JP3831075B2 - β−ガラクトシダーゼの改質方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、β−ガラクトシダーゼの改質方法に関し、更に詳細にはバチルス・サーキュランス由来β−ガラクトシダーゼ中に含まれるβ−ガラクトシダーゼIのガラクトオリゴ糖の生成能を高めるための改質方法およびこの改質されたβ−ガラクトシダーゼによるガラクトオリゴ糖の製造方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
β−ガラクトシダーゼ(β−galactosidase)は、β−D−ガラクシド結合の加水分解とともにガラクトシル基転移反応を触媒する酵素として知られており、近年、乳糖からのガラクトオリゴ糖の製造に有用であることが数多く報告されている。
【0003】
β−ガラクトシダーゼは、微生物、動物、植物に広く分布しているが、ガラクトオリゴ糖の製造には糖転移率の高い微生物起源の酵素が選択される。このような微生物由来のβ−ガラクトシダーゼとしては、例えば、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)、クリプトコッカス・ローレンティー(Cryptococcus laurentii)のほか、ブレラ・シンギュラリス(Bullera singularis)、リポマイセス(Lypomyces)属酵母、ステリグマトマイセス(Sterigmatomyces)属酵母などが知られている。
【0004】
これらのうち、バチルス・サーキュランスは、2種のβ−ガラクトシダーゼ(β−ガラクトシダーゼI、β−ガラクトシダーゼII)を生産することが知られており、その酵素学的性質も報告されている(Agric.Biol.Chem., 48 (12), 3053-3061 (1984))。 この2種のβ−ガラクトシダーゼはオリゴ糖の生成能において大きく相違し、β−ガラクトシダーゼIはガラクトオリゴ糖の生成能が低く、β−ガラクトシダーゼIIは、ガラクトオリゴ糖の生成能が高いことが確認されている。
【0005】
このため、市販のバチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼ製剤より、ガラクトオリゴ糖の製造に有利なβ−ガラクトシダーゼIIを分離する方法が提案されている(特開昭62−118886号)。 しかしながら、この方法はカラムを用いた分離方法であり、カラムに充填した樹脂(ハイドロキシアパタイト)量あたりに処理できる酵素蛋白質の量が少ない、カラム分離に時間がかかる、経費が極めて高い等の点で工業的実施には実用的ではなかった。
【0006】
また、両タイプの酵素を含むバチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼで、乳糖濃度30重量%以上の高濃度下で転移反応を起こさせると、ガラクトオリゴ糖を収率よく製造することができることが報告されている(特公平3−54559号)。 しかしながら、この方法で示された高濃度乳糖での反応では、β−ガラクトシダーゼIIに比べてIの方がガラクトオリゴ糖の生成率が低いことが認められる。また、高乳糖濃度での反応は乳糖の結晶が析出しない高温で反応しなければならないことから、耐熱性の低いβ−ガラクトシダーゼIは反応中に失活が起こり、反応が遅延する難点があった。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
このように、バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼを用いてガラクトオリゴ糖の効率的な製造を行う技術開発が行われているものの、いまだ工業的実施においてβ−ガラクトシダーゼIの混在に由来する問題点を改善するという点で満足のゆく技術は提案されておらず、さらに効率の良いガラクトオリゴ糖の製造方法が望まれていた。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記現状に鑑み、バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼについて研究を重ねたところ、ガラクトオリゴ糖の生成能が低いβ−ガラクトシダーゼIを加熱処理することにより、ガラクトオリゴ糖の生成能が高まり、β−ガラクトシダーゼIIに類似した酵素に改質されるというという極めて特異的な現象を見い出した。
