JP3058600B2 - ネオフラクトオリゴ糖の製造法 - Google Patents
ネオフラクトオリゴ糖の製造法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規に発見した菌
の菌体またはその菌が産生する酵素を用いて、フラクト
オリゴ糖と共にネオフラクトオリゴ糖を同時に製造する
方法に関するものである。
の菌体またはその菌が産生する酵素を用いて、フラクト
オリゴ糖と共にネオフラクトオリゴ糖を同時に製造する
方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】微生物が産生する糖転移酵素または糖加
水分解酵素を糖質に作用させることにより、種々のオリ
ゴ糖を製造することがなされている。
水分解酵素を糖質に作用させることにより、種々のオリ
ゴ糖を製造することがなされている。
【０００３】代表的な例をあげると、シュクロースに、
オウレオバシディウム(Aureobacidium) FERM P-4257 、
オウレオバシディウム・プルラリア・ヴァル・メラニゲ
ヌム(Aureobacidium pullularia var melanigenum)、オ
ウレオバシディウム(Aureobacidium) ATCC 9348 、アス
ペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) ATCC 20611、
アスペルギルス・ジャポニクス(Aspergillus japonicu
s) Mu-2などの微生物が産生するフラクトシルトランス
フェラーゼ（フラクトース転移酵素、β-fructo-franos
idase)を作用させて、シュクロースのフラクトースにフ
ラクトースがβ−１，２結合で１分子結合した１−ケス
トース (ＧＦ2)、２分子結合したニストース (ＧＦ3)、
３分子結合した１−フラクトシルニストース (ＧＦ4)な
どのフラクトオリゴ糖が工業的に生産され、機能性を有
する甘味料として広く食品加工に利用されている。たと
えば、本発明者の出願にかかる特開昭６０−２７３９５
号公報（特公平５−４０７１号公報）、特開昭６０−４
１４９７号公報（特公平５−４０７０号公報）および特
開平７−３１４９２号公報を参照。
オウレオバシディウム(Aureobacidium) FERM P-4257 、
オウレオバシディウム・プルラリア・ヴァル・メラニゲ
ヌム(Aureobacidium pullularia var melanigenum)、オ
ウレオバシディウム(Aureobacidium) ATCC 9348 、アス
ペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) ATCC 20611、
アスペルギルス・ジャポニクス(Aspergillus japonicu
s) Mu-2などの微生物が産生するフラクトシルトランス
フェラーゼ（フラクトース転移酵素、β-fructo-franos
idase)を作用させて、シュクロースのフラクトースにフ
ラクトースがβ−１，２結合で１分子結合した１−ケス
トース (ＧＦ2)、２分子結合したニストース (ＧＦ3)、
３分子結合した１−フラクトシルニストース (ＧＦ4)な
どのフラクトオリゴ糖が工業的に生産され、機能性を有
する甘味料として広く食品加工に利用されている。たと
えば、本発明者の出願にかかる特開昭６０−２７３９５
号公報（特公平５−４０７１号公報）、特開昭６０−４
１４９７号公報（特公平５−４０７０号公報）および特
開平７−３１４９２号公報を参照。
【０００４】特公昭４３−１９８３９号公報には、ペニ
シリウム属に属する微生物をシュクロースを含む培養液
に培養するか、またはこれら菌株の菌体、または菌体押
出物をシュクロース溶液に接触させるようにした、シュ
クロースを原料とするフラクトオリゴ糖の製造方法が示
されている。特開平２−１６３０９３号公報（特公平４
−４１６００号公報）および特開平４−２３５１９２号
公報（特公平６−７００７５号公報）には、スコプラリ
オプシス属に属する微生物を用いてケストースを製造す
る方法が示されている。
シリウム属に属する微生物をシュクロースを含む培養液
に培養するか、またはこれら菌株の菌体、または菌体押
出物をシュクロース溶液に接触させるようにした、シュ
クロースを原料とするフラクトオリゴ糖の製造方法が示
されている。特開平２−１６３０９３号公報（特公平４
−４１６００号公報）および特開平４−２３５１９２号
公報（特公平６−７００７５号公報）には、スコプラリ
オプシス属に属する微生物を用いてケストースを製造す
る方法が示されている。
【０００５】フラクトオリゴ糖の製造技術は、（イ）フ
ラクトシルトランスフェラーゼを効率的に産生する技
術、（ロ）産生した酵素を使用してフラクトオリゴ糖を
生産する技術、（ハ）フラクトオリゴ糖を分離する技
術、より成り立っている。特に重要な技術は、加水分解
活性が弱くかつ転移活性が強い酵素産生菌の分離と酵素
産生技術であり、工業的にはオウレオバシディウム属ま
たはアスペルギルス属の菌が使用されている。
ラクトシルトランスフェラーゼを効率的に産生する技
術、（ロ）産生した酵素を使用してフラクトオリゴ糖を
生産する技術、（ハ）フラクトオリゴ糖を分離する技
術、より成り立っている。特に重要な技術は、加水分解
活性が弱くかつ転移活性が強い酵素産生菌の分離と酵素
産生技術であり、工業的にはオウレオバシディウム属ま
たはアスペルギルス属の菌が使用されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ネオフラクトオリゴ糖
（ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシル
ニストース）は、植物、たとえばタマネギ、ニラ、カラ
スムギ等に含有されているが、微生物の産生するフラク
トース転移酵素をシュクロースに作用させてネオフラク
トオリゴ糖を生産する方法は確立されていない。
（ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシル
ニストース）は、植物、たとえばタマネギ、ニラ、カラ
スムギ等に含有されているが、微生物の産生するフラク
トース転移酵素をシュクロースに作用させてネオフラク
トオリゴ糖を生産する方法は確立されていない。
【０００７】従来提案されているオウレオバシディウム
属、アスペルギルス属、ペニシリウム属などの菌、ある
いはこれらの菌の産生するフラクトシルトランスフェラ
ーゼは、シュクロースから１−ケストース、ニストー
ス、１−フラクトシルニストースなどのフラクトオリゴ
糖への転移反応のみを触媒する酵素であり、ネオフラク
トオリゴ糖を生産するものではない。
属、アスペルギルス属、ペニシリウム属などの菌、ある
いはこれらの菌の産生するフラクトシルトランスフェラ
ーゼは、シュクロースから１−ケストース、ニストー
ス、１−フラクトシルニストースなどのフラクトオリゴ
糖への転移反応のみを触媒する酵素であり、ネオフラク
トオリゴ糖を生産するものではない。
【０００８】本発明は、このような背景下において、自
然界から新規に分離した菌を培養して得られる菌体、ま
たはその菌が産生するフラクトシルトランスフェラーゼ
をシュクロース（またはフラクトオリゴ糖）に作用させ
て、ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシ
ルニストースなどのネオフラクトオリゴ糖を製造する方
法を提供することを目的とするものである。
然界から新規に分離した菌を培養して得られる菌体、ま
たはその菌が産生するフラクトシルトランスフェラーゼ
をシュクロース（またはフラクトオリゴ糖）に作用させ
て、ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシ
ルニストースなどのネオフラクトオリゴ糖を製造する方
法を提供することを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明のネオフラクトオ
リゴ糖の製造法は、基質であるシュクロース(X1)または
／およびシュクロースのフラクトースにフラクトースが
β−１，２結合した構造のフラクトオリゴ糖(X2)に、ペ
ニシリウム・シトリヌム(Penicillium citrinum) FERM
P-15944 菌の菌体(Y1)または／およびその菌が産生する
菌体内または菌体外酵素であるフラクトシルトランスフ
ェラーゼ (β-fructo-franosidase)(Y2)を作用させて、
フラクトオリゴ糖と共にネオフラクトオリゴ糖を生成さ
せることを特徴とするものである。
リゴ糖の製造法は、基質であるシュクロース(X1)または
／およびシュクロースのフラクトースにフラクトースが
β−１，２結合した構造のフラクトオリゴ糖(X2)に、ペ
ニシリウム・シトリヌム(Penicillium citrinum) FERM
P-15944 菌の菌体(Y1)または／およびその菌が産生する
菌体内または菌体外酵素であるフラクトシルトランスフ
ェラーゼ (β-fructo-franosidase)(Y2)を作用させて、
フラクトオリゴ糖と共にネオフラクトオリゴ糖を生成さ
せることを特徴とするものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下本発明を詳細に説明する。
【００１１】本発明においては、基質として、シュクロ
ース(X1)を用いるか、シュクロースのフラクトースにフ
ラクトースがβ−１，２結合（つまりイヌリン型に結
合）した構造のフラクトオリゴ糖(X2)を用いる。両者を
併用することもできる。
ース(X1)を用いるか、シュクロースのフラクトースにフ
ラクトースがβ−１，２結合（つまりイヌリン型に結
合）した構造のフラクトオリゴ糖(X2)を用いる。両者を
併用することもできる。
【００１２】後者のフラクトオリゴ糖(X2)としては、従
来知られている方法により得た１−ケストース、ニスト
ース、１−フラクトシルニストースなどのフラクトオリ
ゴ糖を用いることができる。また、本発明に従い基質と
してシュクロース(X1)を用いたときの中間生成物を用い
ることもできる。
来知られている方法により得た１−ケストース、ニスト
ース、１−フラクトシルニストースなどのフラクトオリ
ゴ糖を用いることができる。また、本発明に従い基質と
してシュクロース(X1)を用いたときの中間生成物を用い
ることもできる。
【００１３】本発明において用いるペニシリウム属の菌
は、本発明者が自然界から分離した新規な菌であり、す
でにペニシリウム・シトリヌム(Penicillium citrinum)
FERM P-15944 菌として受託されている。
は、本発明者が自然界から分離した新規な菌であり、す
でにペニシリウム・シトリヌム(Penicillium citrinum)
FERM P-15944 菌として受託されている。
【００１４】この菌の菌学的特徴を見ると、コロニーは
余り多くならず、ビロード状の暗青灰色で、狭い白色の
周縁部が見える。裏面はごく淡い黄色から濃黄色にわた
って変化し、ツァペック(Czapek)液、その他の液体培地
で培養すると培地が黄金色に変わる。
