WO2006035725A1 - イソサイクロマルトオリゴ糖及びイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素とそれらの製造方法並びに用途 - Google Patents

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WO2006035725A1
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isocyclomaltooligosaccharide
enzyme
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isocyclomalto
oligosaccharide
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PCT/JP2005/017642
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Hikaru Watanabe
Tomoyuki Nishimoto
Michio Kubota
Shigeharu Fukuda
Toshio Miyake
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Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Definitions

  • the present invention relates to an isocyclomalto-oligosaccharide having a structure represented by the general formula 1 and an isocyclic malto-oligosaccharide-forming enzyme, a method for producing the same, and a use thereof.
  • the present invention is represented by the general formula 1.
  • Isocyclomalto-oligosaccharide and isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme having a structure and production method thereof, microorganism producing isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme, DNA encoding the enzyme, and recombinant DNA comprising the same
  • the present invention relates to a transformant, a method for producing and producing an isocyclomaltooligosaccharide using the enzyme, and a composition comprising the isocyclomaltooligosaccharide.
  • sugars having glucose as a constituent sugar for example, amylose, amylodextrin, maltodextrin, maltooligosaccharide, isomaltoligosaccharide, and the like, which are partial decomposition products of starch produced using starch as a raw material, are known. It is known that these carbohydrates usually have a non-reducing end at one end of the molecule and a reducing end at the other end and exhibit reducing properties. In general, the partial degradation product of starch is expressed as Dextrose Equivalent (DE) in terms of the amount of reducing power per solid.
  • DE Dextrose Equivalent
  • Macerance There is a known method of producing ⁇ -, ⁇ -, or ⁇ cyclodextrins in which 6 to 8 molecules of glucose form a cyclic structure by ⁇ -1,4 dalcoside bonds by the action of amylase (macerans a mylase). Yes. At present, these cyclodextrins are also produced on an industrial scale, and these cyclodextrins are used for applications that have the characteristics such as non-reducing, tasteless and inclusion properties. ing. In addition, as previously disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open Nos.
  • the applicant of the present invention applied a non-reducing saccharide-forming enzyme and trehalose to a partially degraded starch such as maltooligosaccharide.
  • a method of generating trehalose in which two molecules of glucose are ⁇ , ⁇ -1, 1 linked by the action of a free enzyme.
  • trehalose is produced from starch on an industrial scale, and is used for its non-reducing and mild, high-quality sweetness characteristics.
  • a cyclic maltosyl maltose producing enzyme is allowed to act on the partially decomposed product. It allows structures glucose 4 molecules are alternately combined in a 1, 4 Darukoshido binding and alpha-1, 6 Darukoshido bond, i.e., cyclo ⁇ 6) - a-D- Darukopiranoshiru one (1 ⁇ 4) - a—D—Darkopyranosyl (1 ⁇ 6)-a—D—Darkopyranosyl (1 ⁇ 4)-a—D—Darco bilanosyl (1 ⁇ cyclic tetrasaccharide (also known as cyclic maltosyl maltose) Living The method of making it is also known.
  • cyclic tetrasaccharides have a cyclic structure, they have inclusion ability, stabilize volatile organic substances, and are non-reducing saccharides, so they do not cause an aminocarbonyl reaction. It is expected that it can be used and processed without concern for browning and deterioration.
  • non-reducing carbohydrates having glucose as a constituent sugar ⁇ -, ⁇ -, ⁇ -cyclodextrins having a glucose polymerization degree of 6 to 8, and ⁇ , ⁇ trehalose having a glucose polymerization degree of 2 are used.
  • An object of the present invention is to provide a novel non-reducing carbohydrate having glucose as a constituent sugar, to expand the range of selection of the non-reducing carbohydrate and to produce the non-reducing carbohydrate. And a production method and a production method thereof, DNA encoding the enzyme, a recombinant DNA and a transformant comprising the enzyme, and a composition comprising the non-reducing carbohydrate. In particular.
  • a method for producing isocyclomalto-oligosaccharides using this enzyme, and a DNA encoding the enzyme, a recombinant DNA containing the enzyme, and a transformant was completed by establishing a production method and use of the existing isocyclomalto-oligosaccharides or sugar compositions containing them.
  • the present invention relates to a novel isocyclomalto-oligosaccharide having a structure represented by the general formula 1, a novel isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme that produces them, and a production method and a production method thereof.
  • DNA encoding the enzyme, recombinant DNA and transformant containing the same, Sarasuko is a food, beverage, cosmetic and pharmaceutical composition containing isocyclomaltooligosaccharide or a sugar composition containing the same.
  • the range of selection of non-reducing saccharides having glucose as a constituent sugar is widened, and a novel cyclic saccharide and isocyclomalto-oligosaccharide, which have been conventionally unknown, can be supplied in large quantities. Therefore, it can be used in various fields including food and drink, cosmetics, and pharmaceuticals.
  • FIG. 1 is a diagram showing an HPLC elution pattern of a carbohydrate I standard.
  • FIG. 2 is a diagram showing an HPLC elution pattern of a carbohydrate II preparation.
  • FIG. 3 is a diagram showing a 1 H-NMR ⁇ vector of a carbohydrate I preparation.
  • FIG. 4 is a diagram showing a 13 C-NMR spectrum of a carbohydrate I preparation.
  • FIG. 5 is a diagram showing the structure of the isocyclomaltopentaose of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing 1 H-NMR ⁇ vector of Carbohydrate II preparation.
  • FIG. 7 is a diagram showing a 13 C-NMR ⁇ vector of a carbohydrate II preparation.
  • FIG. 8 is a diagram showing the structure of isocyclomaltohexaose of the present invention.
  • FIG. 9 is a view showing the optimum temperature of an isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme.
  • FIG. 10 is a graph showing the optimum pH of an isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme.
  • FIG. 11 is a graph showing the temperature stability of an isocyclomaltooligosaccharide producing enzyme.
  • FIG. 12 is a graph showing the pH stability of an isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme.
  • FIG. 13 is a diagram showing a recombinant DNA, pBAMHl.
  • the portion indicated by a thick black line is DNA encoding the isocyclomaltooligosaccharide-producing enzyme of the present invention derived from Bacillus circulans AM7 (FERM BP-10111).
  • FIG. 14 is a view showing a recombinant DNA, pETAM1, for expressing a recombinant isocyclomalto-oligosaccharide synthase.
  • the portion indicated by a thick black line is DNA encoding the isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme of the present invention derived from Bacillus circulan AM7 (FERM BP-10111).
  • the isocyclomaltooligosaccharide referred to in the present invention means a cyclic carbohydrate having a structure represented by the following general formula 1.
  • n-force isocyclooligosaccharide that is, the 1-position of the reducing terminal glucose of the maltopentaose molecule and the 6-position hydroxyl group of the non-reducing terminal glucose.
  • a—A pentasaccharide (referred to herein as isocyclomaltopentaose) formed by linking a 1,6 dalcoside to form a cyclic structure, and the above general
  • an isocyclomalto-oligosaccharide having an n of 5, that is, the 1-position of the reducing terminal glucose of the maltohexaose molecule and the 6-position hydroxyl group of the non-reducing terminal glucose form an ⁇ -1,6-glucoside bond to form a cyclic structure.
  • hexasaccharide (referred to herein as isocyclomaltohexose).
  • the isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme referred to in the present invention acts on ⁇ -1,4 glucan having a glucose polymerization degree of 3 or more, and is a non-reducing terminal glucose of ⁇ -1,4 glucan by intermolecular transfer reaction.
  • the ⁇ 1,4 transition to the 4-position catalyzes the disproportionation reaction that produces ⁇ 1,4 glucans with various degrees of glucose polymerization, while ⁇ 1,4 dulcan (maltoheptaose with a glucose polymerization degree of 7 ), It is cleaved at the maltopentaose unit, and the intra-molecular transition in which the 1-position of the reducing terminal glucose of this maltopentaose is ⁇ 1, 6 transferred to the 6-position hydroxyl group of the non-reducing terminal dulcose of the same molecule
  • ⁇ -1,4 glucan having a glucose polymerization degree of 8 or more
  • maltopentaose or maltohexaose alone By cleaving at the position and cyclizing the 1-position of the reducing terminal glucose of maltopentaose or maltohexaose by an
  • the enzyme that catalyzes the above reaction is included in the isocyclooligosaccharide producing enzyme of the present invention regardless of its source, form, crude enzyme or purified enzyme.
  • the enzyme activity of the isocyclomaltooligosaccharide-producing enzyme of the present invention can be measured as follows. Dissolve amylose in 50 mM acetic acid buffer (pH 6.0) containing ImM calcium chloride to a concentration of 1.25 wZv% to make a substrate solution, add 0.2 ml of the enzyme solution to 0.8 ml of the substrate solution, and at 30 ° C. Incubate for 30 minutes and stop the reaction by heating the reaction solution at about 100 ° C for 10 minutes.a Add 4,000 units of darcosidase per gram of solid and 250 units of darcoamylase per gram of solid.
  • isocyclomaltopentaose in the treated solution is determined by HPLC described in Experiment 1 described later.
  • One unit of activity of isocyclomalto oligosaccharide synthase is defined as the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of isocyclomaltopentaose per minute under the above conditions.
  • isocyclomaltooligosaccharide producing enzyme of the present invention include, for example, an isocyclomaltooligosaccharide producing enzyme having the following physicochemical properties.
  • one of the isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzymes of the present invention having the above-mentioned physical properties is not only the above-mentioned physical properties, but also the sequence in the sequence listing as its N-terminal sequence. It may have the amino acid sequence represented by number 1.
  • the isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme of the present invention usually has a predetermined amino acid sequence.
  • An amino acid sequence is mentioned.
  • As a variant enzyme having an amino acid sequence homologous to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing it acts on ⁇ -1, 4 glucan having a glucose polymerization degree of 3 or more, and is represented by the general formula 1.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is within the range that retains the enzyme activity.
  • the isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme having the above-mentioned physical property or amino acid sequence is merely an example, and an enzyme having a different physicochemical property or N-terminal amino acid sequence from the above may be used as an isoenzyme.
  • the present invention includes a force to generate cyclomaltooligosaccharides.
  • the isocyclomaltooligosaccharide-producing enzyme of the present invention is not limited by its source, a preferable source is a microorganism, and in particular, the microorganism AM7 strain isolated from soil by the present inventors or a mutant strain thereof is preferable. Used for.
  • the identification test results of the microorganism AM7 strain having the ability to produce isocyclomaltooligosaccharide synthase are shown below. The identification test was conducted in accordance with “Classification and identification of microorganisms” (Takeshi Hasegawa, Academic Publishing Center, 1985).
  • Shape Circular Size is 1-2mm in 3 days.
  • Range of growth pH 5.7 to 9.8, temperature 10 to 37 ° C, NaCl concentration
  • Attitude toward oxygen facultative anaerobic
  • the microorganism having the ability to produce an isocyclomaltooligosaccharide-producing enzyme of the present invention includes not only the above-mentioned bacteria, but also mutants thereof, and other microorganisms having the ability to produce an isocyclomaltooligosaccharide-producing enzyme, and Such mutants are also included.
  • the DNA of the present invention means all those encoding the above isocyclomaltooligosaccharide-producing enzyme. As long as the DNA of the present invention encodes an isocyclomaltooligosaccharide-forming enzyme, it may be of natural origin or artificially synthesized. Yes. Examples of natural sources include Bacillus microorganisms including Bacillus circulans AM7 (FERM BP-101111), and the ability of these cells to obtain genetic DNA containing the DNA of the present invention.
  • the target gene DNA can be obtained by applying a conventional method such as phenol extraction, alcohol precipitation, centrifugation, or ribonuclease treatment to the treated product thus obtained.
  • the DNA of the present invention may be chemically synthesized based on the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It is also possible to advantageously carry out PCR synthesis using chemically synthesized DNA as an appropriate primer using a gene DNA containing the DNA as a template.
  • the DNA of the present invention usually has a predetermined base sequence, and examples thereof include the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing or a base sequence homologous thereto.
  • the mutant DNA having a base sequence homologous to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing is one or two in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 as long as the activity of the encoded enzyme is maintained. Examples include those having a base sequence in which the above bases have been deleted, substituted or added, and are usually 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. Those having a base sequence having homology of 90% or more, more desirably 90% or more are suitable.
  • the DNA of the present invention naturally includes those in which one or two or more bases are replaced with other bases based on the degeneracy of the genetic code without changing the amino acid sequence of the encoded enzyme.
  • the DNA of the present invention can also be advantageously implemented as a recombinant DNA by inserting it into an appropriate vector capable of autonomous replication.
  • Recombinant DNA usually consists of DNA and a vector capable of autonomous replication, and if DNA is available, it can be prepared relatively easily by conventional recombinant DNA techniques. Examples of such vectors include pBR322, pUC18, pBluescript II SK (+), pUBHO, pTZ4, pC194, pHV14, TRp7, YEp7, pBS7, etc. And phage vectors such as gt'C, Xgt- ⁇ , p11, ⁇ 1, and ⁇ 105.
  • pBR322, pUC18, Bluescript II SK (+), gt ⁇ ⁇ C and ⁇ gt ⁇ ⁇ ⁇ are preferred for expressing the DNA of the present invention in E. coli, while it is expressed in Bacillus subtilis.
  • PUB110, pTZ4, pC194, 11, ⁇ 1 and ⁇ 105 are suitable.
  • pHV14, TRp7, YEp7 and pBS7 are useful when replicating recombinant DNA in two or more hosts. In order to insert DNA into such a vector, a general method is usually employed in this field.
  • a gene DNA containing DNA and an autonomously replicable vector are cleaved with a restriction enzyme and Z or ultrasound, and then the generated DNA fragment and vector fragment are ligated.
  • Restriction enzymes that specifically act on nucleotides to cleave gene DNA and vectors in particular, ⁇ type restriction enzymes, in particular Sau 3AI, Eco RI, Hind III, Bam HI, Sal I, Xba I, Sac I, If Pst I or the like is used, it is easy to link the DNA fragment and the vector fragment.
  • DNA ligase may be allowed to act in vivo or in vitro.
  • the recombinant DNA obtained in this way can be replicated indefinitely by introducing it into a host as appropriate and transforming it and culturing it.
  • the recombinant DNA thus obtained can be introduced into an appropriate host microorganism such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycetes, or yeast.
  • an appropriate host microorganism such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycetes, or yeast.
  • the ability to apply the Koguchi-Hybridization method is cultured in a nutrient medium containing ⁇ -1,4 glucone having a glucose polymerization degree of 3 or more, and the sugar is isolated from the saccharide. It is sufficient to select one that produces cyclomaltooligosaccharide.
  • the medium used for culturing the microorganism including the transformant having the ability to produce the isocyclomaltooligosaccharide-producing enzyme of the present invention can be any nutrient medium that can grow the microorganism and produce the isocyclomaltooligosaccharide-producing enzyme. Of course, it can be a difference between synthetic and natural media.
  • any microorganism that can be used for growth is acceptable, for example, starch derived from plants, glycogen and pullulan derived from animals and microorganisms, and these partially decomposed products, glucose, and fructose.
  • Sugars such as latatose, sucrose, mannitol, sorbitol and molasses, and organic acids such as succinic acid and succinic acid can also be used.
  • concentration of these carbon sources in the medium can be selected appropriately according to the type of carbon source.
  • the nitrogen source for example, inorganic nitrogen compounds such as ammonium salts and nitrates, and organic nitrogen-containing substances such as urea, corn steep liquor, casein, peptone, yeast extract, meat extract, etc. are used as appropriate. it can.
  • inorganic components for example, calcium salts, magnesium salts, potassium salts, sodium salts, phosphates, manganese salts, zinc salts, iron salts, copper salts, molybdenum salts, cobalt salts, and the like should be used as appropriate. Is possible. Furthermore, amino acids, vitamins and the like can be appropriately used as necessary.
  • the culture is usually aerobic under conditions selected from a temperature range of 5.5 to 10 at a temperature of 15 to 37 ° C, preferably a pH range of 5.5 to 8.5 at a temperature of 20 ° to 34 ° C. To be done.
  • the culture time is preferably 10 hours to 150 hours as long as the microorganism can grow.
  • the dissolved oxygen concentration of the culture solution under the culture conditions is not particularly limited, but usually 0.5 to 20 ppm is preferable.
  • means such as adjusting the air flow rate and stirring are appropriately employed.
  • the culture method may be either batch culture or continuous culture.
  • the culture containing the enzyme of the present invention is collected. Isocyclomalto-oligosaccharide synthase activity is mainly observed in the sterilization solution of the culture, and the sterilization solution can be collected as a crude enzyme solution or the whole culture can be used as a crude enzyme solution.
  • a known solid-liquid separation method is employed to remove the cells from the culture. For example, a method of centrifuging the culture itself, a method of filtration separation using a precoat filter or the like, a method of separation by membrane filtration of a flat membrane, a hollow fiber membrane, or the like is appropriately employed.
  • the sterilized solution can be used as a crude enzyme solution as it is, it is generally used after being concentrated.
  • concentration method an ammonium sulfate salting-out method, an acetone and alcohol precipitation method, a membrane concentration method using a flat membrane, a hollow membrane, or the like can be employed.
  • the isocyclomaltooligosaccharide-forming enzyme can be immobilized by a known method using a sterilizing solution having isocyclomaltooligosaccharide-forming enzyme activity and a concentrated solution thereof.
  • a binding method to an ion exchanger, a covalent bonding method with a resin and a membrane, an adsorption method, a comprehensive method using a polymer substance, and the like can be appropriately employed.
  • the isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme of the present invention can be used as it is or after concentrating the crude enzyme solution. Separation 'Purification can also be used. For example, after dialysis of a crude enzyme preparation concentrated by treatment with ammonium sulfate after treatment of the culture solution, anion exchange column chromatography using “DEAE-Toyopearl 650S” fat, followed by “Butyl It is possible to obtain the isocyclomaltooligosaccharide-forming enzyme of the present invention by electrophoresis as a single enzyme by purifying it using hydrophobic chromatography using pearl (Phenyl-Toyopearl) 650 ⁇ .
  • the enzyme may accumulate in the microbial cells depending on the type of host.
  • the bacterial cells or the culture can be used as they are, but usually after the cell strength is extracted by osmotic shock or a surfactant as needed before use, or Alternatively, after disrupting the cells with ultrasonic waves or cell wall-dissolving enzyme, it is also possible to advantageously use the recombinant enzyme by separating it from the cells or cell disrupted material by filtration, centrifugation, or the like.
  • the isocyclomaltooligosaccharide-producing enzyme of the present invention may specifically have the following physical properties.
  • N-terminal amino acid sequence Amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 It has the amino acid sequence of
  • the ⁇ -1,4 glucan having a degree of polymerization of glucose of 3 or more as a substrate for the isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme of the present invention includes starch, amylose, amylopectin, glycogen, and the like, and amylase or acid.
  • examples include partial degradation products such as amylodextrins, maltodextrins and maltooligosaccharides obtained by partial hydrolysis.
  • partially decomposed products decomposed with amylase are described in, for example, “Handbook of Amylases and Related Enzymes” (1988) Pergamon Press Co., Ltd. (Tokyo).
  • ⁇ -amylase (EC 3.2.1.1.1), maltotetraose-producing amylase (EC 3.2.1.60), maltopentaose-producing amylase, maltohexaose-producing amylase (EC 3.2.1) 1.
  • Partially decomposed products obtained by decomposing starch, amylose, amylopectin, glycogen, etc. using amylase such as 1.98) can be used.
  • starch debranching enzymes such as pullulanase (EC 3.2.1.41) and isoamylase (EC 3.2.1.68) when preparing partial degradation products. .
  • the starch as a substrate may be, for example, ground starch derived from corn, wheat, rice, etc., or may be ground starch derived from potato, sweet potato, tapio, etc.
  • starch is used. Used as gelatinized and Z or liquid solution. The lower the degree of partial degradation of the starch, the higher the production rate of isocyclomaltooligosaccharide. Therefore, a partial degradation product having a DE of about 20 or less, desirably about 12 or less, and more desirably about 5 or less is suitable.
  • isocyclomalto-oligosaccharide production rate (%) ⁇ (mass of produced isocyclomalto-oligosaccharides) / (total carbohydrate in the reaction solution) Mass) ⁇ means the value calculated by X100.
  • the substrate concentration is not particularly limited.
  • a relatively low concentration solution having a substrate concentration of 0.1% (WZV) is used.
  • the reaction of the isocyclomaltooligosaccharide producing enzyme of the present invention proceeds to produce isocyclomaltooligosaccharide.
  • a substrate concentration of 1% (WZV) or more is suitable, and isocyclomaltooligosaccharides can be produced advantageously under these conditions.
  • the reaction temperature may be the temperature at which the reaction proceeds, that is, up to about 55 ° C. Preferably temperatures around 30-45 ° C are used.
  • the reaction pH is usually adjusted in the range of 4.5 to 8.0, preferably in the range of pH 5.0 to 7.5.
  • the amount of enzyme used and the reaction time are closely related and may be appropriately selected depending on the progress of the target enzyme reaction.
  • the isocyclomalto-oligosaccharide-forming enzyme of the present invention to act on starch having a substrate concentration of 1% (w / v) or a partially decomposed product thereof or an aqueous solution of amylose, it is about 20% or more from the starch or partially decomposed product thereof.
  • the isocyclomalto-oligosaccharide of the present invention can be obtained with a high isocyclomalto-oligosaccharide production rate of about 30%.
  • the production mechanism of isocyclomalto-oligosaccharides by this isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme is presumed as follows.
  • This enzyme acts on ⁇ -1,4 glucan having a glucose polymerization degree of 3 or more as a substrate, and ⁇ -1 on the 4-position hydroxyl group of non-reducing terminal glucose of ⁇ -1,4 glucan by intermolecular transfer reaction. , 4-Dalkanes with various degrees of glucose polymerization are produced by the disproportionation reaction due to the 4 transition.
  • another enzyme can be used in combination to improve the isocyclomaltooligosaccharide production rate.
  • another enzyme can be used in combination to improve the isocyclomaltooligosaccharide production rate.
  • it is possible to further improve the production rate of isocyclomalto-oligosaccharide by using starch in combination with isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme and starch debranching enzymes such as isoamylase and pullulanase. Can be implemented.
  • the reaction solution obtained by the above reaction can also be used as an isocyclomaltooligosaccharide-containing sugar solution as it is.
  • one or more selected from ⁇ -amylase, j8-amylase, darcoamylase, and ⁇ -darcosidase are allowed to act on the sugar solution containing isocyclomaltooligosaccharide to hydrolyze contaminating oligosaccharide.
  • It can also be used as a sugar solution containing a decomposed isocyclic maltooligosaccharide. Further, it is optional to carry out further processing such as hydrogenation to convert the reducing sugar remaining in the reaction solution into sugar alcohol to eliminate the reducing power.
  • an isocyclomaltooligosaccharide-containing sugar solution is used after further purification.
  • a purification method a normal method used for sugar purification may be adopted as appropriate, for example, decolorization with activated carbon, H-type, OH-type ion-exchange resin, desalting, ion-exchange column chromatography, activated carbon column.
