JPH01168283A - ムシン分解酵素及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、胃粘膜などを構成する糖蛋白質でるるムシン
を分解する酵素に関するものでるり、更に詳しくは、ス
トレプトミセス属に属する菌が生産する新規な五シン分
解酵素及びその製造法に関するものでめる。

〔従来の技術及びその問題点〕

消化管の内腔においては、粘液産生細胞から合成される
ムシン（ｍｕｃｉｎ　）が分泌されている。ムシンは粘
液糖蛋白質（ｍｕｃｕｓ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　
）　　であり、ヒト、ブタ、ラットの胃においては、蛋
白質含量が１０〜２０％、糖鎖部分が８０〜９０％を占
め、糖鎖部分の構成糖としてＮ−アセチルガラクトサミ
ン（Ｇａ１ＮＡｃ　）、Ｎ−アセチルグルコサミｙ　（
ＧｌｃＮＡｃ　）　、ガラクトース（Ｇａｌ　）、フコ
ース（Ｆｕｃ　）、シアル酸（ＳＡ　）　ｆｆｉ含む巨
大分子構造（分子量的２　Ｘ　１０’ダルトン）を有し
ている。

蛋白部分の全アミノ酸の約５０％がセリンとスレオニン
からなり、このアミノ酸の水酸基に長短さまざまの糖鎖
が還元末端であるＧａ１ＮＡｃ　ｔ−介して０−グリコ
シド結合し、特有の粘液性？呈している。この粘液糖蛋
白質の生体機能は、必ずしも生化学的に充分解明てれｔ
とは言い難いが、抗−ｅｆシｙ作用（Ｔａｋａｇａｋｉ
　＆Ｈｏｔｔａ　、　Ｂｉｏｃｈ＊ｍ　、　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ−Ａｃｔａ　、　５８４巻、２８８頁、　１９７９
年〕　を有すること等からして、粘膜深部の細胞金ペゾ
シンから保護するなどの粘膜防御因子の一種として働い
ていると信じられている。

一方、ムシンを分解する酵素、すなわちムシンを基質と
しグリコシダーゼ活性を持つ酵素を微生物源に限って求
めてみると、免疫グロブリンＧに作用するＤｉｐｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのエンド−β−Ｎ−
アセチルグルコサミニダーゼ（Ｍｕｒａｍａｔａｕ　、
　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｓｍ、、　２４６巻、　５５３５頁、
　１９７１年〕の発見と的後して次々と種々の酵素が知
られるようになつ几。丁なわち、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα−Ｌ−フコシ〆−ゼ（
Ａｍ１ｎｏｆｆ　＆Ｆｕｒｕｋａｗａ　、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２４５巻、　１６５９頁、　
１９７０年〕、Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｏｒａｅ　（Ａ
ｄａ等、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋２
４巻、４０９頁、　１９６１年〕やＣ，ｐｅｒｆｒｉｎ
ｇｅｎｓ（Ｃａａｓｉｄｙ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｍ、、　２４０巻、　３５０１頁、　１９６５年〕
のノイラミニダーゼ、Ｃ、ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのα
−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＭｅＧｎｉｒｅ
等、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　２
８巻、７５５頁。

１９７２年〕等がその例として挙げられる。ま友、Ｈｕ
ａｎｇとＡｍ　ｉ　ｎｏ　ｆ　ｆはＣ，ｐｅｒｆｒｉｎ
ｇｅｎｓの培養液中に糖鎖と蛋白質の０−グリコシド結
合全切断するエンド型のα−Ｎ−アセチルガラクトサミ
ニダーゼ活性ｔ−認めている（　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｍ、　、　２４７巻。

６７３７頁、　１９７２年〕。最近では、Ｒｕｍ　１ｎ
ｏｃｏｃｃｕｓ属やＢ　ｉｆｉｄｏｂａｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ属細菌でβ−Ｎ−７セチルグルコサミニダーゼやβ
−ガラクトシダーゼ活性が報告式れている（　Ｈｏ５ｋ
ｉｎｓ等、　Ｊ、　Ｃ１１ｎｉｃ。

