KR950006951B1

KR950006951B1 - 복합올리고당의 제조방법

Info

Publication number: KR950006951B1
Application number: KR1019910024070A
Authority: KR
Inventors: 인만진; 최경호; 전봉규; 김민홍; 황이남
Original assignee: 주식회사미원; 유영학
Priority date: 1991-12-24
Filing date: 1991-12-24
Publication date: 1995-06-26
Also published as: KR930013130A

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

복합올리고당의 제조방법

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 프락토올리고당과 갈락토올리고당으로 이루어진 복합 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 복합 올리고당은 장내 유익균인 비피도박테리움(Bifidobacterium)속과 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물에 의하여 이용된다.

본 발명의 복합 올리고당의 한 성분인 프락토올리고당은 일반식 Fru-(Fru)_n-Glu(단, 식중 글루코스 잔기, Fru는 프락토스 잔기, n은 1~4의 정수를 나타낸다.)로 나타내지는 올리고당으로, 통상적으로 아스퍼질러스(Aspergillus)속 등의 미생물 유래의 프락토실트랜스퍼라제를 고농도 설탕용액에 작용시킴으로서 프락토올리고당, 미 전환된 설탕, 글루코스, 소량의 프락토스로 이루어진 혼합물로서 얻어진다(일본 공개 특허 소56-154967호). 공업적으로는 프락토실트랜스퍼라제 혹은 효소를 함유한 균체를 알지네이트에 포괄 고정화하거나 또는, 이온교환수지에 이온결합시킨 고정화 효소를 이용하여 제조한다. 이렇게 제조된 프락토올리고당은 장내 소화 효소에 의하여 분해되지 않고 대장에서 인체에 유익한 균인 락토바실러스속의 미생물과 일부 비피도박테리움속의 미생물에 의하여 선택적으로 이용된다.

복합 올리고당의 또다른 성분인 갈락토올리고당은 일반식Gal-(Gal)_n-Glu(단, 식중에서 Gal은 갈락토스 잔기, Glu는 글루코스 잔기, n은 1~4의 정수를 나타낸다)으로 나타내어지는 올리고당으로 모유 올리고당의 주요 구성 성분이다. 통상적으로는 아스퍼질러스속, 크립토코커스(Cryptococcus)속 등의 미생물 유래의 β-갈락토시다제를 고농도의 유당용액에 작용시킴으로서 갈락토올리고당, 전환되지 않는 유당, 포도당, 갈락토스로 이루어진 혼합물로 얻어진다(일본 공개 특허 소58-190388호).

공업적으로는 프락토올리고당을 생산하기 위한 프락토살트랜스퍼라제의 경우와 마찬가지로 고정화β-갈락토시다제 효소를 이용하여 갈락토올리고당을 제조한다.

이렇게 제조된 갈락토올리고당은 장애 유익균인 비피도박테리움속의 미생물에 의하여 주로 이용되어 비피도박테리움속의 미생물을 다른 유해균보다 우세하게 하는 기능성을 가지고 있다.

이들 두 종류의 올리고당은 함께 사용하는 경우에 장내 유익균의 증식에 상승작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.

종래에는, 상기한 바와 같이 프락토올리고당과 갈락토올리고당을 별도로 제조하였기 때문에, 이들 올리고당을 함유하는 복합 올리고당을 제조하기 위해서는 단순히 두 올리고당을 섞는 방법을 채용하고 있으나, 두 올리고당을 각각 제조하여 혼합해야 하므로 제조공정이 번거롭고 경제적인 면에서도 불리하였다.

이러한 상황하에서 본 발명자들은 보다 효율적으로 손쉽게 프락토올리고당과 갈락토올리고당을 함유하는 복합 올리고당을 제조할 수 있는 방법을 강구하기 위하여 예의 연구한 결과, 배지중에 포함된 탄소원의 종류에 따라 프락토실트랜스퍼라제 또는 β-갈락토시다제를 생산하는 미생물변이주에 의해서 상기 목적을 달성할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명에 따르면, 배지중의 탄소원의 종류에 따라 프락토실트랜스퍼라제 또는 β-갈락토시다제를 생산할 수 있는 오레오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) MW-4218(KFCC-10754)를 탄소원으로 설탕 또는 유당을 함유하는 배지에서 배양하여 얻은 프락토실트랜스퍼라제 활성을 갖는 균주 및 β-갈락토시다제 활성을 갖는 균주를 함께 고정화 시키고, 이 고정화 미생물을 설탕 및 유당을 함유하는 기질 용액과 반응시켜 복합 올리고당을 제조하는 방법이 제공된다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 방법에 따라 사용되는 균주 오레오바시디움 플루란스 MW-4218은 오레오바시디움 플루란스 NRRL Y-2567을 변이시켜 얻을 수 있는데, 우선 친주인 NRRL Y-2567에 자외선을 조사하여 1차 돌연변이를 유발한 후 이어서 N-메틸-N'-니트로-N'-니트로소구아니딘으로 2차 돌연변이시켜 얻어진다.