余り多くならず、ビロード状の暗青灰色で、狭い白色の
周縁部が見える。裏面はごく淡い黄色から濃黄色にわた
って変化し、ツァペック(Czapek)液、その他の液体培地
で培養すると培地が黄金色に変わる。
【００１５】本菌をツァペック(Czapek)−イースト(Yea
st) 寒天培地（ＣＹＡ）およびマルトエキス寒天培地に
接種し、２５℃または３７℃で７日培養し、生育したカ
ビ集落の色調、形状および分生子、さらには分生子形成
構造等の形態の観察を行った。このときの本菌の菌学的
性状を表１に示す。
st) 寒天培地（ＣＹＡ）およびマルトエキス寒天培地に
接種し、２５℃または３７℃で７日培養し、生育したカ
ビ集落の色調、形状および分生子、さらには分生子形成
構造等の形態の観察を行った。このときの本菌の菌学的
性状を表１に示す。
【００１６】
【表１】 項 目 性 状 生育速度（25℃／７日間） 集落の直径：３０〜３２mm 生育速度（37℃／７日間） 集落の直径：５〜６mm 集落表面の色 灰緑色〜暗いオレンジ色 集落裏面の色 黄色〜黄褐色 集落表面の組織 羊毛状 分生子柄 滑面 ペニシリ 複輪生〜単輪生 メトレ （12〜15）×(2.5〜3.0)μm ファライド フラスコ形、(7〜12) ×(2〜2.5)μm 分生子 球形〜亜球形、滑面、直径 2.5〜 3.0μm
【００１７】上記の菌を液体培養することにより培養菌
体または菌体を含む培養液が得られるが、本発明におい
てはその菌体（またはそれを含む培養液）自体を菌体内
酵素と共にそのまま用いることできるほか、その菌から
産生される菌体外酵素（フラクトシルトランスフェラー
ゼ）も同様に用いることができる。これらの菌体内酵素
または菌体外酵素は、可溶化してあるいは固定化して使
用することもできる。
体または菌体を含む培養液が得られるが、本発明におい
てはその菌体（またはそれを含む培養液）自体を菌体内
酵素と共にそのまま用いることできるほか、その菌から
産生される菌体外酵素（フラクトシルトランスフェラー
ゼ）も同様に用いることができる。これらの菌体内酵素
または菌体外酵素は、可溶化してあるいは固定化して使
用することもできる。
【００１８】液体培養を行うときの培養液の培養培地組
成としては、たとえば、シュクロース10.0〜 5.0重量
％、NaNO3 0.5重量％、 K2HPO4 0.1重量％、KCl 0.1
重量％、 MgSO4・H2O 0.01 重量％、 FeSO4・7 H2O
0.002重量％、粉末酵母 0.1〜 0.5重量％があげられる
が、他の種々の組成も採用することができる。このよう
な培地を使用して２４時間以上通気撹拌培養すると、フ
ラクトシルトランスフェラーゼが活性な菌体含有培養液
が得られる。
成としては、たとえば、シュクロース10.0〜 5.0重量
％、NaNO3 0.5重量％、 K2HPO4 0.1重量％、KCl 0.1
重量％、 MgSO4・H2O 0.01 重量％、 FeSO4・7 H2O
0.002重量％、粉末酵母 0.1〜 0.5重量％があげられる
が、他の種々の組成も採用することができる。このよう
な培地を使用して２４時間以上通気撹拌培養すると、フ
ラクトシルトランスフェラーゼが活性な菌体含有培養液
が得られる。
【００１９】このとき産生される酵素は、菌体内または
菌体外（主として菌体内）に含有されている酵素であ
り、この酵素は、オウレオバシディウム属やアスペルギ
ルス属の菌の産生する既存のフラクトシルトランスフェ
ラーゼと同様、シュクロースにより誘導される誘導酵素
である。
菌体外（主として菌体内）に含有されている酵素であ
り、この酵素は、オウレオバシディウム属やアスペルギ
ルス属の菌の産生する既存のフラクトシルトランスフェ
ラーゼと同様、シュクロースにより誘導される誘導酵素
である。
【００２０】基質であるシュクロース(X1)または／およ
びシュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−
１，２結合した構造のフラクトオリゴ糖(X2)に、上記の
菌の菌体(Y1)や上記のフラクトシルトランスフェラーゼ
(Y2)を作用させると、フラクトオリゴ糖と共にネオフラ
クトオリゴ糖を効率的に得ることができる。菌体(Y1)ま
たはフラクトシルトランスフェラーゼ(Y2)の作用温度は
４０〜６０℃、ｐＨは４〜６であることが好ましい。
びシュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−
１，２結合した構造のフラクトオリゴ糖(X2)に、上記の
菌の菌体(Y1)や上記のフラクトシルトランスフェラーゼ
(Y2)を作用させると、フラクトオリゴ糖と共にネオフラ
クトオリゴ糖を効率的に得ることができる。菌体(Y1)ま
たはフラクトシルトランスフェラーゼ(Y2)の作用温度は
４０〜６０℃、ｐＨは４〜６であることが好ましい。
【００２１】ここでフラクトオリゴ糖とは、先に述べた
ように、１−ケストース、ニストース、１−フラクトシ
ルニストースなどであり、ネオフラクトオリゴ糖とは、
ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシルニ
ストースなどである。ちなみに、１−ケストースの構造
式は次の化１、ネオケストースの構造式は次の化２で示
される。
ように、１−ケストース、ニストース、１−フラクトシ
ルニストースなどであり、ネオフラクトオリゴ糖とは、
ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシルニ
ストースなどである。ちなみに、１−ケストースの構造
式は次の化１、ネオケストースの構造式は次の化２で示