  • Fractionation by column chromatography such as chromatography, silica gel chromatography, fractionation with organic solvents such as alcohol and acetone, separation with membranes with moderate separation performance, and contamination without using isocyclomaltooligosaccharides
  • One or more purification methods can be used as appropriate, such as fermentation treatment with microorganisms that assimilate and decompose carbohydrates, such as yeast, and decomposition and removal of remaining reducing carbohydrates by alkali treatment. .
  • ion exchange column chromatography which is disclosed in, for example, JP-A-58-23799 and JP-A-58-72598.
  • An isocyclomalto-oligosaccharide or a saccharide containing the same can be advantageously produced by removing contaminating saccharides by column chromatography using a strongly acidic cation-exchanged rosin and improving the content of the target product.
  • a shift method such as a fixed bed method, a moving bed method, and a simulated moving bed method.
  • the aqueous solution containing the isocyclomalto-oligosaccharide thus obtained or the saccharide aqueous solution having an improved content thereof usually contains 10% by mass or more, preferably 10% by mass or more of the isocyclomaltooligosaccharide per solid.
  • a sugar solution containing 40% by mass or more is usually concentrated to obtain a syrup-like product.
  • the syrup-like product is optionally further dried to an amorphous solid product or an amorphous powder product.
  • the isocyclomalto-oligosaccharide of the present invention has an inclusion ability and prevents volatilization of the included fragrance component and active ingredient, as well as quality deterioration. Stabilization 'Excellent retention. At this time, if necessary, cyclodextrins, branched cyclodextrins, glucose 4 molecule alpha -1, 3 and alpha-1, 6 cyclic tetrasaccharide engaged binding alternately coupling, branched cyclic tetrasaccharides, glucose 4 Increasing stabilization by inclusion by using other cyclic carbohydrates such as cyclic maltosyl maltose, cyclodextran, cycloflatanes, etc., in which molecules are alternately linked by ⁇ 1, 4 and ⁇ 1, 6 bonds Can also be advantageously implemented.
  • Cyclic dextrins and other cyclic carbohydrates are not necessarily limited to high-purity cyclic carbohydrates such as low-purity cyclic carbohydrates, such as starch partial decomposition products containing various cyclic carbohydrates with a large amount of maltodextrin. Available.
  • the isocyclomalto-oligosaccharide of the present invention is a hardly refractory saccharide that is not digested and absorbed even when taken orally because it is not substantially degraded by X amylase or a-darcosidase. It is a novel, non-toxic and harmless carbohydrate.
  • the isocyclomalto-oligosaccharide of the present invention or a saccharide containing the same is used as a sweetener, taste improver, quality improver, stabilizer, discoloration inhibitor, excipient, etc. It can be advantageously used in various compositions such as food, food, cosmetics, and pharmaceuticals.
  • the isocyclomaltooligosaccharide of the present invention or a saccharide containing the same can be used as it is as a seasoning for sweetening.
  • a seasoning for sweetening for example, flour, glucose, isomeric sucrose, sugar, maltose, trehalose, honey, maple sugar, sorbitol, maltitol, dihydrochalcone, stevioside, ⁇ -glycosyl stevioside, lacan strength sweetener, glycyrrhizin, thaumatin Used in combination with other sweeteners such as sucralose, L-subspartylphenylalanine methyl ester, saccharin, glycine, alanine, and bulking agents such as dextrin, starch, lactose, etc.
  • the isocyclomalto-oligosaccharide of the present invention or a saccharide powder product containing the same may be used as it is or mixed with a bulking agent, an excipient, a binder or the like, if necessary. It is optional to use in various shapes such as granules, spheres, short bars, plates, cubes, tablets, etc.
  • the sweetness of the isocyclomalto-oligosaccharide of the present invention or a saccharide containing the same well harmonizes with various substances having other tastes such as acidity, salt, taste, astringency, umami, and bitterness, Since it has high acid resistance and heat resistance, it can be advantageously used for sweetening and taste improvement of general foods and drinks, and quality improvement.
  • soy sauce, powdered soy sauce, miso, powdered miso, moromi, hishio, fried oyster, mayonnaise, dressing, vinegar, three cups of vinegar, powdered sushi vinegar, Chinese soup, tempura soup, salmon soup, sauce, ketchup , Carreru, stew, soup, dashi, compound seasonings, sweeteners for various seasonings such as mirin, new mirin, table sugar, coffee sugar, as well as taste improvers and quality improvers For example, it can be advantageously used.
  • rice crackers hail, rice cakes, fertilizers, potatoes, manju, sea bream, varieties, sheepskin, water sheepskin, brocade, jelly, castella, candy balls and other Japanese sweets, bread, biscuits, crackers, cookies, pie , Pudding, butter cream, custard cream, shuffled, waffle, sponge cake, donut, chocolate, chewing gum, caramel, nougat, candy Syrups, pastes such as flower paste, peanut paste, and fruit paste, jam, marmalade, syrup pickles, fruits such as sugar cane, processed vegetables, vegetable pickles, fukujin pickles, lettuce pickles, thousand pieces pickles, raitsuki yo pickles, etc.
  • Soft drinks pudding mix, hot cake mix, Improving the taste by adding sweetness to instant foods such as instant juice, instant coffee, instant shirako, instant soup, and other foods such as baby food, therapeutic food, drinks, peptide food, frozen food, It can be advantageously implemented for quality improvement.
  • Livestock, poultry, and others can also be used for the purpose of improving palatability, such as feed and feed for domestic animals such as bees, sharks, and fish.
  • the quality improver and stabilizer can be advantageously applied to various active ingredients or health foods, functional foods, pharmaceuticals and the like containing the active ingredient and activity.
  • interferon 1 a, 1 ⁇ , 1 ⁇ , Zmoa 'necrosis' factor ⁇ —— a, 1 ⁇ macrophage migration inhibitory factor, colony stimulating factor, transfer factor, lymphokine-containing solution such as interleukin II, insulin, growth Hormone-containing liquids such as hormones, prolatatin, erythropoietin, egg cell stimulating hormone, BCG vaccine, Japanese encephalitis vaginalis, measles vaccine, polio vaccine, seedling, tetanus toxoid, hub antitoxin, human immunoglobulin-containing liquids, Antibiotic fluids such as penicillin, erythromycin, chloramphenicol, tetracycline, streptomycin, kanamycin sulfate, thiamine, riboflavin
  • an isocyclomaltooligosaccharide or a saccharide containing the same is added.
  • a method of inclusion for example, mixing, kneading, dissolution, melting, dipping, infiltration, spraying, coating, coating, spraying, pouring, crystallization, solidification, etc., should be included in the process until the product is completed.
  • a known method is appropriately selected.
  • the amount is usually 0.1% by mass or more, preferably 1% by mass or more.
  • Partially decomposed starch (trade name “Pinedettas # 4”, manufactured by Matsutani Chemical Co., Ltd.) 1.5 wZv%, yeast extract (trade name “Polypeptone”, manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 0.5 w / v%, yeast Extract (trade name “Yeast Extract S”, manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 0. lwZv%, dipotassium phosphate 0.
  • the culture solution was centrifuged (8, OOOrpm, 20 minutes) to remove the cells and obtain a culture supernatant (about 0.3 L).
  • a culture supernatant about 0.3 L
  • 50 mM acetate buffer pH 6.0
  • the reaction was stopped by heat treatment at about 100 ° C for 10 minutes.
  • the saccharides in the obtained reaction solution were analyzed by high performance liquid chromatography for analysis (hereinafter, abbreviated as analytical HPLC).
  • analytical HPLC high performance liquid chromatography for analysis
  • saccharide II a saccharide with an elution time of 37.1 minutes
  • glucose was 73.3%
  • carbohydrate I was 24.2%
  • carbohydrate II was 2.5%.
  • the fractions of carbohydrate I and carbohydrate II were separately collected, microfiltered, and vacuum dried to obtain about 850 mg of carbohydrate I as a solid and about 10 mg of carbohydrate II as a solid.
  • the preparative HPLC uses an “ODS-AQR-355-15AQ” column (manufactured by YMC), 7.5% (v / v) methanol as the eluent, a column temperature of 25 ° C, and a flow rate. The test was performed under the condition of 20 mlZ.
  • the carbohydrate I sample obtained by the method of Experiment 1 was subjected to mass spectrometry using the mass spectrometer “LCQ—Advantage” (manufactured by Thermo Electron). Remarkably detected, the mass number of carbohydrate I was found to be 810.
  • the carbohydrate I preparation obtained by the method of Experiment 1 was hydrolyzed to monosaccharides using sulfuric acid according to a conventional method, and when the constituent sugars were examined by gas chromatography, only D-glucose was detected.
  • Carbohydrate I was found to contain only D-glucose as a constituent sugar. Above Considering the mass number, carbohydrate I was found to be a cyclic carbohydrate consisting of 5 molecules of D-glucose.
  • carbohydrate I is the cyclo ⁇ 6)-a-D-darcoviranosyl shown in FIG.
  • the carbohydrate sample obtained by the method in Experiment 1 was hydrolyzed to monosaccharides using sulfuric acid according to a conventional method, and when the constituent sugars were examined by gas chromatography, only D-glucose was detected.
  • Carbohydrate II was found to contain only D-glucose as a constituent sugar. Considering the above-mentioned mass number, it was found that the carbohydrates are cyclic carbohydrates consisting of 6 molecules of D-glucose.
  • Carbohydrate II is cyclo ⁇ 6)-a-D-darcoviranosyl shown in FIG.
  • the isocyclomaltohexaose of the present invention is a novel cyclic carbohydrate.
  • ammonium sulfate was added to about 10 L (total activity of about 250 units) to a final concentration of 80%, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C for 24 hours for salting out.
  • the generated salting-out precipitate is collected by centrifugation (11, OOOrpm, 30 minutes), dissolved in lOmM acetate buffer (PH 6.0), dialyzed against the same buffer, and used as a crude enzyme solution. About 240 ml was obtained.
  • the isocyclomaltooligosaccharide synthase activity in the crude enzyme solution was about 0.96 units Zml (total activity about 230 units).
  • the crude enzyme solution was subjected to anion exchange chromatography (gel volume 120 ml) using “DEAE-Toyopearl 650S” gel manufactured by Tosoh Corporation.
  • the fraction with isocyclomalto-oligosaccharide synthase activity was not adsorbed on the “DEAE-Toyopearl 650S” gel equilibrated with 10 mM acetic acid (pH 6.0) but dissolved in the non-adsorbed fraction.
  • This active fraction was collected, added with ammonium sulfate to a final concentration of 1M, and left at 4 ° C for 24 hours. After centrifugation, the insoluble material was removed by centrifugation.
  • uthyl-Toyopearl 650M gel was used for hydrophobic chromatography (gel volume 60 ml).
  • the fraction with the isocyclomalto-oligosaccharide-forming enzyme is adsorbed on a “Butyl Toyopearl 650M” gel equilibrated with 10 mM acetate buffer (pH 6.0) containing 1M ammonium sulfate, and a linear graph with an ammonium sulfate concentration of 1M and 0M. As a result, it was eluted at around 0.1M ammonium sulfate concentration.
  • Table 3 shows the activity, specific activity, and yield of the isocyclomaltooligosaccharide-forming enzyme in each step of this purification.
  • the purity of the enzyme preparation was assayed by 5-20 wZv% concentration gradient polyacrylamide gel electrophoresis of the purified isocyclomaltooligosaccharide-producing enzyme preparation. As a result, the protein band was single and the purity of the preparation was high. there were.
  • the purified isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme preparation obtained by the method in Experiment 5 was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (5 to 20 wZv% concentration gradient), and simultaneously migrated molecular weight markers (Nippon Bio 'Rad')
  • the molecular weight of the isocyclomaltooligosaccharide-forming enzyme was found to be 106,000 20,000 ⁇ 20,000 Dalton.
  • the purified isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme preparation obtained by the method of Experiment 5 was subjected to isoelectric focusing polyacrylamide gel electrophoresis containing 2.2 wZv% 7 nforeline (Amersham Biosciences) and electrophoresed simultaneously.
  • isoelectric point was determined by comparison with a point marker (Amersham Biosciences), it was found that the isoelectric point of the isocyclomaltooligosaccharide-producing enzyme was pI7.5 ⁇ 0.5.
  • the optimum temperature of the isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme is 50 to 55 ° C under pH 6.0 for 30 minutes reaction condition, and the optimum pH is 30 ° C for 30 minutes reaction condition 4. It was found to be 5 to 8.0.
  • the temperature stability of the isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme was found to be up to 35 ° C in the absence of calcium chloride and up to 40 ° C in the presence of calcium chloride ImM. Of the enzyme by calcium ions The improvement in temperature stability was remarkable. Further, as is apparent from FIG. 12, it was found that the pH stability of the isocyclomaltooligosaccharide-producing enzyme is in the range of pH 4.5 to 9.0.
  • HPLC column (trade name “Micro Bondersfair C1 8”, diameter, which was equilibrated with 0.1% (v / v) trifluoroacetic acid containing the hydrolyzate in advance with 10% (v / v) acetonitrile. 3. 9 mm X length 150 mm, manufactured by Waters Co., Ltd.), 0.1 ml (v / v) trifluoroacetic acid—10% (v / v) acetonitrile solution at a flow rate of 0.9 mlZ min at room temperature. Peptide fragments were fractionated by passing through a 100% linear gradient of 1% (v / v) trifluoroacetic acid—50% (vZv) acetonitrile.
  • Peptide fragments that also eluted column force were detected by measuring absorbance at a wavelength of 210 nm.
  • DNA encoding an isocyclomalto-oligosaccharide synthase is cloned by Bacillus circulans AM7 (FERM BP-10111) to produce autonomously replicable recombinant DNA, determination of the DNA sequence encoding the enzyme, and traits
  • Bacillus circulans AM7 Bacillus circulans AM7 (FERM BP-10111) to produce autonomously replicable recombinant DNA, determination of the DNA sequence encoding the enzyme, and traits
  • the converter was prepared
  • Partially decomposed starch (trade name “Pinedettas # 4”, manufactured by Matsutani Chemical Industry Co., Ltd.) 0.2 5 wZv%, yeast extract (trade name “Powdered Yeast Extract S”, sold by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 0.2 wZv% , Yeast extract (trade name “Polypeptone”, sold by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 1.
  • Liquid salt medium of 0.05 wZv%, calcium carbonate 0.lwZv% and water is placed in 100 ml portions in a 500 ml Erlenmeyer flask, sterilized in an autoclave at 121 ° C for 20 minutes, cooled, and cooled.
  • Lance AM7 (FERM BP-10111) was inoculated and cultured with shaking at 27 ° C and 230 rpm for 5 days.
  • the partial DNA fragment was subjected to PCR cloning. Based on the 10th to 15th and 13th to 18th amino acid sequences in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing which is the N-terminal amino acid sequence of the isocyclomaltosaccharide sugar-producing enzyme, Two sense primers F1 and F2 shown in SEQ ID NOs: 13 and 14 in the sequence listing were synthesized.
  • SEQ ID NO: 15 Two kinds of antisense primers R1 and R2 indicated by 16 were synthesized.
  • the first PCR was performed according to a conventional method using the combination of the sense primer F1 and the antisense primer R1 and the chromosomal DNA obtained in Experiment 7-1 as a saddle type.
  • the second PCR was performed with the combination of sense primer F2 and antisense primer R2 using the obtained PCR product as a saddle shape, and two types of PCR-amplified DNA fragments of about 200 base pairs and about 300 base pairs were observed. It was.
  • the PCR-amplified DNA fragment is inserted into the restriction enzyme Srf I site of a plasmid (product name: “pCR—Script Amp SK (+)”, sold by Stratagene), and then subjected to a competent cell (product)
  • the name “Epicuri an Coli XL2-Blue”, made by Stratagene's Krounging System” was transformed.
  • the obtained transformant was also extracted by recombinant alkaline DNA by the ordinary alkali-SDS method, and a transformant holding the desired recombinant DNA having an inserted DNA fragment of about 300 base pairs was selected.
  • the recombinant DNA contained DNA having a base sequence of a chain length of 251 base pairs represented by SEQ ID NO: 17 in the sequence listing. I was ashamed.
  • the 37th to 46th and 47th to 60th amino acid sequences of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing are the partial amino acid sequences of isocyclomaltooligosaccharide-forming enzymes in the sequence listing. Since the amino acid sequence completely matched with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 6 and 10, the above DNA fragment is a DNA encoding a part of an isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme derived from Bacillus circulans AM7 (FERM BP — 10111). It turned out to be a fragment.
  • a plasmid vector (Stratagene 'Cloung' system, registered trademark “pBluescript II SK (+)”) is completely cleaved by the restriction enzyme Hind ⁇ ⁇ ⁇ by a conventional method, and then the cleaved plasmid vector 0 5 ⁇ g and about 5 ⁇ g of the previously obtained DNA fragment were ligated using a commercially available kit (trade name “DNA Ligation 'kit” manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the attached instructions.
  • a commercially available kit (trade name “DNA Ligation 'kit” manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the attached instructions.
  • the resulting recombinant DNA is used to transform a competent cell (trade name “Epicurian Coli XL2—Blue”, manufactured by Stratagene Crawling System) by the conventional combi- tive cell method to perform Hind III chromosomal DNA live. A rally was made.
  • a competent cell trade name “Epicurian Coli XL2—Blue”, manufactured by Stratagene Crawling System
  • the transformant thus obtained was prepared according to a conventional method.
  • LOgZl tryptone, 5 gm mother extract, 5 gZl sodium chloride, lOOmgZl ampicillin sodium salt, 50 mgZl5 After inoculating agar plate ( ⁇ 7.0) containing ⁇ -galatatoside and culturing at 37 ° C for 24 hours, about 655 colonies formed on the medium were nylon. It was fixed on a membrane (trade name “Hybond—N +”, manufactured by Amersham).
  • the recombinant DNA prepared in Experiment 7-2 was digested with restriction enzymes Not I and Bam HI, and the target DNA fragment of about 300 base pairs was collected by conventional agarose gel electrophoresis.
  • Transformant BAMH1 was inoculated in L broth medium (pH 7.0) containing 100 gZml ampicillin sodium salt according to a conventional method, and cultured with shaking at 37 ° C for 24 hours. After completion of the culture, the cells were collected from the culture by centrifugation, and the recombinant DNA was extracted by the usual alkaline SDS method.
  • the recombinant DNA was represented by SEQ ID NO: 18 in the sequence listing derived from Bacillus circulans AM7 (FERM BP-101 11). It contained DNA having a base length of 2,985 base pairs. As shown in FIG.
  • the DNA was ligated downstream of the recognition site by the restriction enzyme Hind III.
  • the estimated amino acid sequence of the nucleotide sequence is as shown in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18, and this amino acid sequence and the isocyclomalto-oligo of the present invention confirmed by the method of Experiment 6-6 were used.
  • the N-terminal amino acid sequence of the saccharogenic enzyme and the partial amino acid sequence revealed by the methods of Experiments 6-7 were compared with the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NOs: 4 to 12 in the Sequence Listing.
  • amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 was completely identical with the 36th to 55th amino acid sequences in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 in the Sequence Listing.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, and 12 in the sequence listing are respectively amino acids listed in the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing.
  • 126th to 135th, 140th to 149th, 84th to 93rd, 152th to 163rd, 806th in the array Through the 816th, 925th to 939th, 94th to 107th, 185th to 197th, and 272th to 286th amino acid sequences completely matched.
  • the above is the isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme force S of the present invention, which contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and the enzyme is used in Bacillus circulans AM7 (FERM BP 10111).
  • Bacillus circulans AM7 Bacillus circulans AM7 (FERM BP 10111).
  • the DNA is encoded by the DNA of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • the 1st to 35th amino acid sequences in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing were presumed to be the secretory signal sequence of the enzyme.
  • the precursor before secretion of the enzyme also has the amino acid sequence power shown in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing, and the amino acid sequence is encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing. Turned out to be.
  • the recombinant DNA prepared and confirmed for its base sequence was named “ ⁇ 1 ”.
  • the isocyclomaltooligosaccharide synthase gene in the recombinant DNA “pBAMHl” was inserted into an expression vector, and the expression of the recombinant isocyclomaltooligosaccharide synthase in Escherichia coli was examined.
  • a combination of a sense primer having a sequence and an antisense primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing synthesized based on the base sequence of the Nde I recognition site inside the structural gene, and Nde I recognition inside the structural gene The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21 in the sequence listing synthesized based on the nucleotide sequence of the site
  • the amplified DNA fragment was obtained.
  • the amplified DNA fragment thus obtained was used as a saddle shape, and the sense primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 20 in the sequence listing synthesized to introduce the Nde I recognition site upstream of the structural gene and the structural gene
  • the target Nde I recognition site is obtained by performing secondary PCR with a combination of antisense primers having the base sequence shown in SEQ ID NO: 23 in the sequence listing synthesized based on the base sequence of the restriction enzyme Bam HI recognition site located downstream.
  • a cyclomalto-oligosaccharide synthase gene from which the Nde I recognition site in the structural gene was deleted was amplified.
  • Recombinant DNA obtained by incorporating the above amplified DNA into the expression vector pET-38b (+) (manufactured by Novagen) digested with restriction enzymes Nde I and Bam HI by a conventional method is designated as “ ⁇ 1”. Named.
  • pET AMI is shown in FIG.
  • pETAMl is used to transform E. coli JM109 (sold by Toyobo Co., Ltd.), pETAMl is prepared from the resulting transformant, and the expression host E. coli BL2 1 (DE3) (manufactured by Novazien) is transformed.
  • the body “ETAM1” was prepared.
  • liquid medium consisting of lOgZl tryptone (trade name “Bacto-tryptone”, sold by Difco), 5 gZl yeast extract (trade name “Bacto-yeast extract”, sold by Difco), and lOgZl salt and water in a 500 ml Erlenmeyer flask
  • the solution was sterilized by autoclaving at 121 ° C for 20 minutes, cooled, and adjusted to pH 7.5 aseptically, and then 2 mg of kanamycin was aseptically added to prepare a liquid medium.
  • This liquid medium was inoculated with the transformant ETAM1 obtained by the method of Experiment 8-1, and when turbidity reached about 0.6 after culturing by rotary shaking at 27 ° C, isopropyl 1-thio 1-13 — D-galactopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 0.4 mM to induce the expression of the isocyclomaltooligosaccharide synthase gene, followed by further incubation for 3 hours.
  • IPTG isopropyl 1-thio 1-13 — D-galactopyranoside
  • the obtained culture was centrifuged according to a conventional method, and the culture supernatant and cells were separated and collected. For the cells, the whole extract from the cells was prepared by ultrasonic disruption.
  • the cells are suspended in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5).
  • the cell suspension was cooled in ice water while being disrupted with an ultrasonic homogenizer (Model UH-600, manufactured by SMT Co., Ltd.), and the disrupted product was used as a whole cell extract.
  • the molecular weight by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was about 106,000 ⁇ 20, 000 daltons, and the isoelectric point by polyacrylamide gel electrophoresis was about 7.5 ⁇ 0.5
  • the optimum temperature for cyclomaltooligosaccharide-forming enzyme activity is approximately 6.0 to 55 ° C under the reaction condition of pH 6.0 for 30 minutes, and the optimum pH is approximately 4.5 to 30 minutes under the reaction condition of 30 ° C.
