JPH0437719B2

JPH0437719B2 -

Info

Publication number: JPH0437719B2
Application number: JP59212716A
Authority: JP
Inventors: Hideji Nishibashi; Tadashi Katabami; Mikio Ooyama; Tadao Matsubayashi
Original assignee: Dainippon Ink and Chemicals Co Ltd
Current assignee: DIC Corp
Priority date: 1984-10-12
Filing date: 1984-10-12
Publication date: 1992-06-22
Also published as: JPS6192589A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ストレプトマイセス属に属する微生
物の生産するβ−１，３糖分解酵素（β−１，３
グルカナーゼ）を用いてβ−１，３グルコシル糖
化合物を分解して得られたラミナリペンタオース
（グルコースがβ−１，３の位置で５個結合した
ものG₅）を製造する方法に関するものである。最近、デンプンを分解して得られるマルトオリ
ゴ糖（G₃〜G₆）の製造技術の開発が要望されて
おり、これらは食品の甘味料、増量剤、賦形剤、
包接剤として食品、薬品、及び種々の工業製品に
広く利用できると考えられている。これと同様に
新規なラミナリペンタオースはこれらの分野への
新たな用途を提供することができるものである。また近年、抗腫瘍活性、抗細菌感染症作用、免
疫系に及ぼす作用等を持つ拒子菌、子のう菌、不
完全菌類等が産生する多糖化合物の構造分析が精
力的に検討され、活性多糖の基本骨格は３〜５個
のβ（１→３）−Ｄ−グルカン直鎖にβ−１，６モ
ノグルコシル分岐鎖が結合したものであるという
報告がなされている。〔水野卓；化学と生物
Vol.21、No.７、P473〜（1983）、水野卓；農芸化
学大会要旨集P13（1984）、三崎旭；農芸化学大会
要旨集P14（1984）〕そしてこれら活性多糖化合物
の化学合成が分岐グルコ四糖から試みられ、ま
た、農薬、抗生物質の生理作用を分子レベルで解
明する為、細胞表層グルカンの化学合成がマンノ
ペンタオースを出発原料として行なわれている。
〔ともに小川智也；化学と生物Vol.20、No.12P789
（1982）〕ラミナリペンタオースは、これらの化学
合成の出発物質として有用なものである。（発明の構成）本発明者らはβ−１，３グルコシル糖化合物を
ラミナリペンタオースに分解する微生物を鋭意検
索の結果、ストレプトマイセス属に属する一菌株
が生産するβ−１，３糖分解酵素（β−１，３グ
ルカナーゼ）の一種がβ−１，３グルコシル糖化
合物を分解し、高収率でラミナリペンタオースを
生成することを見い出し本発明を完成するに至つ
た。即ち、本発明はβ−１，３グルコシル糖化合物
又はその部分分解物をラミナリペンタオースに分
解する能力を有するストレプトマイセス属に属す
る微生物の生産するβ−１，３糖分解酵素（β−
１，３−グルカナーゼと称す）をβ−１，３グル
コシル糖化合物又はその部分分解物に作用させて
得られることを特徴とするラミナリペンタオース
の製造法を提供するものである。（従来技術） β−１，３糖分解酵素は、これまで主として酵
母細胞壁の溶解あるいは、ビール工業における麦
汁の粘度低下を目的として利用されているにすぎ
ず、分解生成糖を採取することを目的とした報告
は見あたらない。β−１，３グルコシル糖化合物
類を分解してラミナリペンタオースの生成を確認
している報告はあるが他の菌株のものである。またストレプトマイセス属に放線菌が生産する
β−１，３グルカナーゼは主に酵母細胞壁の溶解
を目的としたものとして知られており、例えばス
トレプトマイセスアルビドフラバス｛st.
albidoflavus；酵母工学学誌第43巻No.10 766頁〜
（1965）｝、ストレプトマイセスエスビー
（Streptomyces SP.）｛Aqricul.Biolog.Biochem.
