KR20070083773A - 이소사이클로말토올리고당 및 이소사이클로말토올리고당생성 효소와 이들의 제조 방법 및 용도 - Google Patents
이소사이클로말토올리고당 및 이소사이클로말토올리고당생성 효소와 이들의 제조 방법 및 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20070083773A KR20070083773A KR1020077009259A KR20077009259A KR20070083773A KR 20070083773 A KR20070083773 A KR 20070083773A KR 1020077009259 A KR1020077009259 A KR 1020077009259A KR 20077009259 A KR20077009259 A KR 20077009259A KR 20070083773 A KR20070083773 A KR 20070083773A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- isocyclomaltooligosaccharide
- enzyme
- thr
- gly
- ala
- Prior art date
Links
- 0 OCC([C@](C(C12)O)O[C@](C(C3O)O)OC(CO)[C@]3O[C@@](C(C3O)O)OC(CO)[C@@]3O[C@](C3O)OC4CO)O[C@@]1*2C([C@](C(C1O)O)O)O[C@@]1O[C@]4C3O Chemical compound OCC([C@](C(C12)O)O[C@](C(C3O)O)OC(CO)[C@]3O[C@@](C(C3O)O)OC(CO)[C@@]3O[C@](C3O)OC4CO)O[C@@]1*2C([C@](C(C1O)O)O)O[C@@]1O[C@]4C3O 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
- C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
- A23L29/30—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols, e.g. xylitol; containing starch hydrolysates, e.g. dextrin
- A23L29/35—Degradation products of starch, e.g. hydrolysates, dextrins; Enzymatically modified starches
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/20—Reducing nutritive value; Dietetic products with reduced nutritive value
- A23L33/21—Addition of substantially indigestible substances, e.g. dietary fibres
- A23L33/25—Synthetic polymers, e.g. vinylic or acrylic polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Birds (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Jellies, Jams, And Syrups (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
글루코오스를 구성당으로 하는 신규의 비환원성 당질을 제공하고, 비환원성 당질의 선택의 폭을 넓힘과 아울러 이 비환원성 당질을 생성하는 신규 효소와, 그것들의 생성 방법 및 제조 방법, 이 효소를 코드하는 DNA, 이것을 함유해서 된 재조합 DNA 및 형질 전환체, 및 이 비환원성 당질을 함유해서 된 조성물과 그 용도를 제공하는 것을 과제로 하고, 아래의 일반식 1로 나타내어지는 구조를 가진 이소사이클로말토올리고당과, 그것들을 생성하는 신규의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소와 그것들의 생성 방법 및 제조 방법, 더욱이는 이 효소를 코드하는 DNA와 이것을 함유해서 된 재조합 DNA 및 형질 전환체, 및 이소사이클로말토올리고당 또는 이것을 함유하는 당질을 함유시켜서 된 조성물과 그 용도를 제공함으로써 상기 과제를 해결한다.
일반식 1:
Cyclo{→6)-[α-D-Glcp -(1→4)]n-α-D-Glcp -(1→}
(위의 식에서 n은 4 또는 5를 의미한다.)
Description
본 발명은, 일반식 1로 나타내어지는 구조를 가진 이소사이클로말토올리고당 및 이소사이클로말토올리고당 생성 효소와 이들의 제조 방법 및 용도에 관한 것으로서, 상세히는, 일반식 1로 나타내어지는 구조를 가진 이소사이클로말토올리고당 및 이소사이클로말토올리고당 생성 효소와 그 제조 방법, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 산생하는 미생물, 이 효소를 코드하는 DNA와 이것을 함유해서 된 재조합 DNA와 형질 전환체, 이 효소를 이용한 이소사이클로말토올리고당의 생성 방법과 제조 방법, 및 이소사이클로말토올리고당을 함유해서 된 조성물에 관한 것이다.
일반식 1:
Cyclo{→6)-[α-D-Glcp -(1→4)]n-α-D-Glcp -(1→}
(위의 식에서 n은 4 또는 5를 의미한다.)
글루코오스를 구성당으로 하는 당질로서는, 예를 들면, 전분을 원료로 해서 제조되는 전분 부분 분해물인 아밀로오스, 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 말토올 리고당, 이소말토올리고당 등이 알려져 있다. 이들 당질은, 통상적으로, 분자의 한쪽 끝에 비환원성 말단을 가지고, 다른 쪽 끝에 환원성 말단을 가지며, 환원성을 나타내는 것이 알려져 있다. 일반적으로, 전분 부분 분해물은, 그 고형물 당(當)의 환원력의 크기를 덱스트로오스 이퀴발렌트(Dextrose Equivalent, DE)로서 나타내어진다. 이 값이 큰 것은, 통상적으로, 분자가 작고, 저점도이며, 감미(甘味)가 강하지만, 반응성이 강하여, 아미노산이나 단백질 등의 아미노기를 가진 물질과 아미노카르보닐 반응을 일으키기 쉽고, 갈변하며, 악취를 발생하여, 품질을 열화(劣化)하기 쉬운 성질이 있는 것이 알려져 있다.
이와 같은 결점을 개선하기 위해서, 그 환원력을 저감 혹은 소멸시키는 간편한 방법이 옛날부터 요망되고 있었다. 예를 들면, 문헌[Journal of American Chemical Society, 미국, 1949년, 제71권, 353 내지 358 페이지]에 개시되어 있는 바와 같이, 전분에 마세란스 아밀라아제(macerans amylase)를 작용시킴으로써, 6 내지 8분자의 글루코오스가 α-1,4 글루코시드 결합에 의해 환상 구조를 형성한 α-, β- 또는 γ-사이클로덱스트린을 생성시키는 방법이 알려져 있다. 현재로서는, 전분으로부터 이들 사이클로덱스트린이 공업적 규모로 생산되고, 이들 사이클로덱스트린은 이들이 가진 비환원성이고, 무미(無味)하며, 포접능(包接能)을 가지는 등의 특성을 살린 용도에 이용되고 있다.
또한, 먼저, 본 출원인이 일본국 특개평7-143876호 공보, 일본국 특개평7-213283호 공보 등에 개시한 바와 같이, 말토올리고당 등의 전분 부분 분해물에 비환원성 당질 생성 효소 및 트레할로오스 유리 효소를 작용시킴으로써, 2분자의 글 루코오스가 α,α-1,1 결합한 트레할로오스를 생성시키는 방법도 알려져 있다. 현재로서는, 전분으로부터 트레할로오스가 공업적 규모로 생산되고, 그 비환원성 및 온화하고 고품질의 감미 특성 등을 살린 용도에 이용되고 있다. 더욱이, 먼저, 본 출원인이 국제공개 WO Ol/90338 Al호 명세서, 국제공개 WO O2/055708 Al호 명세서, 국제공개 WO O2/40659 Al호 명세서 등에서 개시한 바와 같이, 전분 또는 그 부분 분해물에 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이 효소를 작용시킴으로써, 4분자의 글루코오스가 α-1,3 글루코시드 결합 및 α-1,6 글루코시드 결합에 의해 교대로 결합한 구조, 즉, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당을 생성시키는 방법도 알려져 있다.
더욱이, 먼저, 본 출원인이 일본국 특개2005-95148호 공보에 개시한 바와 같이, 전분 또는 그 부분 분해물에 환상 말토실말토오스 생성 효소를 작용시킴으로써, 4분자의 글루코오스가 α-1,4 글루코시드 결합 및 α-1,6 글루코시드 결합에 의해 교대로 결합한 구조, 즉, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당(별명, 환상 말토실말토오스)을 생성시키는 방법도 알려져 있다. 이들 환상 4당은 환상 구조를 가지기 때문에 포접능(包接能)을 가지고, 휘발성 유기물을 안정화하는 작용을 나타냄과 아울러, 비환원성의 당질이기 때문에 아미노카르보닐 반응을 일으키지 않고, 갈변, 열화를 우려함이 없이 이용, 가공할 수 있는 것이 기대된다.
이와 같이, 글루코오스를 구성당으로 하는 비환원성 당질로서, 글루코오스 중합도가 6 내지 8인 α-, β-, γ-사이클로덱스트린, 글루코오스 중합도가 2인 α,α-트레할로오스, 글루코오스 중합도가 4인 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당 및 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당(별명, 환상 말토실말토오스)은, 각각의 특성을 살려서 여러 가지 분야에 이용되거나 이용이 기대되고 있지만, 이들 당질 이외에도 글루코오스를 구성당으로 하는 비환원성 당질이 제공되면 비환원성 당질의 선택의 폭이 확장되어, 더욱 다양한 용도에 대한 이용이 기대된다.
본 발명의 과제는, 글루코오스를 구성당으로 하는 신규의 비환원성 당질을 제공하고, 비환원성 당질의 선택의 폭을 넓힘과 아울러 이 비환원성 당질을 생성하는 신규 효소와, 그것들의 생성 방법 및 제조 방법, 이 효소를 코드하는 DNA, 이것을 함유해서 된 재조합 DNA 및 형질 전환체, 및 이 비환원성 당질을 함유해서 된 조성물을 제공함에 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서, 전분 부분 분해물로부터 신규의 비환원성 당질을 생성하는 전혀 새로운 효소에 기대를 담아, 이러한 효소를 산생하는 미생물을 널리 검색해 왔다. 그 결과, 일본국의 오카야마현 오카야마시의 토양으로부터 새로이 분리한 바실루스(Bacillus)속(屬)에 속하는 신규 미생물 AM7주(株)가 신규의 효소를 산생하고, 이 신규 효소의 작용에 의해, 전분 또는 그 부분 분해물 등의 α-1,4 글루칸으로부터 일반식 1로 나타내어지는 구조를 가진 신규의 이소사이클로말토올리고당이 현저한 양으로 생성하는 것을 발견하였다. 또한, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 여러 가지 성질을 밝힘과 아울러 그 제조 방법을 확립하고, 또한 이 효소를 코드하는 DNA와 이것을 함유해서 된 재조합 DNA 및 형질 전환체를 확립하며, 또한, 이 효소에 의한 이소사이클로말토올리고당의 생성 방법, 및 이 효소를 이용한 이소사이클로말토올리고당 또는 이들을 함유하는 당(糖) 조성물의 제조 방법 및 용도를 확립하여, 본 발명을 완성하였다.
일반식 1:
Cyclo{→6)-[α-D-Glcp -(1→4)]n-α-D-Glcp -(1→}
(위의 식에서 n은 4 또는 5를 의미한다.)
즉, 본 발명은 일반식 1로 나타내어지는 구조를 가진 신규의 이소사이클로말토올리고당과 이들을 생성하는 신규의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소와, 이들의 생성 방법 및 제조 방법, 이 효소를 코드하는 DNA와 이것을 함유해서 된 재조합 DNA 및 형질 전환체, 더욱이 이소사이클로말토올리고당 또는 이것을 함유하는 당조성물을 함유해서 된 음식물, 화장품 및 의약품 조성물을 제공함으로써 상기 과제를 해결하는 것이다.
본 발명에 의하면, 글루코오스를 구성당으로 하는 비환원성 당질의 선택의 폭이 확장됨으로써, 종래 미지였던 신규의 환상 당질, 이소사이클로말토올리고당을 대량으로 공급할 수 있게 되어, 음식물, 화장품, 의약품을 비롯한 여러 가지 분야에서의 이용이 가능해진다.
도 1은 당질 I 표품의 HPLC 용출 패턴을 나타내는 그래프.
도 2는 당질 II 표품의 HPLC 용출 패턴을 나타내는 그래프.
도 3은 당질 I 표품의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 그래프.
도 4는 당질 I 표품의 13C-NMR 스펙트럼을 나타내는 그래프.
도 5는 본 발명의 이소사이클로말토펜타오스의 구조를 나타내는 도면.
도 6은 당질 II 표품의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 그래프.
도 7은 당질 II 표품의 13C-NMR 스펙트럼을 나타내는 그래프.
도 8은 본 발명의 이소사이클로말토헥사오스의 구조를 나타내는 도면.
도 9는 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 최적 온도를 나타내는 그래프.
도 10은 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 최적 pH를 나타내는 그래프.
도 11은 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 온도 안정성을 나타내는 그래프.
도 12는 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 pH 안정성을 나타내는 그래프.
도 13은 재조합 DNA, pBAMHl을 나타내는 도면.
도면 중에서, 검은 굵은 선으로 나타낸 부분은 바실루스 서큘란스 AM7(FERM BP-10111) 유래의 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 코드하는 DNA이다.
도 14는 재조합 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 발현용의 재조합 DNA, pETAM1을 나타내는 도면.
도면 중에서, 검은 굵은 선으로 나타낸 부분은, 바실루스 서큘란스 AM7(FERM BP-10111) 유래의 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 코드하는 DNA이다.
부호의 설명:
a: 1 위치가 α-1,4 글루코시드 결합해 있는 글루코오스 잔기
b: 1 위치가 α-1,6 글루코시드 결합해 있는 글루코오스 잔기
(발명을 실시하기 위한 최선의 형태)
본 발명에서 말하는 이소사이클로말토올리고당이라 함은, 아래의 일반식 1로 나타내어지는 구조를 가진 환상 당질을 의미한다.
일반식 1:
Cyclo{→6)-[α-D-Glcp -(1→4)]n-α-D-Glcp -(1→}
(위의 식에서, n은 4 또는 5를 의미한다)
이소사이클로말토올리고당으로서는, 상기 일반식 1에서 n이 4인 이소사이클로말토올리고당, 즉, 말토펜타오스 분자의 환원 말단 글루코오스의 1 위치와 비환 원 말단 글루코오스의 6 위치 히드록실기가 α-1,6 글루코시드 결합해서 환상 구조를 형성한 5당(본 명세서에서는 이소사이클로말토펜타오스라 호칭함), 및 상기 일반식 1에서 n이 5인 이소사이클로말토올리고당, 즉, 말토헥사오스 분자의 환원 말단 글루코오스의 1 위치와 비환원 말단 글루코오스의 6 위치 히드록실기가 α-1,6 글루코시드 결합해서 환상 구조를 형성한 6당(본 명세서에서는 이소사이클로말토헥사오스라 호칭함)이 존재한다. 이들 당질은, 토양으로부터 얻은 미생물의 배양액 중에서 본 발명자들이 처음으로 발견한 종래 미지의 신규 당질이고, 글루코오스를 구성당으로 하는 환상의 5당 또는 6당은 상기 구조를 가지고 있는 한, 그 공급원, 형태, 순도, 제조 방법을 막론하고 본 발명에 포함된다.
본 발명에서 말하는 이소사이클로말토올리고당 생성 효소라 함은, 글루코오스 중합도 3 이상인 α-1,4 글루칸에 작용하여, 분자간 전이반응에 의해 α-1,4 글루칸의 비환원 말단 글루코오스의 4 위치에 α-1,4 전이함으로써 여러 가지의 글루코오스 중합도의 α-1,4 글루칸을 생성하는 불균화(不均化) 반응을 촉매하는 한편, 글루코오스 중합도 7의 α-1,4 글루칸(말토헵타오스)에 작용했을 경우에는, 말토펜타오스 단위로 절단하고, 이 말토펜타오스의 환원 말단 글루코오스의 1 위치를 동일 분자의 비환원 말단 글루코오스의 6 위치 히드록실기에 α-1,6 전이하는 분자 내 전이반응에 의해 환화함으로써 이소사이클로말토펜타오스를 생성하는 반응을 촉매하고, 글루코오스 중합도 8 이상인 α-1,4 글루칸에 작용했을 경우에는, 말토펜타오스 또는 말토헥사오스 단위로 절단하고, 이 말토펜타오스 또는 말토헥사오스의 환원 말단 글루코오스의 1 위치를 동일 분자의 비환원 말단 글루코오스의 6 위치 히드록실기에 α-1,6 전이하는 분자 내 전이반응에 의해 환화함으로써 이소사이클로말토펜타오스 및 이소사이클로말토헥사오스를 생성하는 반응을 촉매하는 효소 전반(全般)을 의미한다. 상기의 반응을 촉매하는 효소는 그 공급원, 형태, 조(粗)효소 또는 정제 효소의 구별 없이 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소에 포함된다.
