KR960003643B1 - 갈락토올리고당의 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

갈락토올리고당의 제조방법

본 설명은 비피도박테리움균의 증식촉진 인자인 올리고당 중 일반식 Gal-(Gal)n-Glc(식중, Gal은 갈락토스 잔기, Glc는 포도당 잔기, n은 1~4의 정수이다)으로 표시되는 갈락토올리고당(이하 올리고당으로 지칭)을 유당 혹은 유당함유 물질에 오레오바시듐 플루란스(Aureobasidum pullulans KFCC 10754)로부터 얻은 β-갈락토시다제를 작용시켜서 제조하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 갈락토올리고당은 모유에 함유되어 있는 주요한 올리고당으로 최근 건강 감미료로 많은 수요가 기대되고 있으며 유당에 β-갈락토시다제를 작용시켜서 제조하는 것으로 유당에 갈락토스가 1~4개 분자가 결합된 형태로 미반응된 유당이 포도당, 갈락토스와 함께 함유되어 있는 감미성분이다.

β-갈록토시다제(EC 3.2.1.23)는 β-D-갈락토사이드 결합을 분해하는 효소로 포유동물의 소장, 조직등에 광범위하게 분포되어 유당의 소화, 복합당질의 대사 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또 β-갈락토시다제는 포유동물 뿐만 아니라 각종 식물 및 미생물에 존재하며 최근 대장균(Escherichia coli), 클로베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 아스퍼질러스오리제(Asperillus oryza), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 크립토코커스 속(Cryptococcus up) 등과 같은 미생물 기원의 효소의 갈락토스 전이 작용을 이용하여 유당으로부터 올리고당을 제조하는 것이 알려져 있다(일본공개특허공보 소 58-190388호, 소 58-20266).

그러나 상기의 미생물 기원의 β-갈락토시다제 뿐만 아니라 일반적인 β-갈락토시다제의 당전이 반응은 유당의 가수분해 반응과 경쟁하므로 당전이 반응이 우선적으로 진행되도록 해야 우리가 원하는 올리고당을 높은 수율로 제조할 수 있다. 즉 반응 중에 올리고당이 생성됨과 동시에 가수분해 반응으로 포도당과 갈락토스가 생성되며 게다가 일단 생성된 올리고당도 가수분해되어 단당으로 변환되므로 올리고당 생산량이 매우 낮게 된다. 사실 미생물 기원의 각종 β-갈락토시다제의 올리고당의 생성량은 효소이 종류와 기질, 유당의 농도, 효소농도(활성), 반응조건 등에 따라 다르나 최대 약 25% 정도인 것으로 보고되어 있다. {J. Dairy Sci., 1(1) : 33-(1978), Biochem., 15(9) : 1944-2001(1976), J. Dairy Scl., 68(3) : 581-5881985)} 또 반응액이 반응하지 않은 유당, 부산물인 포도당과 갈락토스와 같은 단당류를 다량으로 함유하고 있으므로 올리고당만을 분리하는데 어려움이 있고, 올리고당을 이용하는 경우 반응액을 거의 그대로 이용하므로 큰 효과가 없는 유당, 단당류가 같이 사용되어 올리고당을 첨가한 제품의 칼로리를 높게 만들고 유당분해 효소를 생성하지 못하는 사람도 있으므로 섭취하기 곤란하게 할 수도 있다. 즉 제품의 이용범위 및 사용량이 한정되는 단점이 있다. 한편, 반응시 기질인 유당의 농도가 낮으므로 반응중 다른 미생물에 위한 오염 및 반응 후 농축을 많이 해야 하는 단점도 있다.

본 발명자들은 미생물 기원의 β-갈락토시다제를 사용하여 올리고당을 제조할 때 상기와 같은 문제점을 해결할 목적으로 많은 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명은 오레오바시디움 플루란스(Aureobasidum pullulans)로부터 얻은 β-갈락토시다제를 고농도 유당용액에 작용시켜 높은 전환률로 미반응된 유당, 갈락토스의 농도가 낮고 올리고당의 농도가 높은 올리고당 함유액을 얻는 것이다.

본 발명에 대하여 자세히 설명하면 다음과 같다.

β-갈락토시다제의 생산 균주인 오레오바시디움 플루라슨(aureobasidum pullulans)는 본 발명자들이 친주인 오레오바시디움 플라란스(aureobasidum pullulans NRRL Y-2567)를 변이처리하여 배양조건에 따라 β-갈락토시다제와 프락토실트랜스퍼라제를 생산할 수 있도록 만든 것으로 1991년 12월 20일자로 한국 종균협회에 기탁(KFCC 10754)하였으며 특허출원한 균주이다(출원번호 91-23739호). 이 균주를 유당을 탄소원으로 하는 영양배지에 β-갈락토시다제의 유도체인 이소프로필-β-티오갈락퓨라노사이드(IPTG)를 5~10mM 농도로 첨가한 후 통기적인 조건에서 48~60시간 배양하여 균체내에 효소를 축적시킨 후 여과, 원심분리 등으로 발효액에서 균체를 회수하여 올리고당의 제조에 이용한다.