第111巻、358頁〜364頁、（1965）｝、ストレプトマ
イセスムリナス（Streptomyces murinus）
｛醗酵工学会誌第59巻、No.６ 599頁〜（1978）｝
等が報告されているが、いずれもラミナリペンタ
オースを主生成物としたものではなく本願のβ−
１，３グルカナーゼとは異なるものである。本発明で使用されるβ−１，３糖分解酵素は、
ストレプトマイセス属に属する微生物により生産
され、β−１，３グルコシル糖化合物又はの部分
分解物に作用し、ラミナリペンタオースを主成分
とする分解生成物を生ぜせしめる能力を有する醗
素であればいずれでも良いが、好ましくはストレ
プトマイセスマチンシス DIC−108を培養し
て得られるβ−１，３糖分解酵素（β−１，３グ
ルカナーゼFiと称す）である。 β−１，３−グルカナーゼにより生成するラミ
ナリペンタオースは、使用するβ−１，３グルコ
シル糖化合物の種類や糖化時の反応条件（例えば
β−１，３グルコシル糖化合物の濃度、PH、温
度、酵素濃度）によつても異なるが、通常β−
１，３グルコシル糖化合物に対して収率20〜90重
量％の値の得られるβ−１，３−グルカナーゼで
あることが望ましい。本発明で好ましく用いられるβ−１，３グルカ
ナーゼFiの性質を次に示す。 (1) 作用；β−１，３グルコシル糖化合物、例え
ばカードラン、ラミナリン、パキマン、醗母細
胞壁、又はその部分分解物などからラミナリペ
ンタオースを主成分とす糖分解物を生成する。 (2) 作用PH範囲及び最適作用PH；PH３〜９の範囲
に作用し、最適PHは、６付近である。（第１図
参照） (3) 作用温度範囲及び最適作用温度；約70℃まで
作用し、最適作用温度は約60℃である。（第２
図参照）。 (4) 精製方法本酵素は培養ロ過液から硫安65％飽和で沈澱
物として回収後、DEAE−Sephadex Ａ−25カ
ラムクロマトグラフイー（0.01M Tvis−Hcl
緩衝液PH7.5で平衡化）を行い、その未吸着区
分を集める。次いで、CM−セフアデツクスＣ
−25カラムクロマトグラフイー（0.01M酢酸バ
ツフアーPH6.0で平衡化）を行い。NaClの0.1M
溶液で溶出される区分を集め、硫安50〜70％飽
和としてその沈澱物を回収する。その後、
Sephadex Ｇ−100（フマルマシア社製）ゲルク
ロマトグラフイー（0.01Mリン酸バツフアー、
PH7.0で平衡化）を行うことにより、クロマト
的に単一酵素に精製できる。 (5) 分子量；Sephadex Ｇ−100ゲルクロマトグ
ラフイーによる分子量は約31000と推定できる。本発明の酵素は、上記β−１，３グルカナーゼ
が好ましく用いられるが、この酵素はストレプト
マイセス属の菌株、好ましくは、ストレプトマイ
セスマテンシス DIC−108より得られる。又、こうしたβ−１，３−グルカナーゼは、特
異的にラミナリペンタオースを生成させる為、β
−１，３グルカンの構造解析用の手段となりうる
ものである。また他の好ましいものとしてこれら
の菌株を人工的に変異処理即ち化学、物理的手段
による変異誘発処理を行うことにより得られる人
為的突然変異株、あるいは自然変異株も全て含ま
れる。本発明で好ましく使用される前述の菌株の菌学
的性質は特開昭59−17996号公報にも示されてい
るが次のとおりである。〔ストレプトミセス・マテンシス DIC−108の
菌学的性質〕 (1) 形態的特徴使用した培地（ISP培地を含む）上での栄養
菌糸の生育は優れており、デンプン無機塩、オ
ートミール寒天、イースト麦芽寒天培地上で豊
富な気菌糸を形成する。胞子形成気菌糸は直状
又は直状又は直曲状である。胞子は楕円体で大
きさは、短径×長径0.7〜0.8μ×1.0〜1.2μであ
る。走査型電子顕微鏡による観察では胞子の表
面構造はイボ状（Warty）である。 (2) 各種培地における生育状態 (1) シユクロース硝酸塩寒天培地（37℃）薄茶色の基生菌糸状に灰色の気菌糸を形成
し、溶解性色素はみとめられない。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地（37
℃）薄黄白色の生育で気菌糸の形成はみとめら
