・プロテインが特に好適である。 無機物としては燐酸第一カリウム、燐酸第二カ
リウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
マンガン、硫酸第一鉄、塩化ナトリウム、炭酸カ
ルシウムなどが使用できる。 培地に亜鉛イオンもしくは銅イオンを存在せし
めることによりガラクトース・オキシダーゼの収
量を大巾にあげることができる。 各イオンを提供する化合物としては、塩化亜
鉛、硫酸亜鉛等の亜鉛化合物、硫酸銅、塩化第二
銅等の銅化合物を用いることができる。亜鉛化合
物および銅化合物の添加量はそれぞれ0.0001−
0.005％（ｗ／ｖ）および0.01−0.05％（ｗ／ｖ）
が適当である。 培養はPH6.0〜7.0、温度25−35℃で２〜３日
間、通気撹拌しながら行う。 培養物からのガラクトース酸化酵素の単離精製
はたとえば次の通りに行う。 培養液を過あるいは遠心分離し、菌体を除
き、得られた液あるいは上清をフラツシユ・エ
バポレーターなどを用いる減圧濃縮法によつて約
1/4容まで濃縮する。 濃縮液から硫安30−90％飽和で沈澱する画分を
回収し、これを0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）に
溶解し、透析して脱塩する。透析液をDEAE−セ
ルロースカラムクロマトグラフイー、およびセフ
アデツクスＧ−150カラムクロマトグラフイーに
かける。かくして得られる精製酵素液を凍結乾燥
してガラクトース酸化酵素の粉末を得る。 本発明で得られる酵素の有する性質をジベレ
ラ・フジクロイＹ−530929から生産されるガラク
トース酸化酵素を代表として以下に述べるが、ジ
ベレラ・フジクロイＴ−280530およびジベレラ・
ゼアエＫ−240319から生産されるガラクトース酸
化酵素もほぼ同様の性質を有する。 ガラクトース酸化酵素の酸素活性の測定は、酵
素によつて発生する過酸化水素を、パーオキシダ
ーゼの存在下に、４−アミノアンチピリンとフエ
ノールを反応させ、生成したキノンイミンを定量
することによつて行なう。 反応式は次式(1)、(2)で示される。 尚、式(2)の反応原理はC.C.AllainらClin.
Chem、20、470（1974）に示されている。 (イ) 試薬 基質：0.5Mガラクトース水溶液 0.5ml 緩衝液：0.25Mリン酸緩衝液（PH７）
1.0ml ４−アミノアンチピリン：24ｍμ水溶液
0.5ml フエノール：42ｍＭ（水溶液） 0.5ml パーオキシダーゼ水溶液：（蛋白質２mg／
ml、比活性100） 0.1ml 水 0.3ml 酵素水溶液 0.1ml (ロ) 操作 上記試薬〜を試験管に入れ、よく振とう
し、５分間、25℃で振とうする。次いで酵素
（液）を加えて溶液の全量を３mlに調整する、
25℃で10分間振とうして反応させる。一方コン
トロールとして基質の代りに、水を用いたもの
を同様に処理する。反応液の500nｍでの吸収
値を求めコントロールとの差を求め△ODとす
る。 (ハ) 力価の計算法 ガラクトース酸化酵素の１単位は25℃で１分
間にガラクトースを１μmole分解する酵素量
である。 一方、１ｍＭのキノンイミンの吸光係数は
5.33と報告されている〔Clin.Chem.20、470
（1974）〕から(ロ)の操作で求められた、反応液３
mlの500nｍの吸収（△OD）をａと表示する
と、求める酵素溶液１ml当りの力価(A)は Ａ＝ａ×１／５．３３×３×１／１０＝ａ ×0.56（unit／ml） より求められる。 次に本発明で得られたガラクトース酸化酵素の
諸性質を示す。 (1) 作用 本酵素は酸素の存在下にガラクトースを酸化
して過酸化水素とガラクト−ヘキソジアルドー
スを生成する。 (2) 基質特異性 本酵素はガラクトース以外にもメリビオー
ス、ラフイノース、ダイハイドロキシアセトン
等に作用しうるが、グルコース、グリセロール
等は酸化できなかつた。

【表】 (3) 至適PH 本酵素の至適PHは25℃、10分間の反応でPH
6.0〜7.0付近にある。 (4) 安定PH範囲 本酵素の安定PH領域は45℃、15分間の処理で