발효액으로 일부 분비되는 효소를 정제하여 이용할 수도 있다. 일반적으로 균체내 효소는 균체를 물리적, 화학적 혹은 효소적인 방법으로 파쇄하여 효소를 유출시킨 후, 유리효소를 반응에 이용할 수도 있고 통상의 방법대로 불용성 담체에 고정화하여 사용할 수도 있다. 고정화 방법은 균체를 고정화하거나 효소를 고정화하는 어느 특정한 방법에 한정하지는 않는다. 유당을 용해한 후 오레오바시움 플루란스(Aureobasidum pullulans)로부터 얻은 효소를 작용시켜 일반식 Gal-(Gal)n-Glc(단, 식중 Gal은 갈락토스 잔기, Glc는 포도당잔기, n은 1~4의 정수)으로 표시되는 올리고당을 제조할 때 초기 유당농도를 40~90%(W/V), 바람직하게는 60~80%(W/V)로 pH는 5~7 범위가 적당하다. 반응온도는 효소의 실화과 직접적인 관련이 있으므로 효소의 장기적인 사용에 매우 중요한 인자가 된다. 일반적으로 효소의 실활온도와 기질용액의 농도는 비례관계에 있으므로 기질의 농도가 높아지면 높은 온도에서 반응을 수행할 수 있게 된다. 본 발명에서는 45℃ 이상에서 바람직하게는 55~70℃ 범위에서 반응하는 것을 특징으로 한다. 효소의 투입량은 보통 5~15단위/g-기질 정도면 충분하고 이때의 전환률은 40~60% 정도로 높은 농도의 올리고당을 함유한 반응액을 얻을 수 있다. 기질로 사용되는 유당은 고순도 유당 뿐만 아니라 유장분말, 유청분 등과 같이 유당을 충분히 함유한 것이면 사용이 가능하다.

상기와 같은 조건으로 회분식 또는 연속식으로 반응시켜 얻은 반응액은 필요에 따라 가열하여 효소를 실활시킨 후 이온교환수지, 멤브레인 등과 같은 통상의 방법으로 효소를 제거하고 농축하여 직접 액상제품으로 사용할 수도 있으며 분무건조, 동결 건조 등과 같은 방법으로 건조하여 분말제품의 형태로 얻을 수도 있다.

본 발명에서 얻은 올리고당은 사람의 장내 유익균인 유산균, 비피더스균의 먹이가 되고 칼로리가 낮으며 열안정성이 뛰어나 기능성 식품소재로 사용이 용이하다. 옐서 커피, 탄산음료, 두유, 유제품, 유산균 음료 등의 각종 청량음료수, 샤베트, 아이스크림 등과 같은 각종 빙과류, 과자, 빵, 쨈, 분유, 탁상감미료 등과 같은 각종 음식물, 기호물의 감미료로 사용할 수 있으며 사료 첨가물로도 사용이 가능하다.

이상 본 발명의 특징 및 효과를 용약하면 다음과 같다.

1) 고농도의 유당용액을 기질로 하여 올리고당을 제조할 수 있다.

2) 전환률이 높아 다른 기원의 효소로 두번 반응시킬 필요가 없다.

3) 한번 반응으로 올리고당의 함량이 높은 당조성의 제품을 얻을 수 있다.

4) 반응 온도가 높고 기질의 농도가 높기 때문에 반응 중 다른 미생물에 의한 오염 가능성이 희박하다.

5) 반응온도가 높고 반응속도가 빠르므로 효소량이 적게 된다.

이하 실시예로 본 발명을 보다 상세히 설명하지만 이들 실시예가 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

각 실시예에서 공히 β-갈락토시다제의 활성 측정과 올리고당의 정량은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

[β-갈락토시다제의 활성 측정법]

40%(W/V) 유당을 함유한 0.05M 인산 완충용액(pH 6.5)을 기질로 하여 55℃에서 30분간 반응시킨 후 반응액을 끊는 물에 5분간 중탕하여 반응을 정지시킨다. 생성된 포도당의 농도를 포도당 산화효소를 이용하여 분광학적인 방법을 정량하였다.

1분당 1μmole의 포도당을 생성하는 효소량을 1단위(unit)로 정의하였다.

[갈락토올리고당의 분석법]

고속액체크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 분석하였으며 분석조건은 다음과 같다.