본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 효소 활성은 다음과 같이 해서 측정할 수 있다. 아밀로오스를 농도 1.25w/v％가 되도록 1mM 염화 칼슘을 함유하는 50mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 기질액으로 하고, 이 기질액 0.8ml에 효소액 0.2ml을 가해서 30℃에서 30분간 효소반응하고, 그 반응액을 10분간, 약 100℃에서 가열해서 반응을 정지시킨 후, α-글루코시다아제를 고형물 1 그램당 4000 단위 및 글루코아밀라아제를 고형물 1 그램당 250 단위 첨가해서 50℃에서 1시간 처리함으로써 잔존 가용성 전분이나 협잡 올리고당을 분해하고, 그 처리 액 중의 이소사이클로말토펜타오스량을, 다음에 설명하는 실험 1에 기재한 HPLC에 의해서 정량한다. 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 활성 1 단위는, 상기의 조건하에서 1분간에 1μ몰의 이소사이클로말토펜타오스를 생성하는 효소량으로 정의한다.
본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 구체적인 예를 들면 아래의 이화학적 성질을 가진 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 들 수 있다.
(1) 분자량
SDS-겔 전기 영동법에서, 106,000±20,000 달톤.
(2) 등전점
앰폴라인 함유 등전점 전기 영동법에서, pI 7.5±0.5.
(3) 최적 온도
pH 6.0에서 30분간의 반응 조건하에서, 50℃ 내지 55℃.
(4) 최적 pH
30℃에서 30분간의 반응 조건하에서, pH 4.5 내지 8.0.
(5) 온도 안정성
pH 6.0에서 60분간의 유지 조건하에서, 35℃까지 안정.
1mM 칼슘 이온 존재하에서는 40℃까지 안정.
(6) pH 안정성
4℃ 및 24시간의 유지 조건하에서, pH 4.5 내지 9.0에서 안정.
또한, 상기 이화학적 성질을 가진 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 하나는 상기 이화학적 성질뿐만 아니라 그 N 말단 서열로서, 서열표에서의 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 가지고 있는 경우가 있다.
본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소는, 통상적으로 소정의 아미노산 서열을 가지고 있고, 그 한가지 예를 들면, 서열표에서의 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 거기에 상동적인 아미노산 서열을 들 수 있다. 서열표에서의 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열에 상동적인 아미노산 서열을 가진 변이체 효소로서는, 글루코오스 중합도 3 이상인 α-1,4 글루칸에 작용하여, 일반식 1로 나타내어지는 이소사이클로말토올리고당을 생성한다고 하는 효소 활성 을 유지하는 범위에서, 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열에서 1개 또는 2개 이상의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가한 아미노산 서열을 가진 것을 들 수 있고, 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열에 대하여, 통상적으로 60％ 이상, 바람직하게는 70％ 이상, 더욱 바람직하게는 80％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90％ 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가진 것이 적합하다.
그러나 상기 이화학적 성질 또는 아미노산 서열을 가진 이소사이클로말토올리고당 생성 효소는 어디까지나 한가지 예이고, 상기와 다른 이화학적 성질 또는 N 말단 아미노산 서열을 가진 효소도 이소사이클로말토올리고당을 생성하는 한, 본 발명에 포함되는 것은 말할 필요도 없다.
본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소는 그 공급원에 따라 제한되지 않지만, 바람직한 공급원으로서 미생물을 들 수 있고, 특히 본 발명자들이 토양으로부터 단리한 미생물 AM7주(株) 또는 그 변이주가 적절하게 이용된다.
이하, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 산생능을 가진 미생물 AM7주(株)의 확인시험 결과를 나타낸다. 그리고 확인시험은 『미생물의 분류와 동정(同定)』 (長谷川武治편, 學會出版센터, 1985년)에 준해서 하였다.
<A: 세포형태>
(1) 육즙 한천 배양, 27℃
통상적으로 0.5×2 내지 0.7×5㎛의 간균(桿菌). 그램 양성. 운동성 있음.
타원형의 포자 있음. 균체의 가장자리에 부풀어진 포자낭을 형성한다.
<B:배양 성질>
(1) 육즙 한천 평판배양, 27℃
형상: 원형, 크기는 3일간에서 1 내지 2mm.
주연(周緣): 전연(全緣)
융기: 편평상
광택: 둔광(鈍光)
표면: 러프
색조: 불투명, 백색
(2) 육즙 한천 사면배양, 27℃
생육: 중간 정도
형상: 실 형상
<C: 생리학적 성질>
(1) VP 시험: 음성
(2) 카탈라아제: 양성
(3) 전분의 가수분해: 양성
(4) 티로신의 분해: 음성
(5) 페닐알라닌의 탈아미노화: 음성
(6) 질산의 환원: 양성
(7) D-글루코오스, L-아라비노오스, D-크실로오스, D-만니톨로부터 산을 생성함.
(8) 생육의 범위: pH 5.7 내지 9.8, 온도 10 내지 37℃, NaCl 농도 0 내지 2％
(9) 산소에 대한 태도: 통성(通性) 혐기성
(10) DNA의 GC 함량: 50.7％
이상의 균학적 성질에 근거하여, 문헌[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 제2권(1986년)]을 참고로 해서, 공지 균과의 이동(異同)을 검토하였다. 그 결과, 이 균은 바실루스 서큘란스(Bacillus circulans)에 속하는 미생물인 것이 밝혀졌다. 이들 결과로부터 본 발명자들은 이 균을 신규 미생물 바실루스 서큘란스 AM7로 명명하고, 평성(平成) 16년 8월 25일자로 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 동(東)1정목 1번지 1, 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소, 특허생물 기탁 센터에 기탁하여, 수탁 번호 FERM BP-10111로서 수탁되었다.
본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 산생능을 가진 미생물에는, 상기 균은 물론이고, 그 변이주, 더욱이는 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 산생능을 가진 기타의 미생물, 및 그것들의 변이주 등도 포함된다.
본 발명의 DNA라 함은, 상기 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 코드하는 것 전반을 의미한다. 본 발명의 DNA는 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 코드하는 것인 한, 그것이 천연 유래의 것이어도 좋고, 인위적으로 합성된 것이어도 좋다. 천연의 공급원으로서는, 예를 들면, 바실루스 서큘란스 AM7(FERM BP-10111)을 포함하는 바실루스 속(屬)의 미생물을 들 수 있고, 이들 균체로부터 본 발명의 DNA를 함유하는 유전자 DNA를 얻을 수 있다.
즉, 이와 같은 미생물을 영양배지에 접종하고, 호기적 조건하에서 약 1 내지 3일간 배양 후, 배양물로부터 균체를 채취하고, 리소자임이나 β-글루카나아제 등의 세포벽 용해 효소나 초음파로써 처리함으로써 이 DNA를 함유하는 유전자 DNA를 균체 밖으로 용출시킨다. 이때, 프로테아제 등의 단백질 분해 효소를 병용하거나, SDS 등의 계면 활성제를 공존시키거나, 동결 융해해도 좋다. 이와 같이 하여 얻어지는 처리물에, 예를 들면, 페놀 추출, 알코올 침전, 원심분리, 리보누클레아제 처리 등의 통상적인 방법을 적용하면 목적의 유전자 DNA가 얻어진다. 본 발명의 DNA를 인위적으로 합성하기 위해서는, 예를 들면, 서열표에서의 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열에 근거해서 화학합성하면 된다. 또한, 이 DNA를 함유하는 유전자 DNA를 주형(鑄型)으로 하고, 적당한 프라이머가 되는 화학합성 DNA를 이용해서 PCR 합성하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
본 발명의 DNA는, 통상적으로 소정의 염기서열을 가지고 있는데, 그 한가지 예를 들면, 서열표에서의 서열번호 3으로 나타내어지는 염기서열 또는 거기에 상동적인 염기서열을 들 수 있다. 서열표에서의 서열번호 3으로 나타내어지는 염기서열에 상동적인 염기서열을 가진 변이체 DNA로서는, 코드하는 효소의 활성을 유지하는 범위에서, 서열번호 3으로 나타내어지는 염기서열에서 1개 또는 2개 이상의 염기가 결실, 치환 혹은 부가한 염기서열을 가진 것을 들 수 있고, 서열번호 3으로 나타내어지는 염기서열에 대하여, 통상적으로 60％ 이상, 바람직하게는 70％ 이상, 더욱 바람직하게는 80％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90％ 이상의 상동성을 가진 염기서열을 가진 것이 적합하다. 또한, 유전자 코드의 축중(縮重)에 근거하여, 그 코드하는 효소의 아미노산 서열을 변경함이 없이 염기의 1개 또는 2개 이상을 다른 염기로 치환한 것도 당연히 본 발명의 DNA에 포함된다.
본 발명의 DNA를 자율 복제 가능한 적당한 벡터에 삽입해서 재조합 DNA로 하 는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 재조합 DNA는, 통상적으로 DNA와 자율 복제 가능한 벡터로 되는데, DNA를 입수할 수 있으면, 통상적인 방법의 재조합 DNA 기술에 의해 비교적 용이하게 제조할 수 있다. 이와 같은 벡터의 예로서는, pBR322, pUC18, pBluescript II SK(+), pUBllO, pTZ4, pC194, pHV14, TRp7, YEp7, pBS7 등의 플라스미드 벡터나 λgt·λC, λgt·λB, ρ11, φ1, φ105 등의 파아지 벡터를 들 수 있다. 이 중에서, 본 발명의 DNA를 대장균에서 발현시키기 위해서는, pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), λgt·λC 및 λgt·λB가 적합하고, 한편, 고초균에서 발현시키기 위해서는, pUBllO, pTZ4, pC194, ρ11, φ1 및 φ105가 적합하다. pHV14, TRp7, YEp7 및 pBS7은, 재조합 DNA를 2종 이상의 숙주 내에서 복제시킬 경우에 유용하다.
DNA를 이와 같은 벡터에 삽입하기 위해서는, 이 분야에서 통상 일반적인 방법이 채용된다. 구체적으로는, 우선, DNA를 함유하는 유전자 DNA와 자율 복제 가능한 벡터를 제한 효소 및/또는 초음파에 의해 절단하고, 이어서, 생성한 DNA 단편과 벡터 단편을 연결한다. 유전자 DNA 및 벡터의 절단에 뉴클레오티드에 특이적으로 작용하는 제한 효소, 특히 II형의 제한 효소, 상세히는, Sau 3AI, Eco RI, Hind III, Bam HI, Sal I, Ⅹba I, Sac I, Pst I 등을 사용하면, DNA 단편과 벡터 단편을 연결하는 것이 용이하다. 필요에 따라서, 양자를 어닐링한 후, 생체내 또는 생체외에서 DNA 리가아제를 작용시키면 좋다. 이와 같이 하여 얻어지는 재조합 DNA는, 적당한 숙주에 도입해서 형질 전환체로 하고, 이것을 배양함으로써 무한히 복제 가능하다.
이렇게 하여 얻어지는 재조합 DNA는 대장균, 고초균, 방선균, 효모를 비롯한 적당한 숙주 미생물에 도입할 수 있다. 형질 전환체를 취득하기 위해서는, 콜로니 하이브리다이제이션법을 적용하거나, 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1,4 글루칸을 함유하는 영양배지에서 배양하고, 이 당질로부터 이소사이클로말토올리고당을 생성하는 것을 선택하면 좋다.
본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 산생능을 가진 형질 전환체도 포함한 미생물의 배양에 이용하는 배지는, 미생물을 생육할 수 있고, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 산생할 수 있는 영양배지이면 좋고, 합성 배지 및 천연배지의 어느 것이라도 좋다. 탄소원으로서는, 미생물이 생육에 이용할 수 있는 것이면 좋은데, 예를 들면, 식물 유래의 전분이나 피토글리코겐, 동물이나 미생물 유래의 글리코겐이나 풀룰란, 또한 이들의 부분 분해물이나 글루코오스, 프룩토오스, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 당밀 등의 당질, 또한 시트르산, 숙신산 등의 유기산도 사용할 수 있다. 배지에서의 이들 탄소원의 농도는 탄소원의 종류에 따라 적당히 선택할 수 있다. 질소원으로서는, 예를 들면, 암모늄염, 질산염 등의 무기 질소 화합물 및 예를 들면, 요소(尿素), 콘 스티이프 리커, 카제인, 펩톤, 효모 엑스, 육류 엑기스 등의 유기 질소 함유물을 적당히 이용할 수 있다. 또한, 무기 성분으로서는, 예를 들면, 칼슘염, 마그네슘염, 칼륨염, 나트륨염, 인산염, 망간염, 아연염, 철염, 구리염, 몰리브덴염, 코발트염 등의 염류를 적당히 이용할 수 있다. 더욱이 필요에 따라서, 아미노산, 비타민 등도 적당히 이용할 수 있다.
배양은, 통상적으로 온도 15 내지 37℃에서 pH 5.5 내지 10의 범위, 바람직하게는 온도 20 내지 34℃에서 pH 5.5 내지 8.5의 범위로부터 선택되는 조건에서 호기적으로 실시된다. 배양 시간은 해당 미생물이 증식할 수 있는 시간이면 좋은데, 바람직하게는 10시간 내지 150시간이다. 또한, 배양 조건에서의 배양액의 용존(溶存) 산소 농도에는 특히 제한은 없지만, 통상적으로는 0.5 내지 20ppm이 바람직하다. 따라서 통기량을 조절하거나, 교반하거나 하는 등의 수단을 적당히 채용한다. 또한, 배양 방식은 회분(回分) 배양 또는 연속 배양의 어느 쪽이라도 좋다.
이렇게 하여 미생물을 배양한 후, 본 발명의 효소를 함유하는 배양물을 회수한다. 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 활성은 주로 배양물의 제균액에서 나타고, 제균액을 조(粗)효소액으로 해서 채취할 수도 있고, 배양물 전체를 조(粗)효소액으로 해서 이용할 수도 있다. 배양물로부터 균체를 제거하기 위해서는 공지의 고액(固液) 분리법이 채용된다. 예를 들면, 배양물 그 자체를 원심분리하는 방법, 혹은 프리코우트 필터 등을 이용해서 여과 분리하는 방법, 평막, 중공사막 등의 막여과에 의해 분리하는 방법 등이 적당히 채용된다. 제균액을 그대로 조(粗)효소액으로서 이용할 수 있지만, 일반적으로는 농축해서 이용된다. 농축법으로서는, 황산 암모늄 염석법, 아세톤 및 알코올 침전법, 평막, 중공막 등을 이용한 막 농축법 등을 채용할 수 있다.
더욱이 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 활성을 가진 제균액 및 그 농축액을 사용하고, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 공지의 방법에 의해 고정화할 수도 있다. 예를 들면, 이온 교환체에의 결합법, 수지 및 막(膜) 등과의 공유결 합법·흡착법, 고분자 물질을 이용한 포괄법 등을 적당히 채용할 수 있다.