  • temperature stability is up to 35 ° C in the absence of calcium chloride and about 40 in the presence of ImM calcium chloride under the condition of holding at each temperature for 60 minutes.
  • the substrate specificity of the isocyclomaltooligosaccharide-forming enzyme was examined using various carbohydrates.
  • Aqueous solution containing North, Isopanose, Manolecithonole, Maltotriitol, ⁇ -, ⁇ - or ⁇ -cyclodextrin, amylose, soluble starch, glycogen, pullulan or dextran was prepared.
  • the purified isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme preparation obtained by the method in Experiment 5 was used as a substrate solid.
  • One unit was added per gram of the product, and the substrate concentration was adjusted to 2 wZv%, and this was allowed to act at 40 ° C, pH 6.0 for 24 hours.
  • a mixed solvent of n-butanol, pyridine and water (volume ratio 6: 4: 1) was used as a developing solvent, and “Kezel Gel 60” manufactured by Merck was used as a thin layer plate.
  • TLC silica gel thin layer chromatography
  • isocyclomaltooligosaccharide synthase acts well on maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose and maltoheptaose among the tested sugars. Slightly affected maltotriose.
  • the isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme of the present invention worked well for amylose, soluble starch, and glycogen. From these results, it was found that this enzyme acts on ⁇ -1,4 glucan having a glucose polymerization degree of 3 or more.
  • the purified isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme obtained by the method of Experiment 5 is added.
  • One unit per gram of substrate solid was added, allowed to act at 45 ° C and pH 6.0, sampled over time, and held at 100 ° C for 10 minutes to stop the reaction.
  • the sugar composition of the enzyme reaction solution was measured using HPLC.
  • HPLC is performed by connecting two columns of “MCIgel CK04SS” (manufactured by Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) in series and using water as the eluent at a column temperature of 80 ° C and a flow rate of 0.4 mlZ.
  • the detection was performed using a differential refractometer RID-10A (manufactured by Shimadzu Corporation). The results are shown in Table 7. [0114] [Table 7]
  • the isocyclic malto-oligosaccharide-producing enzyme of the present invention acts on maltohexaose, and a series of malto-oligosaccharides up to maltose force maltopentaose is ⁇ -1,4 transferred between molecules, and glucose polymerization occurs. It catalyzes the formation (disproportionation reaction) of malto-oligosaccharides with different degrees of glucose polymerization, including malto-oligosaccharides with a degree of 8 or higher, and at the same time cleaves from malto-oligosaccharides with a degree of glucose polymerization of 7 (maltoheptaose) in maltopentaose units.
  • the reaction mechanism of the isocyclo oligosaccharide by the isocyclo maltooligosaccharide producing enzyme of the present invention was considered as follows.
  • the enzyme Acts on a-1,4 glucan with a degree of coarse polymerization of 3 or more, and transfers a series of maltooligosaccharides ex 1,4 between molecules to catalyze the formation (disproportionation reaction) of maltooligosaccharides with different degrees of polymerization.
  • isocyclomaltooligosaccharide producing enzyme of the present invention Using the isocyclomaltooligosaccharide producing enzyme of the present invention, the production of isocyclomaltooligosaccharides from various carbohydrates was tested. Each aqueous solution of maltohexaose, maltoheptaose, amylose, soluble starch, partially decomposed starch (trade name "Pinedettas # 100", manufactured by Matsutani Chemical Co., Ltd.), glycogen (derived from corn, manufactured by Kewpie Co., Ltd.) Prepared.
  • Substrate Isocyclomalt Isocyclomal®
  • isocyclomaltopentaose and isocyclohexohexaose were produced from any of the tested carbohydrates by the action of isocyclomaltosaccharide sugar-forming enzyme.
  • the total production rate is as low as about 14% when the substrate is maltohexaose, while it is about 29% when the substrate is amylose, followed by the soluble starch and the partially degraded starch. It was.
  • the purified isozyme maltooligosaccharide-forming enzyme obtained by the method of Experiment 5 Add 1 unit of sample per gram of solid, react at 45 ° C and pH 6.0, sample immediately after addition of the enzyme, and immediately heat the sample for 10 minutes at about 100 ° C to react. The reaction was stopped and the mixture was cooled with water to obtain a reaction solution with a reaction time of 0 hours.
  • Partially decomposed starch (trade name “Pinedettas # 100”, manufactured by Matsutani Chemical Industry Co., Ltd.) Prepare an aqueous solution (final concentration lwZv%), final concentration 20 mM acetate buffer (pH 5.5) and final concentration ImM After adding calcium, 1 unit of purified isocyclomartigosaccharide-forming enzyme preparation obtained by the method of Experiment 5 per gram of solid and 1 unit of isoamylase (produced by Hayashibara Biochemical Laboratories) 0, 125, 250, 500, 1250 or 2500 units were added per gram, and the mixture was allowed to act at 45 ° C and pH 5.5 for 24 hours, followed by heat treatment at 100 ° C for 10 minutes to inactivate the enzyme.
  • Corn starch is made 2% by weight starch milk, calcium carbonate is added to 0.1% by weight to adjust the pH to 6.0, and ⁇ -amylase (manufactured by Novo, trade name “Termameal 60L”) is added to 0 grams of starch. . 2, 0.4, 0.6, 1.0, 1.5 or 2.0 mass 0/0 Karoe, respectively 95.
  • the mixture was reacted at C for 10 minutes, then autoclaved at 120 ° C., and rapidly cooled to about 40 ° C., to obtain 6 types of starch liquids shown in Table 10 of DE 3.1.
  • the purified isocyclomalto-oligosaccharide-producing enzyme preparation obtained by the method of Experiment 5 was added to these starch liquefaction liquids (final concentration 1% by mass). One unit per gram of solid was allowed to act at 45 ° C and pH 6.0 for 48 hours, and then the reaction was boiled for 10 minutes to stop the reaction.
  • isocyclomaltooligosaccharides were quantified by HPLC. The production rate of isocyclomaltooligosaccharide was determined. The results are shown in Table 12.
  • the production rate of isocyclomaltooligosaccharides by the isocyclomaltooligosaccharide-forming enzyme of the present invention is affected by DE of the liquefied starch, and the lower the DE, On the contrary, the production rate of isocyclomalto-oligosaccharide was high, and it was found that the higher the DE, the lower the production rate of isocyclomalto-oligosaccharide. Specifically, it was found that DE of liquid starch is about 20 or less, desirably DE is about 8 or less, more desirably DE is about 5 or less.
  • Soluble starch strength prepared by the method of Experiment 11 and purified to 100% purity by the method of Experiment 1 was dissolved in deionized water to prepare an isocyclomaltopentaose solution with a concentration of 5 wZv%. did. 8 ml of the solution was taken in a glass test tube, sealed, and heated at 120 ° C. for 30 to 90 minutes. After allowing to cool, the degree of coloration of these solutions and the purity of isocyclomaltopentaose by HPLC method were measured. The degree of coloring was the absorbance in an lcm cell at 480 ⁇ m. The results are shown in Table 13.
  • the isocyclomaltopentaose used in Experiment 15 was dissolved in various buffer solutions, and nine types of isocyclomaltopentaose solutions were prepared in which the concentration of isocyclomaltopentaose was 4 wZv% and the pH was adjusted to 2 to 10. 8 ml of each solution was placed in a glass test tube, sealed, and heated at 100 ° C. for 24 hours. After allowing to cool, the degree of coloration of these solutions was measured as in Experiment 15, and the purity of isocyclomaltopentaose was measured by the HPLC method. The results are shown in Table 14.
  • isocyclomaltopentaose is not substantially decomposed in the range of pH 5 to 10 when heated at 100 ° C for 24 hours, and its weak acidity is stable in a wide alkaline range. I understood. However, it is slightly at pH4 and half at pH3. The above was decomposed and completely decomposed and disappeared at pH2.
  • a cyclomaltopentaose solution was prepared.
  • a cyclodextrin-containing solution was prepared in the same manner as described above except that cyclodextrin was used instead of isocyclomaltopentaose. 4 ml of each solution was placed in a glass test tube, sealed, and heated at 120 ° C. for 30 to 90 minutes.
  • isocyclomaltopentaose does not show an increase in coloration, and like the control a cyclodextrin, even when heated in the presence of glycine, it does not easily color or brown. It has been found that it is a stable carbohydrate with low amino-carbohydrate reactivity.
  • Isocyclomaltopentaose used in Experiment 15 and commercially available polypeptone were dissolved in deionized water to prepare a 5w / v isocyclomaltopentaose solution containing 5w / v% polypeptone.
  • ⁇ - cyclodextrin ( ⁇ —) was used in the same manner as above except that a cyclodextrin was used instead of isocyclomaltopentaose.
  • aroma components per 20 ml of the aqueous solution include four short-chain alcohols of methanol, ethanol, propanol and butanol, acetic acid, propionic acid, n-butyric acid and n-valeric acid, four short-chain fatty acids, and benzyl alcohol. , Phenethyl alcohol, 4 phenol, 1 propanol, and o-taresol, each containing 4 kinds of aromatic compounds with respect to isocyclomaltopentaose in a molar amount, and stirred uniformly. I let you.
  • isocyclomaltopentaose has the ability to include various compounds such as short-chain alcohols, short-chain fatty acids and aromatic compounds! won.
  • isocyclomaltopentaose was higher than that of a-cyclodextrin.
  • Isocyclate maltopentaose also showed the inclusion ability of aromatic compounds, but the amount of inclusion varied greatly depending on the type of compound to be included.
  • salivary amylase in vitro was prepared according to the method of Okada et al. Described in Journal of Japanese Society of Nutrition and Food, Vol. 43, pages 23 to 29 (1990).
  • the digestibility by artificial gastric juice, splenic amylase, and small intestinal mucosal enzyme was examined.
  • ⁇ -, j8-, and ⁇ -cyclodextrin which are also cyclic carbohydrates, were similarly examined for digestibility.
  • the results are shown in Table 18.
  • isocyclomaltopentaose is substantially inhibited by salivary amylase, artificial gastric juice, splenic amylase, and small intestinal mucosal enzyme as well as a and j8-cyclodextrin. Turned out not to be digested. On the other hand, ⁇ -cyclodextrin was partially digested by splenic amylase and small intestinal mucosal enzyme. Isocyclomaltopentaose was an indigestible carbohydrate.
  • Isocyclomaltopentaose used in Experiment 15 was orally administered to mice and an acute toxicity test was conducted. As a result, isocyclomaltopentaose is a low-toxic substance, and no deaths were observed even at the maximum dose that could be administered, and its LD value was 5 gZkg-ma
  • the reaction solution was heated to 95 ° C and kept for 30 minutes, then cooled and filtered, and the filtrate obtained was decolorized with activated carbon and desalted with H-type and OH-type ion-exchange resins according to a conventional method. Purification and further concentration yielded an isocyclomaltooligosaccharide-containing syrup having a concentration of 65% by mass in a yield of about 90% per solid.
  • This product contains 27.5% by mass of isocyclomalto-oligosaccharide and 72.5% by mass of other carbohydrates per solid, has low reducing properties, has an appropriate viscosity, is a sweetener, As a taste improver, quality improver, water separation inhibitor, stabilizer, discoloration inhibitor, excipient, inclusion agent, powdered substrate, etc., it is advantageously used in various foods, cosmetics, pharmaceuticals and other various compositions. it can.
  • Tapio force starch is a starch milk with a concentration of about 1% by weight, and calcium carbonate is added to this so that the concentration becomes 0.1% by weight, adjusted to pH 6.0, and ⁇ -amylase (manufactured by Novo, The product name “Termameal 60L”) was added to 0.2% by mass per gram of starch solids, reacted at 95 ° C for 10 minutes, then autoclaved to 120 ° C for 20 minutes, and then about 40 ° Quenched into C to obtain a liquefied solution of DE of about 3, and the concentrated solution containing the isocyclomaltooligosaccharide-producing enzyme obtained by the method of Example 1 to 2.44 ml (about 1 unit) per gram of starch solid And isoamylase (produced by Hayashibara Biochemical Laboratories Co., Ltd.) were added at a rate of 1000 units per gram of starch solids, and reacted at pH 6.0 and temperature of 40 ° C for 48 hours.
  • the reaction solution is heated to 95 ° C and kept for 30 minutes, then cooled and filtered, and the filtrate obtained is decolorized with activated carbon and demineralized with H-type and OH-type ion-exchange resins according to a conventional method.
  • the syrup having a concentration of 60% by mass containing 31.5% of isocyclomalto-oligosaccharide per solid was obtained.
  • the resulting syrup was used as a sugar solution to produce a strongly acidic cation exchange resin (Amberlite CR-1310, Column fractionation using Na type, manufactured by Organo Corporation) was performed.
  • the resin was packed into four jacketed stainless steel columns with an inner diameter of 5.4 cm and connected in series to a total length of 20 m.
  • ⁇ -Darcosidase (trade name “Transdalcosidase L“ AMANO ””, manufactured by Amano Enzym Co., Ltd.) Add 1000 units per gram of starch and Dalcoamylase (trade name “Dalcoteam”, manufactured by Nagase Seikagaku Co., Ltd.) to a rate of 100 units per gram of starch, ⁇ 5.0, 16 at a temperature of 50 ° C. Reacted for hours. The reaction solution is heated to 95 ° C and kept for 30 minutes, then cooled and filtered, and the filtrate obtained is decolorized with activated carbon and desalted with H-type and OH-type ion-exchange resins according to conventional methods.
  • the syrup containing isocyclomalto-oligosaccharide having a concentration of 60% by mass was obtained at a yield of about 95% per solid.
  • the product a solid form product per ICM sugars 32.6 wt 0/0, glucose 63.0 mass 0/0, ⁇ And 4.4% by mass of other saccharides, low reducibility, moderate viscosity, sweetener, taste improver, quality improver, water separation inhibitor, stabilizer, discoloration inhibitor
  • a clathrate, a powdery base material, etc. it can be advantageously used in various compositions such as various foods, cosmetics, and pharmaceuticals.
  • the cyclohexane-oligosaccharide-containing syrup obtained by the method of Example 4 is put in an autoclave, Raney nickel is added as a catalyst at about 9% by mass with respect to the solid content, the temperature is raised to 130 ° C. with stirring, and the hydrogen pressure is increased. Was increased to 75 kgZcm 2 and hydrogenated to convert glucose and other reducing carbohydrates contained in the isocyclomalto-oligosaccharide-containing syrup to their sugar alcohols.
  • This reaction fluid was removed, Raney nickel was removed, decolorized, desalted and purified by conventional methods, concentrated, vacuum dried and ground to obtain isocyclomalto-oligosaccharide-containing powder with a yield of about 90% per solid. .
  • the product, solid per ICM 32.5 wt%, sorbitol 63.2 wt%, and other sugar alcohols are contained 4.3 mass 0/0, exhibit substantially reducing power
  • a sweetener taste improver, quality improver, water release inhibitor, stabilizer, discoloration inhibitor, excipient, clathrate, etc. that are difficult to cause an aminocarbonyl reaction, various foods, cosmetics, pharmaceuticals It can be advantageously used for various compositions.
  • Isocyclomalto-oligosaccharide-containing powder obtained by the method of Example 3 was added to 0.8 parts by mass of water containing trehalose (Hayashibara Shoji Co., Ltd., registered trademark “Treha”) 0.2 parts by mass, ⁇ -glycosyl stevioside (Toyo Seika Co., Ltd., trade name “Hi-G Sweet”) 0.01 parts by mass and L aspartyl L ferulanine methyl ester (trade name “Aspartame”)
  • a granular sweetener was obtained using a granulation machine. This product has excellent sweetness and has about twice the sweetness of sucrose. This product is suitable as a stable sweetener under storage at room temperature without fear of deterioration.
  • Example 4 50 parts by mass of isocyclomaltooligosaccharide-containing syrup obtained by the method of Example 4 was heated and mixed with 100 parts by mass of a 55% sucrose solution, and then heated and concentrated under reduced pressure until the water content was less than 2%. Mix 0.6 parts by weight of citrate and appropriate amount of lemon fragrance and colorant. Molded according to the law to obtain a product.
  • This product is a stable, high-quality hard candy that has good crispness, taste, and flavor, does not cause sucrose crystallization, and does not cause excessive sagging.
  • 3 parts by weight of gum base is heated and melted to a soft level, 2 parts by weight of anhydrous maltitol, 2 parts by weight of xylitol, 2 parts by weight of powder containing isocyclomaltooligosaccharide obtained by the method of Example 5, and trehalose 1 part by mass of water-containing crystals was added, and an appropriate amount of fragrance and colorant were mixed, followed by kneading with a roll, molding and packaging according to a conventional method to obtain a product.
  • This product is suitable as a chewing gum having a good texture, taste and good taste, low caries and low calories.
  • This product can be advantageously used for seasoning of sweets, coffee, cocoa, tea, etc. that have a mild sweet taste.
  • skim milk powder 175 parts by weight of skim milk powder, 100 parts by weight of the isocyclomalto-oligosaccharide-containing powder obtained by the method of Example 3 and powder containing a high amount of extra-sucrose sucrose (Hayashibara Shoji Co., Ltd., registered trademark “Fruit Oligo”) in water 1, Dissolve in 500 parts by mass, sterilize at 65 ° C for 30 minutes, cool to 40 ° C, inoculate 30 parts by mass of a starter of lactic acid bacteria, and incubate at 37 ° C for 8 hours. A lactic acid bacteria beverage was obtained.
  • This product has good flavor, contains oligosaccharides and isocyclomalto-oligosaccharides, and is suitable as a lactic acid bacteria beverage that has a bifidobacteria growth-promoting action and an intestinal regulating action that can be achieved simply by keeping lactic acid bacteria stable.
  • This product is a powdered juice with a fruit juice content of about 30%.
  • this product is a high-quality, low-calorie juice with a different taste and odor, and has a high commercial value.
  • Example 15 Cosmetic cream> 2 parts by weight of polyoxyethylene glycol monostearate, 5 parts by weight of self-emulsifying glyceryl monostearate, 2 parts by weight of isocyclomaltooligosaccharide-containing powder obtained by the method of Example 5, oc darcosyl rutin (Hayashibara Sales, Inc.
  • G rutin 1 part by weight, liquid paraffin 1 part by weight, trioctanoic acid glycerin 10 parts by weight and an appropriate amount of preservatives are dissolved by heating in accordance with a conventional method, and L-lactic acid 2 parts by weight 1, 3, butylene glycol 5 parts by weight And 66 parts by mass of purified water were added, emulsified with a homogenizer, and an appropriate amount of a fragrance was added and stirred and mixed to produce a cosmetic cream.
  • This product has anti-acid properties and high stability, and can be advantageously used as a high-quality sunscreen, skin cleansing agent, fair skin agent and the like.
  • a novel isocyclomaltooligosaccharide having a structure represented by the following general formula 1 that has been conventionally unknown is produced and provided in large quantities using an isocyclomaltooligosaccharide-forming enzyme. It becomes possible.
  • the present invention capable of providing a completely new isocyclomalto-oligosaccharide contributes to various fields of use such as foods and drinks, cosmetics, and pharmaceuticals, and its industrial significance is extremely great.