れない。また溶解性色素はみとめられない。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP
培地−No.５ 37℃）薄黄色の生育で気菌糸の着生はみとめられ
ない。又、また溶解性色素はみとめられな
い。 (4) スターチ・無機塩寒天培地（ISP培地 37
℃）無色の発育上に緑灰色の気菌糸を着生し、
溶解生色素はみとめられない。 (5) チロシン寒天培地（ISP培地−７、37℃）薄茶色の発育上に培養７日目では気菌糸は
着生せず、14日目で白灰色の気菌糸を着生す
る。溶解性色素はみとめられない。 (6) 栄養寒天培地（37℃）緑灰黒色の発育上に薄緑灰色の気菌糸を着
生し、溶解生色素はみとめられない。 (7) イースト麦芽寒天培地（ISP培地−２、37
℃）薄茶色の発育上に薄緑灰色の気菌糸を着生
する。水溶性色素の生成はみとめられない。 (8) オートミール寒天培地（ISP培地−３、37
℃）無色の発育上に薄緑灰色の気菌糸を着生
し、水溶性色素の生成はみとめられない。 (3) 生理的性質 (1) 生育温度範囲酵母エキス・麦芽エキス液体培地による生
育試験では、30℃〜50℃で生育するが、至適
温度は37℃〜45℃である。 (2) ゼラチンの液化：陰性 (3) 脱脂乳の凝固及び脱脂乳のペプトン：陰性 (4) メラニン色素の生成（ペプトン・イース
ト・鉄寒天培地、ISP培地６）：陰性 (5) デンプンの分解性：陽性（分解ゾーンに白
いリングを形成） (6) 炭素源の利用性（プリドハム、ゴドリープ
寒天培地−９、37℃）Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−
キシロース、Ｄ−フルクトース、イノシトー
ル、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンニトール、ガ
ラクトースをよく利用して生育し、シユクロ
ース、ラフイノース、サリシンは利用しな
い。 (7) 細胞壁組成 ISPに記載されている糖組成Typeとして
はType1に属する。なお本菌株は、工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託申請し、微工研菌寄第6593号と
して寄託されている。本発明による酵素生産の為の培養は、通常の固
体培地又は液体培地が使用され、液体培養の為の
培地の炭素源としては、β−１，３グルコシル糖
化合物であれば利用できる。例えば、カードラン、パキマン、ラミナリン、
リケナン、酵母細胞壁又はその部分分解物、リユ
ウコシン、カロース、パラミロン等が挙げられ、
又窒素源としては、硫安、塩安、リン安、硝酸ナ
トリウム、尿素、ペプトン、カゼイン等、有機窒
素、無機窒素、いずれも利用できる。天然栄養源としては、例えば各種糖蜜、コーン
ステイープリカー、オートミール、味液、魚粉、
肉エキス、酵母、酵母エキス、ポテトエキス、麦
芽エキス等があげられる。無機物としては、例えばリン酸ニカリウム、リ
ン酸−ナトリウム、硫酸マグネシウム、微量金属
類などが挙げられる。その他、必要に応じてビタ
ミン類等を添加することもできる。これらの使用
濃度としては、0.1〜40重量％が用いられる。ま
た醗酵中に発泡を抑制するため、0.0001〜1.0重
量％の消泡剤を添加してもよい。消泡剤として
は、シリコーン、大豆油など通常の消泡剤を用い
る。培養方法は、振とう培養、通気培養なだの好気
的液体培養が通しており、PH5.0〜8.0、培養温度
20℃〜50℃で１〜６日、望ましくはPH6.5〜7.5、
35〜40℃で２日前後培養する。 β−１，３グルカナーゼは、菌体外に生産する
酵素であるので、培養終了後、ロ過又は遠心分離
して除菌し、上清液を回収する。そして必要に応
じて濃縮し、硫安、硫酸ナトリウムによる塩析、
又はアセトン、エタノール、メタノール、イソプ
ロパノールなどの有機溶剤を加え、酵素を沈澱物
として取得し、乾燥、保存する。本発明のラミナリペンタオースはβ−１，３糖
分解酵素を水又は緩衝液に懸濁させた前述のβ−
１，３グルコシル糖化合物の１〜10重量％溶液に
対し14〜15μ／mgの本酵素を50〜1000単位／加