상기한 바와 같이 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소는, 조(粗)효소액을 그대로 또는 농축해서 이용할 수 있지만, 필요에 따라서, 공지의 방법에 의해 더욱 분리·정제해서 이용할 수도 있다. 예를 들면, 배양액의 처리물을 황산 암모늄 염석해서 농축한 조(粗)효소 표품을 투석 후, 『DEAE-토요퍼얼(Toyopearl) 650S』 수지를 이용한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 계속해서, 『부틸-토요퍼얼(Phenyl-Toyopearl) 650M』 수지를 이용한 소수 크로마토그래피를 이용해서 정제함으로써, 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 전기 영동적으로 단일의 효소로서 얻을 수 있다.
이소사이클로말토올리고당 생성 효소가 재조합형 효소일 경우에는, 숙주의 종류에 따라서는 균체 내에 효소가 축적할 경우가 있다. 이러한 경우에는, 균체 또는 배양물을 그대로 사용하는 것도 가능하지만, 통상적으로는 사용에 앞서, 필요에 따라서, 침투압 쇼크나 계면 활성제에 의해 균체로부터 추출한 후, 또는 초음파나 세포벽 용해 효소에 의해 균체를 파쇄한 후, 여과, 원심분리 등에 의해 재조합형 효소를 균체 또는 균체 파쇄물로부터 분리해서 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
이렇게 하여 얻어지는 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소는, 구체적으로는 아래의 이화학적 성질을 가질 경우가 있다.
(1) 분자량
SDS-겔 전기 영동법에서, 106,000±20,000 달톤.
(2) 등전점
앰폴라인 함유 등전점 전기 영동법에서, pI 7.5±0.5.
(3) 최적 온도
pH 6.0에서 30분간의 반응 조건하에서, 50℃ 내지 55℃
(4) 최적 pH
30℃에서 30분간의 반응 조건하에서, pH 4.5 내지 8.0.
(5) 온도 안정성
pH 6.0에서 60분간의 유지 조건하에서, 35℃까지 안정.
1mM 칼슘 이온 존재하에서는 40℃까지 안정.
(6) pH 안정성
4℃ 및 24시간의 유지 조건하에서, pH 4.5 내지 9.0에서 안정.
(7) N 말단 아미노산 서열
서열표에서의 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열, 즉, 알라닌-세린-이소로이신-글리신-트레오닌-발린-트레오닌-글루탐산-아스파라긴-아스파라긴산-트레오닌-이소로이신-티로신-글루타민-이소로이신-메티오닌-발린-아스파라긴산-아르기닌-페닐알라닌의 아미노산 서열을 가짐.
본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 기질(基質)이 되는 글루코오스 중합도 3 이상인 α-1,4 글루칸으로서는, 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 글리코겐 등이나, 그것들을 아밀라아제 또는 산 등에 의해 부분적으로 가수분해하여 얻어지는 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 말토올리고당 등의 부분 분해물을 들 수 있다. 아밀라아제에 의해 분해한 부분 분해물로서는, 예를 들면, 문헌[Handbook of Amylases and Related Enzymes(1988년), Pergamon Press사(동경)]에 기재되어 있는 α-아밀라아제(EC 3.2.1.1), 말토테트라오스 생성 아밀라아제(EC 3.2.1.60), 말토펜타오스 생성 아밀라아제, 말토헥사오스 생성 아밀라아제(EC 3.2.1.98) 등의 아밀라아제를 이용해서 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 글리코겐 등을 분해하여 얻어지는 부분 분해물을 이용할 수 있다. 또, 부분 분해물을 제조할 때, 풀룰라나아제(EC 3.2.1.41), 이소아밀라아제(EC 3.2.1.68) 등의 전분 지절(枝切) 효소를 작용시키는 것도 마음대로이다.
기질로서의 전분은, 예를 들면, 옥수수, 밀, 쌀 등 유래의 지상 전분이어도 좋고, 또한 감자, 고구마, 타피오카 등 유래의 지하 전분이어도 좋은데, 바람직하게는 전분을 호화(糊化) 및/또는 액화한 용액으로 해서 이용할 수 있다. 그 전분의 부분 분해의 정도는 낮을수록, 이소사이클로말토올리고당 생성율이 높아지므로, DE 약 20 이하, 바람직하게는 약 12 이하, 더 바람직하게는 약 5 이하의 부분 분해물이 적합하다. 또한 본 명세서에서 말하는 이소사이클로말토올리고당 생성율이라 함은, 식, 이소사이클로말토올리고당 생성율(％）＝ [(생성한 이소사이클로말토올리고당류의 질량)/ (반응액 중의 전체 당질의 질량)]×100으로 산출되는 값을 의미한다.
본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 기질에 작용시킬 때에, 그 기질 농도는 특히 한정되지 않는데, 예를 들면, 기질 농도 0.1％(w/v)의 비교적 저농도의 용액을 사용했을 경우라도, 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 의 반응은 진행해서 이소사이클로말토올리고당을 생성한다. 공업적으로는, 기질 농도 1％(w/v) 이상이 적합하고, 이 조건하에서 이소사이클로말토올리고당을 유리하게 생성할 수 있다. 반응 온도는 반응이 진행하는 온도, 즉 55℃ 부근까지에서 하면 좋다. 바람직하게는 30 내지 45℃ 부근의 온도를 이용한다. 반응 pH는, 통상적으로 4.5 내지 8.0의 범위, 바람직하게는 pH 5.0 내지 7.5의 범위로 조정하는 것이 좋다. 효소의 사용량과 반응 시간은 밀접히 관계하고 있어, 목적으로 하는 효소반응의 진행에 의해 적당히 선택하면 좋다.
예를 들면, 기질 농도 1％(w/v)의 전분 또는 그 부분 분해물이나 아밀로오스의 수용액에 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 작용시킴으로써, 전분 또는 그 부분 분해물로부터는 약 20％ 이상, 아밀로오스로부터는 약 30％의 높은 이소사이클로말토올리고당 생성율로 본 발명의 이소사이클로말토올리고당을 얻을 수 있다. 이 이소사이클로말토올리고당 생성 효소에 의한 이소사이클로말토올리고당류의 생성 메커니즘은 아래와 같이 추측된다.
(1) 이 효소는, 기질로서 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1,4 글루칸에 작용하여 분자간 전이반응에서 α-1,4 글루칸의 비환원 말단 글루코오스의 4 위치 히드록실기에 α-1,4 전이하는 것에 의한 불균화 반응에 의해 여러 가지의 글루코오스 중합도의 α-1,4 글루칸을 생성한다.
(2) 이 효소는, 글루코오스 중합도 7의 α-1,4 글루칸(말토헵타오스)에 작용했을 경우에는 말토펜타오스 단위로 절단하고, 이 말토펜타오스의 환원 말단 글루코오스의 1 위치를 동일 분자의 비환원 말단 글루코오스의 6 위치 히드록실기에 α -1,6 전이하는 분자 내 전이반응에 의해 환화(環化)하여, 이소사이클로말토펜타오스와 말토오스를 생성한다.
(3) 이 효소는, 글루코오스 중합도 8 이상인 α-1,4 글루칸에 작용했을 경우에는 말토펜타오스 또는 말토헥사오스 단위로 절단하고, 이 말토펜타오스 또는 말토헥사오스의 환원 말단 글루코오스의 1 위치를 동일 분자의 비환원 말단 글루코오스의 6 위치 히드록실기에 α-1,6 전이하는 분자 내 전이반응에 의해 환화하여, 이소사이클로말토펜타오스 및 이소사이클로말토헥사오스와 글루코오스 중합도가 5 또는 6 감소한 α-1,4 글루칸을 생성한다.
(4) (2) 및 (3)에서 새롭게 생성한 말토오스 및 α-1,4 글루칸은, 다시 (1) 내지 (3)의 반응을 받음으로써 이소사이클로말토올리고당을 생성한다.
또한, 이 이소사이클로말토올리고당 생성 반응시에, 기타의 효소를 병용하여 이소사이클로말토올리고당 생성율을 향상시키는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 예를 들면, 전분에 이소사이클로말토올리고당 생성 효소와 이소아밀라아제나 풀룰라나아제 등의 전분 지절(枝切) 효소를 병용해서 작용시킴으로써, 이소사이클로말토올리고당의 생성율을 더욱 향상시키는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
상기의 반응에 의해 얻어진 반응액을 그대로 이소사이클로말토올리고당 함유 당액으로서 이용할 수도 있다. 또한, 필요에 따라서, 이소사이클로말토올리고당 함유 당액에, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 α-글루코시다아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 작용시켜서, 협잡(挾雜)하는 올리고당을 가수분해한 이소사이클로말토올리고당 함유 당액으로 해서 이용할 수도 있다. 또 한, 수소첨가해서 반응액 중에 잔존하는 환원성 당질을 당 알코올로 변환해서 환원력을 소멸하게 하는 등의 추가적인 가공 처리를 하는 것도 마음대로이다. 일반적으로는, 이소사이클로말토올리고당 함유 당액을 더욱 정제해서 사용한다. 정제 방법으로서는, 당(糖)의 정제에 이용되는 통상적인 방법을 적당히 채용하면 좋은데, 예를 들면, 활성탄에 의한 탈색, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의한 탈염, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 활성탄 칼럼 크로마토그래피, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 등의 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획, 알코올 및 아세톤 등의 유기용매에 의한 분별, 적당한 분리 성능을 가진 막에 의한 분리, 또한 이소사이클로말토올리고당을 이용하지 않고 협잡 당질을 자화(資化), 분해하는 미생물, 예를 들면 효모 등에 의한 발효 처리나, 알칼리 처리 등에 의해, 잔존해 있는 환원성 당질을 분해 제거하는 등의 1종 또는 2종 이상의 정제 방법을 적당히 채용할 수 있다.
특히, 공업적 대량생산 방법으로서는, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피의 채용이 바람직한데, 예를 들면, 일본국 특개소58-23799호 공보, 일본국 특개소58-72598호 공보 등에 개시되어 있는 강산성 양이온 교환 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 협잡 당류를 제거하여 목적물의 함량을 향상시킨 이소사이클로말토올리고당 또는 이것을 함유하는 당질을 유리하게 제조할 수 있다. 이때, 고정상 방식, 이동상 방식, 유사 이동상 방식 중의 어느 방식을 채용하는 것도 마음대로이다.
이렇게 하여 얻어진 이소사이클로말토올리고당을 함유하는 수용액, 또는 그 함량을 향상시킨 당질 수용액은, 통상적으로 이소사이클로말토올리고당을, 고형물 당, 10 질량％ 이상, 바람직하게는 40 질량％ 이상 함유하는 당질 수용액인데, 통상적으로 이것을 농축하여 시럽상 제품으로 한다. 이 시럽상 제품을 더욱 건조해서 비정질 고상물 제품 또는 비정질 분말 제품으로 하는 것도 마음대로이다.
또한, 본 발명의 이소사이클로말토올리고당은 포접능(包接能)을 가지고 있고, 포접한 향기성분, 유효성분 등의 휘산, 품질열화를 방지하므로, 향기성분, 유효성분의 안정화·유지에 극히 우수하다. 이때, 필요에 따라서, 사이클로덱스트린류, 분기 사이클로덱스트린류, 글루코오스 4 분자가 α-1,3 및 α-1,6 결합에 의해 교대로 결합한 환상 4당, 분기 환상 4당류, 글루코오스 4 분자가 α-1,4 및 α-1,6 결합에 의해 교대로 결합한 환상 말토실말토오스, 사이클로덱스트란류, 사이클로프룩탄류 등의 기타의 환상 당질을 병용함으로써, 포접에 의한 안정화를 강화하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 사이클로덱스트린류 등의 환상 당질로서는, 고순도의 것에 한정할 필요는 없고, 저순도의 환상 당질, 예를 들면, 다량의 말토덱스트린과 함께 각종의 환상 당질을 함유한 전분 부분 분해물 등도 유리하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 이소사이클로말토올리고당은 α-아밀라아제나 α-글루코시다아제에 의해 실질적으로 분해되지 않기 때문에, 경구섭취해도 소화 흡수되지 않는 난(難)소화성의 당질이며, 무독, 무해한 신규의 당질이다.
따라서, 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 또는 이것을 함유하는 당질은 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 변색 방지제, 부형제 등으로서, 음식물, 기호물, 사료, 이료(餌料), 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명의 이소사이클로말토올리고당 또는 이것을 함유하는 당질을 그대로 감미 부여를 위한 조미료로서 사용할 수 있다. 필요하다면, 예컨대, 가루엿, 포도 당, 이성화당, 설탕, 맥아당, 트레할로오스, 벌꿀, 메이플 슈거, 소르비톨, 말티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, α-글리코실스테비오시드, 라캉카 감미물, 글리시리진, 소마틴, 수크랄로오스, L-아스파라틸페닐알라닌 메틸 에스테르, 사카린, 글리신, 알라닌 등과 같은 기타의 감미료와, 또한, 덱스트린, 전분, 락토오스 등과 같은 증량제와 혼합해서 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 또는 이것을 함유하는 당질의 분말상 제품을 그대로 또는 필요에 따라서 증량제, 부형제, 결합제 등과 혼합하여 과립, 원형, 단봉상, 판상, 입방체, 정제 등의 각종 형상으로 성형해서 사용하는 것도 마음대로이다.
또한, 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 또는 이것을 함유하는 당질의 감미는, 신맛, 짠맛, 떫은 맛, 단맛, 쓴 맛 등의 다른 정미를 가진 각종의 물질과 잘 조화하고, 내산성, 내열성도 크므로, 일반 음식물의 감미 부여, 정미(呈味) 개량, 품질 개량 등에 유리하게 이용할 수 있다.