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Description

明 細 書
イソサイクロマルトオリゴ糖及びイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素とそれ らの製造方法並びに用途
技術分野
[0001] 本発明は、一般式 1で表される構造を有するイソサイクロマルトオリゴ糖及びイソサ イク口マルトオリゴ糖生成酵素とそれらの製造方法並びに用途に関し、詳細には、一 般式 1で表される構造を有するイソサイクロマルトオリゴ糖及びイソサイクロマルトオリ ゴ糖生成酵素とその製造方法、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を産生する微生 物、当該酵素をコードする DNAとこれを含んでなる組換え DNAと形質転換体、当該 酵素を用いたイソサイクロマルトオリゴ糖の生成方法及び製造方法、並びにイソサイ クロマルトオリゴ糖を含んでなる組成物に関する。
[0002] 一般式 1 :
[化 1] yc/ {→6)-[a-D-Glc/7-(l→4)]n-a-D-Glc/?-(l→}
(nは 4又は 5を意味する） 背景技術
[0003] グルコースを構成糖とする糖質としては、例えば、澱粉を原料として製造される澱粉 部分分解物であるアミロース、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖、 イソマルトオリゴ糖などが知られている。これらの糖質は、通常、分子の一端に非還元 性末端を、他端に還元性末端を有し、還元性を示すことが知られている。一般に、澱 粉部分分解物は、その固形物当りの還元力の大きさをデキストロース'ェクィバレント (Dextrose Equivalent, DE)として表される。この値の大きいものは、通常、分子 が小さく低粘度で、甘味が強いものの、反応性が強ぐアミノ酸や蛋白質などのアミノ 基を持つ物質とァミノカルボ-ル反応を起こし易ぐ褐変し、悪臭を発生して、品質を 劣化し易 、性質のあることが知られて 、る。 斯カる欠点を改善するために、その還元力を低減、若しくは消滅させる簡便な方法 が古くから望まれていた。例えば、「ジャーナル ·ォブ ·アメリカン'ケミカル'ソサイエテ ィー（Journal of American Chemical Society；)」、米国、 1949年、第 71卷、 3 53乃至 358頁で開示されているように、澱粉にマセランス アミラーゼ（macerans a mylase)を作用させることにより、 6乃至 8分子のグルコースが α—1, 4ダルコシド結 合で環状構造を形成した α—、 β一又は γ サイクロデキストリンを生成させる方法 が知られている。現在では、澱粉力もこれらサイクロデキストリンが工業的規模で生産 され、これらサイクロデキストリンは、それらが有する、非還元性で、無味であり、包接 能を有するなどの特性を生力した用途に利用されている。また、先に、本出願人が、 特開平 7— 143876号公報、特開平 7— 213283号公報などで開示したように、マル トオリゴ糖など澱粉部分分解物に非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素 を作用させることにより、 2分子のグルコースが α , α - 1, 1結合したトレハロースを 生成させる方法も知られている。現在では、澱粉からトレハロースが工業的規模で生 産され、その非還元性や温和で高品質な甘味特性などを生力 た用途に利用されて いる。さらに、先に、本出願人力 国際公開 WO 01/90338 A1号明細書、国 際公開 WO 02/055708 A1号明細書、国際公開 WO 02/40659 A1号 明細書などで開示したように、澱粉又はその部分分解物に α イソマルトシルダルコ 糖質生成酵素と ex イソマルトシル転移酵素を作用させることにより、 4分子のダルコ ースが α—1, 3ダルコシド結合及び a—1, 6ダルコシド結合で交互に結合した構造 、すなわち、サイクロ {→6) - a—D—ダルコピラノシル一 (1→3) - a— D グノレコ ピラノシル一 (1→6) - a—D ダルコピラノシル一 (1→3) - a—D グノレコピラノ シルー（1→}の構造を有する環状四糖を生成させる方法も知られている。また、さら に、先に、本出願人が、特開 2005— 95148号公報で開示したように、澱粉又はその 部分分解物に環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させることにより、 4分子の グルコースが a 1, 4ダルコシド結合及び α— 1, 6ダルコシド結合で交互に結合し た構造、すなわち、サイクロ {→6) - a—D—ダルコピラノシル一 (1→4) - a— D— ダルコピラノシル一 (1→6) - a—D—ダルコピラノシル一 (1→4) - a— D—ダルコ ビラノシルー（1→}の構造を有する環状四糖 (別名、環状マルトシルマルトース）を生 成させる方法も知られている。これら環状四糖は、環状構造を有することから包接能 を有し、揮発性有機物を安定化する作用を示すとともに、非還元性の糖質であるた め、ァミノカルボニル反応を起こさず、褐変、劣化を懸念することなく利用、加工でき ることが期待される。
[0005] このように、グルコースを構成糖とする非還元性糖質として、グルコース重合度が 6 乃至 8の α—、 β―、 γ—サイクロデキストリン、グルコース重合度が 2の α , α トレ ハロース、グルコース重合度力 S4のサイクロ {→6) - a—D—ダルコピラノシル一 (1→ 3) - a—D—ダルコピラノシル一 (1→6) - a—D—ダルコピラノシル一（1→3) - a D ダルコビラノシルー（1→}の構造を有する環状四糖及びサイクロ {→6) - a ~ D—ダルコピラノシル一 (1→4) - a—D—ダルコピラノシル一（1→6) - a— D グ ルコピラノシルー (1→4) a D ダルコビラノシルー（1→}の構造を有する環状 四糖 (別名、環状マルトシルマルトース）は、それぞれの特性を生かして種々の分野 に利用され又は利用が期待されているものの、これら糖質以外にもグルコースを構成 糖とする非還元性糖質が提供されれば非還元性糖質の選択の幅が広がり、更に多 様な用途への利用が期待される。
発明の開示
[0006] 本発明の課題は、グルコースを構成糖とする新規な非還元性糖質を提供し、非還 元性糖質の選択の幅を広げるとともに当該非還元性糖質を生成する新規酵素と、そ れらの生成方法及び製造方法、当該酵素をコードする DNA、これを含んでなる組換 え DNA及び形質転換体、並びに当該非還元性糖質を含んでなる組成物を提供す ることにめる。
[0007] 本発明者等は、上記課題を解決するために、澱粉部分分解物から新規な非還元 性糖質を生成する全く新しい酵素に期待を込めて、このような酵素を産生する微生 物を広く検索してきた。その結果、岡山県岡山巿の土壌から、新たに分離したバチル ス (Bacillus)属に属する新規微生物 AM7株が新規な酵素を産生し、この新規酵素 の作用により、澱粉又はその部分分解物などの α— 1, 4グルカンから一般式 1で表 される構造を有する新規なイソサイクロマルトオリゴ糖が著量生成することを見出した 。また、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の諸性質を明らかにするとともに、その製 造方法を確立し、また、当該酵素をコードする DNAとこれを含んでなる組換え DNA 及び形質転換体を確立し、さらに、本酵素によるイソサイクロマルトオリゴ糖の生成方 法、及び本酵素を用いたイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれらを含む糖組成物の製 造方法並びに用途を確立して、本発明を完成した。
[0008] 一般式 1 :
[化 2]
Cyc/o {→6)-[a-D-Glc/7-(l→4)]n-a-D-Glc/?-(l→}
(nは 4又は 5を意味する）
[0009] すなわち、本発明は、一般式 1で表される構造を有する新規なイソサイクロマルトォ リゴ糖とそれらを生成する新規なイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素と、それらの生 成方法及び製造方法、当該酵素をコードする DNAとこれを含んでなる組換え DNA 及び形質転換体、さら〖こは、イソサイクロマルトオリゴ糖又はこれを含む糖組成物を含 んでなる飲食物、化粧品及び医薬品組成物を提供することによって上記課題を解決 するものである。
[0010] 本発明によれば、グルコースを構成糖とする非還元性糖質の選択の幅が広がる上 に、従来未知であった新規環状糖質、イソサイクロマルトオリゴ糖が大量に供給でき ることとなり、飲食物、化粧品、医薬品をはじめとする様々な分野における利用が可 能となる。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]図 1は、糖質 I標品の HPLC溶出パターンを示す図である。
[図 2]図 2は、糖質 II標品の HPLC溶出パターンを示す図である。
[図 3]図 3は、糖質 I標品の1 H— NMR ^ベクトルを示す図である。
[図 4]図 4は、糖質 I標品の13 C— NMRスペクトルを示す図である。
[図 5]図 5は、本発明のイソサイクロマルトペンタオースの構造を示す図である。
[図 6]図 6は、糖質 II標品の1 H— NMR ^ベクトルを示す図である。
[図 7]図 7は、糖質 II標品の13 C— NMR ^ベクトルを示す図である。 [図 8]図 8は、本発明のイソサイクロマルトへキサオースの構造を示す図である。
[図 9]図 9は、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の至適温度を示す図である。
[図 10]図 10は、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の至適 pHを示す図である。
[図 11]図 11は、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の温度安定性を示す図である。
[図 12]図 12は、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の pH安定性を示す図である。
[図 13]図 13は、組換え DNA、 pBAMHlを示す図である。図中、黒い太線で示した 部分は、バチルス'サーキュランス AM7 (FERM BP— 10111)由来の本発明の イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素をコードする DNAである。
[図 14]図 14は、組換えイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素発現用の組換え DNA、 p ETAM1を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、バチルス'サーキュラン ス AM7 (FERM BP— 10111)由来の本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵 素をコードする DNAである。
符号の説明
[0012] a： 1位が α— 1, 4ダルコシド結合して!/、るグルコース残基
b： 1位が α— 1, 6ダルコシド結合して!/ヽるグルコース残基
発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明でいうイソサイクロマルトオリゴ糖とは、下記の一般式 1で表される構造を有 する環状糖質を意味する。
[0014] 一般式 1 :
[化 3]
Cjc/o {→6)-[a-D-Glc/?-(l→4)]n-a-D-Glcp-(l→} (nは 4又は 5を意味する）
[0015] イソサイクロマルトオリゴ糖としては、上記一般式 1にお 、て、 n力 のイソサイクロマ ルトオリゴ糖、すなわち、マルトペンタオース分子の還元末端グルコースの 1位と非還 元末端グルコースの 6位水酸基が a— 1, 6ダルコシド結合して環状構造を形成した 五糖 (本明細書では、イソサイクロマルトペンタオースと呼称する）、及び、上記一般 式 1において、 nが 5のイソサイクロマルトオリゴ糖、すなわち、マルトへキサオース分 子の還元末端グルコースの 1位と非還元末端グルコースの 6位水酸基が α— 1, 6グ ルコシド結合し環状構造を形成した六糖 (本明細書では、イソサイクロマルトへキサォ ースと呼称する）が存在する。これらの糖質は、土壌より得た微生物の培養液中に本 発明者らが初めて見出した従来未知の新規糖質であり、グルコースを構成糖とする 環状の五糖又は六糖は上記構造を有している力ぎり、その給源、形態、純度、製造 方法を問わず本発明に包含される。
[0016] 本発明でいうイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素とは、グルコース重合度 3以上の α - 1, 4グルカンに作用し、分子間転移反応で α—1, 4グルカンの非還元末端グ ルコースの 4位に α 1, 4転移することにより種々のグルコース重合度の α 1, 4グ ルカンを生成する不均化反応を触媒する一方、グルコース重合度 7の α 1, 4ダル カン (マルトへプタオース）に作用した場合には、マルトペンタオース単位で切断し、 このマルトペンタオースの還元末端グルコースの 1位を同一分子の非還元末端ダル コースの 6位水酸基に α 1, 6転移する分子内転移反応で環化することによりイソサ イク口マルトペンタオースを生成する反応を触媒し、グルコース重合度 8以上の α— 1 , 4グルカンに作用した場合には、マルトペンタオース又はマルトへキサオース単位 で切断し、このマルトペンタオース又はマルトへキサオースの還元末端グルコースの 1位を同一分子の非還元末端グルコースの 6位水酸基に α— 1, 6転移する分子内 転移反応で環化することによりイソサイクロマルトペンタオース及びイソサイクロマルト へキサオースを生成する反応を触媒する酵素全般を意味する。上記の反応を触媒 する酵素はその給源、形態、粗酵素又は精製酵素の区別なく本発明のイソサイクロ マルトオリゴ糖生成酵素に包含される。
[0017] 本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の酵素活性は、次のようにして測定す ることができる。アミロースを濃度 1. 25wZv%となるよう ImM塩化カルシウムを含む 50mM酢酸緩衝液 (pH6. 0)に溶解させ基質液とし、その基質液 0. 8mlに酵素液 0 . 2ml加えて、 30°Cで 30分間酵素反応し、その反応液を 10分間、約 100°Cで加熱 して反応を停止させた後、 a ダルコシダーゼを固形物 1グラム当り 4000単位及び ダルコアミラーゼを固形物 1グラム当り 250単位添カ卩して 50°C、 1時間処理することに より残存可溶性澱粉ゃ夾雑オリゴ糖を分解し、その処理液中のイソサイクロマルトべ ンタオース量を、後述する実験 1に記載の HPLCで定量する。イソサイクロマルトオリ ゴ糖生成酵素の活性 1単位は、上記の条件下で 1分間に 1 μモルのイソサイクロマル トペンタオースを生成する酵素量と定義する。
[0018] 本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の具体例としては、例えば、下記の理 化学的性質を有するイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素が挙げられる。
(1)分子量
SDS—ゲノレ電気泳動法【こお!ヽて、 106, 000 ± 20, 000ダノレトン。
(2)等電点
アンフォライン含有等電点電気泳動法において、 ρΙ7. 5±0. 5。
(3)至適温度
ρΗ6. 0、 30分間反応の条件下で、 50°C乃至 55°C。
(4)至適 pH
30°C、 30分間反応の条件下で、 pH4. 5乃至 8. 0。
(5)温度安定性
pH6. 0、 60分間保持の条件下で、 35°Cまで安定。
ImMカルシウムイオン存在下では、 40°Cまで安定。
(6) pH安定性
4°C、 24時間保持の条件下で、 pH4. 5乃至 9. 0で安定。
[0019] また、上記理ィ匕学的性質を有する本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の 一つは、上記理ィ匕学的性質のみならず、その N末端配列として、配列表における配 列番号 1で表されるアミノ酸配列を有している場合がある。
[0020] 本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素は、通常、所定のアミノ酸配列を有し ており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号 2で示されるアミノ酸配 列又はそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列番号 2で示 されるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体酵素としては、グルコース 重合度 3以上の α—1, 4グルカンに作用し、一般式 1で表されるイソサイクロマルトォ リゴ糖を生成すると ヽぅ酵素活性を保持する範囲で、配列番号 2で示されるアミノ酸配 列において 1個又は 2個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を 有するものが挙げられ、配列番号 2で示されるアミノ酸配列に対し、通常、 60%以上 、望ましくは、 70%以上、さらに望ましくは、 80%以上、よりさらに望ましくは、 90%以 上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものが好適である。
[0021] し力しながら、上記理ィ匕学的性質又はアミノ酸配列を有するイソサイクロマルトオリゴ 糖生成酵素はあくまで一例であって、上記と異なる理化学的性質又は N末端アミノ酸 配列を有する酵素も、イソサイクロマルトオリゴ糖を生成する力ぎり本発明に包含され ることはいうまでもない。
[0022] 本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素はその給源によって制限されないもの の、好ましい給源として、微生物が挙げられ、とりわけ本発明者らが土壌より単離した 微生物 AM7株又はその変異株が好適に用いられる。以下、イソサイクロマルトオリゴ 糖生成酵素産生能を有する微生物 AM7株の同定試験結果を示す。なお、同定試 験は、『微生物の分類と同定』 (長谷川武治編、学会出版センター、 1985年)に準じ て行った。
[0023] <A:細胞形態 >
(1)肉汁寒天培養、 27°C
通常 0. 5 X 2乃至 0.7 X 5 mの桿菌。グラム陽性。運動性あり。楕円形の胞子あり 。菌体の端に膨れた胞子嚢を形成する。
[0024] < 8 :培養性質>
(1)肉汁寒天平板培養、 27°C
形状: 円形 大きさは 3日間で 1乃至 2mm。
周縁: 全縁
隆起: 扁平状
光沢: 鈍光
表面: ラフ
色調: 不透明、白色
(2)肉汁寒天斜面培養、 27°C
生育： 中程度 形状： 糸状
[0025] < C :生理学的性質 >
(1) VP試験： 陰性
(2) カタラーゼ： 陽性
(3) 澱粉の加水分解： 陽性
(4) チロシンの分解： 陰性
(5) フエ-ルァラニン脱ァミノ化： 陰性
(6) 硝酸の還元： 陽性
(7) D—グルコース、 L—ァラビノース、 D—キシロース、 D—マン-トールから酸を 生成する
(8) 生育の範囲： pH5.7乃至 9.8、温度 10乃至 37°C、 NaCl濃度
0乃至 2。/0
(9) 酸素に対する態度： 通性嫌気性
(10) DNAの GC含量： 50.7%
[0026] 以上の菌学的性質に基づいて、『バージーズ 'マニュアル'ォブ 'システマティック' ノクテリオロジー (Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology)、第 2卷 ( 1986年)を参考にして、公知菌との異同を検討した。その結果、本菌は、バチルス' サーキュランス（Bacillus circulans)に属する微生物であることが判明した。これら の結果より本発明者等は、本菌を新規微生物バチルス'サーキュランス AM7と命 名し、平成 16年 8月 25日付で日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6所 在の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し、受託番 号 FERM BP— 10111として受託された。
[0027] 本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素産生能を有する微生物には、上記菌 はもとより、その変異株、更には、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素産生能を有す る他の微生物、及び、それらの変異株なども包含される。
[0028] 本発明の DNAとは、上記イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素をコードするもの全般 を意味する。本発明の DNAは、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素をコードするもの である限り、それが天然由来のものであっても、人為的に合成されたものであってもよ い。天然の給源としては、例えば、バチルス'サーキュランス AM7 (FERM BP— 1 0111)を含むバチルス属の微生物が挙げられ、これらの菌体力 本発明の DNAを 含む遺伝子 DNAを得ることができる。すなわち、斯カゝる微生物を栄養培地に接種し 、好気的条件下で約 1乃至 3日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームや β ダルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該 DNAを 含む遺伝子 DNAを菌体外に溶出させる。このとき、プロテアーゼなどの蛋白質分解 酵素を併用したり、 SDSなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯く して得られる処理物に、例えば、フエノール抽出、アルコール沈殿、遠心分離、リボヌ クレアーゼ処理などの常法を適用すれば目的の遺伝子 DNAが得られる。本発明の DNAを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号 2で示されるアミ ノ酸配列に基づいて化学合成すればよい。また、当該 DNAを含む遺伝子 DNAを铸 型として、適当なプライマーとなる化学合成 DNAを用いて PCR合成することも有利 に実施できる。
[0029] 本発明の DNAは、通常、所定の塩基配列を有しており、その一例としては、例えば 、配列表における配列番号 3で示される塩基配列又はそれに相同的な塩基配列が 挙げられる。配列表における配列番号 3で示される塩基配列に相同的な塩基配列を 有する変異体 DNAとしては、コードする酵素の活性を保持する範囲で、配列番号 3 で示される塩基配列において 1個又は 2個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加し た塩基配列を有するものが挙げられ、配列番号 3で示される塩基配列に対し、通常、 60%以上、望ましくは、 70%以上、さらに望ましくは、 80%以上、よりさらに望ましく は、 90%以上の相同性を有する塩基配列を有するものが好適である。また、遺伝子 コードの縮重に基づき、そのコードする酵素のアミノ酸配列を変えることなく塩基の 1 個又は 2個以上を他の塩基に置換したものも当然、本発明の DNAに包含される。
[0030] 本発明の DNAを、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換え DNAとすること も有利に実施できる。組換え DNAは、通常、 DNAと自律複製可能なベクターとから なり、 DNAが入手できれば、常法の組換え DNA技術により比較的容易に調製する ことができる。斯かるべクタ一の例としては、 pBR322、 pUC18、 pBluescript II S K ( + ) , pUBHO, pTZ4、 pC194、 pHV14、 TRp7、 YEp7、 pBS7などのプラスミ ドベクターやえ gt' C、 X gt- λ Β, p 11, φ 1、 φ 105などのファージベクターが挙 げられる。この内、本発明の DNAを大腸菌で発現させるには、 pBR322、 pUC18、 Bluescript II SK ( + )、え gt · λ C及び λ gt · λ Βが好適であり、一方、枯草菌で 発現させるには、 pUB110、 pTZ4、 pC194、 11, φ 1及び φ 105力 子適である。 pHV14、 TRp7、 YEp7及び pBS7は、組換え DNAを二種以上の宿主内で複製さ せる場合に有用である。 DNAを斯力るベクターに挿入するには、斯界において通常 一般の方法が採用される。具体的には、まず、 DNAを含む遺伝子 DNAと自律複製 可能なベクターとを制限酵素及び Z又は超音波により切断し、次に、生成した DNA 断片とベクター断片とを連結する。遺伝子 DNA及びベクターの切断にヌクレオチド に特異的に作用する制限酵素、とりわけ Π型の制限酵素、詳細には、 Sau 3AI、 Ec o RI、 Hind III、 Bam HI、 Sal I、 Xba I、 Sac I、 Pst Iなどを使用すれば、 D NA断片とベクター断片とを連結するのが容易である。必要に応じて、両者をァニーリ ングした後、生体内又は生体外で DNAリガーゼを作用させればよい。斯くして得ら れる組換え DNAは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養すること〖こより 無限に複製可能である。
[0031] このようにして得られる組換え DNAは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母をはじめと する適宜の宿主微生物に導入することができる。形質転換体を取得するには、コ口- 一ハイブリダィゼーシヨン法を適用する力 グルコース重合度が 3以上の α— 1, 4グ ルカンを含む栄養培地で培養し、該糖質よりイソサイクロマルトオリゴ糖を生成するも のを選択すればよい。
[0032] 本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素産生能を有する形質転換体も含めた 微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、イソサイクロマルトオリゴ糖生成 酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地の ヽずれでもよ い。炭素源としては、微生物が生育に利用できる物であればよぐ例えば、植物由来 の澱粉ゃフイトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、こ れらの部分分解物やグルコース、フラクトース、ラタトース、スクロース、マン-トール、 ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クェン酸、コハク酸などの有機酸も使用するこ とができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択でき る。窒素源としては、例えば、アンモニゥム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および 、例えば、尿素、コーン'スティープ 'リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉ェキ スなどの有機窒素含有物を適宜用いることができる。また、無機成分としては、例え ば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、 亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などの塩類を適宜用いることができる 。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いることができる。
[0033] 培養は、通常、温度 15乃至 37°Cで pH5. 5乃至 10の範囲、好ましくは温度 20乃 至 34°Cで pH5. 5乃至 8. 5の範囲から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時 間は当該微生物が増殖し得る時間であればよぐ好ましくは 10時間乃至 150時間で ある。また、培養条件における培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常 は、 0. 5乃至 20ppmが好ましい。そのために、通気量を調節したり、攪拌したりする などの手段を適宜採用する。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれ でもよい。