Ｉｎｖｅｓｔ、、　７５巻、９４４頁、　１９８５年〕
。

以上の如く、細菌が生産するムシン分解酵素の例は多数
報告され、動植物起源でも種々の報告例かめるが、かつ
て放線菌における知見はなかった。

〔問題点を解決する尼めの手段〕

本発明者らは、昼力価のムシン分解酵素生産株を自然界
の放射菌に求め、鋭意検索を行った結果、ストレプトミ
セス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　）属にムシン資化能
全有し、かつ著量のエキソ−α−Ｎ−ガラクトサミニダ
ーゼ、エキソ−α−Ｌ−フコンダーゼもしくはエンド−
α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを生産する菌株
を見い出し、本発明を完成し訃 丁なわち、本発明はストレプトミセス属に属する菌が生
産するムシン分解酵素及びその製造法全提供するもので
るる。

本発明のムシン分解酵素全生産する菌としては、例えば
本発明者らによって静岡県域ケ崎の土壌から新たに分離
されたストレットミセス・エスピー・０Ｈ−１１２４２
（微工研菌寄第９２４３号（ＦＥＲＭｐ−９２４３））
が挙げられる。

本菌株の菌学的性質を示すと次のとうりでるる。

（１１形態的性質 栄養菌糸は各種寒天培地上で工〈発達し、分断は観察さ
れない。気菌糸はグリセａ−ルアスフ９ラギン寒天やス
ターチ・無機塩寒天等で豊富に着目し、灰色系の色調？
呈する。顕微鏡下の観察では、気菌糸は直線状を呈し、
２０個以上の胞子の連鎖が認められる。胞子の大きさは
０．８龍Ｘ　Ｑ、　７　ｆｌで円柱状である。胞子の表
面は平滑である。菌核、胞子のうお工び遊走子は見出さ
れない。

（ＩＩ）　　各種培地上での性状 イー・ピー・シャーリング（Ｅ、Ｂ、Ｓｈｉｒｌｉｎｇ
　）とデー・ゴツトリープ（Ｄ、　Ｇｏｔｔｌｉｅｂ　
）の方法（インンターナショナル・シャーナル拳オプ・
クステイマテイクク拳バクテリオロゾー、１６巻。

３１３頁、　１９６６年）によって調べた本生産菌の培
養性状を第１表に示す。色調は標準色として、カラー・
ハーモニー−マニニアル第４　Ｊｉ　（コンテナー・コ
ー？レーション・オプ・アメリカ・シカゴ、　１９５８
年）を用いて決定し、色票名とともに括弧内にそのコー
ドを併せて記し几。

以下は特記しない限り、２７℃、２週間口の各培地にお
ける観察の結果である。

以下余白 ｔｉｌ＋１　　生理学的諸性質 （１）　　メラニン色素の生成 イ）チロシン寒天　　　　　　生産しない（ロ）−ｅデ
トン・イースト鉄寒天　　　　生産しない（ハ）　グル
コース・ペプトン・　　　　　生産しないゼラチン培地
（２１〜２３℃） （２）チロンナーゼ反応　　　　陰性 （３）硫化水素の生産　　　　　陰性 （４）硝酸塩の還元　　　　　　陽性 （５）　　ゼラチンの液化（２１〜２３℃）　　陽性（
グルコース・ペゾトン書 ゼラチン培地） （６）　　スターチの加水分解　　　陰性（７）脱脂乳
の凝固（３７℃）　　陰性（８）　　脱脂乳のペプトン
化（３７℃）　　　陽性（９）生育温度範囲　　１５℃
〜３６．５℃αｅ　炭素源の利用性 （プリーダム・ゴトリーブ寒天培地） Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、ラフィノース、Ｄ−
フルクトース、Ｌ−アラビノース、メリビオース、Ｄ−
キシロース、ラムノース、イノシトール？利用する。