예를 들면, 간장, 분말 간장, 된장, 분말 된장, 모로미(정제술), 히시오(정제 간장), 후리카케(어육 조미품), 마요네즈, 드레싱, 식초, 산바이 수(설탕, 간장, 식초로 된 소오스), 훈마츠 수시 수(초밥용 분말 식초), 츄카 노 모토(중화 요리용 인스탄트 믹스), 텐츠유(일본식 튀김 식품용 소오스), 멘츠유(일본식 버어미셀리용 소오스), 소오스, 케첩, 야키니쿠 노 타레(일본식 불고기용 소오스), 커리 루우, 인스탄트 스튜우 믹스, 인스탄트 수우프의 믹스, 다시 노 모토(인스탄트 우려낸 국물), 복합 조미료, 미린(감미나는 식품조리용 술), 신미린(합성 미린), 테이블 슈거, 커피 슈거 등의 각종 조미료에 대한 감미료, 또 정미 개량제, 품질 개량제 등으로서 사용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
또한, 예를 들면, 센베이(쌀 크래커), 아라레(입방체의 쌀떡), 오코시(기장과 쌀로 된 케이크), 규히(전분 페이스트), 떡류, 만두, 우이로(단맛의 젤리), 팥소류, 요캉(단맛의 팥 젤리), 미즈 요캉(연질의 팥 젤리), 킹요쿠(요캉의 일종), 젤리, 카스테라, 눈깔사탕 등의 각종 일본식 과자, 빵, 비스켓, 크래커, 쿠키, 파이, 푸딩, 버터 크림, 커스터드 크림, 슈 크림, 와플, 스펀지 케이크, 도넛, 초콜렛, 츄잉검, 캬라멜, 누가, 캔디 등의 각종 양과자, 아이스크림, 셔베트 등의 빙과, 과실의 시럽절임, 얼음꿀 등의 시럽류, 플라워 페이스트, 땅콩 페이스트, 후루츠 페이스트 등의 페이스트류, 잼, 마아멀레이드, 시럽 즈케(과실 피클류), 당과(糖果) 등의 과실, 야채의 가공 식품류, 후쿠진 즈케(적색의 무우 피클), 베타라 즈케(통무우 피클의 일종), 센마이 즈케(얇게 썬 무우 절임의 일종), 라쿄 즈케(양파 절임) 등의 절인 야채류, 단무지용의 프리믹스, 배추 절임용 프리믹스 등의 절임류의 프리믹스, 햄, 소세지 등의 축육 제품류, 어육 햄, 어육 소시지, 어묵, 치쿠와(어묵의 일종), 튀김 어묵 등의 어육제품, 성게, 물오징어의 젓, 슈 콤부, 말린 오징어, 미린으로 조미된 말린 복어, 대구, 도미, 새우 등의 각종 진미류, 김, 산채, 말린 오징어, 작은 물고기, 조개 등으로 제조되는 해산물 조림류, 콩자반, 포테이토 샐러드, 콤부 말이 등의 반찬식품, 유(乳)제품, 어육, 축육, 과실, 야채 의 병조림, 통조림류, 합성주, 증양주(增釀酒), 청주, 과실주, 발포주, 맥주 등의 주류, 커피, 코코아, 쥬우스, 탄산 음료, 락트산 음료, 유산균 음료 등의 청량 음료수, 즉석 푸딩 믹스, 핫케이크 믹스, 즉석 쥬우스, 즉석 커피, 즉석 팥죽, 즉석 수우프 등의 즉석 식품, 또, 이유식, 치료식, 드링크제, 펩티드 식품, 냉동 식품 등의 각종 음식물에의 감미 부여, 정미 개량, 품질 개량 등에 유리하게 실시할 수 있다.
또한, 가축, 집에서 기르는 새, 기타는 꿀벌, 누에, 물고기 등의 사육 동물을 위한 사료, 이료 등의 기호성을 향상시킬 목적으로 사용할 수도 있다. 그 외에, 담배, 치약, 입술 연지, 립 크림, 내복액, 정제, 트로치, 간유 드롭, 입안 청량제, 입안 향기제, 양치질제 등의 각종 고형물, 페이스트상, 액상 등으로 해서 기호물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에의 감미제로서, 또는 정미 개량제, 교미제(矯味劑)로서, 더욱이 품질 개량제, 안정제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
품질 개량제, 안정제로서는, 유효성분, 활성 등을 상실하기 쉬운 각종 생리활성 물질 또는 이것을 함유하는 건강식품, 기능성 식품, 의약품 등에 유리하게 적용할 수 있다. 예를 들면, 인터페론-α, -β, -γ, 종양 괴사 인자-α, -β, 마크로파아지 유주(遊走) 저지 인자, 콜로니 자극 인자, 트랜스퍼팩터, 인터류킨 II 등의 림포카인 함유액, 인슐린, 성장 호르몬, 프로락틴, 에리드로포이에틴, 난세포 자극 호르몬 등의 호르몬 함유액, BCG 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 폴리오 생 백신, 두묘(痘苗), 파상풍 톡소이드, 허브 항독소, 인간 면역 글로불린 등의 생물제제 함유액, 페니실린, 에리트로마이신, 클로램페니콜, 테트라사이클린, 스트렙 토마이신, 황산 가나마이신 등의 항생 물질 함유액, 티아민, 리보플라빈, L-아스코르브산, 간유, 카로티노이드, 에르고스테롤, 토코페롤 등의 비타민 함유액, EPA, DHA, 아라키돈산 등의 고도 불포화 지방산 또는 그 에스테르 유도체, 리파아제,에스터라아제, 우로키나아제, 프로테아제, β-아밀라아제, 이소아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제 등의 효소 함유액, 약용 인삼 엑스, 자라 엑스, 클로렐라 엑스, 알로에 엑스, 프로폴리스 엑스 등의 엑스류, 바이러스, 유산균, 효모 등의 생균 페이스트, 로얄 젤리 등의 각종 생리활성 물질도, 그 유효성분, 활성을 상실함이 없이 안정하게 고품질의 액상, 페이스트상 또는 고상의 건강식품, 기능성 식품 및 의약품 등을 용이하게 제조할 수 있게 된다.
이상 설명한 바와 같은 각종 조성물에 이소사이클로말토올리고당 또는 이것을 함유하는 당질을 함유시키는 방법으로서는, 그 제품이 완성될 때까지의 공정에서 함유시키면 좋은데, 예를 들면, 혼화, 혼날(混捏), 용해, 융해, 침지, 침투, 살포, 도포, 피복, 분무, 주입, 결정 석출, 고화 등의 공지의 방법이 적당히 선택된다.
그 양은, 통상적으로 0.1 질량％ 이상, 바람직하게는 1 질량％ 이상 함유시키는 것이 바람직하다.
이하, 실험에 의해 본 발명을 상세히 설명한다.
<실험 1: 비환원성 당질의 제조>
전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #4』, 일본국의 松谷화학공업 주식회사제조) 1.5w/v％, 효모 추출물(상품명 『폴리펩톤』, 日本製藥 주식회사 제조) 0.5w/v％, 효모 추출물(상품명 『효모 엑스 S』, 日本製藥 주식회사 제조) 0.1w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·2수화물 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수화물 0.05w/v％, 탄산 칼슘 0.3w/v％, 및 물로 된 액체 배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크 10개에 30ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃에서 20분간 멸균하고, 냉각하였다.
이어서, 바실루스 서큘란스 AM7(FERM BP-10111)을 접종하고, 27℃ 및 230rpm에서 120시간 회전 진탕 배양하였다. 배양 후, 배양액을 원심분리(8,000rpm, 20분간)해서 균체를 제거하고, 배양 상청(약 0.3L)을 얻었다. 얻어진 배양 상청의 0.25L을 효소액으로서 사용하고, 이것을 2w/v％ 아밀로오스 및 2mM 염화 칼슘을 함유하는 50mM 아세트산 완충액(pH 6.0) 0.25L에 첨가하고, 48시간 동안 40℃에서 반응시킨 후, 약 100℃에서 10분간 열처리함으로써 반응을 정지하였다.
이어서, 협잡(挾雜)하는 환원당을 글루코오스까지 가수분해하기 위해서, 상기의 반응물을 염산으로 pH 5.0으로 조정한 후, α-글루코시다아제(상품명 『트란스글루코시다아제 L 「아마노」』, 일본국의 天野 엔자임 주식회사 제조)를 고형물 1 그램당 400 단위 및 글루코아밀라아제(일본국의 나가세 생화학 공업 주식회사 판매)를 고형물 1 그램당 25 단위 첨가해서 50℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 후, 약 100℃에서 10분간 열처리해서 반응을 정지시켰다.
얻어진 반응액 중의 당질을 분석용의 고속 액체 크로마토그래피(이하, 분석 HPLC로 약칭함.)에 의해 분석한 결과, 용출시간 57.3분의 글루코오스, 용출시간 43.7분의 당질(이하, 당질 I로 약칭함.), 및 용출시간 37.1분의 당질(이하, 당질 II로 약칭함.)이 검출되었다. 각각의 조성은, 글루코오스가 73.3％이고, 당질 I이 24.2％이며, 당질 II가 2.5％이었다.
그리고 분석 HPLC는, 칼럼에 『MCIgel CKO4SS』(일본국의 三菱화학 주식회사 제조)의 2개를 직렬로 연결하고, 용리액으로서 물을 사용하며, 칼럼 온도 80℃, 유속 0.4ml/분의 조건에서 실시하고, 검출은 시차(示差) 굴절계 RID-10A(일본국의 주식회사 島津제작소 제조)를 이용해서 하였다.
계속해서, 상기의 반응액 중의 불용물을 여과해서 제거한 후, 일본국의 미쓰비시(三菱) 화학제 이온교환 수지 『다이아이온 SK-1B』와 『다이아이온 WA30』 및 일본국의 오르가노제 이온교환 수지 『IRA411』을 사용해서 탈색, 탈염하고, 농축하여 정밀여과한 후, 조제용 HPLC로 분획(分劃)한 결과, 글루코오스는 용출시간 29분으로부터 40분에서 용출하여 당질 I는 용출시간 57분으로부터 75분에서 용출하며, 당질 II는 용출시간 120분으로부터 180분에서 용출하였다. 당질 I과 당질 II의 획분을 따로따로 회수하고, 정밀여과한 후, 진공건조하여 당질 I을 고형물로서 약 850mg, 당질 II를 고형물로서 약 100mg을 얻었다. 또한 조제용 HPLC는, 『ODS-AQ R-355-15AQ』 칼럼(YMC주식회사 제조)을 사용하고, 용리액으로서 7.5％(v/v)메탄올을 사용하여, 칼럼 온도 25℃, 유속20ml/분의 조건에서 실시하였다.
얻어진 당질 I 및 당질 II 표품의 당조성을 분석 HPLC로써 조사한 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 당질 I 및 당질 II의 함량은 모두 97％ 이상이어서, 극히 고순도인 것이 밝혀졌다.
또한, 당질 I 및 당질 II 표품의 환원력을 소모기·넬슨법으로 측정한 결과, 이들 두 가지 표품 모두 환원력은 검출한계 이하이어서, 당질 I 및 당질 II는 실질적으로 비환원성이라고 판단되었다.
<실험 2: 당질 I의 구조해석>
<실험 2-1: 질량분석>
실험 1의 방법으로 얻어진 당질 I 표품에 대해서, 질량분석 장치 『LCQ-Advantage』 (사모일렉트론사제)를 사용해서 질량분석한 결과, 질량수 833의 나트륨 부가 분자 이온이 현저하게 검출되어, 당질 I의 질량수는 810인 것이 밝혀졌다.
<실험 2-2: 구성당 분석>
실험 1의 방법으로 얻어진 당질 I 표품에 대해서, 통상적인 방법에 따라 황산을 사용해서 단당으로까지 가수분해하고, 가스 크로마토그래피로써 구성당을 조사한 결과, D-글루코오스만이 검출되어, 당질 I는 D-글루코오스만을 구성당으로 하는 것이 밝혀졌다. 상기의 질량수를 고려하면, 당질 I는 D-글루코오스 5분자로 된 환상 당질인 것을 알았다.
<실험 2-3: 메틸화 분석>
실험 1의 방법으로 얻어진 당질 I 표품에 대해서, 통상적인 방법에 따라 메틸화 분석을 해서 가스 크로마토그래피에 의해 메틸화물을 조사하였다. 그 결과를 표 1에 정리하였다.
| 분석 메틸화물의 종류 | 비율 |
| 2,3,4-트리메틸화물 | 1.00 |
| 2,3,6-트리메틸화물 | 3.91 |
표 1의 결과로부터 명확한 바와 같이, 2,3,4-트리메틸화물과 2,3,6-트리메틸화물의 비율이 거의 1:4이므로, 당질 I을 구성하는 D-글루코오스 5분자 중에서, 1분자는 1 위치와 6 위치에서 글루코시드 결합해 있고, 또한 다른 4분자는 1 위치와 4 위치에서 글루코시드 결합해 있는 것이 밝혀졌다.
<실험 2-4: 핵자기 공명 분석>
실험 1의 방법으로 얻어진 당질 I 표품을 사용하고, 통상적인 방법에 따라 핵자기 공명(NMR) 분석을 하였다. 1H-NMR 스펙트럼을 도 3에, 13C-NMR 스펙트럼을 도 4에 나타냈다.
1H-NMR 스펙트럼에서의 약 5.07ppm의 시그널, 약 5.00ppm의 시그널, 약 4.99ppm의 시그널, 약 4.98ppm의 시그널, 및 약 4.87ppm의 시그널은 D-글루코오스 잔기의 1 위치 프로톤에 귀속되어, 그 스핀-스핀 결합 정수를 구한 결과, 약 3.49Hz(약 5.07ppm의 시그널), 약 3.86Hz(약 5.00ppm의 시그널), 약 2.39Hz(약 4.99ppm의 시그널), 약 2.94Hz(약 4.98ppm의 시그널) 및 약 3.31Hz(약 4.87ppm의 시그널)이었기 때문에, 1,4 글루코시드 결합해 있는 D-글루코오스 잔기의 1 위치의 아노머형 및 1,6 글루코시드 결합해 있는 D-글루코오스 잔기의 1 위치의 아노머형은 양쪽 모두 α형인 것이 밝혀졌다.
이상의 결과로부터, 당질 I는, 도 5에 나타내는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 글루코 5당, 즉, 이소사이클로말토펜타오스인 것이 밝혀졌다. 이 구조를 가진 당질은 종래 전혀 알려져 있지 않아, 본 발명의 이소사이클로말토펜타오스는 신규의 환상 당질이다.
<실험 3: 당질 II의 구조해석>
<실험 3-1: 질량분석>
실험 1의 방법으로 얻어진 당질 II 표품에 대해서, 질량분석 장치 『LCQ-Advantage』를 사용해서 질량분석한 결과, 질량수 995의 나트륨 부가 분자 이온이 현저하게 검출되어, 당질 II의 질량수는 972인 것이 밝혀졌다.
<실험 3-2: 구성당 분석>
실험 1의 방법으로 얻어진 당질 II 표품에 대해서, 통상적인 방법에 따라 황산을 사용해서 단당으로까지 가수분해하고, 가스 크로마토그래피에 의해 구성당을 조사한 결과, D-글루코오스만이 검출되어, 당질 II는 D-글루코오스만을 구성당으로 하는 것이 밝혀졌다. 상기의 질량수를 고려하면, 당질 II는 D-글루코오스 6분자로 된 환상 당질인 것을 알았다.
<실험 3-3: 메틸화 분석>
실험 1의 방법으로 얻어진 당질 II 표품에 대해서, 통상적인 방법에 따라 메틸화 분석을 해서 가스 크로마토그래피에 의해 메틸화물을 조사하였다. 그 결과를 표 2에 정리하였다.
| 분석 메틸화물의 종류 | 비율 |
| 2,3,4-트리메틸화물 | 1.00 |
| 2,3,6-트리메틸화물 | 4.87 |
표 2의 결과로부터 명확한 바와 같이, 2,3,4-트리메틸화물과 2,3,6-트리메틸화물의 비율이 거의 1:5이므로, 당질 II를 구성하는 D-글루코오스 6분자 중에서, 1분자는 1 위치와 6 위치에서 글루코시드 결합해 있고, 또한, 다른 5분자는 1 위치와 4 위치에서 글루코시드 결합해 있는 것이 밝혀졌다.