[0034] このようにして微生物を培養した後、本発明の酵素を含む培養物を回収する。イソ サイクロマルトオリゴ糖生成酵素活性は、主に培養物の除菌液に認められ、除菌液を 粗酵素液として採取することも、培養物全体を粗酵素液として用いることもできる。培 養物から菌体を除去するには公知の固液分離法が採用される。例えば、培養物その ものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する 方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。除 菌液をそのまま粗酵素液として用いることができるものの、一般的には、濃縮して用 いられる。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中 空膜などを用いた膜濃縮法などを採用することができる。
[0035] 更に、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素活性を有する除菌液及びその濃縮液を 用いて、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を公知の方法により固定ィ匕することもで きる。例えば、イオン交換体への結合法、榭脂及び膜などとの共有結合法'吸着法、 高分子物質を用いた包括法などを適宜採用できる。
[0036] 上記のように本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素は、粗酵素液をそのまま 又は濃縮して用いることができるものの、必要に応じて、公知の方法によって、さらに 分離 '精製して利用することもできる。例えば、培養液の処理物を硫安塩祈して濃縮 した粗酵素標品を透析後、『DEAE—トヨパール (Toyopearl) 650S』 脂を用いた 陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、『ブチルートヨパール（Phenyl— Toy opearl) 650Μ』 脂を用いた疎水クロマトグラフィーを用いて精製することにより、本 発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を電気泳動的に単一な酵素として得るこ とがでさる。
[0037] イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素が組換え型酵素である場合には、宿主の種類 によっては菌体内に酵素が蓄積することがある。このような場合には、菌体又は培養 物をそのまま使用することも可能であるものの、通常は使用に先立ち、必要に応じて 、浸透圧ショックや界面活性剤により菌体力も抽出した後、又は、超音波や細胞壁溶 解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより組換え型酵素を菌体又 は菌体破砕物カゝら分離して用いることも有利に実施できる。
[0038] このようにして得られる本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素は、具体的に は、下記の理ィ匕学的性質を有する場合がある。
(1)分子量
SDS—ゲノレ電気泳動法【こお!ヽて、 106, 000 ± 20, 000ダノレトン。
(2)等電点
アンフォライン含有等電点電気泳動法において、 ρΙ7. 5±0. 5。
(3)至適温度
ρΗ6. 0、 30分間反応の条件下で、 50°C乃至 55°C。
(4)至適 pH
30°C、 30分間反応の条件下で、 pH4. 5乃至 8. 0。
(5)温度安定性
pH6. 0、 60分間保持の条件下で、 35°Cまで安定。
ImMカルシウムイオン存在下では、 40°Cまで安定。
(6) pH安定性
4°C、 24時間保持の条件下で、 pH4. 5乃至 9. 0で安定。
(7) N末端アミノ酸配列 配列表における配列番号 1で示されるアミノ酸配列、すなわち、ァラニンーセリン イソロイシン グリシンースレオニン バリンースレオニン グルタミン酸ーァスパラ ギン ァスパラギン酸ースレオニン イソロイシンーチロシン グルタミン イソ口イシ ンーメチォニン一パリンーァスパラギン酸一アルギ-ン フエ-ルァラニンのアミノ酸 配列を有する。
[0039] 本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の基質となるグルコース重合度 3以上 の α— 1, 4グルカンとしては、澱粉、アミロース、アミロぺクチン、グリコーゲンなどや、 それらをアミラーゼまたは酸などによって部分的に加水分解して得られるアミロデキス トリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖などの部分分解物が挙げられる。アミラーゼ で分解した部分分解物としては、例えば、『ハンドブック'ォブ 'アミレーシズ'アンド'リ レイテッド ·ェンザィム (Handbook of Amylases and Related Enzymes) (19 88年)パーガモン'プレス社 (東京）に記載されている、 α—アミラーゼ (EC 3. 2. 1 . 1)、マルトテトラオース生成アミラーゼ（EC 3. 2. 1. 60)、マルトペンタオース生 成アミラーゼ、マルトへキサオース生成アミラーゼ (EC 3. 2. 1. 98)などのアミラー ゼを用いて澱粉、アミロース、アミロぺクチン、グリコーゲンなどを分解して得られる部 分分解物を用いることができる。更には、部分分解物を調製する際、プルラナーゼ (E C 3. 2. 1. 41)、イソアミラーゼ (EC 3. 2. 1. 68)などの澱粉枝切酵素を作用さ せることも随意である。
[0040] 基質としての澱粉は、例えば、とうもろこし、小麦、米など由来の地上澱粉であって も、また、馬鈴薯、さつまいも、タピオ力など由来の地下澱粉であってもよぐ好ましく は、澱粉を糊化及び Z又は液ィ匕した溶液として用いられる。その澱粉の部分分解の 程度は低い程、イソサイクロマルトオリゴ糖生成率が高くなることから、 DE約 20以下、 望ましくは約 12以下、更に望ましくは約 5以下の部分分解物が好適である。なお、本 明細書でいうイソサイクロマルトオリゴ糖生成率とは、式、イソサイクロマルトオリゴ糖生 成率 (％) = { (生成したイソサイクロマルトオリゴ糖類の質量) / (反応液中の全糖質 の質量） } X 100で算出される値を意味する。
[0041] 本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を基質に作用させるに際し、その基質 濃度は特に限定されず、例えば、基質濃度 0. 1% (WZV)の比較的低濃度の溶液を 用いた場合でも、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の反応は進行してィ ソサイクロマルトオリゴ糖を生成する。工業的には、基質濃度 1% (WZV)以上が好適 であり、この条件下で、イソサイクロマルトオリゴ糖を有利に生成できる。反応温度は 反応が進行する温度、即ち 55°C付近までで行えばよい。好ましくは 30乃至 45°C付 近の温度を用いる。反応 pHは、通常、 4. 5乃至 8. 0の範囲、好ましくは pH5. 0乃至 7. 5の範囲に調整するのがよい。酵素の使用量と反応時間とは密接に関係しており 、 目的とする酵素反応の進行により適宜選択すればよい。
例えば、基質濃度 1% (w/v)の澱粉又はその部分分解物やアミロースの水溶液に 本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を作用させることにより、澱粉又はその 部分分解物からは約 20%以上、アミロースからは約 30%の高いイソサイクロマルトォ リゴ糖生成率で本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖を得ることができる。このイソサイ クロマルトオリゴ糖生成酵素によるイソサイクロマルトオリゴ糖類の生成メカニズムは、 以下のように推察される。
(1)本酵素は、基質としてグルコース重合度が 3以上の α— 1, 4グルカンに作用し、 分子間転移反応で α— 1, 4グルカンの非還元末端グルコースの 4位水酸基に α— 1, 4転移することによる不均化反応により種々のグルコース重合度の α— 1, 4ダル カンを生成する。
(2)本酵素は、グルコース重合度 7の α— 1 , 4グルカン（マルトへプタオース）に作用 した場合には、マルトペンタオース単位で切断し、このマルトペンタオースの還元末 端グルコースの 1位を同一分子の非還元末端グルコースの 6位水酸基に α— 1, 6転 移する分子内転移反応により環化し、イソサイクロマルトペンタオースとマルトースとを 生成する。
(3)本酵素は、グルコース重合度 8以上の α—1 , 4グルカンに作用した場合には、マ ルトペンタオース又はマルトへキサオース単位で切断し、このマルトペンタオース又 はマルトへキサオースの還元末端グルコースの 1位を同一分子の非還元末端ダルコ ースの 6位水酸基に α— 1, 6転移する分子内転移反応により環化し、イソサイクロマ ルトペンタオース及びイソサイクロマルトへキサオースとグルコース重合度が 5又は 6 減じた α— 1, 4グルカンとを生成する。 (4) (2)及び（3)で新たに生じたマルトース及び a— 1, 4グルカンは、再度、（1)乃 至（3)の反応を受けることによって、イソサイクロマルトオリゴ糖を生成する。
[0043] また、このイソサイクロマルトオリゴ糖生成反応の際、他の酵素を併用して、イソサイ クロマルトオリゴ糖生成率を向上させることも有利に実施できる。例えば、澱粉に、イソ サイクロマルトオリゴ糖生成酵素とイソアミラーゼやプルラナーゼなどの澱粉枝切酵素 を併用して作用させることにより、イソサイクロマルトオリゴ糖の生成率をさらに向上さ せることち有禾 IJ〖こ実施できる。
[0044] 上記の反応によって得られた反応液は、そのままイソサイクロマルトオリゴ糖含有糖 液として用いることもできる。また、必要に応じて、イソサイクロマルトオリゴ糖含有糖液 に、 α—アミラーゼ、 j8—アミラーゼ、ダルコアミラーゼ及び α—ダルコシダーゼから 選ばれる 1種又は 2種以上を作用させて、夾雑するオリゴ糖を加水分解したイソサイク 口マルトオリゴ糖含有糖液として用いることもできる。また、水素添加して反応液中に 残存する還元性糖質を糖アルコールに変換して還元力を消滅せしめるなどの更なる 加工処理を施すことも随意である。一般的には、イソサイクロマルトオリゴ糖含有糖液 はさらに精製して用いられる。精製方法としては、糖の精製に用いられる通常の方法 を適宜採用すればよぐ例えば、活性炭による脱色、 H型、 OH型イオン交換榭脂〖こ よる脱塩、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリ 力ゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコール およびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離、更 には、イソサイクロマルトオリゴ糖を利用せず夾雑糖質を資化、分解する微生物、例 えば酵母などによる発酵処理や、アルカリ処理などにより残存している還元性糖質を 分解除去するなどの 1種または 2種以上の精製方法が適宜採用できる。
[0045] とりわけ、工業的大量生産方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーの採用 が好適であり、例えば、特開昭 58— 23799号公報、特開昭 58— 72598号公報など に開示されている強酸性カチオン交換榭脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより夾 雑糖類を除去し、 目的物の含量を向上させたイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれを 含む糖質を有利に製造することができる。この際、固定床方式、移動床方式、疑似移 動床方式の 、ずれの方式を採用することも随意である。 [0046] このようにして得られたイソサイクロマルトオリゴ糖を含む水溶液、又はその含量を 向上させた糖質水溶液は、通常、イソサイクロマルトオリゴ糖を、固形物当たり、 10質 量％以上、望ましくは 40質量％以上含有する糖質水溶液で、通常、これを濃縮し、 シラップ状製品とする。このシラップ状製品は、更に、乾燥して非晶質固状物製品又 は非晶質粉末製品にすることも随意である。
[0047] また、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖は包接能を有しており、包接した香気成 分、有効成分などの揮散、品質劣化を防止することから、香気成分、有効成分の安 定化 '保持に極めて優れている。この際、必要に応じて、サイクロデキストリン類、分岐 サイクロデキストリン類、グルコース 4分子が α—1, 3及び α—1, 6結合で交互に結 合した環状四糖、分岐環状四糖類、グルコース 4分子が α 1, 4及び α 1, 6結合 で交互に結合した環状マルトシルマルトース、サイクロデキストラン類、サイクロフラタ タン類など他の環状糖質を併用することで、包接による安定化を強化することも有利 に実施できる。サイクロデキストリン類など環状糖質としては、高純度のものに限る必 要はなぐ低純度の環状糖質、例えば、多量のマルトデキストリンとともに各種の環状 糖質を含有した澱粉部分分解物なども有利に利用できる。
[0048] さらに、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖は (X アミラーゼや a—ダルコシダー ゼによって実質的に分解されないことから、経口摂取しても消化吸収されない、難消 ィ匕性の糖質であって、無毒、無害の新規な糖質である。
[0049] 従って、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれを含む糖質は、甘味料、呈味 改良剤、品質改良剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤などとして、飲食物、嗜好物、飼 料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
[0050] 本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれを含む糖質は、そのまま甘味付のため の調味料として使用できる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、異性ィ匕糖、砂糖、 麦芽糖、トレハロース、蜂蜜、メープルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロ カルコン、ステビオシド、 α—グリコシルステビオシド、ラカン力甘味物、グリチルリチン 、ソーマチン、スクラロース、 Lーァスパラチルフエ二ルァラニンメチルエステル、サッ カリン、グリシン、ァラニンなどのような他の甘味料と、また、デキストリン、澱粉、乳糖 などのような増量剤と混合して使用することもできる。 [0051] また、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれを含む糖質の粉末状製品は、そ のままで、または必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球 状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成形して使用することも随意である
[0052] また、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれを含む糖質の甘味は、酸味、塩 から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種の物質とよく調和し、耐酸性 、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付、呈味改良に、また品質改良などに 有利に利用できる。
[0053] 例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、 ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麵つゆ、ソース、ケチ ヤップ、焼き肉のタレ、カレールゥ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味 料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料への 甘味料、更には、呈味改良剤、品質改良剤などとして使用することも有利に実施でき る。また、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、あん 類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット 、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シユータリー ム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌ ガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実 のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルー ッペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野 菜の加工食品類、福神漬け、べつたら漬、千枚漬、らつきよう漬などの漬物類、たくあ ん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉 ハム、魚肉ソーセージ、力マボコ、チタヮ、天ぷらなどの魚肉製品、ゥ-、イカの塩辛、 酢コンブ、さきするめ、ふぐのみりん干し、タラ、タイ、ェビなどの田麩などの各種珍味 類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コ ンブ卷などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、 増醸酒、清酒、果実酒、発泡酒、ビールなどの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲 料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、 即席ジュース、即席コーヒー、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離 乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付に 、呈味改良に、品質改良などに有利に実施できる。
[0054] また、家畜、家禽、その他は蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料など 嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リツ プクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤 など各種の固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組 成物への甘味剤として、または呈味改良剤、矯味剤として、さらに品質改良剤、安定 剤などとして有利に利用できる。
[0055] 品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性など失!ヽ易 ヽ各種生理活性物質ま たはこれを含む健康食品、機能性食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、 インターフェロン一 a、 一 β 、 一 γ 、ッモア 'ネクロシス'ファクタ^—— a、 一 β 、マクロ ファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキ ン IIなどのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラタチン、エリトロポ ェチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、 BCGワクチン、日本脳炎ヮクチ ン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫 グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフエニコー ル、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、 チアミン、リボフラビン、 L ァスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、ト コフエロールなどのビタミン含有液、 EPA、 DHA、ァラキドン酸、などの高度不飽和 脂肪酸又はそのエステル誘導体、リパーゼ、エステラーゼ、ゥロキナーゼ、プロテア ーゼ、 13 アミラーゼ、イソアミラーゼ、ダルカナーゼ、ラタターゼなどの酵素含有液、 薬用人参エキス、スツボンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなど のエキス類、ウィルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペースト、ローヤルゼリーなどの各種 生理活性物質も、その有効成分、活性を失うことなぐ安定で高品質の液状、ペース ト状または固状の健康食品、機能性食品や医薬品などを容易に製造できることとなる
[0056] 以上述べたような各種組成物に、イソサイクロマルトオリゴ糖又はこれを含む糖質を 含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程に含有せしめればよぐ例 えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、 固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常 0. 1質量％以上、望ましくは 1質量％以上含有せしめるのが好適である。
[0057] 以下、実験により本発明を詳細に説明する。
[0058] <実験 1 :非還元性糖質の調製 >
澱粉部分分解物 (商品名『パインデッタス # 4』、松谷化学工業株式会社製造） 1. 5 wZv%、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、 日本製薬株式会社製造) 0. 5w/v% 、酵母抽出物 (商品名『酵母エキス S』、 日本製薬株式会社製造) 0. lwZv%、リン 酸二カリウム 0. lwZv%、リン酸一ナトリウム · 2水和物 0. 06wZv%、硫酸マグネシ ゥム · 7水和物 0. 05wZv%、炭酸カルシウム 0. 3wZv%、及び水からなる液体培 地を、 500ml容三角フラスコ 10本に 30mlずつ入れ、オートクレーブで 121°C、 20分 間滅菌し、冷却した。次いで、バチルス'サーキュランス AM7 (FERM BP— 1011 1)を接種し、 27°C、 230rpmで 120時間回転振盪培養した。培養後、培養液を遠心 分離 (8, OOOrpm, 20分間）して菌体を除き、培養上清 (約 0. 3L)を得た。得られた 培養上清の 0. 25Lを酵素液として用いて、これを 2wZv%アミロース及び 2mM塩 化カルシウムを含有する 50mM酢酸緩衝液 (pH6. 0) 0. 25Lに添加し、 48時間、 4 0°Cで反応させた後、約 100°Cで 10分間、熱処理することによって反応を停止した。
[0059] 続いて、夾雑する還元糖をグルコースまで加水分解するため、上述の反応物を塩 酸で pH5. 0に調整した後、 α—ダルコシダーゼ（商品名『トランスダルコシダーゼ L「 ァマノ」』、天野ェンザィム株式会社製造)を固形物 1グラム当り 400単位及びダルコ アミラーゼけガセ生化学工業株式会社販売）を固形物 1グラム当り 25単位添加して 50°C、 24時間反応させた。反応後、約 100°Cで 10分間、熱処理して反応を停止さ せた。得られた反応液中の糖質を分析用の高速液体クロマトグラフィー（以下、分析 HPLCと略称する。）で分析したところ、溶出時間 57.3分のグルコース、溶出時間 43 . 7分の糖質 (以下、糖質 Iと略称する。）、及び、溶出時間 37. 1分の糖質 (以下、糖 質 IIと略称する。）が検出さた。それぞれの組成は、グルコースが 73. 3%で、糖質 Iが 24. 2%で、糖質 IIが 2. 5%であった。 なお、分析 HPLCは、、カラムに『MCIgel CK04SS』（三菱化学株式会社製造） の 2本を直列につなぎ、溶離液に水を用いて、カラム温度 80°C、流速 0. 4mlZ分の 条件で行い、検出は示差屈折計 RID— 10A (株式会社島津製作所製造)を用いて 行った。
[0060] 続いて、上述の反応液中の不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換 榭脂『ダイヤイオン SK— 1B』と『ダイヤイオン WA30』及びオルガノ製イオン交換榭 脂『IRA411』を用いて脱色、脱塩し、濃縮し、精密濾過した後、調製用 HPLCで分 画したところ、グルコースは溶出時間 29分力も 40分に溶出し、糖質 Iは溶出時間 57 分から 75分に溶出し、糖質 IIは溶出時間 120分から 180分に溶出した。糖質 Iと糖質 IIの画分を別々に回収し、精密濾過した後、真空乾燥して、糖質 Iを固形物として約 8 50mg、糖質 IIを固形物として約 lOOmgを得た。なお、調製用 HPLCは、『ODS— A Q R— 355— 15AQ』カラム (YMC株式会社製造）を用い、溶離液に 7. 5% (v/v) メタノールを用いて、カラム温度 25°C、流速 20mlZ分の条件で行った。
[0061] 得られた糖質 I及び糖質 II標品の糖組成を分析 HPLCで調べたところ、図 1及び図 2に示すように、糖質 I及び糖質 IIの含量はいずれも 97%以上であり、極めて高純度 であることが判明した。
[0062] また、糖質 I及び糖質 II標品の還元カをソモギー ·ネルソン法で測定したところ、両 標品とも還元力は検出限界以下であり、糖質 I及び糖質 Πは実質的に非還元性であ ると判断された。
[0063] <実験 2 :糖質 Iの構造解析 >
[0064] <実験 2— 1 :質量分析 >
実験 1の方法で得られた糖質 I標品につ ヽて、質量分析装置『LCQ—Advantage 』 (サーモエレクトロン社製)を用いて質量分析したところ、質量数 833のナトリウム付 加分子イオンが顕著に検出され、糖質 Iの質量数は 810であることが判明した。
[0065] <実験 2— 2 :構成糖分析 >
実験 1の方法で得られた糖質 I標品について、常法に従って、硫酸を用いて単糖に まで加水分解し、ガスクロマトグラフィーで構成糖を調べたところ、 D—グルコースの みが検出され、糖質 Iは D—グルコースのみを構成糖とすることが判明した。上述の 質量数を考慮すると、糖質 Iは D—グルコース 5分子カゝらなる環状糖質であることがわ かった。
[0066] <実験 2— 3 :メチル化分析 >
実験 1の方法で得られた糖質 I標品について、常法に従って、メチル化分析を行い ガスクロマトグラフィーでメチルイ匕物を調べた。結果を表 1にまとめた。
[0067] [表 1]
Figure imgf000024_0001
[0068] 表 1の結果から明らかなように、 2, 3, 4—トリメチルイ匕物と 2, 3, 6—トリメチル化物 の比率がほぼ 1 : 4であることから、糖質 Iを構成する D—グルコース 5分子のうち、 1分 子は 1位と 6位でダルコシド結合しており、また、他の 4分子は 1位と 4位でダルコシド 結合して ヽることが判明した。
[0069] <実験 2— 4 :核磁気共鳴分析 >
実験 1の方法で得られた糖質 I標品を用い、常法に従って、核磁気共鳴 (NMR)分 析を行った。 H— NMRスペクトルを図 3に、 13C— NMR ^ベクトルを図 4に示した。 1 H— NMRスペクトルにおける約 5. 07ppmのシグナル、約 5. OOppmのシグナル、 約 4. 99ppmのシグナル、約 4. 98ppmのシグナル、及び、約 4. 87ppmのシグナル は D—グルコース残基の 1位プロトンに帰属され、そのスピン—スピン結合定数を求 めたところ、約 3. 49Hz (約 5. 07ppmのシグナル）、約 3. 86Hz (約 5. OOppmのシ グナル）、約 2. 39Hz (約 4. 99ppmのシグナル）、約 2. 94Hz (約 4. 98ppmのシグ ナル）、及び、約 3. 31Hz (約 4. 87ppmのシグナル）であったことから、 1, 4ダルコシ ド結合して ヽる D—グルコース残基の 1位のァノマー型及び 1 , 6ダルコシド結合して いる D—グルコース残基の 1位のァノマー型は両方とも α型であることが判明した。
[0070] 以上の結果から、糖質 Iは、図 5に示すサイクロ {→6) - a—D—ダルコビラノシル