이렇게 하여 얻은 오레오바시디움 플루란스 MW-4218(KFCC-10754)는 탄소원의 종류에 따라 다른 효소를 생산한다. 즉, 탄소원으로 설탕을 사용하면 프락토실트랜스퍼라제를 생산하고, 탄소원으로 유당을 사용하면 β-갈락토시다제를 생산한다.

본 발명의 방법에 따르면, 오레오바시디움 플루란스 MW-4218을 설탕을 탄소원으로 하는 영양배지에서 호기적으로 배양하여 균체내에 프락토실트랜스퍼라제를 축적시키고, 한편 유당을 탄소원으로 하는 배지에서 호기적으로 배양하여 β-갈락토시다제를 축적시킨 후, 두 균체를 혼합하고 포괄법에 의해 고정화하여 복합 올리고당의 제조에 사용한다.

본 발명의 균주를 고정화하는 방법으로는 포괄법 또는 결합법 모두 사용할 수 있으나, 바람직하게는 포괄법에 의해 고정화시켜 사용한다.

고정화에 사용되는 담체로는 폴리아크릴아미드겔, 폴리비닐알콜, 광경화성 수지 등의 합성고분자 물질 및 전분, 젤라틴, 알지네이트 ,카라기난등의 천연 고분자 물질이 포함되며, 바람직하게는 알지네이트가 사용된다.

본 발명에서는 균체를 고정화시키기 위하여 담체로 알지네이트를 사용하였으며, 습균체와 일지네이트의 투입비는 1/3~1/20, 바람직하게는 1/5~1/10이다. 습균체와 알지네이트를 상기 범위의 비율로 혼합한 후 시린지 게이지를 통하여 Ca이온을 함유하고 있는 수용액(0.3~5M)에 적하시켜 비드(bead)형태로 균체를 고정화하고, 고정화 균체를 기질용액에 0~4℃에서 15~20시간 침지하여 활성화 및 강화시킨 후 사용할 수있다.

이렇게 하여 얻은 고정화 균체는 설탕 혹은 유당을 기질로 하여 각각의 효소의 활성을 측정할 수 있으며,설탕과 유당을 함유하는 기질 용액과 반응시켜 프락토올리고당과 갈락토올리고당을 동시에 함유하는 복합올리고당을 제조할 수 있다.

반응에 사용되는 기질은 설탕과 유당의 혼합액으로 각각은 프락토올리고당과 갈락토올리고당의 원료가 된다. 적절한 설탕의 농도는 50~90%(w/v), 바람직하게는 60~80%, 유당의 농도는 10~60%, 바람직하게는 30~50%가 좋으며, 실제 반응의 pH는 두효소의 최적 pH가 서로 조금 다르므로 (프락토실트랜스퍼라제 5.5, β-갈락토시다제 6.5) 어느 성분을 주로 할 것이냐에 따라 조절이 가능하지만 보통 pH5~7범위로 하는 것이 좋다. 반응온도는 통상 40~60 ℃범위가 효소의 실활이 적고 고정화 효소의 수명이 연장되므로 적당하다.

반응은 회분식으로도, 연속식으로도 실시할 수 있다.

반응후에 얻어지는 프락토올리고당과 갈락토올리고당의 혼합액은 통상의 방법으로 농축하여 분무건조하면 분말 제품으로, 또는 액상 제품으로 얻을 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 얻어지는 복합 올리고당 및 그 제조방법은 다음과 같은 특징을 갖는다.

1)프락토올리고당과 갈락토올리고당을 각각 단독으로 섭취하였을 경우보다 장내 균총 중 유익균의 비를 높일 수 있고, 균의 종류도 다양하게 유지할 수 있다.