（Ｉｌｌ　　セルロースの分解　　　　陰性制　ムシン
の資化性 陽性 （■　細胞壁組成 細胞壁のシアミノピメリン酸はＬＬ型である。

以上、本閑の歯学的性状全要約すると次のとおりでるる
。細胞壁中のシアミノピメリン酸はＬＬ型でめる′。気
菌糸の形態は直線状で、長い胞子鎖を形成する。胞子の
表面は平滑である。培養状の諸性質としては、栄養菌糸
はブラウン系の色調を呈し、気菌糸は灰色系の色調を呈
する。黄色系の可溶性色素を生産する。

これらの結果から、本菌株はストレゾトミセス属に属す
る菌種であり、ブリドハムとトレスナーの分類（バーシ
ーズ・マニュアルφオプーデターミネーテイプ・バクテ
リオロシー、第８版、７４８〜８２９頁、　１９７４年
）によるダレイシリーズに属する菌種であると考えられ
る。

なお、本菌株はストレプトミセス俸エスピー・０Ｈ−１
１２４２（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅａ　ｓｐ、　０Ｈ−１
１２４２）として、工業技術院微生物研究所に寄託され
でいる（微工研菌寄第９２４３号）。

本発明のムシン分解酵素は、例えば上述した菌を栄養培
地中で培養し、該培養物から酵素を分離することによっ
て得られる。

培養にメ友っては通常の微生物の培養方法が用いられ、
用いる培地、−１温度、培養時間などについては、上記
菌株が生育すれば、何れの条件でも工い。

培地としては、炭素源、窒素源、無機物、必要に応じて
その他の栄養物を程よく含有する合成培地または天然培
地を使用することができる。

培地に使用される炭素源、窒素源は使用菌株の利用可能
なものならいずれの種類でも良い。すなわち炭素源とし
ては、友とえはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、マルトース、マンニット、キンロース、ガラクトー
ス、ラクトース、リゼース、澱粉、ムシンまたはその加
水分解物等の種々の炭水化物が使用できる。その濃度は
通常、培地に対して０．１％〜５％（グルコース換算）
が好ましい。またグルコン酸、ピルビン酸、乳駿、酢酸
等の各種有機酸、グリシン、グルタミン酸、アラニン等
の各種アミノ酸、さらにはメタノール、エタノール等の
アルコール類やノルマル／Ｑラフイン等の各種の非芳香
族系炭化水素、おるいは植物性もしくは動物性の各種油
脂等も使用可能である。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、燐酸
アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等
の各種の無機酸るるいは有機酸のアンモニウム塩類、尿
素、ペプトン、ＮＺ　−アミン、肉エキス、酵母エキス
、乾燥酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加
水分解物、フィツシュミールるるいはその消化物、大豆
粉あるいはその消化物、脱脂大豆るるいはその消化物、
蛸加水分解物等の含窒素有機物質、さらにはグリシン、
グルタミン酸、アラニン等の各種アミノ酸が使用可能で
ある。

無機物としては各種燐酸塩、硫酸マグネシウム、食塩等
、さらに微量の重金属塩が使用される。

ま友栄譬要求性を示す変異株を用いる場合には、当然そ
の栄養要求を満足させる物ｘｉ培地に加えなければなら
ないが、この種の栄養素は天然物を含む培地を使用する
場合にはとくに添加を必要としない場合がある。

また使用菌株としては、前記０Ｈ−１１２４２株の他ム
シン分解酵素生産能を有するストレプトミセスに属する
菌株から公知の変異処理法に工！ｌｌ誘導されるα−メ
チルグルコシド耐件株や２−デオキシグルコース耐性株
などの変異株も用い得る。