される。
【００２２】
【化１】
【００２３】
【化２】
【００２４】オウレオバシディウム属やアスペルギルス
属の菌から産生される既存のフラクトシルトランスフェ
ラーゼは、シュクロース等の基質のフラクトースにフラ
クトースがβ−１，２結合したイヌリン型のフラクトオ
リゴ糖のみを生成する。すなわち、 G-(F)n → G-(F)n+1 ＋ G-(F)n-1 の転移反応を触媒する。なお、基質(G-(F)n)のｎが１の
場合（シュクロースの場合）はグルコースが遊離する。
この転移反応は、同一分子間のフラクトース転移反応で
ある。
属の菌から産生される既存のフラクトシルトランスフェ
ラーゼは、シュクロース等の基質のフラクトースにフラ
クトースがβ−１，２結合したイヌリン型のフラクトオ
リゴ糖のみを生成する。すなわち、 G-(F)n → G-(F)n+1 ＋ G-(F)n-1 の転移反応を触媒する。なお、基質(G-(F)n)のｎが１の
場合（シュクロースの場合）はグルコースが遊離する。
この転移反応は、同一分子間のフラクトース転移反応で
ある。
【００２５】これに対し、本発明で用いているペニシリ
ウム・シトリヌム FERM P-15944 の産生するフラクトシ
ルトランスフェラーゼは、シュクロース等の基質から、
下記の化３の反応を触媒する。なお、基質(G-(F)n)のｎ
が１の場合（シュクロースの場合）はグルコースを遊離
する。
ウム・シトリヌム FERM P-15944 の産生するフラクトシ
ルトランスフェラーゼは、シュクロース等の基質から、
下記の化３の反応を触媒する。なお、基質(G-(F)n)のｎ
が１の場合（シュクロースの場合）はグルコースを遊離
する。
【００２６】
【化３】
【００２７】そして、上記の(i) のネオフラクトオリゴ
糖は、本酵素の転移反応基質にはならない。この点がこ
の転移反応で重要なことである。
糖は、本酵素の転移反応基質にはならない。この点がこ
の転移反応で重要なことである。
【００２８】基質からのネオフラクトオリゴ糖転移率は
基質濃度に依存し、基質濃度が高いほどネオフラクトオ
リゴ糖の転移率が高くなる。このことは、ネオフラクト
オリゴ糖生産上非常に重要なことである。後述の図２
は、基質（シュクロース）濃度とネオフラクトオリゴ糖
転移率との関係を示したグラフである。基質濃度は、 B
rix ３０以上、４０以上、５０以上、６０以上というよ
うに、高くなるほど好ましい。基質シュクロース濃度 B
rix ７０の場合、フラククトオリゴ糖とネオフラクトオ
リゴ糖との合計転移率は５５〜６０％と非常に高い。
基質濃度に依存し、基質濃度が高いほどネオフラクトオ
リゴ糖の転移率が高くなる。このことは、ネオフラクト
オリゴ糖生産上非常に重要なことである。後述の図２
は、基質（シュクロース）濃度とネオフラクトオリゴ糖
転移率との関係を示したグラフである。基質濃度は、 B
rix ３０以上、４０以上、５０以上、６０以上というよ
うに、高くなるほど好ましい。基質シュクロース濃度 B
rix ７０の場合、フラククトオリゴ糖とネオフラクトオ
リゴ糖との合計転移率は５５〜６０％と非常に高い。
【００２９】本発明の方法によれば、１−ケストース、
ニストース、１−フラクトシルニストースなどのフラク
トオリゴ糖と同時に、ネオケストース、ネオニストー
ス、ネオフラクトシルニストースなどのネオフラクトオ
リゴ糖が得られるが、通常は生成したフラクトオリゴ糖
とネオフラクトオリゴ糖とを分離するには及ばないの
で、そのまま種々の用途に用いる。
ニストース、１−フラクトシルニストースなどのフラク
トオリゴ糖と同時に、ネオケストース、ネオニストー
ス、ネオフラクトシルニストースなどのネオフラクトオ
リゴ糖が得られるが、通常は生成したフラクトオリゴ糖
とネオフラクトオリゴ糖とを分離するには及ばないの
で、そのまま種々の用途に用いる。
【００３０】得られたネオフラクトオリゴ糖は、そのす
ぐれた保湿作用、好甘味、低カロリー性、抗う蝕作用、
腸内細菌の増殖作用、腸管局所免疫増強作用などの諸機
能を生かして、甘味料、機能性食品、飼料、医薬、植物
の防疫促進剤をはじめ、多方面に利用することができ
る。
ぐれた保湿作用、好甘味、低カロリー性、抗う蝕作用、
腸内細菌の増殖作用、腸管局所免疫増強作用などの諸機
能を生かして、甘味料、機能性食品、飼料、医薬、植物
の防疫促進剤をはじめ、多方面に利用することができ
る。
【００３１】〈作用〉下記の表２は、基質がシュクロー
スであるときに、その基質にペニシリウム・シトリヌム
FERM P-15944 菌の産生するフラクトシルトランスフェ
ラーゼを作用させたときの転移反応をモデル的に示した
ものである。
スであるときに、その基質にペニシリウム・シトリヌム
FERM P-15944 菌の産生するフラクトシルトランスフェ
ラーゼを作用させたときの転移反応をモデル的に示した
ものである。
【００３２】
【表２】
【００３３】ルートＡは、既存のフラクトシルトランス
フェラーゼを用いたときの一連の転移反応を示したもの
であり、シュクロース→１−ケストース→ニストース→
１−フラクトシルニストースを経るというように、より
高次のフラクトオリゴ糖が生成していく。
フェラーゼを用いたときの一連の転移反応を示したもの
であり、シュクロース→１−ケストース→ニストース→
１−フラクトシルニストースを経るというように、より
高次のフラクトオリゴ糖が生成していく。
【００３４】これに対し、本発明者が見い出したペニシ
リウム・シトリヌム FERM P-15944が産生するフラクト
シルトランスフェラーゼは、ルートＡの転移反応と共
に、ルートＢの転移反応も触媒する。ルートＢは、シュ