また、これはβ−ガラクトシダーゼの粗酵素から分離したβ−ガラクトシダーゼIに対してだけでなく、分離前のβ−ガラクトシダーゼの粗酵素に対して加熱処理を行っても同様の効果が得られることを見い出し本発明を完成した。
【0009】
即ち、本発明の第1の発明は、バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼを加熱処理することを特徴とするガラクトオリゴ糖の生成能を高めるためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法である。
また、本発明の第2の発明は、上記改質方法においてバチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼがβ−ガラクトシダーゼIであるガラクトオリゴ糖の生成能を高めるためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法である。
更に本発明の第3の発明は、上記両改質方法において加熱処理を40〜60℃で行うガラクトオリゴ糖の生成能を高めるためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法である。
更にまた、本発明の第4の発明は、上記各改質方法により得られたβ−ガラクトシダーゼを乳糖に作用させるガラクトオリゴ糖の製造方法である。
【0010】
【発明の実施の形態】
本発明の改質方法の対象となるβ−ガラクトシダーゼは、バチルス・サーキュランス由来のものである。 バチルス・サーキュランスに属する微生物の産生するβ−ガラクトシダーゼであれば、いずれも利用することができるが、好ましいものの例としては、バチルス・サーキュランス(ATCC−31382)の培養により得られたβ−ガラクトシダーゼ等を挙げることができる。
【0011】
上記のβ−ガラクトシダーゼは、乳糖に作用させた場合のガラクトオリゴ糖の生成能が低いβ−ガラクトシダーゼIおよび乳糖に作用させた場合のガラクトオリゴ糖の生成能が高いβ−ガラクトシダーゼIIを含有するものであるが、本発明の改質方法は、β−ガラクトシダーゼの粗酵素からβ−ガラクトシダーゼIのみを分離した後に実施しても、また両酵素を分離せずβ−ガラクトシダーゼIIを含有する状態で実施しても良い。
【0012】
また、バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼとして、市販の酵素製剤を用いることもできるが、このものが賦形剤として糖を含有している場合は糖含量ができるだけ少ないものか、あるいは糖を除いて用いることが望ましい。 糖が存在すると本発明の改質が十分に行われない場合がある。 なお、市販されている酵素製剤の例としては、ビオラクタN5(大和化成(株)製)などが挙げられる。
【0013】
本発明のβ−ガラクトシダーゼの改質方法を実施するには、上記のβ−ガラクトシダーゼ(IまたはIとIIの混合)を単に加熱処理すれば良い。 加熱は、40℃以上の温度で、適宜時間、酵素が失活しない範囲で行えば良く、例えば、40〜60℃程度の温度で10分〜16時間程度、望ましくは、45〜55℃程度の温度で1時間〜16時間程度行うのがよい。 なお、40℃未満の加熱では十分な改質が行われず、また、60℃を越える加熱では酵素が失活してしまう場合がある。 これらの加熱条件はタンクなどでのバッチ式加熱での条件であって、例えばプレートヒーターなど連続的に加熱可能な装置を用いれば高温で短時間の加熱も実施可能となる。 以上の加熱処理により、β−ガラクトシダーゼ中のβ−ガラクトシダーゼIがβ−ガラクトシダーゼIIに類似した特徴を有する酵素に改質され、ガラクトオリゴ糖の生成能が高められる。
【0014】
上記方法により改質されたβ−ガラクトシダーゼを用いてガラクトオリゴ糖を製造するには、このβ−ガラクトシダーゼを単に乳糖に作用させれば良い。
このガラクトオリゴ糖の製造方法は、改質されたβ−ガラクトシダーゼを用いることを除いては、通常の酵素作用条件で実施することができ、例えば、pH5.0〜8.0程度、温度20〜70℃程度の条件で実施すれば良い。 また、改質されたβ−ガラクトシダーゼの添加量も特に限定されないが、通常約1〜20LU(乳糖力価)/g基質程度から選択されるのが良い。
【0015】
本発明方法により改質されたβ−ガラクトシダーゼは、β−ガラクトシダーゼIのガラクトオリゴ糖の生成能が高められており、ガラクトオリゴ糖の製造におけるβ−ガラクトシダーゼIの不都合が解消されているため、基質として用いられる乳糖の濃度は特に限定されず、任意の基質濃度でガラクトオリゴ糖の製造を行うことができる。 また、ガラクトオリゴ糖生成反応は乳糖のみの溶液においてだけでなく、牛乳や脱脂粉乳溶液など乳糖を含有する溶液においても高いガラクトオリゴ糖生成率が達成できる。