醗酵は振盪培養、または通気攪拌深部培養等の好気的条
件下で行なう。培養温度は通常２０〜４０℃である。培
養期間は通常１〜８日で、菌体内外に著量のムシン分解
酵素が生成蓄積する。培養終了後に培養物より、ムシン
分解酵素に７’ｊとえば次の方法で採取する。培養物を
遠心分離により炉液と沈澱に分離する。Ｆ液から硫安、
？リエチレングリコール、有機溶媒等を用いる沈澱法に
より本発明のムシン分解酵素を取得する。沈澱物からは
、超音波処理、その他の方法により、菌体を破砕して酵
素を溶出させｔ後、常法にｚｖ本発明の酵素を取得する
。さらに、通常用いられる公知の方法、例えばイオン交
換、分子篩、吸着、分配等の各種クロマトグラフィー法
、塩析法、透析法、濃縮法など？適宜組み合わせること
によりＦ＊製することができる。

上記のようにして得られた本発明のムシン分解酵素には
、■ムシン及びα−グリコシド結合金持つｐ−ニトロフ
エニル−α−Ｌ−フコシ）’　ニ作用し、Ｌ−７コース
？遊離する酵素、■ムシン及びα−グリコシド結合を持
つｐ−ニトロフエニル−α−Ｎ−アセチルガラクトサミ
ニドに作用し％Ｎ−アセチルガラクトサミンを遊離する
酵素、及び■ムシンに作用し、還元末端にＮ−アセチル
ガラクトサミンを有する３糖以上のオリゴ糖を遊離する
酵素の３種類が存在する。以下、これらの酵素？それぞ
れＥｚ、！、Ｅｚ、ＩＩ、Ｅｚ、Ｉ［ｌと略記スル。

Ｅ　ｚ、Ｉ、■及び■の酵素学的性質は以下のとうりで
るる。

＜Ｅｚ、Ｉの酵素学的性質〉 （１）　　作用 ムシンおよびα−グリコシド結合金持つｐ−二トａフェ
ニルーα−Ｌ−フコシドニ作用し、Ｌ−７コースを遊離
する。

１２）　　至適− ３７℃における至適−は５〜６付近である。

（３）−安定性 ＰＨ５，ｓ付近で最も安定テあす、ｐＨ４，５〜８．０
の範囲で最大活性の５０％以上の活性を有する。

（４）　　至適作用温度 ６０分反応での至適作用温度範囲は３５〜４５℃でるる
。

（５）＠度安定性 ４０℃より低温で安定である。

（６）分子量 セファクリｔｈ　（５ｅｐｈａｃｒｙｌ　）　Ｓ　−２
００ｋ用イルグル戸適法により分子量は約３３，５００
と推定される。

（７）金属イオン等の影響 Ｃａ２＋、Ｍｇ”、Ｍ　ｎ　２＋　は活性をほとんど阻
害しない。Ｃｕ２＋　に工って活性が若干阻害される。

エチレンシアミン四酢酸（ＥＤＴＡ　）による活性阻害
は認められない。ノ９ラクロルマーキュリ安息香酸（Ｐ
ＣＭＢ）による活性阻害が認められる。

（Ｅｚ、■の酵素学的性質〉 （１）作用 ムシン及びα−グリコシド結合を持つｐ−二トロフェニ
ルーα−Ｎ−アセチルガラクトサミニドに作用し、Ｎ−
アセチルガラクトサミン業遊離する。