<실험 3-4: 핵자기 공명 분석>
실험 1의 방법으로 얻어진 당질 II 표품을 사용하고, 통상적인 방법에 따라 핵자기 공명(NMR) 분석을 하였다. 1H-NMR 스펙트럼을 도 6에, 13C-NMR 스펙트럼을 도 7에 나타냈다. 1H-NMR 스펙트럼에서의 약 5.20ppm의 시그널, 약 5.00ppm의 시그널, 약 4.99ppm의 시그널, 약 4.97ppm의 시그널, 약 4.96ppm의 시그널, 및 약 4.86ppm의 시그널은 D-글루코오스 잔기의 1 위치 프로톤에 귀속되어, 그 스핀-스핀 결합 정수를 구한 결과, 약 3.49Hz(약 5.20ppm의 시그널), 약 2.57Hz(약 5.00ppm의 시그널), 약 3.13Hz(약 4.99ppm의 시그널), 약 4.04Hz(약 4.97ppm의 시그널), 약 3.86Hz(약 4.96ppm의 시그널), 및 약 3.86Hz(약 4.86ppm의 시그널)이었기 때문에, 1,4 글루코시드 결합해 있는 D-글루코오스 잔기의 1 위치의 아노머형 및 1,6 글루코시드 결합해 있는 D-글루코오스 잔기의 1 위치의 아노머형은 양쪽 모두 α형인 것이 밝혀졌다.
이상의 결과로부터, 당질 II는, 도 8에 나타내는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 글루코 6당, 즉, 이소사이클로말토헥사오스인 것이 밝혀졌다. 이 구조를 가진 당질은 종래 전혀 알려져 있지 않아, 본 발명의 이소사이클로말토헥사오스는 신규의 환상 당질이다.
<실험 4: 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 생산>
실험 1에 기재한 액체 배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크 2개에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃에서 20분간 멸균하여 냉각하고, 바실루스 서큘란스 AM7(FERM BP-10111)을 접종하여, 27℃ 및 230rpm에서 48시간 회전 진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다.
용량 30L의 퍼멘터에 종배양과 동일한 조성의 액체 배지를 약 20L 넣고, 가열 멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 약 200ml을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서, 96시간 통기(通氣) 교반 배양하였다. 배양 후, 퍼멘터로부터 배양액을 뽑아내고, 원심분리(8,000rpm, 20분간)해서 균체를 제거하여, 배양 상청 약 18L을 얻었다.
배양액 및 배양 상청에 대해서, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 활성을 측정한 결과, 배양액 중에는 이 효소 활성을 약 0.027 단위/ml 함유하고, 상청 중에는 이 효소 활성을 약 0.025 단위/ml 함유하는 것을 알 수 있어, 바실루스 서큘란스 AM7에 의해 생산되는 이소사이클로말토올리고당 생성 효소는 그 대부분이 균체 밖에 존재하는 것이 밝혀졌다.
<실험 5: 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 정제>
실험 4에서 얻은 배양 상청 중에서, 약 10L(총 활성 약 250 단위)에, 최종농도 80％ 포화가 되도록 황산 암모늄을 첨가하고, 4℃에서 24시간 방치함으로써 염석(鹽析)하였다. 생성한 염석 침전물을 원심분리(11,000rpm, 30분간)에 의해서 회수하고, 이것을 10mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해 후, 이 완충액에 대하여 투석하여, 조(粗)효소액으로서 약 240ml을 얻었다. 조효소액 중의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 활성은 약 0.96 단위/ml이었다(총 활성 약 230 단위).
이 조(粗)효소액을 일본국의 Tosoh 주식회사제 『DEAE-토요퍼얼(Toyopearl) 650S』 겔을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피(겔 용량 120ml)에 제공하였다. 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 활성이 있는 획분은, 10mM 아세트산(pH 6.0)으로 평형화한 『DEAE-토요퍼얼 650S』 겔에 흡착하지 않고, 비흡착 획분에서 용출하였다. 이 활성획분을 회수하고, 마지막 농도 1M이 되도록 황산 암모늄을 첨가해서 4℃에서 24시간 방치한 후, 원심분리해서 불용물을 제거하고, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『부틸-토요퍼얼 (Butyl-Toyopearl) 650M』 겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔 용량 60ml)에 제공하였다. 이소사이클로말토올리고당 생성 효소가 있는 획분은, 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 아세트산 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 『부틸-토요퍼얼 650M』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 농도 1M로부터 0M의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.1M 부근에서 용출하였다. 이 정제의 각 스텝에서의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 활성, 비활성(比活性) 및 수율을 표 3에 나타낸다.
| 공정 | 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 활성(단위) | 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 비활성 (단위/mg 단백질) | 수율 (％) |
| 배양 상청 | 250 | 0.01 | 100 |
| 황산 암모늄 염석 후의 투석액 | 230 | 0.19 | 92 |
| 이온 교환 칼럼 용출액 | 200 | 0.39 | 80 |
| 소수 칼럼 용출액 | 110 | 6.10 | 44 |
정제한 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 표품을 5 내지 20w/v％ 농도 기울기의 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 단백질 밴드는 단일이어서, 순도가 높은 표품이었다.
<실험 6: 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 성질>
<실험 6-1:분자량>
실험 5의 방법으로 얻은 정제 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(5 내지 20w/v％ 농도 기울기)에 제공하고, 동시에 영동한 분자량 마커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 분자량을 측정한 결과, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 분자량은 106,000±20,000 달톤인 것이 밝혀졌다.
<실험 6-2: 등전점>
실험 5의 방법으로 얻은 정제 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 표품을 2.2w/v％ 앰폴라인(애머샴 바이오사이언스사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 제공하고, 동시에 영동한 등전점 마커(애머샴 바이오사이언스사제)와 비교해서 등전점을 구한 결과, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 등전점은 pI 7.5±0.5인 것이 밝혀졌다.
<실험 6-3: 효소반응의 최적 온도 및 최적 pH>
실험 5의 방법으로 얻은 정제 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 표품을 사용하여 효소 활성에 미치는 온도 및 pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 이들 결과를 도 9(최적 온도) 및 도 10(최적 pH)에 나타냈다.
이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 최적 온도는 pH 6.0에서 30분간의 반응 조건하에서 50 내지 55℃이고, 최적 pH는 30℃에서 30분간의 반응 조건하에서 4.5 내지 8.0인 것이 밝혀졌다.
<실험 6-4: 효소의 온도 안정성 및 pH 안정성>
실험 5의 방법으로 얻은 정제 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 표품을 사용하여 이 효소의 온도 안정성 및 pH 안정성을 조사하였다.
온도 안정성은, 효소용액(10mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 염화 칼슘 비존재하 또는 1mM 존재하에서 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다.
pH 안정성은, 이 효소를 각 pH lOOmM 완충액 중에서 4℃에서 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다.
이들 결과를 도 11(온도 안정성) 및 도 12(pH 안정성)에 나타냈다.
도 11로부터 명확한 바와 같이, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 온도 안정성은, 염화 칼슘 비존재하에서 35℃까지이고, 염화 칼슘 1mM 존재하에서 40℃까지인 것이 밝혀져서, 칼슘 이온에 의해 이 효소의 온도 안정성이 향상하는 것을 알 수 있다. 또한, 도 12로부터 명확한 바와 같이, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 pH 안정성은 pH 4.5 내지 9.0의 범위인 것이 밝혀졌다.
<실험 6-5: 효소 활성에 미치는 금속염의 영향>
실험 5의 방법으로 얻은 정제 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 표품을 사용하고, 효소 활성에 미치는 금속염의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
| 금속염 | 상대활성 (％) | 금속염 | 상대활성 (％) |
| 무첨가 | 100 | NiCl2 | 105 |
| MgCl2 | 110 | CuCl2 | 79 |
| AlCl3 | 106 | ZnCl2 | 113 |
| CaCl2 | 105 | SrCl2 | 100 |
| MnCl2 | 108 | BaCl2 | 99 |
| FeCl2 | 94 | HgCl2 | 55 |
| FeCl3 | 82 | PbCl2 | 130 |
| CoCl2 | 100 | EDTA | 86 |
표 4의 결과로부터 명확한 바와 같이, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 활성은 HgCl2 에 의해서 45％ 저해되고, FeCl3 및 CuCl2에 의해서 약 20％ 저해되는 것이 밝혀졌다. 또한, 금속 이온의 킬레이트제인 EDTA에 의해서도 약간 저해되었다.
<실험 6-6: N 말단 아미노산 서열>
실험 5의 방법으로 얻은 정제 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 표품을 사용하고, 이 효소의 N 말단 아미노산 서열을 프로틴 시퀀서 모델 492HT(어플라이드 바이오시스템즈사제)를 사용해서 분석한 결과, 서열표에서의 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열, 즉, 알라닌-세린-이소로이신-글리신-트레오닌-발린-트레오닌-글루탐산-아스파라긴-아스파라긴산-트레오닌-이소로이신-티로신-글루타민-이소로이신-메티오닌-발린-아스파라긴산-아르기닌-페닐알라닌을 가지고 있는 것이 밝혀졌다.
<실험 6-7: 부분 아미노산 서열>
실험 5의 방법으로 얻은 정제 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 표품을 적당량 취하고, 10mM 트리스-염산 완충액(pH 9.0)에 대하여 4℃에서 18시간 투석한 후, 이 완충액을 가해서 단백질 농도 약 1mg/ml로 하였다. 이 용액을 약 1ml 취하고, 리실 엔도펩티다아제(일본국의 和光純藥 주식회사 판매) 20㎍을 가해서, 30℃에서 20시간 유지해서 효소 단백질을 가수분해하였다.
가수 분해물을, 미리 10％(v/v) 아세토니트릴을 함유하는 0.1％(v/v) 트리플루오로아세트산으로 평형화시켜 둔 HPLC용 칼럼(상품명 『마이크로본다스페아 C18』, 지름 3.9mm × 길이 150mm, 워터즈사제)에 주입하고, 유속 0.9ml/분, 실온의 조건하, 0.1％(v/v) 트리플루오로아세트산-10％(v/v) 아세토니트릴 용액으로부터 0.1％(v/v) 트리플루오로아세트산-50％(v/v) 아세토니트릴 용액의 100분간의 리니어 그래디언트로 통액하여, 펩티드 단편을 분획하였다.
칼럼으로부터 용출한 펩티드 단편은 파장 210nm의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 통액 개시에서부터 약 14분, 약 18분, 약 30분, 약 35분, 약 38분, 약 61분, 약 64분, 약 67분 및 약 82분에서 용출한 9종의 펩티드 단편의 아미노산 서열을 각각 실험 6-6과 동일한 방법으로 분석한 결과, 각각 서열표에서의 서열번호 4 내지 12에 나타내어지는 아미노산 서열을 가지고 있었다.
<실험 7: 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 코드하는 DNA의 클로닝 및 이것을 함유하는 재조합 DNA와 형질 전환체의 제조>
이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 코드하는 DNA를 바실루스 서큘란스 AM7(FERM BP-10111)로부터 클로닝하고, 자율 복제 가능한 재조합 DNA의 작제, 효소를 코드하는 DNA의 염기서열의 결정, 및 형질 전환체의 제조를 실시했다.
<실험 7-1: 염색체 DNA의 제조>
전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #4』, 일본국의 松谷화학공업 주식회사제조) 0.25w/v％, 효모 추출물(상품명 『분말 효모 엑스 S』, 日本製藥 주식회사 판매) 0.2w/v％, 효모 추출물(상품명 『폴리펩톤』, 日本製藥 주식회사 판매) 1.0w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·2수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％, 탄산 칼슘 0.1w/v％ 및 물로 된 액체 배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃에서 20분간 멸균하여 냉각하고, 바실루스 서큘란스 AM7(FERM BP-10111)을 접종하고, 27℃ 및 230rpm에서 5일간 회전 진탕 배양하였다.
원심분리에 의해 배양물로부터 채취한 균체를 TES 완충액(pH 8.0)에 부유시키고, 리소자임을 0.05％(w/v) 가하고, 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다. 처리물을 -80℃에서 1시간 동결 후, TSS 완충액(pH 9.0)을 가해서 60℃로 가온하고, TES 완충액/페놀 혼합액을 가해서, 얼음물 속에서 냉각하면서 10분간 격렬하게 진탕한 후, 원심분리에 의해 상청을 채취하였다.
이 상청에 2배 체적의 냉(冷)에탄올을 가하고, 침전한 조(粗)염색체 DNA를 채취하여 SSC 완충액(pH 7.1)에 용해 후, 리보누클레아제와 프로티나아제를 각각 7.5㎍과 125㎍ 가하고, 37℃에서 1시간 유지해서 반응시켰다.
반응물에 클로로포름/이소아밀 알코올 혼합액을 가해서 염색체 DNA를 추출하고, 냉에탄올을 가해서 생성한 염색체 DNA를 함유하는 침전을 채취하였다. 이렇게 하여 얻은 정제 염색체 DNA를 농도 약 1mg/ml가 되도록 SSC 완충액(pH 7.1)에 용해하고, -80℃에서 동결하였다.
<실험 7-2: PCR에 의한 부분 DNA 단편의 클로닝>
이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 코드하는 DNA의 클로닝을 실시하기에 앞서, 우선, 그 부분 DNA 단편의 PCR-클로닝을 하였다. 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 N 말단 아미노산 서열인 서열표에서의 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열에서의 제10번째 내지 제15번째 및 제13번째 내지 제18번째의 아미노산 서열에 근거하여, 서열표에서의 서열번호 13 및 14로 나타내어지는 2종의 센스 프라이머 Fl 및 F2를 합성하였다. 또한, 이 효소의 내부 아미노산 서열인 서열표에서의 서열번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열에서의 제4번째 내지 제8번째 및 제1번째 내지 제5번째의 아미노산 서열에 근거하여, 서열표에서의 서열번호 15 및 16으로 나타내어지는 2종의 안티센스 프라이머 Rl 및 R2를 합성하였다.
센스 프라이머 Fl과 안티센스 프라이머 Rl의 조합에서, 실험 7-1에서 얻은 염색체 DNA를 주형(鑄型)으로 해서 1회째의 PCR을 통상적인 방법에 따라 실시하였다. 이어서, 얻어진 PCR 산물을 주형으로 해서 센스 프라이머 F2와 안티센스 프라이머 R2의 조합에서 2회째의 PCR을 한 결과, 약 200 염기쌍과 약 300 염기쌍의 2종의 PCR 증폭 DNA 단편이 얻어졌다. PCR 증폭 DNA 단편을, 플라스미드(상품명 「pCR-Script Amp SK(+)」, 스트라타진사 판매)의 제한 효소 Srf I부위에 삽입한 후, 통상적인 컴피텐트 셀법에 의해 컴피텐트 셀(상품명 『Epicurian Coli XL2-Blue』, 스트라타진·클로닝·시스템제)을 형질 전환하였다.
얻어진 형질 전환체로부터 통상적인 알칼리-SDS법에 의해 재조합 DNA를 추출하여, 목적으로 하는 약 300 염기쌍의 삽입 DNA 단편을 가진 재조합 DNA를 유지하는 형질 전환체를 선택하였다. 이어서, 이 재조합 DNA의 염기서열을, 통상적인 디데옥시법에 의해 분석한 결과, 이 재조합 DNA는, 서열표에서의 서열번호 17로 나타내어지는 쇄장(鎖長) 251 염기쌍의 염기서열을 가진 DNA를 함유하고 있었다.
서열표에서의 서열번호 17에 병기된 아미노산 서열의 제37번째 내지 제46번째 및 제47번째 내지 제60번째의 아미노산 서열은, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 부분 아미노산 서열인 서열표에서의 서열번호 6 및 10으로 나타내어지는 아미노산 서열과 완전히 일치하였기 때문에, 상기 DNA 단편은, 바실루스 서큘란스 AM7(FERM BP-10111)에서 유래하는 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 일부를 코드하는 DNA 단편인 것이 밝혀졌다.