クロース→ネオケストースの転移反応を含むが、その転
移反応物であるネオケストースを新たな基質としては反
応は進行しない。一段高次のネオニストースは、同時に
生成した１−ケストースの転移反応により得られるので
ある。同様にこのときの転移反応物であるネオニストー
スを新たな基質としては反応は進行しない。より高次の
ネオフラクトシルニストースは、ニストースを経て生成
した１−フラクトシルニストースの転移反応により得ら
れるのである。
リウム・シトリヌム FERM P-15944が産生するフラクト
シルトランスフェラーゼは、ルートＡの転移反応と共
に、ルートＢの転移反応も触媒する。ルートＢは、シュ
クロース→ネオケストースの転移反応を含むが、その転
移反応物であるネオケストースを新たな基質としては反
応は進行しない。一段高次のネオニストースは、同時に
生成した１−ケストースの転移反応により得られるので
ある。同様にこのときの転移反応物であるネオニストー
スを新たな基質としては反応は進行しない。より高次の
ネオフラクトシルニストースは、ニストースを経て生成
した１−フラクトシルニストースの転移反応により得ら
れるのである。
【００３５】基質としてのシュクロースにペニシリウム
・シトリヌム FERM P-15944 が産生するフラクトシルト
ランスフェラーゼを作用させたときの反応経時的な糖組
成は後述の図３の通りであり、ネオフラクトオリゴ糖の
転移率が高く、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ
糖との合計転移率も非常に高いのが特徴である。
・シトリヌム FERM P-15944 が産生するフラクトシルト
ランスフェラーゼを作用させたときの反応経時的な糖組
成は後述の図３の通りであり、ネオフラクトオリゴ糖の
転移率が高く、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ
糖との合計転移率も非常に高いのが特徴である。
【００３６】
【実施例】次に実施例をあげて本発明を詳細に説明す
る。
る。
【００３７】実施例１、比較例１〜２ 予備的実験として、オウレオバシディウム FERM P-4257
菌（比較例１）、アスペルギルス・ジャポニクス Mu-2
菌（比較例２）、ペニシリウム・シトリヌム FERM P-15
944 菌（実施例１）がそれぞれ産生する３種のフラクト
シルトランスフェラーゼをシュクロースに作用させ、生
成したフラクトオリゴ糖（１−ケストース、ニトース）
を高速液体クロマトグラフィー (使用カラム SCR-101N)
で経時的に定量して、横軸に１−ケストースを、縦軸に
ニストース（いずれも重量％）をプロットしたところ、
図１に示すようなフラクトオリゴ糖曲線が得られた。な
おこのカラムによっては、１−ケストースとネオケスト
ースとは分離できないので、１−ケストースにはネオケ
ストースの分も含まれている。
菌（比較例１）、アスペルギルス・ジャポニクス Mu-2
菌（比較例２）、ペニシリウム・シトリヌム FERM P-15
944 菌（実施例１）がそれぞれ産生する３種のフラクト
シルトランスフェラーゼをシュクロースに作用させ、生
成したフラクトオリゴ糖（１−ケストース、ニトース）
を高速液体クロマトグラフィー (使用カラム SCR-101N)
で経時的に定量して、横軸に１−ケストースを、縦軸に
ニストース（いずれも重量％）をプロットしたところ、
図１に示すようなフラクトオリゴ糖曲線が得られた。な
おこのカラムによっては、１−ケストースとネオケスト
ースとは分離できないので、１−ケストースにはネオケ
ストースの分も含まれている。
【００３８】オウレオバシディウム FERM P-4257菌（比
較例１）、アスペルギルス・ジャポニクス Mu-2 菌（比
較例２）が産生するフラクトシルトランスフェラーゼを
用いた場合は、全く同じフラクトオリゴ糖曲線になる
が、ペニシリウム・シトリヌムFERM P-15944 菌（実施
例１）が産生するフラクトシルトランスフェラーゼを用
いた場合は、異なったフラクトオリゴ糖曲線になること
を見い出した。
較例１）、アスペルギルス・ジャポニクス Mu-2 菌（比
較例２）が産生するフラクトシルトランスフェラーゼを
用いた場合は、全く同じフラクトオリゴ糖曲線になる
が、ペニシリウム・シトリヌムFERM P-15944 菌（実施
例１）が産生するフラクトシルトランスフェラーゼを用
いた場合は、異なったフラクトオリゴ糖曲線になること
を見い出した。
【００３９】本発明者は、図１に示されたフラクトオリ
ゴ糖曲線の相違の原因を、１−ケストースの構造異性体
が生成するためと判断して、定性および定量分析した結
果、ペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 菌（実施
例１）が産生するフラクトシルトランスフェラーゼを用
いた場合には、先に述べた表１のルートＢとルートＡの
転移反応が同時に行われていることを見い出したのであ
る。
ゴ糖曲線の相違の原因を、１−ケストースの構造異性体
が生成するためと判断して、定性および定量分析した結
果、ペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 菌（実施
例１）が産生するフラクトシルトランスフェラーゼを用
いた場合には、先に述べた表１のルートＢとルートＡの
転移反応が同時に行われていることを見い出したのであ
る。
【００４０】実施例２ 〈菌の培養と酵素の産生〉本発明者が土中から分離した
ペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 菌を、下記の