え、PH４〜8.5、好ましくは５〜7.5、反応温度30
〜70、好ましくは40〜60℃の反応条件で30分〜24
時間、好ましくは10〜20時間反応させることによ
つて得られる。本発明のラミナリペンタオースは、食品の甘味
料、増量剤、賦形剤、包括剤として食品、医薬品
等種々の工業製品に利用可能であり、又抗腫瘍活
性、抗細菌感染症作用、免疫系に及ぼす作用等を
有する医薬品の中間原体として有用なものであ
る。以下に実施例により本発明を詳細に説明する
が、文中「部」及び「％」は重量基準であるもの
とする。実施例１ β−１，３グルカナーゼFiの調製 500mg容の坂口フラスコ10本に、ポリペプト
ン（牛乳カセインの酵素分解物、和光純薬工業
株式会社販売）0.2％、酵母エキス（和光純薬
工業株式会社販売）0.2％、K₂HPO₄0.2％、
MgSO₄・7H₂O0.1％からなる液体培地（PH7.0）
を各々に100mlづつ分注した。常法による殺菌
後、ストレプトマイセス・マテンシスDIC−
108（微工研菌寄第6593号）を接種し、35℃で３
日間振盪培養した。培養後、ブフナーでロ過を
行つて除菌し、得られた上清液を65％の飽和硫
安として沈澱を回収した。これを0.01Mのリン
酸緩衝液PH7.0で溶解して得られた粗酵素中に
は、ラミナリペンタオースを分解するβ−１，
３グルカナーゼが存在する為、0.01Mトリム緩
衝液で平衡化したDEAE−セフアデツクスＡ−
25カラムに吸着させ、その未吸着部分を回収す
ることにより、β−１，３グルカナーゼFiを
得た。得られた活性は14.7単位／mgタンパク
〔396.9単位（27mg）〕であつた。分解反応カードラン（ｎ＝550、和光純薬工業式会社
製品）0.25ｇに、該酵素液2.2単位を添加して
全量を５mlとし、45℃で24時間反応させた。そ
の結果ラミナリペントースは188mgで得られ、
収率は75.2％であつた。そして得られたカード
ラン糖化物中の糖組成を、高速液体クロマトグ
ラフイー｛充てん剤；Lichrosorb−NH₂5μｍ
（メルク社製）、溶出液；アセトニトリル70％、
水30％）｝で分離定量を行つた結果、77％が水
溶性オリゴ糖となり、その内訳はラミナリペン
タオース5.2％で残り1.8％はラミナリトリオー
ス、ラミナリテトラオース、ラミナリヘキサオ
ース、ラミナリヘプタオース、ラミナリオクタ
オースであつた。（第３図参照）〔酵素力価の決定〕 0.01Mの酢酸バツフアー（PH6.0）に、カード
ラン１％を懸濁させ、それに適量の酵素を加え
て、水で5.0mlとし、45℃で反応させる。この条
件で１時間に１mgのグルコースに相当する還元力
を生成する酵素量を１単位とする。実施例２実施例１で用いたカードランの代わりに酵母細
胞壁（Candida属）不溶性ラミナリン、パキマ
ン、各々0.2ｇに、実施例１で得られた酵素液2.2
単位を添加して全量を５mlとし、45℃で24時間反
応させた。そして得られた酵母細胞壁ラミナリン、及びパ
キマンの糖化液中の糖組成を実施例１と同様の方
法にて分離定量を行つた。結果を表−１に示し
た。【表】

【図面の簡単な説明】

第１図はβ−１，３グルカナーゼFiのPHと活
性の関係を示し、第２図はβ−１，３グルカナー
ゼFiの温度と活性の関係を示し、第３図は、β
−１，３グルカナーゼにより分解されたカードラ
ンの分解物を高速液体クロマトグラフイーで分析
したチヤートを示し、数字は、各々１ラミナリト
リオース、２ラミナリテトラオース、４ラミナリ
ヘキサオース、５ラミナリヘプタオース、６ラミ
ナリオクタオースを示すものである。

Claims

【特許請求の範囲】１ β−１，３グルコシル糖化合物又はその部分
分解物をラミナリペンタオースに分解する能力を
有するストレプトマイセス属に属する微生物の生
産するβ−１，３糖分解酵素をβ−１，３グルコ
シル糖化合物又はその部分分解物に作用させて得
られることを特徴とするラミナリペンタオースの
製造法。２ β−１，３グルコシル糖化合物が、カードラ
ン、パキマン、ラミナリンであることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載のラミナリペンタオ
ースの製造法。