（２）至適−（ ３７℃における至適−は５〜６付近である。

（３１ＰＨ安定性 ｐＨ５，５付近で最も安定でメク、ｐ）１４．５〜８．
０の範囲で最大活性の５０％以上の活性を有する。

（４）至適作用温度 ３０分反応での至適作用温度範囲４０〜５０℃であり、
３５〜５５℃においても最大活性の５０％以上の活性？
保持している。

（５）　　温度安定性 ５０℃ニジ低温で安定でるり、特に４５℃以下で安定で
める。

（６）　　分子量 セファクリル（５ｅｐｈａｃｒｙｌ　）　Ｓ　−２００
’＜用いるグル濾過法にＬジ分子量は約３９，０００と
推定される。

（７）金属イオン等の影響 Ｃａ２＋、Ｍｇ”　ｌＭｎ２＋　は活性？はとんど阻害
しない。Ｃｕ２＋　によって活性が阻害される。

ＥＤＴＡＩＣよる活性阻害は認められない。

ＰＣＭＢにＩる活性阻害が認められる。

（Ｅｚ、ｉｌｌの酵素学的性質〉 （１）作用 ムシンに作用し、還元末端にＮ−アセチルガラクトサミ
ンを有する３ｍ以上のオリゴ糖を遊離する。

（２）至適… ３７℃における至適−は、５〜６付近でめる。

ｆ３１　　ｐＨ安定性 ｐ）１５〜６で最も安定である。

（４）至適作用温度 ２時間反応での至適作用温度範囲は、３５〜４０℃でお
る。

（５）＠度安定性 ４５℃より低温で、最も安定でるる。

（６）分子量 セファクリル（５ｅｐｈａｃｒｙｌ　）　Ｓ　−２００
″ｆ！：用いるグル濾過法忙おいて、明確なピークが得
られないが、分子量２０，０００から１２０，０００に
相当する両分に活性が認められる。

（７）　　金属イオン等の影響 Ｃａ”、Ｍｇ”、Ｍｎ２＋　は活性上はとんど阻害しな
い。ＥＤＴＡは活性をほとんど阻害しない。

以上のように、本発明のムシン分解酵素Ｅｚ、Ｉは、例
えばＣ６ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｇ　（Ａｍ１ｎｏｆｆ　
＆　Ｆｕｒｕｋａｗａ　、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２４５巻、　１６５９頁
、　１９７０年）や、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇ
ｅｒ　（Ｂａｈｌ　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　
、　２４５巻、２９９頁、　１９７０年）が生産する酵
素とは明らかに異なる性質を有し、また、Ｅｚ、ＩＩ、
Ｅｚ、Ｉｌｌもそれぞれ、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ　ｎｉｇｅｒ　（Ｂａｈｌ　、　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　、　２４５巻、２９９頁、　１９７０年）
とＤ　ｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　（
Ｈｎｇｈｅｓ　＆　Ｊｅａｎｌｏｚ　、　　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　。

３巻、　１５４３　、１９６４年）　、　Ｃ，ｐｅｒｆ
ｒｉｎｇｅｎｓ　（Ｃａｓｓｉｄｙ等、　Ｊ、　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２４０巻、　３５０１頁。

１９１５年）等の酵素と明らかに酵素学的性質を異にす
る。従って、本発明の酵素はいずれも文献未記依の新規
酵素である。

〔発明の効果〕

本発明の酵素は粘液糖蛋白質であるムシンを分解するこ
とから、去痰剤等の医薬として、めるいは診断薬として
、さらには糖蛋白質の構造と機能の解明等を目的とする
分析手段に利用できる。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例１ （１）　　種培地として次の組成のものを用いた。

グルコース　　　２　％ ペゾトン　　　　０１５％ 乾燥酵母　　　　０．３％ 肉エキス　　　　０．５％ ＮａＣｌ　　　　　Ｏ，５％ ＣａＣ０，０，３％ 水道水 ｐＨ７，０ ｒ２１　　ムシン分解酵素生産培地として次の組成の培
地を用いた。

豚胃由来精製ムシン　　　０５　％ グルコース　　　　　０．１　　％ （ＮＨ４’）　ｔｓ　０４　　　　　　０．２６％ＫＨ
！Ｐ０．　　　　　　　０．２４％に、ＨＰｏ、　　　
　　　　　０．４３％Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ，ＯＯ，１％ 微量金属溶液　　　　０．１　　％（Ｖ／Ｖ　）水道水 ＰＨ７，０ ただし微量金属溶液は１００ｙ＋／中に次のものを含む
。