<실험 7-3: 콜로니 하이브리다이제이션법에 의한 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 코드하는 DNA의 클로닝>
실험 7-1에서 제조한 정제 염색체 DNA 용액을 0.1ml 취하고, 여기에 제한 효소 Hind III을 약 100 단위 첨가하고, 37℃에서 1시간 반응시켜서 염색체 DNA를 가수분해한 후, 아가로오스 전기 영동법에 의해 약 5,000 내지 9,000 염기쌍으로 이루어진 DNA 단편을 채취하였다. 별도로, 플라스미드 벡터(스트라타진·클로닝·시스템제, 등록상표 『pBluescript II SK(+)』)를 통상적인 방법에 의해 제한 효소 Hind III을 작용시켜 완전히 절단한 후, 그 절단된 플라스미드 벡터 0.5㎍과 앞서 얻은 DNA 단편 약 5㎍을 시판의 키트(일본국의 寶酒造제, 상품명 『DNA 라이게이션·키트』)를 사용하고, 첨부의 설명서에 따라서 조작하여 연결하였다. 얻어진 재조합 DNA를 사용하고, 통상적인 컴피텐트 셀법에 의해 컴피텐트 셀(상품명 『Epicurian Coli XL2-Blue』, 스트라타진·클로닝·시스템제)을 형질 전환해서 Hind III 염색체 DNA 라이브러리를 제작하였다.
이렇게 하여 얻은 형질 전환체를, 통상적인 방법에 의해 제조한, 10g/l 트립톤, 5g/l 효모 엑스, 5g/l 염화 나트륨, 100mg/l 앰피실린 나트륨염, 50mg/l 5-브로모―4-클로로―3-인돌릴-β-갈락토시드를 함유하는 한천 평판 배지(pH 7.0)에 식균(植菌)하고, 37℃에서 24시간 배양 후, 배지 위에 형성된 콜로니 약 655개를 나일론 막(상품명 『Hybond-N+』, 애머샴제) 위에 고정하였다.
별도로, 실험 7-2에서 제조한 재조합 DNA를 제한 효소 Not I 및 Bam HI에 의해서 소화한 후, 통상적인 방법의 아가로오스 겔 전기 영동법에 의해 목적으로 하는 약 300 염기쌍의 DNA 단편을 채취하고, DNA 표지 키트(상품명 「DIG DNA Labeling and Detection Kit」, 로슈·다이애그노스틱 주식회사 판매)를 사용해서 표지하여, DIG (디곡시게닌) 표지 프로브로 하였다.
상기의 나일론 막 위에 고정한 콜로니 655주에 대하여, DIG 표지 프로브를 사용해서 통상적인 콜로니 하이브리다이제이션을 함으로써, 양성(陽性) 클론으로서 1종류의 형질 전환체를 얻었다. 이 형질 전환체를 『BAMHl』로 명명하였다.
<실험 7-4: 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 코드하는 DNA의 염기서열의 결정>
형질 전환체 BAMHl을, 통상적인 방법에 따라 100㎍/ml 앰피실린 나트륨염을 함유하는 L-브로스(broth) 배지(pH 7.0)에 식균하고, 37℃에서 24시간 회전 진탕 배양하였다. 배양 종료 후, 원심분리에 의해 배양물로부터 균체를 채취하고, 통상적인 알칼리-SDS법에 의해 재조합 DNA를 추출하였다.
이 재조합 DNA의 염기서열을 통상적인 디데옥시법에 의해 분석한 결과, 이 재조합 DNA는, 바실루스 서큘란스 AM7(FERM BP-10111)에서 유래하는, 서열표에서의 서열번호 18로 나타내어지는 쇄장(鎖長) 2,985 염기쌍의 염기서열을 가진 DNA를 함유하고 있었다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 이 재조합 DNA에서, 이 DNA는 제한 효소 Hind III에 의한 인식 부위의 하류에 연결되어 있었다. 한편, 이 염기서열로 추정되는 아미노산 서열은, 그 서열번호 18로 나타내어지는 염기서열에 병기한 바와 같으며, 이 아미노산 서열과, 실험 6-6의 방법으로 확인된 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 N 말단 아미노산 서열 및 실험 6-7의 방법에 의해서 밝혀진 부분 아미노산 서열인, 서열표에서의 서열번호 1 및 서열번호 4 내지 12로 나타내어지는 아미노산 서열과 비교한 결과, 서열표에서의 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열은, 서열표에서의 서열번호 18에 병기한 아미노산 서열에서의 제36번째 내지 제55번째의 아미노산 서열과 완전히 일치하였다.
또한, 서열표에서의 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및 12에 나온 아미노산 서열은, 각각 서열표에서의 서열번호 18로 나타내어지는 염기서열에 병기한 아미노산 서열에서의 제126번째 내지 제135번째, 제140번째 내지 제149번째, 제84 번째 내지 제93번째, 제152번째 내지 제163번째, 제806번째 내지 제816번째, 제925번째 내지 제939번째, 제94번째 내지 제107번째, 제185번째 내지 제197번째, 및 제272번째 내지 제286번째의 아미노산 서열과 완전히 일치하였다.
이상은, 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소가 서열표에서의 서열번호 2에 나온 아미노산 서열을 함유하는 것이며, 이 효소는 바실루스 서큘란스 AM7(FERM BP-10111)에 있어서는, 서열표에서의 서열번호 3에 나온 염기서열의 DNA에 의해 코드되어 있는 것을 나타내고 있다. 또한, 서열표에서의 서열번호 18에 병기한 아미노산 서열에서의 제1번째 내지 제35번째의 아미노산 서열은 이 효소의 분비 시그널 서열이라고 추정되었다.
이들로부터, 이 효소의 분비 전의 전구체는, 서열표에서의 서열번호 18에 병기된 아미노산 서열로 이루어지고, 그 아미노산 서열은, 서열표에서의 서열번호 18에 나온 염기서열에 코드되어 있는 것이 밝혀졌다.
이상과 같이 해서 제조하여, 염기서열을 확인한 재조합 DNA를 『pBAMHl』이라고 명명하였다.
<실험 8: 발현용 재조합 DNA pETAM1의 제작과 그 형질 전환체 ETAM1에 의한 재조합형 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 산생>
재조합 DNA 『pBAMHl』중의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 유전자를 발현용 벡터에 삽입하고, 재조합형 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 대장균에서의 발현을 검토하였다.
<실험 8-1: 발현용 재조합 DNA, pETAM1의 제작 및 형질 전환체 ETAM1의 제조>
pBAMHl 중의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 유전자를 발현용 벡터에 구성해 넣을 때에, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 구조 유전자의 상류에 제한 효소 Nde I 인식 부위를 도입하고, 이 구조 유전자 내부에 존재하는 Nde I 인식 부위를 삭제할 목적으로 PCR에 의한 변이(變異)를 도입하였다.
pBAMHl을 주형으로서 이용하고, pBAMHl의 벡터인 pBluescript II SK(+)에서의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 구조 유전자의 상류에 위치하는 염기서열에 근거해서 합성한 서열표에서의 서열번호 19로 나타내어지는 염기서열을 가진 센스 프라이머와 구조 유전자 내부의 Nde I 인식 부위의 염기서열에 근거해서 합성한 서열표에서의 서열번호 22로 나타내어지는 염기서열을 가진 안티센스 프라이머의 조합, 및 구조 유전자 내부의 Nde I 인식 부위의 염기서열에 근거해서 합성한 서열표에서의 서열번호 21로 나타내어지는 염기서열을 가진 센스 프라이머와 구조 유전자의 하류에 위치하는 제한 효소 Bam HI 인식 부위의 염기서열에 근거해서 합성한 서열표에서의 서열번호 23으로 나타내어지는 염기서열을 가진 안티센스 프라이머의 조합에서 1차 PCR을 하여 증폭 DNA 단편을 얻었다.
이어서, 이 얻어진 증폭 DNA 단편을 주형으로 해서 구조 유전자의 상류에 Nde I 인식 부위를 도입하기 위해서 합성한 서열표에서의 서열번호 20으로 나타내어지는 염기서열을 가진 센스 프라이머와 구조 유전자의 하류에 위치하는 제한 효소 Bam HI 인식 부위의 염기서열에 근거해서 합성한 서열표에서의 서열번호 23으로 나타내어지는 염기서열을 가진 안티센스 프라이머의 조합에서 2차 PCR을 하여, 목적으로 하는 Nde I 인식 부위를 구조 유전자의 상류에 가지고, 구조 유전자 내부의 Nde I 인식 부위가 삭제된 사이클로말토올리고당 생성 효소 유전자를 증폭하였다. 통상적인 방법에 의해, 제한 효소 Nde I 및 Bam HI에 의해서 소화한 발현용 벡터 pET-38b(+)(노바젠사제)에, 상기에서 증폭한 DNA를 구성해 넣어서 얻어진 재조합 DNA를 『pETAM1』이라고 명명하였다. pETAM1을 도 14에 나타낸다.
pETAM1을 이용해서 대장균 JMlO9(일본국의 東洋紡 주식회사 판매)를 형질 전환하고, 얻어진 형질 전환체로부터 pETAM1을 제조하고, 발현용 숙주 대장균 BL21(DE3)(노바젠사제)을 형질 전환해서 형질 전환체 『ETAM1』을 제조하였다.
<실험 8-2: 형질 전환체 ETAM1에 의한 재조합형 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 산생>
10g/l 트립톤(상품명 『Bacto-tryptone』, Difco사 판매), 5g/l 효모 엑스(상품명 『Bacto-yeast extract』, Difco사 판매) 및 10g/l 식염 및 물로 된 액체 배지를 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃에서 20분간 멸균하고, 냉각하여 무균적으로 pH 7.5로 조정한 후, 가나마이신 2mg을 무균적으로 첨가해서 액체 배지를 제조하였다.
이 액체 배지에 실험 8-1의 방법으로 얻은 형질 전환체 ETAM1을 접종하고, 27℃에서 회전 진탕 배양해서 혼탁도가 약 0.6에 달한 시점에서 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(IPTG)를 마지막 농도 0.4mM이 되도록 첨가해서 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 유전자의 발현을 유도하고, 다시 3시간 배양하였다. 얻어진 배양물을 통상적인 방법에 따라 원심분리해서 배양 상청과 균체로 분리해서 회수하였다.
균체에 대해서는, 초음파 파쇄법에 의해 세포로부터의 전체 추출물을 제조하였다. 초음파 파쇄법은, 균체를 20mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5)에 현탁한 후, 그 균체 현탁액을 얼음물 속에서 냉각하면서 초음파 호모지나이저(모델 UH-600, 주식회사 에스 엠 테제)로 세포파쇄함으로써 실시하고, 그 파쇄물을 전체 세포 추출물로 하였다.
이렇게 하여 제조한 배양 상청과 전체 세포 추출물에 대해서 각각의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 활성을 측정하고, 각각의 활성값을 배양물 1ml당으로 환산하였다. 또한 대조로서 플라스미드 pET-38b(+)를 유지하는 대장균 BL21(DE3)을 상기의 형질 전환체의 경우와 동일한 조건에서 배양하고, 배양물로부터 배양 상청과 전체 세포 추출물을 제조하여, 마찬가지로 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 활성을 측정하였다. 이들 결과를 표 5에 나타낸다.
| 균주 | 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 활성(단위/ml-배양물) | |
| 배양 상청 | 전체 세포 추출물 | |
| ETAM1(본 발명) | 0.00 | 0.12 |
| 대장균 BL21(DE3) pET-38b(+) (대조) | 0.00 | 0.00 |
표 5의 결과로부터 명확한 바와 같이, 형질 전환체 ETAM1은 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 세포 내에서 산생하는 것이 밝혀졌다. 숙주인 대조의 대장균에서는 배양 상청, 전체 세포 추출물의 어느 것에서도 이 효소 활성은 전혀 나타나지 않았다.
이 실험 8의 방법으로 얻은 전체 세포 추출물을 다시 실험 5에 나타낸 방법에 준하여 염석, 투석하고, DEAE-토요퍼얼 650S겔, 부틸-토요퍼얼 650M겔을 사용한 칼럼 크로마토그래피에 제공해서 정제하고, 또한 이 정제 효소 표품을 실험 6에 나타낸 방법에 준해서 분석하였다. 그 결과, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 의한 분자량은 약 106,000±20,000 달톤, 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 의한 등전점은 약 7.5±0.5, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 활성의 최적 온도는 pH 6.0에서 30분간의 반응 조건하에서 약 50 내지 55℃, 최적 pH는 30℃에서 30분간의 반응 조건하에서 약 4.5 내지 8.0, 온도 안정성은, 각 온도에서 60분간 유지하는 조건하에서, 염화 칼슘 비존재하에서 35℃까지, 1mM 염화 칼슘 존재하에서 약 40℃까지 안정이며, pH 안정성은, 각 pH에서 4℃에서 24시간 유지하는 조건하에서 약 4.5 내지 9.0의 범위에서 안정하였다.
이들 이화학적 성질은, 실험 5에 나타난 방법으로 제조된 이 효소의 그것과 실질적으로 동일하였다.
이상의 결과는, 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소는 재조합 DNA 기술에 의해 양호하게 제조할 수 있는 것을 나타내고 있다.
<실험 9: 각종 당질에의 작용>
각종 당질을 사용하여, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 기질 특이성을 조사하였다. 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, 네오트레할로스, 트레할로오스, 코지비오스, 니게로오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 파노오스, 이소파노오스, 말티톨, 말토트리이톨, α-, β- 또는 γ-사이클로덱스트린, 아밀로오스, 가용성 전분, 글리코겐, 풀룰란 또는 덱스트란을 함유하는 수용액을 제조하였다.
이들 기질 용액에 최종농도 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)과 최종농도 1mM 염화 칼슘을 첨가한 후, 실험 5의 방법으로 얻은 정제 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 표품을 기질 고형물 1 그램당 각각 1 단위씩 첨가하고, 기질 농도를 2w/v％가 되도록 조정하여, 이것을 40℃, pH 6.0에서 24시간 작용시켰다.
효소반응 전후의 반응액 중의 당질을 조사하기 위해서, 전개 용매로서 n-부탄올, 피리딘, 물 혼합액(용량비 6:4:1)을, 또한 박층 플레이트로서 메르크사제 『키젤겔 60』(알루미늄 플레이트, 10×20cm)을 사용하고, 2회 전개하는 실리카겔 박층 크로마토그래피(이하, 간단히 "TLC"라 함)를 실시하여 당질을 분리하였다. 황산-메탄올법으로 발색시켜, 분리한 당질을 검출하고, 각각의 당질에 대한 효소작용의 유무 또는 강도의 정도를 확인하였다. 그 결과를 표 6에 나타낸다.
| 기질 | 작용 | 기질 | 작용 |
| 말토오스 | - | 파노오스 | - |
| 말토트리오스 | + | 이소파노오스 | - |
| 말토테트라오스 | ++ | 말티톨 | - |
| 말토펜타오스 | +++ | 말토트리이톨 | - |
| 말토헥사오스 | +++ | α-사이클로덱스트린 | - |
| 말토헵타오스 | +++ | β-사이클로덱스트린 | - |
| 네오트레할로스 | - | γ-사이클로덱스트린 | - |
| 트레할로오스 | - | 아밀로오스 | +++ |
| 코지비오스 | - | 가용성 전분 | ++ |
| 니게로오스 | - | 글리코겐 | + |
| 이소말토오스 | - | 풀룰란 | - |
| 이소말토트리오스 | - | 덱스트란 | - |
주) 효소반응 전후에서,
-는「변화 없음」을 나타내고,
+는 「기질의 스폿이 약간 감소하고, 이소사이클로말토올리고당의 생성이 나타남」을 나타내고,
++는 「기질의 스폿이 상당히 감소하고, 이소사이클로말토올리고당의 생성이 나타남」을 나타내고,
+++는 「기질의 스폿이 거의 소실하고, 이소사이클로말토올리고당의 생성이 나타남」을 나타낸다.