PH5.0〜8.0の間にある。 (5) 作用適温の範囲 本酵素の最適温度はPH7.0、10分間の反応に
おいて20〜30℃付近にある。 (6) 温度安定性 本酵素はPH7.0、15分間の処理で50℃まで安
定、60℃では90％程度失活する。 (7) 阻害 25℃、PH7.0で反応させた場合、下記物質に
よつて阻害される。

【表】 (8) 分子量 セフアデツクスＧ−75ゲル過法により、本
酵素の分子量は約45000と算出された。 一方、セフアロースCL−4Bゲル過法によ
れば本酵素の分子量は約90000と算出された。
前者においては本酵素がセフアデツクスＧ−75
とは親和性があるため測定値が低くでたものと
解される。本発明者らは後者の分子量が正しい
と考えている。 (9) 金属の分析 本酵素は１モルあたり約１ｇ原子の銅を含有
する。この分析は原子吸光分析により行つた
（使用機器：日本電子(株)の原子吸光分析装置タ
イプAA−１）。 (10) 結晶構造および元素分析値は本酵素が結晶化
されていないので測定していない。 以下実施例をあげて本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ ジベレラ・フジクロイＹ−530929（微工研菌寄
第5066号）をガラクトース１ｇ／dl、ソルブル・
ベジタブル・プロテイン１ｇ／dl、ZnCl₂0.001
ｇ／dlからなる培地（PH6.0）300mlを含む２エ
ルレンマイヤーフラスコに植菌し、30℃で48時間
振盪培養する。 この培養液600mlを上記培地と同じ組成の培地
15を含む30ジヤーフアーメンターに入れ、通
気撹拌（300rpm、15／分）しつつ、30℃で48
時間培養を行う。 この培養液15を大型タツチエで過し、培養
液約15を得る。 この培溶液を約1/4容まで減圧濃縮する。 この濃縮液に硫安を加え、硫安90％飽和で沈澱
する部分を採取する。 この沈殿のガラクトース酸化酵素活性収率は約
70％で、比活性は約３倍に上昇している。 この沈殿を少量（約100ml）の0.01Mリン酸緩
衝液（PH7.0）に溶解する。 この溶液を同緩衝液10で24時間透析する。透
析液を同緩衝液で平衡化したDEAE−セルロース
カラム（１、口径６cm）に通塔する。この操作
で、ガラクトース酸化酵素はDEAE−セルロース
に吸着されずに素通りする。この素通りする活性
画分をあわせ、これに硫安を加え、硫安90％飽和
で沈殿する部分を遠心分離（12000×ｇ、20分）
で集め、0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）10mlに溶
解する。この溶液を同緩衝液５で24時間透析す
る。 透析後酵素液を同緩衝液で平衡化したセフアデ
ツクスＧ−150のカラム（500ml、口径3.5cm）に
通す。 溶出液を分画回収し、比活性の高い分画を集め
凍結乾燥し、ガラクトース酸化酵素の粉末精製酵
素標品25mg（比活性13単位／mg）を得る。 精製酵素は細胞液に比べて比活性は約100倍
に上昇し、活性の収率は50％である。 実施例 ２ 実施例１において使用菌株をジベレラ・フジク
ロイＴ−280530（微工研菌寄受託受理番号第5067
号）に替え、発酵培地をシユークロース１ｇ／
dl、ソルブル・ベジタブル・プロテイン１ｇ／
dl、ZnCl₂0.001ｇ／dlからなる培地（PH6.0）に
替えて行う以外は実施例１と同様に行つて比活性
10単位／mgの精製ガラクトース酸化酵素約20mgを
得る。活性の収率は45％である。 実施例 ３ 実施例２において使用菌株をジベレラ・ゼアエ
Ｋ−240319（微工研菌寄第5068号）に替えて行う
以外は実施例２と同様に行い、比活性８単位／mg
の精製ガラクトース酸化酵素約20mgを得る。活性
の収率は40％である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ジベレラ属に属し、ガラクトース酸化酵素を
   生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培
   養液中にガラクトース酸化酵素を蓄積せしめ、該
   培養液から該酵素を採取することを特徴とするガ
   ラクトース酸化酵素の製造法。