【0016】
【実施例】
以下、実施例および試験例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。 なお、本明細書中においては、β−ガラクトシダーゼの活性を以下の方法により評価した。
また、試験例および実施例のβ−ガラクトシダーゼIとβ−ガラクトシダーゼIIは、従来技術であるハイドロキシアパタイトを用いて分離精製をしたものを用いた。
【0017】
[ β−ガラクトシダーゼの活性評価法 ]
(1) ONPG法(ONPG力価:LSU)
酵素溶液1mlを試験管に量りとり、40mMのONPG(o−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド;o−Nitrophenyl−β−D-galactopyranoside)溶液を1ml加え、pH6.0、40℃で10分間反応させる。 2%炭酸ナトリウム溶液を5ml加えて反応を停止させ、420nmの吸光度を測定する。 この方法で1分間に1μmolのONP(o−ニトロフェノール;o-Nitrophenol)を遊離する酵素量を1LSUとした。
【0018】
(2) 乳糖分解力法(乳糖力価:LU)
12%乳糖溶液5mlを試験管に量りとり、酵素溶液を1ml加えてpH6.0、40℃で10分間反応させる。 反応を中止したのち生成したグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で測定する。 この方法で1分間に1μmolのグルコースを生成する酵素量を1LUとした。
【0019】
(3)活性比(LSU/LU)
β−ガラクトシダーゼIとβ−ガラクトシダーゼIIは、ONPGと乳糖に対する分解力が異なることから、これらの活性比(LSU/LU)を両酵素の指標とした。
【0020】
試 験 例 1
ビオラクタN5より調製したβ−ガラクトシダーゼIを試験管に分注し、密栓したのち各温度条件下で加熱保持した。 所定の時間保持した酵素をONPG法と乳糖分解法にて活性を測定し、活性比(LSU/LU)を算出した。 なお、残存活性%は非加熱の各酵素活性に対する割合で算出した。 この結果を表1に示す。
【0021】
【表1】
【0022】
試 験 例 2
ビオラクタN5に含まれる賦形剤の糖をセファデックス(Sephadex) G−10(ファルマシア製)で除いた酵素を調製し、試験例1と同様に各温度条件下で加熱保持した。 所定の時間保持した酵素をONPG法と乳糖分解法にて活性を測定し、活性比(LSU/LU)を算出した。 なお、残存活性%は非加熱の各酵素活性に対する割合で算出した。 この結果を表2に示す。
【0023】
【表2】
【0024】
試 験 例 3
β−ガラクトシダーゼIを30℃から55℃の各温度で60分加熱して改質させた。 改質後のβ−ガラクトシダーゼIを乳糖濃度10%の基質に40℃で作用させ、三糖以上のオリゴ糖の含有量を経時的にHPLC(高速液体クロマトグラフィー)で測定した。 なお、酵素添加量は5.0LU/g乳糖とした。 また、コントロールとして非加熱のβ−ガラクトシダーゼIおよびIIについても測定した。 この結果を図1に示す。
【0025】
試 験 例 4
55℃で1時間加熱して改質させたβ−ガラクトシダーゼ(I,II混合)を、30または50重量%の乳糖濃度の基質にそれぞれ50および60℃で作用させ、三糖以上のオリゴ糖の含有量を経時的に測定した。 なお、酵素添加量はそれぞれ6.0または8.0LU/g乳糖とした。 また、コントロールとして非加熱のものについても測定した。 この結果を図2に示す。
【0026】
この結果、基質濃度に関係なく改質β−ガラクトシダーゼ(I,II混合)がオリゴ糖製造に有効であることが明らかになった。
【0027】
実 施 例 1
β−ガラクトシダーゼIの加熱処理とガラクトオリゴ糖の製造:
ビオラクタN5(5500LU/g)を50g秤量して1Lの0.02Mリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解し、限外濾過モジュール(SIP−1013、旭化成製)を用い、酵素の濃縮と賦形剤の糖を除いた。 得られた370mlをハイドロキシアパタイト(BIO−GEL HT, BIO−RAD製)を充填した2Lのカラムに通し、0.02Mのリン酸緩衝液(pH6.0)の4Lを流したのち、同緩衝液の濃度をステップワイズで上昇させ、0.15Mを10L流してβ−ガラクトシダーゼIIを溶出させた。