- (1→4) - a—D—ダルコピラノシル一（1→4) - a—D—ダルコピラノシル一 (1→ 4) - a—D—ダルコピラノシル一 (1→4) - a—D—ダルコピラノシル一（1→}の構 造を有する環状ダルコ五糖、すなわち、イソサイクロマルトペンタオースであることが 判明した。この構造を有する糖質は従来全く知られておらず、本発明のイソサイクロ マルトペンタオースは新規な環状糖質である。
[0071] く実験 3 :糖質 IIの構造解析〉
[0072] <実験 3— 1 :質量分析 >
実験 1の方法で得られた糖質 Π標品につ 、て、質量分析装置『LCQ—Advantage
』を用いて質量分析したところ、質量数 995のナトリウム付加分子イオンが顕著に検 出され、糖質 IIの質量数は 972であることが判明した。
[0073] <実験 3— 2 :構成糖分析 >
実験 1の方法で得られた糖質 Π標品について、常法に従って、硫酸を用いて単糖 にまで加水分解し、ガスクロマトグラフィーで構成糖を調べたところ、 D—グルコース のみが検出され、糖質 IIは D—グルコースのみを構成糖とすることが判明した。上述 の質量数を考慮すると、糖質 Πは D—グルコース 6分子カゝらなる環状糖質であること がわかった。
[0074] <実験 3— 3 :メチル化分析 >
実験 1の方法で得られた糖質 Π標品について、常法に従って、メチル化分析を行い ガスクロマトグラフィーでメチルイ匕物を調べた。結果を表 2にまとめた。
[0075] [表 2]
Figure imgf000025_0001
[0076] 表 2の結果から明らかなように、 2, 3, 4—トリメチルイ匕物と 2, 3, 6—トリメチル化物 の比率がほぼ 1 : 5であることから、糖質 IIを構成する D—グルコース 6分子のうち、 1 分子は 1位と 6位でダルコシド結合しており、また、他の 5分子は 1位と 4位でダルコシ ド結合していることが判明した。
[0077] <実験 3— 4 :核磁気共鳴分析 >
実験 1の方法で得られた糖質 II標品を用いて、常法に従って、核磁気共鳴 (NMR) 分析を行った。 H— NMRスペクトルを図 6に、 13C— NMR ^ベクトルを図 7に示した 。ェ！！ー NMR ^ベクトルにおける約 5. 20ppmのシグナル、約 5. OOppmのシグナル 、約 4. 99ppmのシグナル、約 4. 97ppmのシグナル、約 4. 96ppmのシグナル、及 び、約 4. 86ppmのシグナルは D—グルコース残基の 1位プロトンに帰属され、そのス ピン一スピン結合定数を求めたところ、約 3. 49Hz (約 5. 20ppmのシグナル）、約 2 . 57Hz (約 5. OOppmのシグナル）、約 3. 13Hz (約 4. 99ppmのシグナル）、約 4. 0 4Hz (約 4. 97ppmのシグナル）、約 3. 86Hz (約 4. 96ppmのシグナル）、及び、約 3 . 86Hz (約 4. 86ppmのシグナル）であったことから、 1, 4ダルコシド結合している D -グルコース残基の 1位のァノマー型及び 1 , 6ダルコシド結合して!/、る D ダルコ一 ス残基の 1位のァノマー型は両方とも a型であることが判明した。
[0078] 以上の結果から、糖質 IIは、図 8に示すサイクロ {→6) - a—D—ダルコビラノシル
- (1→4) - a—D—ダルコピラノシル一（1→4) - a—D—ダルコピラノシル一 (1→ 4) - a—D—ダルコピラノシル一 (1→4) - a—D—ダルコピラノシル一（1→4) - a D ダルコビラノシルー（1→}の構造を有する環状ダルコ六糖、すなわち、イソサイ クロマルトへキサオースであることが判明した。この構造を有する糖質は従来全く知ら れておらず、本発明のイソサイクロマルトへキサオースは新規な環状糖質である。
[0079] <実験 4 :イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の生産 >
実験 1に記載の液体培地を、 500ml容三角フラスコ 2本に 100mlずつ入れ、オート クレーブで 121°C、 20分間滅菌し、冷却して、バチルス'サーキュランス AM7 (FE RM BP— 10111)を接種し、 27°C、 230rpmで 48時間回転振盪培養したものを種 口 ピしァこ。
[0080] 容量 30Lのフアーメンターに種培養と同じ組成の液体培地を約 20L入れて、加熱 滅菌、冷却して温度 27°Cとした後、種培養液約 200mlを接種し、温度 27°C、 pH6. 0乃至 8. 0に保ちつつ、 96時間通気攪拌培養した。培養後、フアーメンターカゝら培養 液を抜き出し、遠心分離 (8, OOOrpm, 20分間）して菌体を除き、培養上清約 18Lを 得た。培養液及び培養上清について、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素活性を測 定したところ、培養液中には該酵素活性を約 0. 027単位 Zml含み、上清中には該 酵素活性を約 0. 025単位 Zml含むことがわかり、バチルス'サーキュランス AM7 によって生産されるイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素はその大部分が菌体外に存 在することが判明した。 [0081] <実験 5：イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の精製 >
実験 4で得た培養上清のうち、約 10L (総活性約 250単位）に、最終濃度 80%飽和 となるように硫安を添加し、 4°C、 24時間放置することにより塩析した。生成した塩析 沈殿物を遠心分離（11, OOOrpm、 30分間）にて回収し、これを lOmM酢酸緩衝液（ PH6. 0)に溶解後、同緩衝液に対して透析し、粗酵素液として約 240mlを得た。粗 酵素液中のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素活性は約 0. 96単位 Zmlであった（ 総活性約 230単位)。この粗酵素液を東ソー株式会社製『DEAE—トヨパール (Toy opearl) 650S』ゲルを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量 120ml)に 供した。イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素活性のある画分は、 10mM酢酸 (pH6. 0)で平衡ィ匕した『DEAE—トヨパール 650S』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶 出した。この活性画分を回収し、終濃度 1Mとなるように硫安を添加して 4°C、 24時間 放置した後、遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『プチルートヨパール (B uthyl-Toyopearl) 650M』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル容量 60ml )に供した。イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素のある画分は、 1M硫安を含む 10m M酢酸緩衝液 (pH6. 0)で平衡化した『ブチルートヨパール 650M』ゲルに吸着し、 硫安濃度 1M力 0Mのリニアグラジェントで溶出させたところ、硫安濃度約 0. 1M付 近に溶出した。この精製の各ステップにおけるイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の 活性、比活性及び収率を表 3に示す。
[0082] [表 3]
Figure imgf000027_0001
[0083] 精製したイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を 5乃至 20wZv%濃度勾配ポリ アクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単 一であり、純度の高い標品であった。
[0084] <実験 6：イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の性質 > [0085] <実験 6— 1 :分子量 >
実験 5の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を SDS—ポリア クリルアミドゲル電気泳動法（5乃至 20wZv%濃度勾配）に供し、同時に泳動した分 子量マーカー（日本バイオ 'ラッド'ラボラトリーズ株式会社製)と比較して分子量を測 定したところ、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の分子量は 106, 000± 20, 000 ダルトンであることが判明した。
[0086] <実験 6— 2 :等電点 >
実験 5の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を 2. 2wZv%7 ンフオライン（アマシャム ·バイオサイエンス社製)含有等電点ポリアクリルアミドゲル電 気泳動法に供し、同時に泳動した等電点マーカー（アマシャム'バイオサイエンス社 製）と比較して等電点を求めたところ、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の等電点 は pI7. 5±0. 5であることが判明した。
[0087] <実験 6— 3：酵素反応の至適温度及び至適 pH >
実験 5の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を用いて、酵素 活性に及ぼす温度、 pHの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を 図 9 (至適温度）、図 10 (至適 pH)に示した。イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の至 適温度は、 pH6. 0、 30分間反応の条件下で、 50乃至 55°Cであり、至適 pHは、 30 °C、 30分間反応の条件下で 4. 5乃至 8. 0であることが判明した。
[0088] <実験 6— 4：酵素の温度安定性及び pH安定性 >
実験 5の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を用いて、本酵 素の温度安定性及び pH安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（10mM酢酸 緩衝液、 pH6. 0)を塩ィ匕カルシウム非存在下または ImM存在下で各温度に 60分 間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。 pH安定性 は、本酵素を各 pHlOOmM緩衝液中で 4°C、 24時間保持した後、 pHを 6. 0に調整 し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図 11 (温度安定 性）、図 12 (pH安定性）に示した。図 11から明らかなように、イソサイクロマルトオリゴ 糖生成酵素の温度安定性は、塩ィ匕カルシウム非存在下で 35°Cまで、塩化カルシゥ ム ImM存在下で 40°Cまでであることが判明し、カルシウムイオンによって本酵素の 温度安定性が向上することがわ力つた。また、図 12から明らかなように、イソサイクロ マルトオリゴ糖生成酵素の pH安定性は pH4. 5乃至 9. 0の範囲であることが判明し た。
[0089] <実験 6— 5：酵素活性に及ぼす金属塩の影響 >
実験 5の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を用いて、酵素 活性に及ぼす金属塩の影響を濃度 ImMの各種金属塩存在下で活性測定の方法 に準じて調べた。結果を表 4に示す。
[0090] [表 4]
Figure imgf000029_0001
[0091] 表 4の結果から明らかなように、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素活性は、 HgCl
2 で 45%阻害され、 FeCl及び CuClで約 20%阻害されることが判明した。また、金属
3 2
イオンのキレート剤である EDTAによっても弱く阻害された。
[0092] <実験 6— 6 :N末端アミノ酸配列 >
実験 5の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を用いて、本酵 素の N末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー モデル 492HT (アプライドバイ ォシステムズ社製)を用いて分析したところ、配列表における配列番号 1で示されるァ ミノ酸配列、すなわち、ァラニンーセリン一イソロイシン グリシンースレオニン バリ ン一スレオニン一グルタミン酸一ァスパラギン一ァスパラギン酸一スレオニン一イソ口 イシンーチロシン グルタミン イソロイシン メチォニン一パリン ァスパラギン酸 アルギニン一フエ-ルァラニン を有していることが判明した。
[0093] <実験 6— 7 :部分アミノ酸配列 >
実験 5の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を適量とり、 10m Mトリス'塩酸緩衝液 (pH9. 0)に対して 4°Cで 18時間透析した後、同緩衝液を加え て蛋白濃度約 lmgZmlとした。この溶液を約 lmlとり、リジルエンドべプチダーゼ (和 光純薬株式会社販売）20；^を加えて、 30°C、 20時間保持して酵素蛋白を加水分 解した。加水分解物を予め 10% (v/v)ァセトニトリルを含む 0. 1% (v/v)トリフルォ 口酢酸で平衡ィ匕させておいた HPLC用カラム（商品名『マイクロボンダスフエアー C1 8』、直径 3. 9mm X長さ 150mm、ウォーターズ社製）に注入し、流速 0. 9mlZ分、 室温の条件下、 0. 1% (v/v)トリフルォロ酢酸— 10% (v/v)ァセトニトリル溶液から 0. 1% (v/v)トリフルォロ酢酸— 50% (vZv)ァセトニトリル溶液の 100分間のリニア グラジェントで通液し、ペプチド断片を分画した。カラム力も溶出したペプチド断片は 波長 210nmの吸光度を測定することにより検出した。通液開始力も約 14分、約 18 分、約 30分、約 35分、約 38分、約 61分、約 64分、約 67分及び約 82分に溶出した 9 種のペプチド断片のアミノ酸配列を、それぞれ実験 6— 6と同じ方法で分析したところ 、それぞれ配列表における配列番号 4乃至 12に示されるアミノ酸配列を有して ヽた。
[0094] <実験 7 :イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素をコードする DNAのクローユング及び これを含む組換え DNAと形質転換体の調製 >
イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素をコードする DNAをバチルス ·サーキュランス AM7 (FERM BP— 10111)力らクローニングし、 自律複製可能な組換え DNAの 作製、酵素をコードする DNAの塩基配列の決定、及び形質転換体の調製を行った
[0095] <実験 7— 1：染色体 DNAの調製 >
澱粉部分分解物 (商品名『パインデッタス # 4』、松谷化学工業株式会社製造) 0. 2 5wZv%、酵母抽出物 (商品名『粉末酵母エキス S』、 日本製薬株式会社販売) 0. 2 wZv%、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、 日本製薬株式会社販売） 1. Ow/v% 、リン酸二カリウム 0. lwZv%、リン酸一ナトリウム · 2水塩 0. 06wZv%、硫酸マグネ シゥム · 7水塩 0. 05wZv%、炭酸カルシウム 0. lwZv%及び水からなる液体培地 を、 500ml容三角フラスコに 100mlずつ入れ、オートクレーブで 121°C、 20分間滅 菌し、冷却して、バチルス 'サーキュランス AM7 (FERM BP— 10111)を接種し、 27°C、 230rpmで 5日間回転振盪培養した。 [0096] 遠心分離により培養物から採取した菌体を TES緩衝液 (pH8. 0)に浮遊させ、リゾ チームを 0. 05% (wZv)加え、 37°Cで 30分間インキュベートした。処理物を 80°C で 1時間凍結後、 TSS緩衝液 (pH9. 0)をカ卩えて 60°Cに加温し、 TES緩衝液 Zフエ ノール混液を加え、氷水中で冷却しながら 10分間激しく振盪した後、遠心分離により 上清を採取した。この上清に 2倍容の冷エタノールを加え、沈殿した粗染色体 DNA を採取し、 SSC緩衝液 (pH7. 1)に溶解後、リボヌクレアーゼとプロティナーゼをそれ ぞれ 7. 5 μ gと 125 μ gカ卩え、 37°Cで 1時間保持して反応させた。反応物にクロロホ ルム Zイソアミルアルコール混液をカ卩えて染色体 DN Aを抽出し、冷エタノールをカロ え、生成した染色体 DNAを含む沈殿を採取した。このようにして得た精製染色体 D NAを濃度約 lmg/mlになるように SSC緩衝液 (pH7. 1)に溶解し、 80°Cで凍結 した。
[0097] <実験 7— 2： PCRによる部分 DNA断片のクローユング >
イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素をコードする DNAのクローユングを行うに先立 ち、まず、その部分 DNA断片の PCR クロー-ングを行った。イソサイクロマルトオリ ゴ糖生成酵素の N末端アミノ酸配列である配列表における配列番号 1で表されるアミ ノ酸配列における第 10乃至第 15番目及び第 13乃至第 18番目のアミノ酸配列に基 づき、配列表における配列番号 13及び 14で示される 2種のセンスプライマー F1及 び F2を合成した。また、当該酵素の内部アミノ酸配列である配列表における配列番 号 4で示されるアミノ酸配列における第 4乃至第 8番目及び第 1乃至第 5番目のァミノ 酸配列に基づき、配列表における配列番号 15及び 16で示される 2種のアンチセンス プライマー R1及び R2を合成した。センスプライマー F1とアンチセンスプライマー R1 の組合せで、実験 7— 1で得た染色体 DNAを铸型として 1回めの PCRを常法に従い 行った。次いで、得られた PCR産物を铸型としてセンスプライマー F2とアンチセンス プライマー R2の組合せで 2回目の PCRを行ったところ、約 200塩基対と約 300塩基 対の 2種の PCR増幅 DNA断片が認められた。 PCR増幅 DNA断片は、プラスミド（商 品名「pCR— Script Amp SK( + )」、ストラタジーン社販売）の制限酵素 Srf I部 位に挿入した後、通常のコンビテントセル法によりコンビテントセル (商品名『Epicuri an Coli XL2 - Blue』、ストラタジーン'クローユング ·システム製）を形質転換した。 得られた形質転換体力も通常のアルカリ— SDS法により組換え DNAを抽出し、 目的 とする約 300塩基対の挿入 DNA断片を有する組換え DNAを保持する形質転換体 を選択した。次いで、この組換え DNAの塩基配列を、通常のジデォキシ法により分 祈したところ、当該組換え DNAは、配列表における配列番号 17で示される鎖長 251 塩基対の塩基配列を有する DNAを含んで ヽた。
[0098] 配列表における配列番号 17に併記されたアミノ酸配列の第 37乃至第 46番目及び 第 47乃至 60番目のアミノ酸配列は、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の部分アミ ノ酸配列である配列表における配列番号 6及び 10で示されるアミノ酸配列と完全に 一致したことから、上記 DNA断片は、バチルス'サーキュランス AM7 (FERM BP — 10111)に由来するイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の一部をコードする DNA 断片であることが判明した。
[0099] <実験 7— 3 :コロニーハイブリダィゼーシヨン法によるイソサイクロマルトオリゴ糖生成 酵素をコードする DNAのクローニング>
実験 7—1で調製した精製染色体 DNA溶液を 0. 1mlとり、これに制限酵素 Hind IIIを約 100単位カ卩え、 37°Cで 1時間反応させて染色体 DNAを加水分解した後、ァ ガロース電気泳動法により約 5, 000乃至 9, 000塩基対カゝらなる DNA断片を採取し た。別途、プラスミドベクター (ストラタジーン'クローユング 'システム製、登録商標『pB luescript II SK( + )』）を常法により制限酵素 Hind ΠΙを作用させ完全に切断し た後、その切断されたプラスミドベクター 0. 5 μ gと先に得た DNA断片約 5 μ gとを巿 販のキット (宝酒造製、商品名『DNAライゲーシヨン'キット』)を用いて、添付の説明 書に従って操作し、連結した。得られた組換え DNAを用いて、通常のコンビテントセ ル法によりコンビテントセル（商品名『Epicurian Coli XL2— Blue』、ストラタジー ン ·クローユング ·システム製）を形質転換して Hind III染色体 DNAライブラリーを作 製した。
[0100] このようにして得た形質転換体を、常法により調製した、 lOgZlトリプトン、 5g m 母エキス、 5gZl塩化ナトリウム、 lOOmgZlアンピシリンナトリウム塩、 50mgZl5—ブ 口モー 4—クロ口一 3—インドリル一 β—ガラタトシドを含む寒天平板培地 (ρΗ7. 0) に植菌し、 37°Cで 24時間培養後、培地上で形成されたコロニー約 655個をナイロン 膜 (商品名『Hybond— N +』、アマシャム製)上に固定した。別途、実験 7— 2で調製 した組換え DN Aを制限酵素 Not I及び Bam HIで消化した後、常法のァガロース ゲル電気泳動法により目的とする約 300塩基対の DNA断片を採取し、 DNA標識キ ット（商品名「DIG DNA Labeling and Detection Kit」、ロシュ'ダイァグノス ティックス株式会社販売）を用いて標識し、 DIG (ジゴキシゲニン)標識プローブとした 。前記した、ナイロン膜上に固定したコロニー 655株に対して、 DIG標識プローブを 用いて通常のコロニーハイブリダィゼーシヨンを行い、陽性クローンとして 1種類の形 質転換体を得た。この形質転換体を『BAMH1』と命名した。
<実験 7— 4：イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素をコードする DNAの塩基配列の決 定>
形質転換体 BAMH1を、常法に従い 100 gZmlアンピシリンナトリウム塩を含む L ブロス培地 (pH7. 0)に植菌し、 37°Cで 24時間回転振盪培養した。培養終了後 、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ SDS法により組換え D NAを抽出した。この組換え DNAの塩基配列を、通常のジデォキシ法により分析し たところ、当該組換え DNAは、バチルス'サーキュランス AM7 (FERM BP— 101 11)に由来する、配列表における配列番号 18で示される鎖長 2, 985塩基対の塩基 配列を有する DNAを含んでいた。図 13に示すように、この組換え DNAにおいて、 当該 DNAは、制限酵素 Hind IIIによる認識部位の下流に連結されていた。一方、 この塩基配列力 推定されるアミノ酸配列は、その配列番号 18で示される塩基配列 に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験 6— 6の方法で確認された本発明 のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の N末端アミノ酸配列及び実験 6— 7の方法で 明らかにされた部分アミノ酸配列である、配列表における配列番号 1及び配列番号 4 乃至 12で示されるアミノ酸配列と比較したところ、配列表における配列番号 1で示さ れるアミノ酸配列は、配列表における配列番号 18に併記したアミノ酸配列における 第 36乃至 55番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、及び 12に示されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列表に おける配列番号 18で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列における第 126乃至 135番目、第 140乃至 149番目、第 84乃至 93番目、第 152乃至 163番目、第 806 乃至 816番目、第 925乃至 939番目、第 94乃至 107番目、第 185乃至 197番目、 及び第 272乃至 286番目のアミノ酸配列と完全に一致した。以上のことは、本発明の イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素力 S、配列表における配列番号 2に示されるァミノ 酸配列を含むものであり、当該酵素はバチルス'サーキュランス AM7 (FERM BP 10111)においては、配列表における配列番号 3に示す塩基配列の DNAによりコ ードされていることを示している。また、配列表における配列番号 18に併記したァミノ 酸配列における第 1乃至 35番目のアミノ酸配列は、当該酵素の分泌シグナル配列と 推定された。これらのこと力 、当該酵素の分泌前の前駆体は、配列表における配列 番号 18に併記されたアミノ酸配列力もなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配 列番号 18に示す塩基配列にコードされていることが判明した。以上のようにして調製 し、塩基配列を確認した組換え DNAを『ρΒΑΜΗ1』と命名した。
[0102] <実験 8：発現用組換え DNApETAMlの作製とその形質転換体 ETAM1による組 換え型イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の産生 >
組換え DNA『pBAMHl』中のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素遺伝子を発現 用ベクターに挿入し、組換え型イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の大腸菌におけ る発現を検討した。
[0103] <実験 8— 1：発現用組換え DNA、 pETAMlの作製及び形質転換体 ETAM1の調 製 >
pBAMH 1中のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素遺伝子を発現用ベクターに組 込むに際し、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の構造遺伝子の上流に制限酵素 N de I認識部位を導入し、当該構造遺伝子内部に存在する Nde I認識部位を削除 する目的で PCRによる変異を導入した。 pBAMHlを铸型として用い、 pBAMHlの ベクターである pBluescript II SK( + )におけるイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵 素の構造遺伝子の上流に位置する塩基配列に基づき合成した配列表における配列 番号 19で示される塩基配列を有するセンスプライマーと構造遺伝子内部の Nde I 認識部位の塩基配列に基づき合成した配列表における配列番号 22で示される塩基 配列を有するアンチセンスプライマーの組合せ、及び、構造遺伝子内部の Nde I認 識部位の塩基配列に基づき合成した配列表における配列番号 21で示される塩基配 列を有するセンスプライマーと構造遺伝子の下流に位置する制限酵素 Bam HI認 識部位の塩基配列に基づき合成した配列表における配列番号 23で示される塩基配 列を有するアンチセンスプライマーの組合せで 1次 PCRを行 ヽ、増幅 DNA断片を得 た。次いで、この得られた増幅 DNA断片を铸型とし、構造遺伝子の上流に Nde I認 識部位を導入するために合成した配列表における配列番号 20で示される塩基配列 を有するセンスプライマーと構造遺伝子の下流に位置する制限酵素 Bam HI認識 部位の塩基配列に基づき合成した配列表における配列番号 23で示される塩基配列 を有するアンチセンスプライマーの組合せで 2次 PCRを行い、目的とする Nde I認 識部位を構造遺伝子の上流に有し、構造遺伝子内部の Nde I認識部位が削除され たサイクロマルトオリゴ糖生成酵素遺伝子を増幅した。常法により、制限酵素 Nde I 及び Bam HIで消化した発現用ベクター pET— 38b ( + ) (ノバジェン社製）に、上記 で増幅した DNAを組込んで得られた組換え DNAを『ρΕΤΑΜ1』と命名した。 pET AMIを図 14に示す。 pETAMlを用いて大腸菌 JM109 (東洋紡株式会社販売）を 形質転換し、得られた形質転換体から pETAMlを調製し、発現用宿主大腸菌 BL2 1 (DE3) (ノバジヱン社製)を形質転換して形質転換体『ETAM1』を調製した。