표 6의 결과로부터 명확한 바와 같이, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소는 시험한 당질 중에서 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스에 잘 작용하고, 또한 말토트리오스에 약간 작용하였다. 또한, 아밀로오스, 가용성 전분, 글리코겐에도 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소는 잘 작용하였다.
이들 결과로부터, 이 효소는 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1,4 글루칸에 작용하는 것이 밝혀졌다.
<실험 10: 작용 메커니즘>
<실험 10-1: 말토헥사오스로부터의 생성물>
최종농도 1w/v％의 말토헥사오스 수용액에 최종농도 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)과 최종농도 1mM 염화 칼슘을 첨가한 후, 실험 5의 방법으로 얻은 정제 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를, 기질 고형물 1 그램당 1 단위 첨가하고, 45℃에서 pH 6.0에서 작용시켜, 경시적으로 샘플링을 하고, 100℃에서 10분간 유지해서 반응을 정지하였다. 이 효소 반응액의 당조성을 HPLC를 이용해서 측정하였다.
HPLC는 칼럼에 『MCIgel CKO4SS』 (일본국의 三菱화학 주식회사 제조)의 2개를 직렬로 연결하고, 용리액으로서 물을 사용하며, 칼럼 온도 80℃, 유속 0.4ml/분의 조건에서 실시하고, 검출은 시차(示差) 굴절계 RID-10A(일본국의 주식회사 島津제작소 제조)를 이용해서 하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.
| 당 질 | 당 조 성(％) | |||
| 반응 전 | 반응 1시간 | 반응 2시간 | 반응 4시간 | |
| 글루코오스 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 말토오스 | 0.0 | 3.4 | 4.7 | 6.1 |
| 말토트리오스 | 0.0 | 7.0 | 8.6 | 9.7 |
| 말토테트라오스 | 0.0 | 5.8 | 7.5 | 8.8 |
| 말토펜타오스 | 1.7 | 8.1 | 9.6 | 10.6 |
| 이소사이클로말토펜타오스 | 0.0 | 5.5 | 8.0 | 10.8 |
| 말토헥사오스 | 97.5 | 41.7 | 29.1 | 19.2 |
| 이소사이클로말토헥사오스 | 0.0 | 0.4 | 0.5 | 0.7 |
| 말토헵타오스 | 0.8 | 4.4 | 5.2 | 6.0 |
| 말토옥타오스 | 0.0 | 3.4 | 4.4 | 5.2 |
| 말토노나오스 | 0.0 | 4.8 | 4.6 | 4.5 |
| 말토데카오스 | 0.0 | 2.8 | 3.3 | 3.6 |
| 말토운데카오스 | 0.0 | 7.3 | 6.9 | 5.7 |
| 기타 | 0.0 | 5.4 | 7.6 | 9.1 |
표 7의 결과로부터 명확한 바와 같이, 이 효소의 작용의 결과, 기질 말토헥사오스로부터, 말토헥사오스보다도 중합도가 낮은 말토올리고당, 이소사이클로말토펜타오스, 이소사이클로말토헥사오스 및 말토헥사오스보다도 중합도가 높은 말토올리고당을 생성하는 것이 밝혀졌다.
이 결과로부터 추측하면, 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소는 말토헥사오스에 작용하여, 말토오스로부터 말토펜타오스까지의 일련의 말토올리고당을 분자 사이에서 α-1,4 전이하여, 글루코오스 중합도 8 이상의 말토올리고당을 함유하는 글루코오스 중합도가 여러가지로 다른 말토올리고당의 생성(불균화 반응)을 촉매함과 동시에, 글루코오스 중합도가 7의 말토올리고당(말토헵타오스)으로부터, 말토펜타오스 단위로 절단하여 분자 내에서 α-1,6 전이하여, 이소사이클로말토펜타오스를 생성하고, 또한 글루코오스 중합도가 8 이상인 말토올리고당으로부터, 말토펜타오스 또는 말토헥사오스 단위로 절단해서 분자 내에서 α-1,6 전이하여, 이소사이클로말토펜타오스 및 이소사이클로말토헥사오스를 생성한다고 추정되었다.
이상으로부터, 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소에 의한 이소사이클로말토올리고당의 반응 메커니즘은 아래와 같이 생각되었다. 이 효소는, 기질로서 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1,4 글루칸에 작용하여, 일련의 말토올리고당을 분자 사이에서 α-1,4 전이하여, 중합도가 상이한 말토올리고당의 생성(불균화 반응)을 촉매한다. 한편, 글루코오스 중합도가 7인 α-1,4 글루칸(말토헵타오스)에 작용할 경우에는, 그 비환원성 말단에서부터 말토펜타오스 단위로 절단하고, 말토펜타오스의 비환원 말단 글루코오스의 6 위치 히드록실기에 환원 말단 글루코오스의 1 위치를 분자 내에서 전이하는 환화반응을 촉매함으로써, 이소사이클로말토펜타오스와 말토오스를 생성한다.
또한, 글루코오스 중합도가 8 이상인 α-1,4 글루칸에 작용할 경우에는, 그 비환원성 말단에서부터 말토펜타오스 또는 말토헥사오스 단위로 절단하고, 말토펜타오스 또는 말토헥사오스의 비환원 말단 글루코오스의 6 위치 히드록실기에 환원 말단 글루코오스의 1 위치를 분자 내에서 전이하는 환화반응을 촉매함으로써, 이소사이클로말토펜타오스 및 이소사이클로말토헥사오스와, 글루코오스 중합도가 5 또는 6 감소한 α-1,4 글루칸을 생성한다.
<실험 11: 각종 기질로부터의 이소사이클로말토올리고당의 생성>
본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 사용하여 각종 당질로부터의 이소사이클로말토올리고당의 생성을 시험하였다. 말토헥사오스, 말토헵타오스, 아밀로오스, 가용성 전분, 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #100』, 일본국의 松谷화학공업 주식회사 제조), 글리코겐(옥수수 유래, 큐피 주식회사 제조)의 각 수용액을 제조하였다.
이들 수용액(최종농도 1.0w/v％)에 최종농도 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)과 최종농도 1mM 염화 칼슘을 첨가한 후, 실험 5의 방법으로 얻은 정제 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 표품을 고형물 1 그램당 1 단위 첨가하고, 이들을 45℃, pH 6.0에서 48시간 작용시킨 후, 그 반응액을 100℃에서 10분간 가열해서 반응을 정지시켰다. 실험 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제로 처리한 후, HPLC에 의해서 이소사이클로말토올리고당을 정량하고, 이소사이클로말토올리고당의 생성율을 구하였다. 이들 결과를 표 8에 나타낸다.
| 기질 | 이소사이클로말토올리고당 생성율(％) | |
| 이소사이클로말토펜타오스 | 이소사이클로말토헥사오스 | |
| 말토헥사오스 | 10.7 | 2.9 |
| 말토헵타오스 | 13.1 | 3.1 |
| 아밀로오스 | 24.8 | 4.0 |
| 가용성 전분 | 23.8 | 4.1 |
| 전분 부분 분해물 | 16.9 | 3.4 |
| 글리코겐 | 11.5 | 3.1 |
표 8의 결과로부터 명확한 바와 같이, 시험한 어느 쪽의 당질로부터도 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 작용에 의해 이소사이클로말토펜타오스 및 이소사이클로말토헥사오스가 생성하였다. 그 생성율의 합계는, 기질이 말토헥사오스인 경우 약 14％로서 낮은 것에 대해서, 기질이 아밀로오스인 경우 약 29％로서 가장 높고, 이어서 가용성 전분, 전분 부분 분해물의 순이었다.
<실험 12: 이소사이클로말토올리고당 생성 반응과 반응 산물의 환원력>
아밀로오스 수용액(최종농도 1.0w/v％)에 최종농도 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)과 최종농도 1mM 염화 칼슘을 첨가한 후, 실험 5의 방법으로 얻은 정제 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 표품을 고형물 1 그램당 1 단위 첨가하고, 이들을 45℃, pH 6.0에서 반응시키고, 효소첨가 직후에 샘플링한 것을 즉시 약 100℃에서 10분간 가열해서 반응을 정지하고, 물로 냉각하여 반응 0시간의 반응액을 얻었다.
계속해서, 반응 1, 2, 3, 4시간 각각의 시점에서 샘플링하고, 즉시 약 100℃에서 10분간 가열해서 반응을 정지하고, 물로 냉각하여 반응 1시간, 반응 2시간, 반응 3시간, 반응 4시간의 각각의 반응액을 얻었다.
얻어진 반응액의 환원당의 양을 소모기·넬슨법으로 측정하고, 전체 당의 양을 안드론 황산법으로 측정하여, 전체 당의 양에서 차지하는 환원당의 양의 비율을 백분율(％)로 나타내고, 환원력으로 하였다. 또한, 반응액을 실험 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제로 처리한 후, HPLC에 의해서 이소사이클로말토올리고당을 정량하고, 이소사이클로말토올리고당의 생성율을 구하였다. 이들 결과를 표 9에 정리하였다.
| 반응시간 (시간) | 환원력 (％) | 이소사이클로말토올리고당 생성율(％) | |
| 이소사이클로말토펜타오스 | 이소사이클로말토헥사오스 | ||
| 0 | 6.9 | 0.0 | 0.0 |
| 1 | 7.1 | 7.8 | 0.0 |
| 2 | 7.0 | 11.7 | 0.5 |
| 3 | 7.0 | 14.4 | 0.6 |
| 4 | 6.9 | 16.2 | 0.7 |
표 9의 결과로부터 명확한 바와 같이, 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 가용성 전분에 작용시켜 이소사이클로말토올리고당류를 생성시킨 결과, 이소사이클로말토올리고당의 생성율이 10％ 이상의 경우라도 환원력의 증가는 0.1％ 정도로서 극히 얼마 안되는 것이 밝혀졌다. 이것은, 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소가 본질적으로 전이·환화 반응을 촉매하는 효소이며, 이들 반응에 즈음해서는 거의 가수분해를 수반하지 않는다는 것을 뜻하고 있다. 전분이나 그 분해물 등에 이 효소를 작용시켜 이소사이클로말토올리고당류를 생성시킬 때, 반응 전의 전분이나 그 분해물의 환원력, 즉 DE를 낮게 해두면, 증가하는 환원력이 얼마 안 되기 때문에, 환원력이 낮은 생성물이 얻어지는 것을 알 수 있었다.
<실험 13: 이소사이클로말토올리고당의 생성에 미치는 이소아밀라아제 및 풀룰라나아제의 첨가 효과>
전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #100』, 일본국의 松谷화학공업 주식회사제) 수용액(최종농도 1w/v％)을 제조하고, 최종농도 20mM 아세트산 완충액(pH 5.5)과 최종농도 1mM 염화 칼슘을 첨가한 후, 실험 5의 방법으로 얻은 정제 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 표품을 고형물 1 그램당 1 단위와, 이소아밀라아제(주식회사 林原 생물화학 연구소 제조)를 고형물 1 그램당 각각 0, 125, 250, 500, 1250 또는 2500 단위 가하고, 45℃에서 pH 5.5에서 24시간 작용시킨 후, 100℃에서 10분간 열처리해서 효소를 실활시켰다.
계속해서, 반응액을 실험 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제로 처리한 후, HPLC에서 이소사이클로말토올리고당을 정량하여, 이소사이클로말토올리고당 생성율을 구하였다. 또한, 이소아밀라아제 대신에 풀룰라나아제(주식회사 林原 생물화학 연구소 제조)를 사용하여, 고형물 1 그램당 각각 0, 1.3, 2.7, 5.3, 13.3 또는 26.7 단위 가하여 동일한 조작을 하고, 이소사이클로말토올리고당 생성율을 구하였다. 이들 결과를 표 10 및 표 11에 나타낸다.
| 이소아밀라아제 첨가량(단위) | 이소사이클로말토올리고당 생성율(％) | |
| 이소사이클로말토펜타오스 | 이소사이클로말토헥사오스 | |
| 0 | 21.1 | 1.8 |
| 125 | 23.5 | 1.8 |
| 250 | 24.4 | 1.9 |
| 500 | 25.3 | 2.0 |
| 1250 | 25.8 | 2.0 |
| 2500 | 25.9 | 2.0 |
| 풀룰라나아제 첨가량(단위) | 이소사이클로말토올리고당 생성율(％) | |
| 이소사이클로말토펜타오스 | 이소사이클로말토헥사오스 | |
| 0.0 | 21.1 | 1.8 |
| 1.3 | 24.9 | 2.0 |
| 2.7 | 25.4 | 2.0 |
| 5.3 | 26.0 | 2.1 |
| 13.3 | 26.4 | 2.2 |
| 26.7 | 26.6 | 2.3 |
표 10 및 표 11의 결과로부터 명확한 바와 같이, 이소아밀라아제 또는 풀룰라나아제를 첨가함으로써, 이소사이클로말토올리고당류의 생성율이 증가하는 것이 밝혀졌다.
<실험 14: 이소사이클로말토올리고당의 생성에 미치는 액화 전분 DE의 영향>
옥수수 전분을 농도 2 질량％ 전분유(澱粉乳)로 하고, 여기에 탄산 칼슘을 0.1 질량％ 첨가해서 pH 6.0으로 조정하고, α-아밀라아제(노보사 제조, 상품명 『터마밀 60L』)를 전분 그램당 0.2, 0.4, 0.6, 1.0, 1.5 또는 2.0 질량％ 가하고, 각각 95℃에서 10분간 반응시킨 다음에, 120℃에서 오토클레이브하고, 약 40℃로 급냉하여 DE 3.1 내지 20.4의 표 10에 나타내는 6종류의 전분 액화액을 얻었다.
이들 전분 액화액(최종농도 1 질량％)에, 실험 5의 방법으로 얻은 정제 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 표품을 고형물 1 그램당 1 단위 첨가하고, 45℃에서 pH 6.0에서 48시간 작용시킨 후, 그 반응액을 10분간 펄펄 끓여서 반응을 정지시켰다. 이들 열실활시킨 반응액 중의 이소사이클로말토올리고당류의 생성량을 조사하기 위해서, 실험 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제를 첨가해서 반응시킨 후, HPLC에서 이소사이클로말토올리고당을 정량하여, 이소사이클로말토올리고당 생성율을 구하였다. 이들 결과를 표 12에 나타낸다.
| α-아밀라아제 사용량 (질량％/g-전분) | DE | 이소사이클로말토올리고당 생성율(％) | |
| 이소사이클로말토펜타오스 | 이소사이클로말토헥사오스 | ||
| 0.2 | 3.1 | 17.1 | 3.5 |
| 0.4 | 4.8 | 13.5 | 2.9 |
| 0.6 | 7.9 | 11.8 | 2.7 |
| 1.0 | 12.6 | 10.1 | 2.6 |
| 1.5 | 17.4 | 8.3 | 2.4 |
| 2.0 | 20.0 | 6.3 | 1.8 |
표 12의 결과로부터 명확한 바와 같이, 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소에 의한 이소사이클로말토올리고당류의 생성율은, 액화 전분의 DE에 의해 영향을 받고, DE가 낮은 값일수록, 이소사이클로말토올리고당의 생성율은 높고, 반대로, DE가 최고치일수록, 이소사이클로말토올리고당의 생성율이 낮은 것이 밝혀졌다. 구체적으로는, 액화 전분의 DE는 약 20 이하, 바람직하게는 DE 약 8 이하, 더욱 바람직하게는 DE 약 5 이하가 적합하다는 것이 밝혀졌다.