Ｃｕｓｏ、　ｅ　５ＨｔＯＯ，６４ｇ ＦｅＳＯ，−７Ｈ２ＯＯ，１１，！ｉ’ＭｎＣ１１・４
Ｈ！ＯＯ，７９，１ｉｔＺｎＳＯａ　・７ＨｔＯＯ，１
５ｙ （３）　　ストレゾトミセスエスピー０Ｈ１１２４２（
微工研菌寄第９２４３号）を種培地１ｏｏｙｉ含む５０
０１１７容坂口フラスコに接種し、２７℃で２日間培養
し、種培養液を得た。

ムシン分解酵素生産培地１００Ｍ１ｔ−含む５００ｍｔ
容坂ロフラスコに上記の通り得九種培養液２Ｋｇｋ移植
し、２７℃で３日間振盪培養し次。培養終了後、上清液
中に産生され几ムシン分解酵素量全公知の方法により次
の通り測定した０ 基質０．０２モル溶液０．２ｍ、０．２モル酢酸緩衝液
（ｐＨ５，０）０．２ｄ、および上記培養上清液０、４
　ｍ／　を混合し、３７℃で１時間反応させ、次に０．
２モル炭酸す）　ＩＪウム溶液１０１ｊ’ｉ添加して反
応全停止し、さらに水１５１加えて希釈し次溶液のノＱ
ラニトロフェノールにもとず〈４００　ｎｍでの吸光度
を測定した。その結果、ノ９ラニトロフェニルα−Ｌ−
フコシ）’４Ｌ＜ｔｉ、Ｑラニトロフェニルα−ｂ−Ｎ
−アセチルガラクトサミニドを基質に用い次場合の吸光
度はそれぞれ０．１２　、０．５３でめった。

実施例２ 実施例１の工うにして得た培養上清液１１に固定硫安を
８０％飽和になるように加え得られ几沈液（ｐＨ５，０
）ｓ　ｏ　ｏｒｎｔに対し、テ２回透析ｔ、、酵素液を
得た。

酵素液５１、ブタ胃由来精製ムシ７２００〜．０．０５
モルクエン酸緩衝液（ｐＨ４，５）２　ｒｕｌを混合し
、３７℃で一昼夜反応させ、１００℃で１ｏ分間加熱し
て反応を停止させ次。

反応液ｅ２００ｍの水に対して２回透析し、透析外液を
濃縮し次。

バイオグルＰ−４（４００メツシユ）のカラム（１，６
ｃｍｘ９０ｃｍ、１８０＋ｊ）を用イルタル濾過法にて
反応生成物を分析し九ところ単糖、２糖、３糖、４糖と
それより分子量の大きいオリゴ糖が検出され友。

次に６糖及びこれより分子量の大きいオリゴ糖の溶出さ
れ友画分を集め濃縮乾固し几。

濃縮残渣中のオリゴ糖の環元末端の糖を調べる為、公知
の方法（続生化学実験講座第４章、第１４５頁、九１１
）にエフオリゴ糖の還元末端をビリゾルアミノ化し、６
規定塩酸中１００℃で４時間加水分解した後ｆ　Ｉ７ゾ
ルアミノ化糖を高速液体クロマトグラフィーにより分析
し念。カラムは、ペックマンウルトラスフェア０ＤＳ（
４，６Ｘ２５０１１１）ｔ″用い、０．０１モルクエン
酸緩衝液（ｐＨ４，０）に１％アセトニトリルを混合し
た溶液で溶出した。

その結果的９８％がピリゾルアミノ化ガラクトサミンで
あつ７ｔ。

比較の為、ディジｏ　＝ｙ　７カｘ　（Ｄｉｐｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ　）属細菌由来のＯ−グルカナーゼ（生化学工
業製）をムシンと反応場せ、同様に分析し几ところ２糖
からなるオリゴ糖のみが検出された。