培地で液体培養した。すなわち、１リットルの水道水
に、シュクロース（グラニュー糖）１００ｇ、NaNO3 ２
ｇ、 K2HPO4 １ｇ、KCl １ｇ、 MgSO4・H2O１ｇ、 FeSO
4・7 H2O 0.02 ｇ、粉末酵母５ｇを加え、ｐＨを 6.4
に調整することにより、培地を作った。この培地を容量
1.5リットルの培養槽に入れて１１５℃で２０分間殺菌
後、４８時間培養した５０mlの種菌を接種し、３０℃で
通気撹拌培養した。通気量は５００ml/minとし、撹拌は
１００rpm の回転速度で行った。７２時間培養後、菌体
を遠心分離で分取した。得られた菌体は８０ｇ（水分８
０重量％）であり、１ｇの菌体の酵素力価は５００u/gr
菌体、培養ろ過液中の酵素力価は２u/mlであった。
ペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 菌を、下記の
培地で液体培養した。すなわち、１リットルの水道水
に、シュクロース（グラニュー糖）１００ｇ、NaNO3 ２
ｇ、 K2HPO4 １ｇ、KCl １ｇ、 MgSO4・H2O１ｇ、 FeSO
4・7 H2O 0.02 ｇ、粉末酵母５ｇを加え、ｐＨを 6.4
に調整することにより、培地を作った。この培地を容量
1.5リットルの培養槽に入れて１１５℃で２０分間殺菌
後、４８時間培養した５０mlの種菌を接種し、３０℃で
通気撹拌培養した。通気量は５００ml/minとし、撹拌は
１００rpm の回転速度で行った。７２時間培養後、菌体
を遠心分離で分取した。得られた菌体は８０ｇ（水分８
０重量％）であり、１ｇの菌体の酵素力価は５００u/gr
菌体、培養ろ過液中の酵素力価は２u/mlであった。
【００４１】酵素力価の測定は、結晶精製シュクロース
を濃度 Brix ５０（重量％）に調整し、ｐＨ 5.0にて、
このシュクロース液１００ｇに上記の菌体（水分８０重
量％） 0.5ｇを添加し、５５℃、１００rpm で３０分間
反応後、高速液体クロマトグラフィーでグルコースを定
量することにより行った。液体クロマトグラフィーのカ
ラムとしては、ダイソー株式会社製の「DAISO PAK.sp-1
20-5.DDS-B」を使用した。酵素力価は、１μ-molグルコ
ース／１分＝１ｕとした。
を濃度 Brix ５０（重量％）に調整し、ｐＨ 5.0にて、
このシュクロース液１００ｇに上記の菌体（水分８０重
量％） 0.5ｇを添加し、５５℃、１００rpm で３０分間
反応後、高速液体クロマトグラフィーでグルコースを定
量することにより行った。液体クロマトグラフィーのカ
ラムとしては、ダイソー株式会社製の「DAISO PAK.sp-1
20-5.DDS-B」を使用した。酵素力価は、１μ-molグルコ
ース／１分＝１ｕとした。
【００４２】〈転移反応〉上記で得た菌体を、シュクロ
ースに対して１重量％添加し（つまりシュクロース１ｇ
当り５ｕの酵素を添加したことになる）、ｐＨ 5.0、温
度５０℃で、シュクロース濃度をBrix１０，２０，３
０，５０，７０にして反応させた。４０時間後に液体ク
ロマトグラフィーにてネオフラクトオリゴ糖を定量した
ところ、図２の結果が得られた。基質のシュクロース濃
度が高いほどシュクロースからのネオフラクトオリゴ糖
の生成量は多くなるが、総オリゴ糖の量（ネオフラクト
オリゴ糖とフラクトオリゴ糖との合計量）は、基質シュ
クロース固形物に対して一定（５５〜６０％）であるこ
とがわかる。
ースに対して１重量％添加し（つまりシュクロース１ｇ
当り５ｕの酵素を添加したことになる）、ｐＨ 5.0、温
度５０℃で、シュクロース濃度をBrix１０，２０，３
０，５０，７０にして反応させた。４０時間後に液体ク
ロマトグラフィーにてネオフラクトオリゴ糖を定量した
ところ、図２の結果が得られた。基質のシュクロース濃
度が高いほどシュクロースからのネオフラクトオリゴ糖
の生成量は多くなるが、総オリゴ糖の量（ネオフラクト
オリゴ糖とフラクトオリゴ糖との合計量）は、基質シュ
クロース固形物に対して一定（５５〜６０％）であるこ
とがわかる。
【００４３】基質シュクロース濃度 Brix ７０における
反応経過時間ごとのネオフラクトオリゴ糖（ネオケスト
ース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストース）
およびフラクトオリゴ糖（１−ケストース、ニストー
ス、フラクトシルニストース）のシュクロースからの転
移率は図３に示す通りである。また反応時間（４０時
間）におけるネオフラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖
の糖組成は、下記の表３に示す通りである。シュクロー
スからのネオフラクトオリゴ糖（ネオケストース、ネオ
ニストース、ネオフラクトシルニストース）の転移率は
約２０％であった。なお、酵素は菌体を直接使用し、酵
素量は５(u)/grシュクロースである。
反応経過時間ごとのネオフラクトオリゴ糖（ネオケスト
ース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストース）
およびフラクトオリゴ糖（１−ケストース、ニストー
ス、フラクトシルニストース）のシュクロースからの転
移率は図３に示す通りである。また反応時間（４０時
間）におけるネオフラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖
の糖組成は、下記の表３に示す通りである。シュクロー
スからのネオフラクトオリゴ糖（ネオケストース、ネオ
ニストース、ネオフラクトシルニストース）の転移率は