<実験 8— 2：形質転換体 ETAM1による組換え型イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵 素の産生 >
lOgZlトリプトン（商品名『Bacto— tryptone』、 Difco社販売）、 5gZl酵母エキス（ 商品名『Bacto— yeast extract』、 Difco社販売）及び lOgZl食塩及び水からなる 液体培地を、 500ml容三角フラスコに 100mlずつ入れ、オートクレーブで 121°C、 2 0分間滅菌し、冷却して、無菌的に pH7. 5に調整した後、カナマイシン 2mgを無菌 的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験 8— 1の方法で得た形質転 換体 ETAM1を接種し、 27°Cで回転振盪培養して濁度が約 0. 6に達した時点でィ ソプロピル一 1—チォ一 13— D—ガラクトピラノシド (IPTG)を終濃度 0. 4mMになる ように添加してイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素遺伝子の発現を誘導し、さらに 3 時間培養した。得られた培養物を、常法に従い、遠心分離して培養上清と菌体と〖こ 分離して回収した。菌体については、超音波破砕法により細胞からの全抽出物を調 製した。超音波破砕法は、菌体を 20mMトリス—塩酸緩衝液 (pH7. 5)に懸濁した後 、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザー（モデル UH— 60 0、株式会社エスエムテー製)で細胞破砕することによって行い、その破砕物を全細 胞抽出物とした。
[0105] このようにして調製した培養上清と全細胞抽出物とについて、それぞれのイソサイク 口マルトオリゴ糖生成酵素活性を測定し、それぞれの活性値を培養物 lml当りに換 算した。なお、対照としてプラスミド pET— 38b ( + )を保持する大腸菌 BL21 (DE3) を上述の形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と全細胞抽 出物を調製し、同様にイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素活性を測定した。これらの 結果を表 5に示す。
[0106] [表 5]
Figure imgf000036_0001
[0107] 表 5の結果から明らかなように、形質転換体 ETAM1は、本発明のイソサイクロマル トオリゴ糖生成酵素を細胞内に産生することが判明した。宿主である対照の大腸菌で は培養上清、全細胞抽出物のいずれにも当該酵素活性は全く認められな力つた。
[0108] この実験 8の方法で得た全細胞抽出物を、さらに実験 5に示した方法に準じて、塩 析、透析し、 DEAE—トヨパール 650Sゲル、ブチルートヨパール 650Mゲルを用 いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、さらにこの精製酵素標品を実験 6に示 した方法に準じて分析した。その結果、 SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に よる分子量は約 106, 000 ± 20, 000ダルトン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳 動法による等電点は約 7. 5±0. 5、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素活性の至適 温度は、 pH6. 0、 30分間反応の条件下で約 50乃至 55°C、至適 pHは 30°C、 30分 間反応の条件下で約 4. 5乃至 8. 0、温度安定性は、各温度に 60分間保持する条 件下で、塩化カルシウム非存在下で 35°Cまで、 ImM塩化カルシウム存在下で約 40 °Cまで安定であり、 pH安定性は、各 pHに 4°Cで 24時間保持する条件下で約 4. 5乃 至 9. 0の範囲で安定であった。これらの理ィ匕学的性質は、実験 5に示された方法で 調製された当該酵素のそれと実質的に同一であった。以上の結果は、本発明のイソ サイクロマルトオリゴ糖生成酵素は、組換え DNA技術によって良好に製造できること を示している。
[0109] <実験 9 :各種糖質への作用 >
各種糖質を用いて、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の基質特異性を調べた。 マノレトース、マノレトトリオース、マノレトテトラオース、マノレトペンタオース、マノレトへキサ オース、マノレトへプタオース、ネオトレノヽロース、トレノヽロース、コージビオース、 -ゲロ ース、イソマノレトース、イソマノレトトリオース、ノ《ノース、イソパノース、マノレチトーノレ、マ ルトトリイトール、 α—、 β—又は γ—サイクロデキストリン、アミロース、可溶性澱粉、 グリコーゲン、プルラン又はデキストランを含む水溶液を調製した。これらの基質溶液 に、最終濃度 20mM酢酸緩衝液 (ρΗ6. 0)と最終濃度 ImM塩ィ匕カルシウムをカロえ た後、実験 5の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を基質固形 物 1グラム当たりそれぞれ 1単位ずつ加え、基質濃度を 2wZv%になるように調整し、 これを 40°C、 pH6. 0で 24時間作用させた。酵素反応前後の反応液中の糖質を調 ベるため、展開溶媒として n—ブタノール、ピリジン、水混液 (容量比 6 : 4 : 1)を、また 、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル 60』（アルミプレート、 10 X 20cm)を 用い、 2回展開するシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、 TLCと略す)を行い、糖 質を分離した。硫酸 メタノール法にて発色させ、分離した糖質を検出し、それぞれ の糖質に対する酵素作用の有無又は強さの程度を確認した。結果を表 6に示す。
[0110] [表 6] 基質 作用 基質 作用 マルトース - パノース - マルトトリオース + イソパノース - マルトテトラオース ++ マルチトール - マル卜ペン夕オース +++ マルトトリィトール - マルトへキサオース +++ α—サイクロデキストリン - マルトヘプ夕オース +++ β—サイクロデキストリン - ネオトレ Λ口一ス - r—サイクロデキストリン - トレハロース - アミロース +++ コ一ジビオース - 可溶性澱粉 ++ ニゲロース ― グリコーゲン + イソマルトース - プルラン - イソマルトトリオース - キス卜ラン - 注〉 酵素反応前後で、
-は、 「変化無し」 を示し、
+は、 r基質のスポットが僅かに滅少し、 イソサイクロマルトオリゴ糖の生成が認められる」 を示し、
+ +は、 「基質のスポットがかなり減少し、 イソサイクロマルトオリゴ糖の生成が認められる」 を示し、 + + +は、 「基質のスポットがほとんど消失し、 イソサイクロマルトオリゴ糖の生成が認められる」 を示す。
[0111] 表 6の結果力も明らかなように、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素は、試験した糖 質のうち、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトへキサオース、マルトへプタ オースによく作用し、また、マルトトリオースに僅かに作用した。さらに、アミロース、可 溶性澱粉、グリコーゲンにも、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素はよく作 用した。これらの結果より、本酵素はグルコース重合度が 3以上の α— 1, 4グルカン に作用することが判明した。
[0112] <実験 10 :作用メカニズム >
[0113] <実験 10— 1：マルトへキサオースからの生成物 >
最終濃度 lwZv%のマルトへキサオース水溶液に、最終濃度 20mM酢酸緩衝液 ( PH6. 0)と最終濃度 ImM塩ィ匕カルシウムを加えた後、実験 5の方法で得た精製イソ サイクロマルトオリゴ糖生成酵素を、基質固形物 1グラム当たり 1単位加え、 45°C、 pH 6. 0で作用させ、経時的にサンプリングを行い、 100°Cで 10分間保持して反応を停 止した。その酵素反応液の糖組成を、 HPLCを用いて測定した。 HPLCは、、カラム に『MCIgel CK04SS』 (三菱ィ匕学株式会社製造)の 2本を直列につなぎ、溶離液 に水を用いて、カラム温度 80°C、流速 0. 4mlZ分の条件で行い、検出は示差屈折 計 RID— 10A (株式会社島津製作所製造)を用いて行った。その結果を表 7に示す [0114] [表 7]
Figure imgf000039_0001
[0115] 表 7の結果力も明らかなように、本酵素の作用の結果、基質マルトへキサオースから 、マルトへキサオースよりも重合度の低いマルトオリゴ糖、イソサイクロマルトペンタォ ース、イソサイクロマルトへキサオースおよびマルトへキサオースよりも重合度の高 ヽ マルトオリゴ糖を生成することが判明した。この結果から推察すると、本発明のイソサ イク口マルトオリゴ糖生成酵素はマルトへキサオースに作用して、マルトース力 マル トペンタオースまでの一連のマルトオリゴ糖を分子間で α— 1,4転移して、グルコース 重合度 8以上のマルトオリゴ糖を含むグルコース重合度の種々異なるマルトオリゴ糖 の生成 (不均化反応）を触媒すると同時に、グルコース重合度が 7のマルトオリゴ糖（ マルトへプタオース）から、マルトペンタオース単位で切断し分子内で α— 1,6転移し て、イソサイクロマルトペンタオースを生成し、またグルコース重合度が 8以上のマルト オリゴ糖から、マルトペンタオース又はマルトへキサオース単位で切断し分子内で a 1,6転移して、イソサイクロマルトペンタオース及びイソサイクロマルトへキサオース を生成すると推定された。
[0116] 以上のことから、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素によるイソサイクロマ ルトオリゴ糖の反応メカニズムは以下のように考えられた。本酵素は、基質としてダル コース重合度が 3以上の a—1 , 4グルカンに作用し、一連のマルトオリゴ糖を分子間 で ex 1 ,4転移して、重合度の異なるマルトオリゴ糖の生成 (不均化反応）を触媒す る。一方、グルコース重合度が 7の a—1 , 4グルカン（マルトへプタオース）に作用す る場合には、その非還元性末端よりマルトペンタオース単位で切断し、マルトペンタ オースの非還元末端ダルコースの 6位水酸基に還元末端ダルコースの 1位を分子内 で転移する環化反応を触媒することにより、イソサイクロマルトペンタオースとマルトー スとを生成する。また、グルコース重合度が 8以上の a— 1 , 4グルカンに作用する場 合には、その非還元性末端よりマルトペンタオース又はマルトへキサオース単位で切 断し、マルトペンタオース又はマルトへキサオースの非還元末端グルコースの 6位水 酸基に還元末端ダルコースの 1位を分子内で転移する環化反応を触媒することにより
、イソサイクロマルトペンタオース及びイソサイクロマルトへキサオースと、グルコース 重合度が 5又は 6減じた a—1 , 4グルカンとを生成する。
[0117] く実験 11：各種基質力 のイソサイクロマルトオリゴ糖の生成〉
本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素用いて、各種糖質からのイソサイクロ マルトオリゴ糖の生成を試験した。マルトへキサオース、マルトへプタオース、アミロー ス、可溶性澱粉、澱粉部分分解物 (商品名『パインデッタス # 100』、松谷化学工業 株式会社製造)、グリコーゲン (トウモロコシ由来、キューピー株式会社製造)の各水 溶液を調製した。
[0118] これらの水溶液 (最終濃度 1. Ow/v%)に、最終濃度 20mM酢酸緩衝液 (pH6. 0 )と最終濃度 ImM塩ィ匕カルシウムを加えた後、実験 5の方法で得た精製イソサイクロ マルトオリゴ糖生成酵素標品を固形物 1グラム当たり 1単位加え、これらを 45°C、 pH6 . 0で 48時間作用させた後、その反応液を 100°Cで 10分間加熱して反応を停止させ た。実験 1と同様に a ダルコシダーゼ及びダルコアミラーゼで処理した後、 HPLC でイソサイクロマルトオリゴ糖を定量し、イソサイクロマルトオリゴ糖の生成率を求めた 。それらの結果を表 8に示す。
[0119] [表 8] イソサイクロマルトオリゴ糖生成率 （％)
基 質 イソサイクロマルト イソサイクロマル卜
ペン夕オース へキサオース マルトへキサオース 10. 7 2. 9
マルトへプタオース 13. 1 3. 1
アミロース 24. 8 4. 0
可溶性澱粉 23. 8 4. 1
澱粉部分分解物 16. 9 3. 4
グリコーゲン 11. 5 3. 1
[0120] 表 8の結果から明らかなように、試験したいずれの糖質からも、イソサイクロマルトォ リゴ糖生成酵素の作用によってイソサイクロマルトペンタオース及びイソサイクロマルト へキサオースが生成した。その生成率の合計は、基質がマルトへキサオースの場合 約 14%と低いのに対して、基質がアミロースの場合約 29%と最も高ぐ次いで可溶 性澱粉、澱粉部分分解物の順であった。
[0121] <実験 12：イソサイクロマルトオリゴ糖生成反応と反応産物の還元力 >
アミロース水溶液 (最終濃度 1. OwZv%)に、最終濃度 20mM酢酸緩衝液 (pH6. 0)と最終濃度 ImM塩ィ匕カルシウムを加えた後、実験 5の方法で得た精製イソサイク 口マルトオリゴ糖生成酵素標品を固形物 1グラム当たり 1単位加え、これらを 45°C、 p H6. 0で反応させ、酵素添加直後にサンプリングし、サンプリングしたものを直ちに約 100°Cで 10分間加熱して反応を停止し、水冷し、反応 0時間の反応液を得た。続い て、反応 1、 2、 3、 4時間、それぞれの時点でサンプリングし、直ちに約 100°Cで 10分 間加熱して反応を停止し、水冷し、反応 1時間、反応 2時間、反応 3時間、反応 4時間 のそれぞれの反応液を得た。得られた反応液の還元糖量をソモギー ·ネルソン法で、 全糖量をアンスロン硫酸法で測定し、全糖量に占める還元糖量の割合を百分率（％) で表し、還元力とした。また、反応液を実験 1と同様に α—ダルコシダーゼ及びダル コアミラーゼで処理した後、 HPLCでイソサイクロマルトオリゴ糖を定量し、イソサイク 口マルトオリゴ糖の生成率を求めた。これらの結果を表 9にまとめた。
[0122] [表 9] イソサイクロマルトオリゴ糖生成率 （％) 反応時間 遠元力
イソサイクロマルト イソサイクロマルト
(時間） ( %) ペン夕オース へキサオース
0 6. 9 0. 0 0. 0
1 7. 1 7. 8 0. 0
2 7. 0 1 1 . 7 0. 5
3 7. 0 14. 4 0. 6
4 6. 9 1 6. 2 0. 7
[0123] 表 9の結果から明らかなように、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を可 溶性澱粉に作用させ、イソサイクロマルトオリゴ糖類を生成させたところ、イソサイクロ マルトオリゴ糖の生成率が 10%以上の場合でも、還元力の増加は 0. 1%程度とごく 僅かであることが判明した。このことは、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素 が本質的に転移'環化反応を触媒する酵素であり、それら反応に際してはほとんど加 水分解を伴わないことを意味している。澱粉やその分解物などに本酵素を作用させ、 イソサイクロマルトオリゴ糖類を生成させる際、反応前の澱粉やその分解物の還元力
、すなわち、 DEを低くしておけば、増加する還元力が僅かなため、還元力が低い生 成物が得られることがわ力つた。
[0124] <実験 13：イソサイクロマルトオリゴ糖の生成に及ぼすイソアミラーゼ及びプルラナ一 ゼの添加効果 >
澱粉部分分解物 (商品名『パインデッタス # 100』、松谷化学工業株式会社製)水 溶液 (最終濃度 lwZv%)を調製し、最終濃度 20mM酢酸緩衝液 (pH5. 5)と最終 濃度 ImM塩ィ匕カルシウムを加えた後、実験 5の方法で得た精製イソサイクロマルトォ リゴ糖生成酵素標品を固形物 1グラム当たり 1単位と、イソアミラーゼ (株式会社林原 生物化学研究所製造）を固形物 1グラム当りそれぞれ 0、 125、 250、 500、 1250又 は 2500単位加え、 45°C、 pH5. 5で 24時間作用させた後、 100°Cで 10分間熱処理 して酵素を失活させた。続いて、反応液を実験 1と同様に OC ダルコシダーゼ及びグ ルコアミラーゼで処理した後、 HPLCでイソサイクロマルトオリゴ糖を定量し、イソサイ クロマルトオリゴ糖生成率を求めた。また、イソアミラーゼに替えてプルラナーゼ (株式 会社林原生物化学研究所製造)を用い、固形物 1グラム当りそれぞれ 0、 1. 3、 2. 7 、 5. 3、 13. 3又は 26. 7単位カ卩えて同様の操作を行い、イソサイクロマルトオリゴ糖 生成率を求めた。それらの結果を表 10及び表 11に示す。
[表 10]
Figure imgf000043_0001
[0126] [表 11]
Figure imgf000043_0002
[0127] 表 10及び表 11の結果から明らかなように、イソアミラーゼ又はプルラナ一ゼを添カロ することによって、イソサイクロマルトオリゴ糖類の生成率が増加することが判明した。
[0128] <実験 14：イソサイクロマルトオリゴ糖の生成に及ぼす液化澱粉 DEの影響〉
とうもろこし澱粉を濃度 2質量％澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを 0. 1質量％加 えて pH6. 0に調整し、 α—アミラーゼ (ノボ社製造、商品名『ターマミール 60L』）を 澱粉グラム当り 0. 2、 0. 4、 0. 6、 1. 0、 1. 5又は 2. 0質量0 /0カロえ、それぞれ 95。Cで 10分間反応させ、次いで、 120°Cでオートクレーブし、約 40°Cに急冷して、 DE3. 1 乃至 20. 4の表 10に示す 6種類の澱粉液ィ匕液を得た。これらの澱粉液化液 (最終濃 度 1質量％)に、実験 5の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を 固形物 1グラム当たり 1単位カ卩え、 45°C、 pH6. 0で 48時間作用させた後、その反応 液を 10分間煮沸して反応を停止させた。これら熱失活させた反応液中のイソサイクロ マルトオリゴ糖類の生成量を調べるために、実験 1と同様にひ—ダルコシダーゼ及び ダルコアミラーゼを添加し反応させた後、 HPLCでイソサイクロマルトオリゴ糖を定量 し、イソサイクロマルトオリゴ糖生成率を求めた。それらの結果を表 12に示す。
[0129] [表 12]
Figure imgf000044_0001
[0130] 表 12の結果から明らかなように、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素によ るイソサイクロマルトオリゴ糖類の生成率は、液化澱粉の DEによって影響され、 DEが 低値であるほど、イソサイクロマルトオリゴ糖の生成率は高ぐ逆に、 DEが高値である ほど、イソサイクロマルトオリゴ糖の生成率が低いことが判明した。具体的には、液ィ匕 澱粉の DEは約 20以下、望ましくは、 DE約 8以下、更に望ましくは、 DE約 5以下が 適していることが判明した。
[0131] く実験 15 :イソサイクロマルトオリゴ糖の熱安定性〉
実験 11の方法で可溶性澱粉力 調製し、実験 1の方法で純度 100%まで精製して 得たイソサイクロマルトペンタオースを脱イオン水に溶解し、濃度 5wZv%のイソサイ クロマルトペンタオース溶液を調製した。その溶液 8mlをガラス製試験管に採り、密封 した後、 120°Cで 30乃至 90分間加熱した。放冷後、それら溶液の着色度の測定と、 HPLC法によるイソサイクロマルトペンタオースの純度測定を行った。着色度は 480η mにおける lcmセルでの吸光度とした。結果を表 13に示した。
[0132] [表 13] 着色度 純度
加熱時間 （分）
(A480nm) (%)
0 0. 00 100
30 0. 00 100
60 0. 00 100
90 0. 01 100
[0133] 表 13の結果から明らかなように、イソサイクロマルトペンタオース水溶液は 120°Cの 高温加熱においても着色せず、分解による純度低下も認められず、イソサイクロマル トペンタオースは熱に対して安定な糖質であることが判明した。
[0134] く実験 16 :イソサイクロマルトオリゴ糖の pH安定性〉
実験 15で用いたイソサイクロマルトペンタオースを各種緩衝液に溶解し、イソサイク 口マルトペンタオース濃度 4wZv%、 pHを 2乃至 10に調整した 9種類のイソサイクロ マルトペンタオース溶液を調製した。それぞれの溶液 8mlをガラス製試験管に採り、 密封した後、 100°Cで 24時間加熱した。放冷後、実験 15と同様にそれら溶液の着色 度の測定と、 HPLC法によるイソサイクロマルトペンタオースの純度測定を行った。結 果を表 14に示した。
[0135] [表 14]
Figure imgf000045_0001
表 14から明らかなように、イソサイクロマルトペンタオースは 100°C、 24時間の加熱 において、 pH5乃至 10の範囲で実質的に分解されず、弱酸性力もアルカリ性の広 い範囲で安定であることが分かった。し力しながら、 pH4では僅かに、 pH3では半分 以上が分解され、 pH2では完全に分解され消失した。
[0137] <実験 17 :ァミノカルボ-ル反応 >
実験 15で用いたイソサイクロマルトペンタオースと巿販試薬特級グリシンとを脱ィォ ン水に溶解し、さらに、リン酸緩衝液で ρΗ7. 0に調整した lw/v%グリシンを含む 5 wZvイソサイクロマルトペンタオース溶液を調製した。対照として、イソサイクロマルト ペンタオースの代わりにひ サイクロデキストリンを用いた以外は上記と同様にしてひ —サイクロデキストリン含有溶液を調製した。それぞれの溶液 4mlをガラス製試験管 に採り、密封した後、 120°Cで 30乃至 90分間加熱した。室内で放冷後、それらの着 色度を測定しァミノカルボ-ル反応性を調べた。同時にグリシンのみを含む溶液を同 様に加熱しブランクとした。着色度は 480nmにおける lcmセルでの吸光度とし、ブラ ンクの値を差し引 、た値とした。結果を表 15に示す。
[0138] [表 15]
Figure imgf000046_0001
[0139] 表 15の結果から明らかなように、イソサイクロマルトペンタオースは着色度の上昇を 示さず、対照の a サイクロデキストリンと同様にグリシン共存下で加熱しても着色、 褐変を起こしにく 、、ァミノカルボ-ル反応性の低 、安定な糖質であることが分かつ た。
[0140] <実験 18 :ァミノカルボ-ル反応 >
実験 15で用いたイソサイクロマルトペンタオースと巿販ポリペプトン（日本製薬製）と を脱イオン水に溶解し、 5w/v%ポリペプトンを含む 5w/vイソサイクロマルトペンタ オース溶液を調製した。対照として、イソサイクロマルトペンタオースの代わりに a サイクロデキストリンを用いた以外は上記と同様にして α—サイクロデキストリン（α—
CD)含有溶液を調製した。それぞれの溶液 4mlをガラス製試験管に採り、密封した 後、 120°Cで 30乃至 90分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しアミ ノカルボ-ル反応性を調べた。同時にポリペプトンのみを含む溶液を同様に加熱し ブランクとした。着色度は 480nmにおける lcmセルでの吸光度とし、ブランクの値を 差し引いた値とした。結果を表 16に示す。
[0141] [表 16]
Figure imgf000047_0001
[0142] 表 16の結果から明らかなように、イソサイクロマルトペンタオースの着色度はわずか であり、対照の a—サイクロデキストリンと同様に、ポリペプトン共存下で加熱しても着 色、褐変を起こしにくい、ァミノカルボニル反応性の低い安定な糖質であることが分か つた o
[0143] <実験 19：イソサイクロマルトオリゴ糖の包接作用 >
実験 15で用 、たイソサイクロマルトペンタオースを脱イオン水に溶解し、 20質量0 /0 水溶液を調製した。その水溶液 20ml当たりに、香気成分の具体例として、メタノール 、エタノール、プロパノール及びブタノールの 4種短鎖アルコール、酢酸、プロピオン 酸、 n 酪酸及び n—吉草酸の 4種短鎖脂肪酸、及び、ベンジルアルコール、フ ネ チルアルコール、 4 フエ-ル 1 プロパノール及び o—タレゾールの 4種芳香族化 合物をそれぞれイソサイクロマルトペンタオースに対してモル換算で 3倍量カ卩えて均 一に攪拌し包接させた。その後、それぞれを濾過し、濾液を凍結乾燥して未包接物 を除去した。凍結乾燥物中の包接物量を測定するために、それぞれの凍結乾燥物 について化合物をガスクロマトグラフィー法にて定量した。対照として α—サイクロデ キストリン（a—CD)を用い、同様に試験した。結果を表 17に示す。
[0144] [表 17] 包接量 （mg/g_凍結乾燥物）
包接物 イソサイクロマルト
a-CD ペンタオース
メタノール 33.5 16.7 短鎖 エタノール 57.6 36.7 アルコール プロパノール 69.2 66.8
ブタノール 82.7 79.5 酢酸 82.4 15.1 短鎖 プロピオン酸 91.4 16.6 脂肪酸 n—酪酸 69.9 13.2
n_吉草酸 48.3 45.0 ベンジルアルコール 61.9 165.7 フエネチルアルコール 10.0 144.4 芳香族化合物
4-フエニル 1-プロパノール 225.2 171.5 o—クレゾール 151.5 49.5
[0145] 表 17の結果から明らかなように、イソサイクロマルトペンタオースは、短鎖アルコー ル、短鎖脂肪酸及び芳香族化合物など各種化合物の包接能を有して!/ヽることが分 かった。メタノール、エタノール、酢酸、プロピオン酸、 n—酪酸の包接量に関しては、 a—サイクロデキストリンよりもイソサイクロマルトペンタオースの方が多かった。イソサ イク口マルトペンタオースは芳香族化合物の包接能も示したものの、その包接量は包 接される化合物の種類によって大きく異なった。
[0146] <実験 20：イソサイクロマルトオリゴ糖の消化性試験〉
実験 15で用 、たイソサイクロマルトペンタオースについて、 日本栄養食糧学会誌、 第 43卷、第 23乃至 29頁（1990)に記載の岡田らの方法に準じて、試験管内での唾 液アミラーゼ、人工胃液、脾液アミラーゼ、及び小腸粘膜酵素による消化性を調べた 。対照として、同じく環状糖質である α—、 j8—、及び γ—サイクロデキストリンを用い 、同様に消化性を調べた。結果を表 18に示す。なお、表中の分解率 (％)は、上記の 各消化反応において、式、分解率(％) = { (反応液中の還元糖量) Ζ (反応液中の 全糖量） } X 100で算出される値を意味する。
[0147] [表 18] 分解率 （％)
消化酵素 イソサイクロマルト
a - C D* 3 - C D r - C D ペンタオース
唾液アミラーゼ 0 0 0 0. 1 人工胃液 0 0 0 0 滕液アミラーゼ 0 0 0. 2 5. 4 小腸粘膜酵素 0. 2 0. 2 1. 1 57. 4
* :サイクロデキストリン
[0148] 表 18の結果から明らかなように、イソサイクロマルトペンタオースは、 a 及び j8— サイクロデキストリンと同様に、唾液アミラーゼ、人工胃液、脾液アミラーゼ、及び小腸 粘膜酵素のいずれによっても実質的に消化されないことが判明した。一方、 γ—サイ クロデキストリンは脾液アミラーゼ及び小腸粘膜酵素により部分的に消化された。イソ サイクロマルトペンタオースは難消化性の糖質であった。
[0149] <実験 21 :急性毒性試験 >
実験 15で用 、たイソサイクロマルトペンタオースをマウスに経口投与して、急性毒 性試験を行った。その結果、イソサイクロマルトペンタオースは低毒性の物質で、投 与可能な最大投与量においても死亡例は認められず、その LD 値は、 5gZkg—マ
50
ウス体重以上であった。
[0150] 以下、実施例によりさらに詳細に本発明を説明する。し力しながら、本発明はこれら 実施例により限定されるものではない。
[0151] 〈実施例 1〉
バチルス 'サーキュランス AM7 (FERM BP— 10111)を実験 1の方法に準じて 、種培養した。続いて、容量 30Lのフアーメンターに、澱粉部分分解物（商品名『パイ ンデッタス # 4』、松谷化学工業株式会社製造） 1. 5wZv%、酵母抽出物 (商品名『 ポリペプトン』、 日本製薬株式会社製造) 0. 5wZv%、酵母抽出物 (商品名『酵母ェ キス S』、 日本製薬株式会社製造) 0. lwZv%、リン酸二カリウム 0. lwZv%、リン酸 一ナトリウム · 2水和物 0. 06wZv%、硫酸マグネシウム · 7水和物 0. 05wZv%、炭 酸カルシウム 0. 3wZv%、及び水からなる液体培地を約 20L入れて、加熱滅菌、冷 却して温度 27°Cとした後、種培養液 1νΖν%を接種し、温度 27°C、 pH5. 5乃至 8. 0に保ちつつ、 96時間通気培養した。培養後、 SF膜を用いて除菌濾過し、約 18Lの 培養濾液を回収し、更に、その濾液を UF膜濃縮し、 0. 41単位 Zmlの本発明のイソ サイクロマルトオリゴ糖生成酵素を含む濃縮酵素液約 1Lを回収した。