実施例３ 実施例１のように実施し、たｙ−シ、培養２日月で培養
を終了して、培養液５１Ｙｔ得友。この上清液に同温硫
安を８０％飽和になる工う加え、得られ次沈澱物ｔｏ、
０１モルβ−メルカノトエタノールを含む０．０１モル
クエン酸緩衝液（ｐＨ５）５０１に溶解し友。これを同
一組成の緩衝液１ｅに対して３回透析し、不溶物ｔＦ別
した後凍結乾燥して粗酵素粉末２．４ｇを得た。

上記の緩衝液で予め平衡に達せしめたバイオゲルｐ−６
０のカラム（２ｃｒＩＬｘ　９０ＣｒｒＬ、　２８０ｍ
Ｊ？）の上端に粗酵素（２ｇ）ｔ−負荷し、０．１モル
Ｋｃｌを含む上記緩衝液１１で溶出し分画した。分画容
量約３−５ｄ　、溶出速度は２５〜３０ｄ／時でめった
。

各両分のムシン分解酵素活性を実施例１で用いた方法に
ニジ測定し友ところ、第７５番目の両分前後に、９ラニ
トロフェニルα−フコシドを分解する活性のピークが、
また第６２番目の画分前後にノＱラニトロフェニルα−
Ｎ−アセチルガラクトサミニドを分解する活性のピーク
ｔ−認めた。第３０〜５５番目、第５６〜７０番目、第
７１〜８０番目の画分を集めて濃縮し、それぞれ試料Ａ
、Ｂ。

Ｃを得几。

実施例４ 実施例３で得た試料Ａの溶液１　ｒｎｌ　ｆ使用した０
０．０１モルクエン酸緩衝液で予め平衡に達せしめ次バ
イオダルｐ−６０のカラム（１，６ｃＩＬｘ　５０ａｎ
。

１００　Ｎｔ’）の上端に試料全負荷し、同一緩衝液で
溶出分画した。分画容量０．５〜１′ＩＬｌ、流速は７
〜１０ｄ／時とし友。第４６〜８５番目の両分を集めて
３　ｍｌまで濃縮し、水、次に上記緩衝液１００１に対
して透析し、酵素液を得た。酵素液０．２　ｍ、ブタ胃
由来の精製ムシ７８０■、０．０２モル酢酸緩衝液（ｐ
）（５，０）２ｍｊからなる反応液ｔ−３７℃２５時間
保温した。ｇ　ｍｔエタノール金加えて反応を停止し、
生じた沈澱を戸別し、涙液を濃縮乾固し友。残渣を少量
の水に溶解し、シリカゲル薄層（メルク社製第５７４８
番）にスポットし、ブタノール−酢酸−水（３：１：１
）からなる溶媒系で展開後、ジフェニルアミンで発色さ
せた。その結果、ムシン分解生成物として、３糖、４糖
とそればあ分子量のオリゴ糖が検出嘔九友。かくして得
られた酵素は前記Ｅｚ、ＩＩＩと同一の性質？示した。

実施例５ 実施例３で得た試料Ｂの溶液ＩＪｖｉ−使用した。

水に懸濁したセファロースＣＬ−４Ｂのカラム（１，６
×４２ｃＩＩＬ、８５１１ＩＺ）に試料全負荷し、水で
溶出、分画し念。分画容量０．５〜Ｑ、　ｇ　ｍｌ　、
溶出速度７〜１１ｙｎｌ／時でめった。第７７−８５番
目の両分を集めてｌ　ｔｕｇにまで濃縮し几。

めらかじめ０．０１モルリン酸緩衝液（−７）で平衝に
達せしめたＤＥＡＥ）ヨ、Ｑ−ルのカラム（１，６Ｘ４
２α、８５１７）の上端に上記の濃縮液１−全負荷し、
０．０１モルリン酸緩衝液中ＮａＣｌのの濃度勾配によ
り溶出分画した。分画容量０．５〜１−１溶出液の流速
は８〜１０　ａｔｙ時でめった。