約２０％であった。なお、酵素は菌体を直接使用し、酵
素量は５(u)/grシュクロースである。
【００４４】
【表３】 生 成 物 転移率(%) グルコース(G) 31.63 % シュクロース(GF) 11.62 % オリゴ糖 56.74 % ・フラクトオリゴ糖 36.85 % １−ケストース(GF2) 21.80 % ニストース(GF3) 14.05 % １−フラクトシルニストース(GF4) 1.00 % ・ネオフラクトオリゴ糖 19.89 % ネオケストース(FGF) 10.51 % ネオニストース(FGF2) 8.01 % ネオフラクトシルニストース(FGF3) 1.28 % 合計 100.0％
【００４５】Brix ７０で４０時間反応後の液体クロマ
トグラフィー分析結果を図４に示す。Ｐ1 はネオケスト
ース、Ｐ2 はネオニストース、Ｐ3 はネオフラクトシル
ニストースのピークを示している。
トグラフィー分析結果を図４に示す。Ｐ1 はネオケスト
ース、Ｐ2 はネオニストース、Ｐ3 はネオフラクトシル
ニストースのピークを示している。
【００４６】上記で得られたネオフラクトオリゴ糖含有
液（Brix７０）を１００ｇ分取して、それにメタノール
１００mlを添加し、３０℃でよく撹拌後、０℃で２４時
間放置し、その間に沈澱した物質を遠心分離で分取し
た。分取量は２０ｇであった。減圧乾燥後、蒸留水を加
えて２０％溶液とした。この２０％溶液の高速液体クロ
マトグラフィー分析結果を図５に示す。
液（Brix７０）を１００ｇ分取して、それにメタノール
１００mlを添加し、３０℃でよく撹拌後、０℃で２４時
間放置し、その間に沈澱した物質を遠心分離で分取し
た。分取量は２０ｇであった。減圧乾燥後、蒸留水を加
えて２０％溶液とした。この２０％溶液の高速液体クロ
マトグラフィー分析結果を図５に示す。
【００４７】さらに、高速液体クロマトグラフィー（使
用カラム「DAISO PAK.sp-120-5.VDS-B）で、ネオケスト
ース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストースを
それぞれ１０mg、５mg、３mg秤取した。これら３種の粉
末を各々メチル化アルジトール・アセテート分析、さら
には重クロロホルム溶液13Ｃ−ＮＭＲ分析した結果、シ
ュクロース、１−ケストース、ニストースのグルコース
にフラクトースが１分子、Fruct β2-６Glu に結合した
ネオフラクトオリゴ糖であることが明らかになった。
用カラム「DAISO PAK.sp-120-5.VDS-B）で、ネオケスト
ース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストースを
それぞれ１０mg、５mg、３mg秤取した。これら３種の粉
末を各々メチル化アルジトール・アセテート分析、さら
には重クロロホルム溶液13Ｃ−ＮＭＲ分析した結果、シ
ュクロース、１−ケストース、ニストースのグルコース
にフラクトースが１分子、Fruct β2-６Glu に結合した
ネオフラクトオリゴ糖であることが明らかになった。
【００４８】
【発明の効果】本発明によれば、次のようなすぐれた効
果が奏される。 （ａ）本発明者が分離したペニシリウム・シトリヌム F
ERM P-15944 菌を液体培養することにより産生されるフ
ラクトシルトランスフェラーゼを、シュクロース（また
はシュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−
１，２結合した構造のフラクトオリゴ糖）に作用させる
と、ネオフラクトオリゴ糖を２０％も含有する糖液を工
業的に生産することができる。 （ｂ）高基質濃度（たとえば Brix ７０）で、ネオフラ
クトオリゴ糖の転移反応が最大になる転移反応であるた
め、工業生産上のメリットが大である。 （ｃ）シュクロース（またはシュクロースのフラクトー
スにフラクトースがβ−１，２結合した構造のフラクト
オリゴ糖）から、腸内有用菌の増殖作用、腸管局所免疫
増強作用、植物の防疫促進作用をはじめとする特徴ある
特性を持つ糖が工業的に得られるので、新しい機能をも
つ食品を提供することができる。
果が奏される。 （ａ）本発明者が分離したペニシリウム・シトリヌム F
ERM P-15944 菌を液体培養することにより産生されるフ
ラクトシルトランスフェラーゼを、シュクロース（また
はシュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−
１，２結合した構造のフラクトオリゴ糖）に作用させる
と、ネオフラクトオリゴ糖を２０％も含有する糖液を工
業的に生産することができる。 （ｂ）高基質濃度（たとえば Brix ７０）で、ネオフラ
クトオリゴ糖の転移反応が最大になる転移反応であるた
め、工業生産上のメリットが大である。 （ｃ）シュクロース（またはシュクロースのフラクトー
スにフラクトースがβ−１，２結合した構造のフラクト
オリゴ糖）から、腸内有用菌の増殖作用、腸管局所免疫
増強作用、植物の防疫促進作用をはじめとする特徴ある
特性を持つ糖が工業的に得られるので、新しい機能をも
つ食品を提供することができる。
【図１】アスペルギルス・ジャポニクス Mu-2 菌、オウ
レオバシディウム FERM P-4257菌、ペニシリウム・シト
リヌム FERM P-15944 菌が産生するフラクトシルトラン
スフェラーゼをシュクロースに作用させたときのフラク
トオリゴ糖曲線を示す図である。
レオバシディウム FERM P-4257菌、ペニシリウム・シト
リヌム FERM P-15944 菌が産生するフラクトシルトラン