[0152] 〈実施例 2〉
馬鈴薯澱粉乳を濃度約 1質量％澱粉乳とし、これに最終濃度 ImMとなるように塩 化カルシウムをカ卩え、 pH6. 0に調整し、 95°Cに約 20分間加熱して糊化を行い、次 Vヽで約 40°Cに冷却し、これに実施例 1の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖生成 酵素を含む濃縮酵素液を澱粉固形物 1グラム当り 2. 44ml (約 1単位)の割合になる ように加え、 pH6. 0、温度 40°Cで 48時間反応させた。その反応液を 95°Cに加熱し 30分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し 、 H型及び OH型イオン交換榭脂により脱塩して精製し、更に、濃縮して濃度 65質量 %のイソサイクロマルトオリゴ糖含有シラップを固形物当たり収率約 90%で得た。本 品は、固形物当たり、イソサイクロマルトオリゴ糖類を 27. 5質量％、その他の糖質を 7 2. 5質量％含有しており、低還元性で、適度の粘度を有し、甘味料、呈味改良剤、 品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材など として、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
[0153] 〈実施例 3〉
タピオ力澱粉を濃度約 1質量％澱粉乳とし、これに濃度 0. 1質量％となるように炭 酸カルシウムをカ卩え、 pH6. 0に調整し、これに α—アミラーゼ (ノボ社製造、商品名『 ターマミール 60L』）を澱粉固形物グラム当り 0. 2質量％になるようにカ卩え、 95°Cで 1 0分間反応させ、次いで 120°Cに 20分間オートクレーブし、更に約 40°Cに急冷して DE約 3の液化溶液を得、これに実施例 1の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖生 成酵素を含む濃縮液を澱粉固形物 1グラム当り 2. 44ml (約 1単位)とイソアミラーゼ（ 株式会社林原生物化学研究所製造)を澱粉固形物 1グラム当り 1000単位の割合に なるように加え、 pH6. 0、温度 40°Cで 48時間反応させた。その反応液を 95°Cに加 熱し 30分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱 色し、 H型及び OH型イオン交換榭脂により脱塩して精製し、更に濃縮して、固形物 当りイソサイクロマルトオリゴ糖類を 31. 5%含む濃度 60質量％のシラップを得た。得 られたシラップを糖液として、強酸性カチオン交換榭脂 (アンバーライト CR— 1310、 Na型、オルガノ株式会社製造)を用いたカラム分画を行なった。榭脂を内径 5. 4cm のジャケット付きステンレス製カラム 4本に充填し、直列につなぎ榭脂層全長 20mとし た。カラム内温度 60°Cに維持しつつ、糖液を榭脂に対して 5vZv%加え、これに 60 °Cの温水を SVO. 13で流して分画し、溶出液の糖組成を HPLC法でモニターし、ィ ソサイクロマルトオリゴ糖含有画分を含む低分子画分を採取し、精製し、濃縮し、噴霧 乾燥して、イソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末を固形物当たり収率約 54%で得た。 本品は、固形物当たり、イソサイクロマルトオリゴ糖類を 51. 5質量％、その他の糖質 を 48. 5質量％含有しており、低還元性で、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離 水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、 医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
〈実施例 4〉
トウモロコシ澱粉を濃度約 1質量％澱粉乳とし、これに濃度 0. 1質量％となるように 炭酸カルシウムをカ卩え、 pH6. 0に調整し、これに α—アミラーゼ（商品名『ネオスピタ 一ゼ』、ナガセ生化学工業株式会社製)を澱粉固形物グラム当り 0. 2%になるように 加え、 85乃至 90°Cで 20分間反応させ、次いで 120°Cに 20分間オートクレーブし、 更に約 40°Cに急冷して DE約 3の液ィ匕溶液を得、これに実施例 1の方法で得たイソ サイクロマルトオリゴ糖生成酵素を含む濃縮液を滅粉固形物 1グラム当り 2. 44ml (約 1単位)とイソアミラーゼ (株式会社林原生物化学研究所製造)を澱粉固形物 1グラム 当り 1000単位の割合になるように加え、 pH6. 0、温度 40°Cで 48時間反応させた。 その反応液を 95°Cに加熱し 30分間保った後、 pH5. 0、温度 50°Cにし、それに α— ダルコシダーゼ (商品名『トランスダルコシダーゼ L「ァマノ」』、天野ェンザィム株式会 社製)を澱粉 1グラム当り 1000単位及びダルコアミラーゼ（商品名『ダルコチーム』、 ナガセ生化学工業株式会社製)を澱粉 1グラム当り 100単位の割合になるように加え 、 ρΗ5. 0、温度 50°Cで 16時間反応させた。その反応液を 95°Cに加熱し 30分間保 つた後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、 H型及 び OH型イオン交換榭脂により脱塩して精製し、更に濃縮して、濃度 60質量％のイソ サイクロマルトオリゴ糖含有シラップを固形物当たり収率約 95%で得た。本品は、固 形物当たり、イソサイクロマルトオリゴ糖類 32. 6質量0 /0、グルコース 63. 0質量0 /0、及 びその他の糖質を 4. 4質量％含有しており、低還元性で、適度の粘度を有し、甘味 料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤 、粉末ィ匕基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利 用できる。
[0155] 〈実施例 5〉
実施例 4の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有シラップを、オートクレープに 入れ、触媒としてラネーニッケルを固形分に対し約 9質量％添加し、攪拌しながら温 度を 130°Cに上げ、水素圧を 75kgZcm2に上げて水素添カ卩して、イソサイクロマルト オリゴ糖含有シラップに含まれるグルコース及びその他の還元性糖質を、それらの糖 アルコールに変換した。この反応液力 ラネーニッケルを除去し、常法により脱色、脱 塩して精製し、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、イソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末を 固形物当たり収率約 90%で得た。本品は、固形物当たり、イソサイクロマルトオリゴ糖 32. 5質量％、ソルビトール 63. 2質量％、及びその他の糖アルコールを 4. 3質量0 /0 含有しており、実質的に還元力を示さず、ァミノカルボニル反応を起こしにくぐ甘味 料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤 などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
[0156] <実施例 6 :甘味料 >
実施例 3の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末 0. 8質量部に、トレハロ ース含水結晶 (株式会社林原商事販売、登録商標『トレハ』) 0. 2質量部、 α—グリコ シルステビオシド (東洋精糖株式会社販売、商品名『ひ Gスイート』) 0. 01質量部、お よび L ァスパルチル L フエ-ルァラニンメチルエステル（商品名『ァスパルテー ム』) 0. 01質量部を均一に混合し、顆粒成型機にかけて顆粒状甘味料を得た。本品 は、甘味の質が優れ、蔗糖の約 2倍の甘味度を有している。本品は、室温保存下、変 質劣化の懸念も無く安定な甘味料として好適である。
[0157] <実施例 7 :ハードキャンディー >
濃度 55%蔗糖溶液 100質量部に実施例 4の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖 含有シラップ 50質量部を加熱混合し、次 、で減圧下で水分 2%未満になるまで加熱 濃縮し、これにクェン酸 0. 6質量部および適量のレモン香料と着色料とを混和し、常 法に従って成型し、製品を得た。本品は歯切れ、呈味、風味とも良好で、蔗糖の晶出 も起こさず、吸湿性少なぐダレも起こさない安定で高品質のハードキャンディーであ る。
[0158] <実施例 8 :チューイングガム >
ガムベース 3質量部を柔ら力べなる程度に加熱溶融し、これに無水マルチトール 2質 量部、キシリトール 2質量部、実施例 5の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有 粉末 2質量部、およびトレハロース含水結晶 1質量部を加え、更に適量の香料と着色 料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成型、包装して製品を得た。 本品は、テクスチャー、呈味、風味良好で、低う蝕性、低カロリーのチューイングガム として好適である。
[0159] <実施例 9 :加糖練乳 >
原乳 100質量部に実施例 2の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有シラップ 4 質量部および蔗糖 2重量を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度 70 %に濃縮し、無菌状態で缶詰して製品を得た。本品は、温和な甘味で風味も良ぐフ ルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に有利に利用できる。
[0160] <実施例 10 :乳酸菌飲料 >
脱脂粉乳 175質量部、実施例 3の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末 1 00質量部およびラ外スクロース高含有粉末 (株式会社林原商事販売、登録商標『 乳果オリゴ』）を水 1、 500質量部に溶解し、 65°Cで 30分間殺菌し、 40°Cに冷却後、 これに、常法に従って、乳酸菌のスターターを 30質量部植菌し、 37°Cで 8時間培養 して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好で、オリゴ糖、イソサイクロマルトオリゴ糖 を含有し、乳酸菌を安定に保つだけでなぐビフィズス菌増殖促進作用、整腸作用を 有する乳酸菌飲料として好適である。
[0161] <実施例 11 :粉末ジュース >
噴霧乾燥により製造したオレンジ果汁粉末 33質量部に対して、実施例 5の方法で 得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末 50質量部、無水結晶マルチトール 10質量 部、無水クェン酸 0. 65質量部、リンゴ酸 0. 1質量部、 2-0- a ダルコシルー L ーァスコルビン酸 0. 2質量部、クェン酸ソーダ 0. 1質量部、プルラン 0. 5質量部およ び粉末香料の適量をよく混合攪拌し、粉砕し微粉末にして、これを流動層造粒機に 仕込み、排風温度 40°Cとし、これに実施例 2の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖 含有シラップをバインダーとして適量スプレーし、 30分間造粒し、計量し、包装して製 品を得た。本品は、果汁含有率約 30%の粉末ジュースである。又、本品は、異味、 異臭がなぐ高品質で、低カロリーのジュースとして商品価値の高いものである。
[0162] <実施例 12 :カスタードクリーム >
コーンスターチ 100質量部、実施例 2の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有 シラップ 100質量部、トレハロース含水結晶 60質量部、蔗糖 40質量部、および食塩 1質量部を充分に混合し、鶏卵 280質量部を加えて攪拌し、これに沸騰した牛乳 1、 000質量部を徐々に加え、更に火にかけて攪拌を続け、コーンスターチが完全に糊 化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料をカロ え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、なめらかな光沢を有し、風味良好で 、澱粉の老化も抑制され、高品質のカスタードクリームである。
[0163] <実施例 13 :ハム >
豚もも肉 1、 000質量部に食塩 15質量部および硝酸カリウム 3質量部を均一にすり 込んで、冷室に 1昼夜堆積する。これを水 500質量部、食塩 100質量部、硝酸力リウ ム 3質量部、実施例 5の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末 40質量部お よび香辛料力 なる塩漬液に冷室で 7日間漬け込み、次いで、常法に従い、冷水で 洗浄し、ひもで巻き締め、薫煙し、クッキングし、冷却、包装して製品を得た。本品は、 色合いもよぐ風味良好な高品質のハムである。
[0164] <実施例 14：粉末ペプチド >
40%食品用大豆ペプチド溶液 (不二製油株式会社販売、商品名『ハイ-ユート S』） 1質量部に、実施例 3の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末 2質量部を混 合し、プラスチック製バットに入れ、 50°Cで減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを得 た。本品は風味良好で、プレミックス、冷菓などの低カロリー製菓材料として有用であ るのみならず、経口流動食、経管流動食のための難消化性の食物繊維、整腸剤量と しても有用である。
[0165] <実施例 15 :化粧用クリーム > モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール 2質量部、 自己乳化型モノステアリン 酸グリセリン 5質量部、実施例 5の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末 2質 量部、 oc ダルコシル ルチン (株式会社林原販売、商品名《Gルチン） 1質量部、 流動パラフィン 1質量部、トリオクタン酸グリセリン 10質量部および防腐剤の適量を常 法に従って加熱溶解し、これに L 乳酸 2質量部、 1、 3 ブチレングリコール 5質量 部および精製水 66質量部をカ卩え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を 加えて攪拌混合し、化粧用クリームを製造した。本品は、抗酸ィ匕性を有し、安定性は 高ぐ高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
[0166] <実施例 16 :練歯磨 >
第二リン酸カルシウム 45質量部、ラウリル硫酸ナトリウム 1. 5質量部、グリセリン 25 質量部、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート 0. 5質量部、実施例 3の方法で得た イソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末 10質量部、サッカリン 0. 02質量部を水 18質量 部と混合して練歯磨を得た。本品は、界面活性剤の洗浄力を落とすことなぐ嫌味を 改良し、使用後感も良好である。
[0167] <実施例 17 :流動食用固体製剤 >
実施例 2の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有シラップ 100質量部、トレハロ ース含水結晶 200質量部、マルトテトラオース高含有粉末 200質量部、粉末卵黄 27 0質量部、脱脂粉乳 209質量部、塩ィ匕ナトリウム 4. 4質量部、塩ィ匕カリウム 1. 8質量 部、硫酸マグネシウム 4質量部、チアミン 0. 01質量部、 Lーァスコルビン酸ナトリウム 0. 1質量部、ビタミン Eアセテート 0. 6質量部およびニコチン酸アミド 0. 04質量部か らなる配合物を調製し、この配合物 25グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒ ートシールして製品を得た。本品は、流動食として経口的、または鼻腔、胃、腸など へ経管的使用方法により利用され、生体へのエネルギー補給用に有利に利用できる
[0168] <実施例 18 :外傷治療用膏薬 >
実施例 5の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末 100質量部およびマルト ース 300質量部に、ヨウ素 3質量部を溶解したメタノール 50質量部を加え混合し、更 に 10wZv%プルラン水溶液 200質量部をカ卩えて混合し、適度の延び、付着性を示 す外傷治療用膏薬を得た。本品は、経時変化が少ない商品価値の高い膏薬である 。又、本品は、ヨウ素による殺菌作用のみならず、マルトースによる細胞へのエネルギ 一補給剤としても作用することから治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。 産業上の利用可能性
[0169] 本発明によれば、従来未知であった下記の一般式 1で表される構造を有する新規 なイソサイクロマルトオリゴ糖を、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を用いて大量に 製造し、提供することが可能となる。全く新規なイソサイクロマルトオリゴ糖の提供を可 能とする本発明は、飲食物、化粧品、医薬品など種々の利用分野に貢献することとな り、その産業的意義はきわめて大きい。
[0170] 一般式 1 :
[化 4] yc/o {→6)-[a-D-Glc/7-(l→4)]n-a-D-Glc/?-(l→}
(nは 4又は 5を意味する）

Claims

請求の範囲 [1] 一般式 1で表される構造を有するイソサイクロマルトオリゴ糖。 一般式 1 :
[化 1]
Cjc/o {→6)-[a-D-Glc -(l→4)]n-a-D-Glcp-(l→}
(nは 4又は 5を意味する）
[2] 請求の範囲第 1項記載のイソサイクロマルトオリゴ糖とともに他の糖質を含んでなる イソサイクロマルトオリゴ糖含有糖質。
[3] 形態が、シラップ、粉末又は固状物のいずれかであることを特徴とする請求の範囲 第 2項記載のイソサイクロマルトオリゴ糖含有糖質。
[4] グルコース重合度が 3以上の a— 1, 4グルカンに作用し、一般式 1で表される構造 を有するイソサイクロマルトオリゴ糖を生成する作用を有するイソサイクロマルトオリゴ 糖生成酵素。
一般式 1 :
[化 2]
Cyc/o {→6)-[a-D-Glc -(l→4)]n-a-D-Glcp-(l→} (nは 4又は 5を意味する）
[5] 下記の理ィ匕学的性質を有する請求の範囲第 4項記載のイソサイクロマルトオリゴ糖 生成酵素。
(1)分子量
SDS—ゲノレ電気泳動法【こお!ヽて、約 106, 000 ± 20,000ダノレトン。
(2)等電点
アンフォライン含有等電点電気泳動法において、 pI7. 5±0. 5。
(3)至適温度
pH6. 0、 30分間反応の条件下で、 50乃至 55°C。 (4)至適 pH
30°C、 30分間反応の条件下で、 pH4. 5乃至 8. 0。
(5)温度安定性
pH6. 0、 60分間保持の条件下で、 35°Cまで安定。
ImMカルシウムイオン存在下では、 40°Cまで安定。
(6) pH安定性
4°C、 24時間保持の条件下で、 pH4. 5乃至 9. 0で安定。
[6] 配列表における配列番号 1で示されるアミノ酸配列を N末端アミノ酸配列として有す る請求の範囲第 4項又は第 5項記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素。
[7] 配列表における配列番号 2で示されるアミノ酸配列力 又は配列表における配列番 号 2で示されるアミノ酸配列において、その酵素活性を保持する範囲で 1個又は 2個 以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する請求の範囲第 4 項乃至第 6項のいずれかに記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素。
[8] グルコース重合度が 3以上の α— 1, 4グルカン力 マルトオリゴ糖、マルトデキストリ ン、アミロデキストリン、アミロース、アミ口べクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉及 びグリコーゲン力 選ばれる 1種又は 2種以上の糖質である請求の範囲第 4項乃至第 7項のいずれかに記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素。
[9] イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素が、微生物由来の酵素である請求の範囲第 4 項乃至第 8項のいずれかに記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素。
[10] 微生物が、バチルス属に属する微生物である請求の範囲第 9項記載のイソサイクロ マルトオリゴ糖生成酵素。
[11] バチルス属に属する微生物力 バチルス 'サーキュランス（Bacillus circulans)A M7 (独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、寄託番号 FER M BP— 10111)又はその変異株である請求の範囲第 10項記載のイソサイクロマル トオリゴ糖生成酵素。
[12] バチルス ·サーキュランス (Bacillus circulans) AM7 (独立行政法人産業技術総 合研究所 特許生物寄託センター、寄託番号 FERM BP— 10111)又はその変異 株である請求の範囲第 4項乃至第 11項のいずれかに記載のイソサイクロマルトオリゴ 糖生成酵素産生能を有する微生物。
[13] 請求の範囲第 4項乃至第 11項のいずれかに記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成 酵素をコードする DNA。
[14] 配列表における配列番号 3で示される塩基配列力 又は配列表における配列番号
3で示される塩基配列において、コードする酵素の活性を保持する範囲で 1個又は 2 個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列、又はそれらに相補的な塩基 配列を有する請求の範囲第 13項記載の DNA。
[15] 遺伝子コードの縮重に基づき、コードするアミノ酸配列を変えることなぐ配列表に おける配列番号 3で示される塩基配列における塩基の 1個又は 2個以上を他の塩基 で置換した請求の範囲第 13項又は第 14項記載の DNA。
[16] バチルス属の微生物に由来する請求の範囲第 13項乃至第 15項の 、ずれかに記 載の DNA。
[17] 請求の範囲第 13項乃至第 16項のいずれかに記載の DNAと、自律複製可能なベ クタ一を含んでなる複製可能な組換え DNA。
[18] 自律複製可能なベクターがプラスミドベクター pBluescript II SK( + )である請 求の範囲第 17項記載の組換え DNA。
[19] 請求の範囲第 17項又は第 18項記載の組換え DNAを適宜の宿主に導入してなる 形質転換体。
[20] 宿主が大腸菌である請求の範囲第 19項記載の形質転換体。
[21] 請求の範囲第 4項乃至第 11項のいずれかに記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成 酵素の産生能を有する微生物を栄養培地で培養して得られる培養物から、請求の範 囲第 4項乃至第 11項のいずれかに記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を採 取することを特徴とするイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の製造方法。
[22] 請求の範囲第 19項又は第 20項記載の形質転換体を培養し、培養物力も組換え型 イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を採取することを特徴とする組換え型イソサイクロ マルトオリゴ糖生成酵素の製造方法。
[23] グルコース重合度が 3以上の α— 1, 4グルカンを含有する溶液に、請求の範囲第 4項乃至第 11項のいずれかに記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素力 又は請 求の範囲第 12項記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素産生能を有する微生物 を作用させることを特徴とする一般式 1で表される構造を有するイソサイクロマルトオリ ゴ糖の生成方法。
一般式 1 :
[化 3]
Cjc/ {→6)-[a-D-Glc/7-(l→4)]n-a-D-Glc/?-(l→}
(nは 4又は 5を意味する）
[24] グルコース重合度が 3以上の a 1, 4グルカン力 マルトオリゴ糖、マルトデキストリ ン、アミロデキストリン、アミロース、アミ口べクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉及 びグリコーゲン力 選ばれる 1種又は 2種以上の糖質である請求の範囲第 23項記載 のイソサイクロマルトオリゴ糖の生成方法。
[25] 澱粉を糊化及び Z又は液ィ匕した溶液に、請求の範囲第 4項乃至第 11項のいずれ 力に記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を作用させることを特徴とする一般式 1で表される構造を有するイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれを含む糖組成物の製造 方法。
一般式 1 :
[化 4]
Cjc/o {→6)-[a-D-Glc/?-(l→4)]n-a-D-Glc/?-(l→} (nは 4又は 5を意味する）
[26] 澱粉を糊化及び Z又は液化した溶液が、 DE20以下の溶液である請求の範囲第 2 5項記載のイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれらを含む糖組成物の製造方法。
[27] 澱粉を糊化及び Z又は液ィ匕した溶液に、請求の範囲第 4項乃至第 11項のいずれ かに記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素とともにイソアミラーゼ又はプルラナ ーゼを作用させ、必要に応じて、更に a—アミラーゼ、 13 アミラーゼ、サイクロマル トデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ダルコアミラーゼ、 a—ダルコシダーゼから 選ばれる 1種又は 2種以上の酵素を作用させることを特徴とする請求の範囲第 25項 又は第 26項記載のイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれらを含む糖組成物の製造方 法。
[28] 澱粉を糊化及び Z又は液ィ匕した溶液に、請求の範囲第 4項乃至第 11項のいずれ かに記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素とともにイソアミラーゼ又はプルラナ ーゼを作用させ、必要に応じて、更に α—アミラーゼ、 13 アミラーゼ、サイクロマル トデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ダルコアミラーゼ、 α—ダルコシダーゼから 選ばれる 1種又は 2種以上の酵素を作用させた後、カラムクロマトグラフィーによる分 画、膜による分離、微生物による発酵処理及びアルカリ処理による分解除去から選 ばれる 1種又は 2種以上の精製方法を用いることを特徴とする請求の範囲第 25項乃 至第 27項のいずれか〖こ記載のイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれらを含む糖組成 物の製造方法。
[29] 請求の範囲第 1項記載のイソサイクロマルトオリゴ糖、又は請求の範囲第 2項又は 第 3項記載のイソサイクロマルトオリゴ糖含有糖質を含有せしめてなる飲食物、化粧 品又は医薬品。
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