０．１５モル付近のＮａＣｌで溶出される第２７−３２
番目の画分を集めて濃縮し、酵素液？得比。

本酵素は前記Ｅｚ、ｎと同一の性質を示した。

実施例６ 実施例３で得友試料Ｃの溶液２．５　ｄ　′ｆｒ：使用
し念。

０．０１モルβ−メルカデトエタノールヲ含ム０．０１
モルクエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）で予め平衡に達せし
めたＤＥＡＥトヨノＱ−ルのカラム（１，６ｃｌｒＬｘ
９０ｃｍ、１８０！ＩＬｔ）に試料全負荷し、上記と同
一の緩衝液中ＮａＣ１の濃度勾配によＶ溶出分画し友。

分画容量１．５〜２．５１、溶出液の流速は２０−３　
Ｑ　ｒｎｌ１時でめつｆｔｏ約０．２そルのＮａＣｌで
溶出される部分の第７０−７５番目の画分を集めて濃縮
し、酵素試料？得た。本酵素の性質は、前記Ｅｚ、Ｉと
同一でめつ友。

参考例〔菌の分離方法〕 静岡県域ケ崎海岸で採取し友±１１０．５ｇＴｈ使用し
友。土壌試料？滅菌水５０鮮に懸濁し、懸濁液のＱ、３
ｍｌ’ｊＨ５０℃に保温した分離用寒天培地１０−中に
加え、攪拌後、シャーレに流し放冷固化させ友。分離用
培地は次の組成のもの？用いた。

澱　　粉　　　　　　　　１　％ グリセロール　　１　％ （ＮＨ４）！　Ｓ　０４　　　０．２％ＣａＣ０，０，
２％ に、ＨＰＯ４０，１％ Ｍ　ｇ　Ｓ　０４　　　　　　　０−１％ＮａＣ６Ｏ，
１％ 寒　　天　　　　　　　　１．０％　　ジＩ７，０シャ
ーレを２７℃で保温し、２日目から１００日目での間に
出現する菌集落を順次釣菌し、同−組成のスラントに移
植し、２７℃で生育嘔せることにより、１５０株を得友
。

上記のようにして得几菌株のムシン分解酵素生産能全欠
の通り調べた。

ムシン分解酵素生産用培地（実施例１）１０１１Ｌ／を
含む５０Ｗｔ容試験管（２×２０ｃｒｒＬ）に各スラン
トの供試菌七植苗し、２７℃で５日間振盪培養した。培
養終了後、培養液を遠心分離し、上清液中のムシン分解
酵素活性を実施例１記載の）Ｑラニトロフェニルα−Ｄ
−Ｎ−アセチルガラクトサミニド七基質として用いる方
法で測定し、最も活性の高い菌株を検索し、ストレプト
ミセス属に属する株菌？得几。

本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所にストレプ
トミセス・エスピー・０Ｈ−１１２４２（微工研菌寄第
９２４３号（ＦＥＲＭ　Ｐ−９２４３）’）として寄託
されている。

以上 出願人　北里研究所（社団法人） １−−１＋。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ストレプトミセス属に属する菌が生産するムシン分
   解酵素。 ２、ムシン及びα−グリコシド結合を持つｐ−ニトロフ
   エニル−α−Ｌ−フコシドに作用し、Ｌ−フコースを遊
   離する酵素である特許請求の範囲第１項記載のムシン分
   解酵素。 ３、ムシン及びα−グリコシド結合を持つｐ−ニトロフ
   エニル−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニドに作用し、
   Ｎ−アセチルガラクトサミンを遊離する酵素である特許
   請求の範囲第１項記載のムシン分解酵素。 ４、ムシンに作用し、還元末端にＮ−アセチルガラクト
   サミンを有する３糖以上のオリゴ糖を遊離する酵素であ
   る特許請求の範囲第１項記載のムシン分解酵素。 ５、ストレプトミセス属に属するムシン分解酵素生産菌
   を培養し、該培養物よりムシン分解酵素を採取すること
   を特徴とするムシン分解酵素の製造法。