2) 동일한 미생물에서 유래된 두 효소를 함께 고정화하여 반응에 사용하기 때문에 두 효소의 반응 조건이 크게 다르지 않아 간단하게 반응을 수행할 수 있다.

3) 두가지 올리고당을 동시에 제조하므로 경제적이다.

본 발명에 따라 얻어지는 복합 올리고당은 전술한 장내 유익균 활성작용 뿐만 아니라 높은 감도를 갖기 때문에 감미료로 이용된다. 즉, 일반식품 및 다이어트 식품에 감미원으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 커피, 유음료, 유산균음료, 두유, 탄산음료 등과 같은 청량음료수, 아이스크림, 샤베트와 같은 빙과류, 탁상감미료등과 같은 각종 음식물, 기호물의 감미료로 사용할 수 있으며, 사료 첨가물로도 사용이 가능하다.

이하 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 이들 실시예가 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

[참고실시예]

친주인 오레오바시디움 플루란스 NRRL Y-2567을 설탕 6%, 효모 엑기스 0.3%, 제2인산칼륨 0.5%, 염화나트륨 0.1%, 질산암모늄 0.06% 및 황산마그네슘 0.02%를 함유하는 배지1(pH 6.8,120℃×20분 살균)에서 36~48시간동안 배양한 후, 원심분리하여 상등액과 균체를 분리하고 상등액은 버린뒤 멸균한 0.05M 인산완충용액(pH 6.8)에 현탁시킨 다음 15W 자외선 등으로 30cm 거리에서 30분간 노출시켜 변이를 유발하였다. 자외선 변이 유발후 생존율은 0.1~0.5%이었다. 그런 후 감자 침출물 20%, 포도당 2% 및 한천 1.5%를 함유하는 배지 2(120℃×20분 살균)에 도말하고 30℃에서 60~84시간 동안 배양한 다음 분리된 콜로니를 플라스크에 액체 배양하여 증식시켜 1차 변이주를 얻었다.

1차 변이주를 상기 배지 2에 다시 배양하여 얻은 콜로니를 살균한 0.05M 인산완충용액(pH 6.8)에 잘 현탁한 후 50g/ml농도의 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소-구아니딘용액 2ml를 첨가하여 실온에서 30분간 진탕시킨 후 원심분리 및 세척에 의하여 균체와 변이체를 분리시킨 후 배지 2에 평판이식 후 30℃에서 60~84시간 동안 배양 후 생육이 우수한 콜로니를 2차 변이주로 얻었다.

이렇게 얻은 2차 변이주들을 설탕 20%, 옥수수 침지액 5%, 제2인산칼륨 0.5%, 질산나트륨 1% 및 황산마그네슘 0.05%를 함유하는 배지 3(pH 6.8, 120℃×20분 살균) 및 유당 10%, 펩톤 1.5%, 효모 엑기스 0.5%, 제1인산칼륨 0.5%, 질산나트륨 0.2%, 황산마그네슘 0.05% 및 염화칼슘 0.05%를 함유하는 배지 4(pH 6.0, 120℃×20분 살균)에서 각각 배양하여 프락토실트랜스퍼라제와 β-갈락토시다제의 활성이 모두 높은 변이주를 선별하고 MW-4218로 명명하였다.

본 발명에 따른 변이주 오레오바시디움 풀루란스 MW-4218은 1991년 12월 20일자로 한국종균협회(KFCC)에 KFCC-10754의 기탁번호로 기탁되어 있다.

[실시예 1]

(1) 오레오바시디움 플루란스 MW-4218(KFCC-10754)을 발아배지(설탕 6%, 효모엑기스 0.3%, 제2인산칼륨 0.5%, 염화나트륨 0.1%, 질산암모늄 0.06%, 황산마그네슘 0.02%, pH 6.8) 50ml를 함유하는 플라스크에 접종한 후 30℃에서 48시간동안 진탕배양하였다. 배양액 5ml를 본배양 배지 (설탕 20%, 옥수수 침지액 5%, 제2인산칼륨 0.5%, 질산나트륨 1%, 황산마그네슘 0.05% pH 6.8) 100ml에 집중하고 동일하게 25시간 배양하여 습균체 20g을 얻었다.