【0028】
次いで、0.20Mの同緩衝液を10L流したのち0.25Mの緩衝液15Lでβ−ガラクトシダーゼIを回収し、限外濾過装置を用いて濃縮して125,000LUの酵素液を調製した。 このβ−ガラクトシダーゼI溶液(60ml)をビーカーにとり、攪拌しながら55℃で1時間加熱した。 加熱処理した酵素液の活性を測定したところ111,000LUでLSU/LUは0.6であった。
【0029】
25kgの食品用乳糖を25Lの水に加えて加熱溶解し、次いで反応タンクのジャケットに水を流して60℃まで冷却した。 6N−NaOHを加えてpHを6.0に調製したのち、100,000LUの上記β−ガラクトシダーゼIを加え、60℃で10時間反応させた。 反応後、三糖以上のガラクトオリゴ糖39.9%、二糖41.5%、グルコース18.0%、ガラクトース0.6%の糖組成の溶液を得た。
【0030】
実 施 例 2
β−ガラクトシダーゼI+IIの加熱処理とガラクトオリゴ糖の製造:
ビオラクタN5(5500 LU/g)を25g秤量して500mlの0.02Mリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解し、攪拌しながら55℃で1時間加熱した。加熱処理した酵素液(132,000 LU、LSU/LU:0.6)を限外濾過装置で濃縮した。
【0031】
25kgの食品用乳糖を25Lの水に加えて加熱溶解し、次いで反応タンクのジャケットに水を流して60℃まで冷却した。 6N−NaOHを加えてpHを6.0に調製したのち、100,000LUの上記酵素液を加えて60℃で12時間反応させ、三糖以上のガラクトオリゴ糖40.0%、二糖40.9%、グルコース18.5%、ガラクトース0.6%の糖組成の溶液を得た。
【0032】
【発明の効果】
本発明の改質方法によれば、加熱という極めて簡易な方法により、バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼのうち、ガラクトオリゴ糖の生成能が低いβ−ガラクトシダーゼIを、ガラクトオリゴ糖の生成能が高いβ−ガラクトシダーゼIIに類似した特徴に改質させることができ、これによりガラクトオリゴ糖の生成能を高めることができる。
【0033】
また、本発明改質方法では、分離されたβ−ガラクトシダーゼI単独のみならず、分離前のβ−ガラクトシダーゼを利用することができるため、分離工程を設けることなくガラクトオリゴ糖の製造に非常に有利なβ−ガラクトシダーゼを得ることができる。
【0034】
さらに、本発明の改質方法により得られたβ−ガラクトシダーゼは、基質濃度にかかわらず優れたガラクトオリゴ糖の生成能を有するものであり、ガラクトオリゴ糖の製造に極めて有効なものである。
【図面の簡単な説明】
【図1】β−ガラクトシダーゼIの改質条件と反応でのオリゴ糖の含有率の経時的変化の関係を示す図面。
【図2】高い基質濃度における加熱または非加熱β−ガラクトシダーゼを用いた場合のオリゴ糖生成率の比較を示す図面。以 上
Claims (4)
- バチルス・サーキュランス由来のβ-ガラクトシダーゼを45℃以上の温度で加熱処理することを特徴とするガラクトオリゴ糖の生成能を高めるためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法。
- 加熱処理の温度が45℃以上〜60℃以下である請求項1記載のガラクトオリゴ糖の生成能を高めるためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法。
- 該バチルス・サーキュランス由来のβ-ガラクトシダーゼがβ-ガラクトシダーゼIであることを特徴とする請求項1または2記載のガラクトオリゴ糖の生成能を高めるためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法。
- 請求項1ないし請求項3のいずれかの請求項記載の改質方法により得られたβ−ガラクトシダーゼを乳糖に作用させることを特徴とするガラクトオリゴ糖の製造方法。
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JP19204397A JP3831075B2 (ja) | 1997-07-03 | 1997-07-03 | β−ガラクトシダーゼの改質方法 |
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