スフェラーゼをシュクロースに作用させたときのフラク
トオリゴ糖曲線を示す図である。
【図２】基質（シュクロース）濃度とネオフラクトオリ
ゴ糖への転移率との関係を示す図である。
ゴ糖への転移率との関係を示す図である。
【図３】基質（シュクロース）濃度 Brix ７０における
反応経過時間ごとのネオフラクトオリゴ糖生成との関係
を示す図である。
反応経過時間ごとのネオフラクトオリゴ糖生成との関係
を示す図である。
【図４】ネオフラクトオリゴ糖含有糖液の高速液体クロ
マトグラフィー分析表を示す図である。
マトグラフィー分析表を示す図である。
【図５】図４で示した糖組成の糖液をメタノールで精製
したフラクトオリゴ糖含有液の高速液体クロマトグラフ
ィー分析表を示す図である。
したフラクトオリゴ糖含有液の高速液体クロマトグラフ
ィー分析表を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:80）
Claims (3)
- 【請求項１】基質であるシュクロース(X1)または／およ
びシュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−
１，２結合した構造のフラクトオリゴ糖(X2)に、ペニシ
リウム・シトリヌム(Penicillium citrinum) FERM P-15
944 菌の菌体(Y1)または／およびその菌が産生する菌体
内または菌体外酵素であるフラクトシルトランスフェラ
ーゼ (β-fructo-franosidase)(Y2)を作用させて、フラ
クトオリゴ糖と共にネオフラクトオリゴ糖を生成させる
ことを特徴とするネオフラクトオリゴ糖の製造法。 - 【請求項２】ネオフラクトオリゴ糖が、ネオケストース
(6G-β-fructofranosyl-Sucrose)、ネオニストース(6G-
β-fructofranosyl-Kestose)およびネオフラクトシルニ
ストース(6G-β-fructofranosyl-Nystose)の少なくとも
１種である請求項１記載の製造法。 - 【請求項３】基質濃度が Brix ３０以上である請求項１
記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8333749A JP3058600B2 (ja) | 1996-12-13 | 1996-12-13 | ネオフラクトオリゴ糖の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8333749A JP3058600B2 (ja) | 1996-12-13 | 1996-12-13 | ネオフラクトオリゴ糖の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10165192A JPH10165192A (ja) | 1998-06-23 |
| JP3058600B2 true JP3058600B2 (ja) | 2000-07-04 |
Family
ID=18269537
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8333749A Expired - Fee Related JP3058600B2 (ja) | 1996-12-13 | 1996-12-13 | ネオフラクトオリゴ糖の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3058600B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100458151B1 (ko) * | 2001-05-14 | 2004-11-26 | 씨제이 주식회사 | 프락토실 트랜스퍼라제를 생산하는 신규 미생물 및 이를이용하여 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당을생산하는 방법 |
| ATE338140T1 (de) * | 2001-05-14 | 2006-09-15 | Cj Corp | Fructosyl-transferase produzierender mikroorganismus und verfahren zur herstellung von fructooligosacchariden und neofructooligosacchariden unter dessen verwendung |
| JP2006314240A (ja) * | 2005-05-12 | 2006-11-24 | Meiji Seika Kaisha Ltd | 血糖値上昇抑制低カロリー甘味料 |
| JP5680290B2 (ja) * | 2009-09-04 | 2015-03-04 | 学校法人酪農学園 | ネオケストースの製造方法 |
| GB201805577D0 (en) * | 2018-04-04 | 2018-05-16 | Optibiotix Health Ltd | Prebiotic compositions and methods of production thereof |
-
1996
- 1996-12-13 JP JP8333749A patent/JP3058600B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH10165192A (ja) | 1998-06-23 |
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