(2) 오레오바시디움 플루란스 MW-4218(KFCC-10754)을 발아배지(유당 5%, 포도당 1%, 펩톤 0.5%, 제1인산칼륨 0.5%, 황산마그네슘 0.02%, pH 6.0), 50ml를 함유하는 플라스크에 접종한 후 30℃에서 48시간 진탕배양하였다. 배양액 5ml를 본배양 배지 (유당 10%, 펩톤 1.5%, 효모엑기스 0.5%, 제1인산칼륨 0.5%, 질산나트륨 0.2%, 황산마그네슘 0.05%, 염화칼슘 0.05%, pH 6.0) 100ml에 식균하고 30℃에서 50시간 배양하여 습균체 15g을 얻었다.

(3) 상기 (1)과 (2)에서 얻은 습균체를 생리 식염수로 2회 세척후 2~3%(w/v) 알지네이트 용액과 습균체 농도가 20~40%가 되도록 충분히 혼합한 다음 시린지 게이지를 통하여 1.0M 염화칼슘 수용액상에 적하시켜 비드 형태의 고정화 세포를 얻었다. 이들을 0~4℃에서 15시간 이상 기질용액에 침지하여 경화 및 활성화 시킨다.

이렇게 생성된 고정화 효소에 대해 설탕(혹은 유당)을 기질로 하여 효소의 활성을 측정하였다. 60%(w/w) 설탕용액 또는 40%(w/w)유당용액과 pH 5.5(pH 6.5),온도 55℃에서 반응시킨 후 1분당 1umole의 포도당을 생성하는 효소량을 1단위(unit)로 정의하며 생성된 포도당의 농도는 포도당 산화효소를 이용하여 분광학적으로 정량하였다. 그 결과, 프락토실트랜스퍼라제의 활성은 200~300unit/g-비드 범위이며, β-갈락토시다제의 활성은 100~200unit/g-비드이었다.

[실시예 2]

실시예 1에서 제조한 고정화 균체 10g을 온도 조절용 자켁과 배플이 부착된 교반반응기에 넣고 기질용액(설탕 60%, 유당 40% 농도로 0.1M 인산 완충용액(pH6.0)에 용해하고 총 고형분 함량이 70%(v/v)로 되도록 조절한 것)을 100ml의 양으로 가하고 온도를 55℃로 유지하면서 반응시켰다. 반응에 따른 각 올리고당의 함량을 HPLC로 분석하였으며 그 결과는 표 1과 같다.

[표 1]

[실시예 3]

실시예 1에서 제조한 고정화 균체 10g을 온도조절용 자켓이 부착된 컬럼 (ψ 18×200)에 충진한 후 실시예 2에서와 동일한 기질용액을 공간속도 0.01~10까지 바꾸어 가면서 운전하고, 프락토올리고당 및 갈락토올리고당의 함량을 HPLC로 분석하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.

[표 2]

상기 표 2의 결과로부터, 높은 전환율을 얻으려면 기질용액의 유량을 공간 속도 0.1~0.5hr^-1사이로 조절하여야 함을 알 수 있다.

Claims

탄소원의 종류에 따라 프락토실트랜스퍼라제 또는 β-갈락토시다제를 생산할 수 있는 오레오바시디움플루란스(Aureobasidium pullulans MW-4218(KFCC-10754)를 각각 설탕 및 유당을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 얻은 균체를 혼합하여 알지네이트에 고정화시켜 얻은 프락토실트랜스퍼라제 활성 및 β-갈락토시다제 활성을 갖는 고정화 세포를 유당과 설탕을 함유하는 기질 용액과 반응시켜 갈락토올리고당과 프락토올리고당을 동시에 제조하는 것을 특징으로 하는 복합 올리고당의 제조 방법.
제1항에 있어서, 고정화 균체는 혼합 균체(습균체)와 알지네이트의 비를 1 : 5~1 :10의 범위로 하여 고정화시켜 얻은 것임을 특징으로 하는 복합 올리고당의 제조 방법.
제1항에 있어서, 기질 용액은 50~90%의 설탕 및 10~60%의 유당을 함유함을 특징으로 하는 복합 올리고당의 제조 방법.
제1항에 있어서, 반응 pH가 5~7인 것을 특징으로 하는 복합 올리고당의 제조 방법.
제1항에 있어서, 반응 온도가 40~60℃인 것을 특징으로 하는 복합 올리고당의 제조 방법.
제1항에 있어서, 반응은 회분식 혹은 연속식으로 수행하는 것을 특징으로 하는 복합 올리고당의 제조 방법.