* 컬럼 : Alltech사의 Econospher NH₂4.6×250mm

* 용매 : 아세토니트릴/물=65/35(V/V)

* 유량 : 0.8ml/min

* 감지기 : 굴절룰 감지기(RI detector)

[실시예 1]

오레오바시디움 플루란스(Aureobasodu pullulans KFCC 10754)를 발아배지(유당 5%, 포도당 1%, 펩톤 0.5%, 제1인산칼륨 0.5%, 황산마그네슘 0.02%, pH6.0)에 접종한 후 30℃에서 48시간 진탕 배양하였다. 이를 본배양 배지(유당 10%, 펩톤 1.5%, 호모엑기스 0.5%, 제1인산칼륨 0.5%, 질산나트륨 0.2%, 황산마그네슘 0.05%, 염화칼슘 0.05%, pH60)에 식균하여 35℃에서 50시간 배양하여 효소를 얻었다. 배양 완료 후생선된 β-갈락토시다제는 100~150단위(unit)/ml였다.

[실시예 2]

실시예 1의 본 배양에서 얻은 균체내의 효소를 얻기 위하여 원심분리(300rpm, 15분)로 발효액에서 균체를 회수하였다. 이 습균체를 60%(W/V) 유당용액(0.05인산 완충용액, pH6.5에 가열 용해)에 온도를 60℃로 조절한 후 기질 g당 10단위(unit)가 되도록 투입하고 4시간 동안 반응시켰다. 그런 다음 100℃에서 10분간 가열하여 효소를 실활시키고 반응액의 당조성을 분석한 결과 전환률은 45.4%였다.

주)

[실시예 3]

실시예 2에서 사용한 습균체를 70%(W/V)로 실시예 2에서와 동일하게 제조한 기질용액에 기질 g당 10단위가 되도록 투입하고 70℃에서 동일하게 반응시켰다.

[실시예 4]

실시예 2에서 사용한 습균체를 80%(W/V)로 실시예 2에서와 동일하게 제조한 기질용액에 기질 g당 5단위가 되도록 투입하고 80℃에서 동일하게 반응시켰다.

그 결과 전환률은 51.3%였다.

[실시예 5]

실시예 1에서 얻은 균체를 회수하여 고형분인 균체를 0.05M 인산완충용액(pH 6.5)에 10%(W/V)정도로 현탁시킨 후 4℃에서 호모게나이져로 파쇄하여 효소를 유출시킨 후 균체잔사를 원심분리로 제거하여 조효소 용액을 얻었다. 여기에 다공형 이온교환수지를 투입하여 통상의 방법대로 고정화한 후 고정화된 효소의 활성을 측정하니 400~450단위/g 수지였다.

[실시예 6]

실시예 2에서 습균체 대신 실시예 5에서 제조한 고정화 효소를 동일조건으로 투입하고 150rpm으로 교반하면서 반응시켰다. 반응액의 전환률은 실시예 2와 유사하였다.

[실시예 7]

실시예 3에서 습균체 대신 실시예 5에서 제조한 고종화 효소를 동일조건으로 투입하고 150rpm으로 교반하면서 반응시켰다. 반응액의 전환률은 실시예 3와 유사하다.

[실시예 8]

실시예 4에서 습균체 대신 실시예 5에서 제조한 고정화 효소를 동일조건으로 투입하고 150rpm으로 교반하면서 반응시켰다. 반응액의 전환률은 실시예 4와 유사하다.

[실시예 9]

실시예 5에서 제조한 고정화 효소 10g을 자켓이 달린 컬럼형태의 반응기에 넣고 온수를 순환시켜 60℃를 유지하면서 60%(W/V)의 기질용액(pH6.5)을 공간속도 0.3~0.4hr^-1의 속도로 기질을 통과시키면서 장기간 연속운전하였다.

운전일수에 따른 전환률의 변화는 다음표와 같다.

Claims (5)

1. 유당 또는 유당 함유물에 오레오바시디움 플루란스(Aureobasidum pullulans KFCC 10754) 기원의 β-갈락토시다제를 작용시켜 일반식 Gal-(Gal)n-Glc(단, 식중 Gal은 갈락토스 잔기, Glc는 포도당 잔기, n은 1~4의 정수)으로 표시되는 올리고당을 제고하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 효소반응액의 기질 농도를 60~80%(W/V)로 함을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 효소반응의 온도를 55~75℃로 함을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 배양된 오레오바시디움 플루란스(Aureobasidum pullulans)의 균체 혹은 추출 정제된 효소 단백질을 이용함을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서 고정화 균체 혹은 고정화 효소를 사용하여 회분식 혹은 연속식으로 제조함을 특징으로 하는 방법.