<실험 15: 이소사이클로말토올리고당의 열안정성>
실험 11의 방법으로 가용성 전분으로부터 제조하고, 실험 1의 방법으로 순도 100％까지 정제해서 얻은 이소사이클로말토펜타오스를 탈이온수에 용해하여, 농도 5w/v％의 이소사이클로말토펜타오스 용액을 제조하였다.
이 용액 8ml을 유리제 시험관에 넣고, 밀봉한 후, 120℃에서 30 내지 90분간 가열하였다. 방냉 후, 이들 용액의 착색도의 측정과, HPLC법에 의한 이소사이클로말토펜타오스의 순도측정을 하였다. 착색도는 480nm에서의 1cm셀에서의 흡광도로 하였다. 그 결과를 표 13에 나타냈다.
| 가열시간 (분) | 착색도 (A 480nm) | 순도(％) |
| 0 | 0.00 | 100 |
| 30 | 0.00 | 100 |
| 60 | 0.00 | 100 |
| 90 | 0.01 | 100 |
표 13의 결과로부터 명확한 바와 같이, 이소사이클로말토펜타오스 수용액은 120℃의 고온가열에 있어서도 착색하지 않고, 분해에 의한 순도 저하도 나타나지 않아, 이소사이클로말토펜타오스는 열에 대하여 안정한 당질인 것이 밝혀졌다.
<실험 16: 이소사이클로말토올리고당의 pH 안정성>
실험 15에서 사용한 이소사이클로말토펜타오스를 각종 완충액에 용해하고, 이소사이클로말토펜타오스 농도 4w/v％, pH를 2 내지 10으로 조정한 9종류의 이소사이클로말토펜타오스 용액을 제조하였다. 각각의 용액 8ml을 유리제 시험관에 취하고, 밀봉한 후, 100℃에서 24시간 가열하였다. 방냉 후, 실험 15와 마찬가지로 이들 용액의 착색도의 측정과, HPLC법에 의한 이소사이클로말토펜타오스의 순도측정을 하였다. 그 결과를 표 14에 나타냈다.
| pH | 완충액의 종류 | 착색도(A 480nm) | 순도(％) |
| 2.0 | 아세트산 | 0.00 | 0 |
| 3.0 | 아세트산 | 0.00 | 34.9 |
| 4.0 | 아세트산 | 0.00 | 89.9 |
| 5.0 | 아세트산 | 0.00 | 99.4 |
| 6.0 | 아세트산 | 0.00 | 100 |
| 7.0 | 붕산 | 0.00 | 100 |
| 8.0 | 암모늄 | 0.00 | 100 |
| 9.0 | 암모늄 | 0.01 | 100 |
| 10.0 | 암모늄 | 0.01 | 99.6 |
표 14로부터 명확한 바와 같이, 이소사이클로말토펜타오스는 100℃, 24시간의 가열에서 pH 5 내지 10의 범위에서 실질적으로 분해되지 않고, 약산성으로부터 알카리성의 넓은 범위에서 안정하다는 것을 알 수 있다. 그러나 pH 4에서는 약간, pH 3에서는 반 이상이 분해되고, pH 2에서는 완전히 분해되어 소실하였다.
<실험 17: 아미노카르보닐 반응>
실험 15에서 사용한 이소사이클로말토펜타오스와 시판 시약 특급 글리신을 탈이온수에 용해하고, 또한 인산 완충액으로 pH 7.0으로 조정한 1w/v％ 글리신을 함유하는 5w/v 이소사이클로말토펜타오스 용액을 제조하였다.
대조로서, 이소사이클로말토펜타오스 대신에 α-사이클로덱스트린을 사용한 이외는 상기와 마찬가지로 해서 α-사이클로덱스트린 함유 용액을 제조하였다.
각각의 용액 4ml을 유리제 시험관에 취하고, 밀봉한 후, 120℃에서 30 내지 90분간 가열하였다. 실내에서 방냉 후, 이들의 착색도를 측정해서 아미노카르보닐 반응성을 조사하였다. 동시에 글리신만을 함유하는 용액을 마찬가지로 가열해서 블랭크로 하였다.
착색도는 480nm에서의 1cm 셀에서의 흡광도로 하고, 블랭크의 값을 뺀 값으로 하였다. 그 결과를 표 15에 나타낸다.
| 가열시간 (분) | 착색도 (A 480nm) | |
| 이소사이클로말토펜타오스 | α-사이클로덱스트린 | |
| 0 | 0.00 | 0.02 |
| 30 | 0.00 | 0.02 |
| 60 | 0.00 | 0.03 |
| 90 | 0.00 | 0.02 |
표 15의 결과로부터 명확한 바와 같이, 이소사이클로말토펜타오스는 착색도의 상승을 나타내지 않고, 대조인 α-사이클로덱스트린과 마찬가지로 글리신 공존하에서 가열해도 착색, 갈변을 일으키기 어려운, 아미노카르보닐 반응성이 낮은 안정한 당질인 것을 알 수 있다.
<실험 18: 아미노카르보닐 반응>
실험 15에서 사용한 이소사이클로말토펜타오스와 시판 폴리펩톤(日本製藥제)을 탈이온수에 용해하고, 5w/v％ 폴리펩톤을 함유하는 5w/v 이소사이클로말토펜타오스 용액을 제조하였다.
대조로서, 이소사이클로말토펜타오스 대신에 α-사이클로덱스트린을 사용한 이외는 상기와 마찬가지로 해서 α-사이클로덱스트린(α-CD) 함유 용액을 제조하였다.
각각의 용액 4ml을 유리제 시험관에 취하고, 밀봉한 후, 120℃에서 30 내지 90분간 가열하였다. 실내에서 방냉 후, 이들의 착색도를 측정해서 아미노카르보닐 반응성을 조사하였다. 동시에 폴리펩톤만을 함유하는 용액을 마찬가지로 가열해서 블랭크로 하였다.
착색도는 480nm에서의 1cm셀에서의 흡광도로 하고, 블랭크의 값을 뺀 값으로 하였다. 그 결과를 표 16에 나타낸다.
| 가열시간 (분) | 착색도 (A 480nm) | |
| 이소사이클로말토펜타오스 | α-사이클로덱스트린 | |
| 0 | 0.00 | 0.01 |
| 30 | 0.02 | 0.03 |
| 60 | 0.02 | 0.04 |
| 90 | 0.02 | 0.06 |
표 16의 결과로부터 명확한 바와 같이, 이소사이클로말토펜타오스의 착색도는 약간 정도이고, 대조인 α-사이클로덱스트린과 마찬가지로, 폴리펩톤 공존 하에서 가열해도 착색, 갈변을 일으키기 어려운, 아미노카르보닐 반응성이 낮은 안정한 당질인 당질인 것을 알 수 있다.
<실험 19: 이소사이클로말토올리고당의 포접 작용>
실험 15에서 사용한 이소사이클로말토펜타오스를 탈이온수에 용해하여 20 질량％ 수용액을 제조하였다. 이 수용액 20ml당, 향기성분의 구체적인 예로서, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올의 4종의 단쇄(短鎖) 알코올, 아세트산, 프로피온산, n-부티르산 및 n-발레르산의 4종의 단쇄 지방산, 및 벤질 알코올, 페네틸 알코올, 4-페닐1-프로판올 및 o-크레졸의 4종의 방향족 화합물을 각각 이소사이클로말토펜타오스에 대하여 몰 환산으로 3배량 가하고 균일히 교반하여 포접시켰다. 그 후, 각각을 여과하고, 여액을 동결 건조해서 미(未)포접물을 제거하였다. 동결 건조물 중의 포접물의 양을 측정하기 위해서, 각각의 동결 건조물에 대해서 화합물을 가스 크로마토그래피법으로 정량하였다.
대조로서 α-사이클로덱스트린(α-CD)을 사용하고, 마찬가지로 시험하였다. 그 결과를 표 17에 나타낸다.
| 포접물 | 포접량(mg/g-동결 건조물) | ||
| 이소사이클로말토펜타오스 | α-사이클로덱스트린 (α-CD) | ||
| 단쇄(短鎖) 알코올 | 메탄올 | 33.5 | 16.7 |
| 에탄올 | 57.6 | 36.7 | |
| 프로판올 | 69.2 | 66.8 | |
| 부탄올 | 82.7 | 79.5 | |
| 단쇄(短鎖) 지방산 | 아세트산 | 82.4 | 15.1 |
| 프로피온산 | 91.4 | 16.6 | |
| n-부티르산 | 69.9 | 13.2 | |
| n-발레르산 | 48.3 | 45.0 | |
| 방향족 화합물 | 벤질 알코올 | 61.9 | 165.7 |
| 페네틸 알코올 | 10.0 | 144.4 | |
| 4-페닐1-프로판올 | 225.2 | 171.5 | |
| o-크레졸 | 151.5 | 49.5 | |
표 17의 결과로부터 명확한 바와 같이, 이소사이클로말토펜타오스는, 단쇄 알코올, 단쇄 지방산 및 방향족 화합물 등의 각종 화합물의 포접능(包接能)을 가지고 있는 것을 알 수 있었다. 메탄올, 에탄올, 아세트산, 프로피온산, n-부티르산의 포접량에 관해서는, α-사이클로덱스트린보다도 이소사이클로말토펜타오스쪽이 많았다. 이소사이클로말토펜타오스는 방향족 화합물의 포접능(包接能)도 나타냈지만, 그 포접량은 포접되는 화합물의 종류에 따라 크게 달랐다.
<실험 20: 이소사이클로말토올리고당의 소화성 시험>
실험 15에서 사용한 이소사이클로말토펜타오스에 대해서, 일본 영양 식량 학회지, 제43권, 제23 내지 제29 페이지(1990)에 기재한 오카다 등의 방법에 준하여, 시험관 내에서의 타액 아밀라아제, 인공 위액, 췌액 아밀라아제, 및 소장 점막 효소에 의한 소화성을 조사하였다.
대조로서, 마찬가지로 환상 당질인 α-, β-, 및 γ-사이클로덱스트린을 사용하여 마찬가지로 소화성을 조사하였다. 그 결과를 표 18에 나타낸다. 또한 표 중의 분해율(％)은 상기의 각 소화 반응에서, 아래의 식으로 산출되는 값을 의미한다.
분해율(％）＝ [(반응액 중의 환원당의 양)/(반응액 중의 전체 당의 양)]×100
| 소화효소 | 분해율(％） | |||
| 이소사이클로말토 펜타오스 | α-CD | β-CD | γ-CD | |
| 타액 아밀라아제 | 0 | 0 | 0 | 0.1 |
| 인공 위액 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 췌액 아밀라아제 | 0 | 0 | 0.2 | 5.4 |
| 소장 점막 효소 | 0.2 | 0.2 | 1.1 | 57.4 |
표 18의 결과로부터 명확한 바와 같이, 이소사이클로말토펜타오스는, α- 및 β-사이클로덱스트린과 마찬가지로, 타액 아밀라아제, 인공 위액, 췌액 아밀라아제, 및 소장 점막 효소 중의 어느 것에 의해서도 실질적으로 소화되지 않는 것이 밝혀졌다. 한편, γ-사이클로덱스트린은 췌액 아밀라아제 및 소장 점막 효소에 의해 부분적으로 소화되었다. 이소사이클로말토펜타오스는 난(難)소화성의 당질이었다.
<실험 21: 급성 독성 시험>
실험 15에서 사용한 이소사이클로말토펜타오스를 마우스에 경구투여하여 급성 독성 시험을 하였다. 그 결과, 이소사이클로말토펜타오스는 저독성의 물질로서, 투여가능한 최대 투여량에 있어서도 사망예는 나타나지 않고, 그 LD50값은 5g/kg-마우스 체중 이상이었다.
이하, 실시예에 의해 더욱 상세히 본 발명을 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다.
<실시예 1>
바실루스 서큘란스 AM7(FERM BP-10111)을 실험 1의 방법에 준하여 종배양하였다. 계속해서, 용량 30L의 퍼멘터에, 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #4』, 일본국의 松谷화학공업 주식회사제조) 1.5w/v％, 효모 추출물(상품명 『폴리펩톤』, 日本製藥 주식회사 제조) 0.5w/v％, 효모 추출물(상품명 『효모 엑스 S』, 日本製藥 주식회사 제조) 0.1w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·2수화물 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수화물 0.05w/v％, 탄산 칼슘 0.3w/v％, 및 물로 된 액체 배지를 약 20L 넣고, 가열 멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고, 온도 27℃, pH 5.5 내지 8.0로 유지하면서 96시간 통기 배양하였다.
배양 후, SF막을 이용해서 제균여과하여 약 18L의 배양 여액(濾液)을 회수하고, 다시 이 여액을 UF막 농축하여 약 0.41 단위/ml의 본 발명의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 함유하는 농축 효소액 약 1L을 회수하였다.
<실시예 2>
감자 전분유(澱粉乳)를 농도 약 1 질량％ 전분유로 하고, 여기에 최종농도 1mM이 되도록 염화 칼슘을 첨가하여 pH 6.0으로 조정하고, 95℃에서 약 20분간 가열해서 호화(糊化)를 한 다음에, 약 40℃로 냉각하고, 여기에 실시예 1의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 함유하는 농축 효소액을 전분 고형물 1 그램당 2.44ml(약 1 단위)의 비율이 되도록 첨가하여 pH 6.0, 온도 40℃에서 48시간 반응시켰다. 이 반응액을 95℃로 가열해서 30분간 유지한 후, 냉각하고, 여과해서 얻어지는 여액을, 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축해서 농도 65 질량％의 이소사이클로말토올리고당 함유 시럽을 고형물당 수율 약 90％로 얻었다.
이 제품은, 고형물당, 이소사이클로말토올리고당류를 27.5 질량％, 기타의 당질을 72.5 질량％ 함유하고 있고, 저환원성이며, 적당한 점도를 가지므로, 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
<실시예 3>
타피오카 전분을 농도 약 1 질량％ 전분유(澱粉乳)로 하고, 여기에 농도 0.1 질량％가 되도록 탄산 칼슘을 첨가하여 pH 6.0으로 조정하고, 여기에 α-아밀라아제(노보사 제조, 상품명 『터마밀 60L』)를 전분 고형물 그램당 0.2 질량％가 되도록 첨가하여 95℃에서 10분간 반응시키고, 이어서 120℃에서 20분간 오토클레이브하고, 약 40℃로 급냉해서 DE 약 3의 액화 용액을 얻어, 여기에 실시예 1의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 함유하는 농축액을 전분 고형물 1 그램당 2.44ml(약 1 단위)와 이소아밀라아제(주식회사 林原 생물화학 연구소 제조)를 전분 고형물 1 그램당 1000 단위의 비율이 되도록 가하고, pH 6.0, 온도 40℃에서 48시간 반응시켰다. 이 반응액을 95℃로 가열해서 30분간 유지한 후, 냉각하고, 여과해서 얻어지는 여액을, 통상적인 방법에 따라, 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축함으로써, 고형물당 이소사이클로말토올리고당류를 31.5％ 함유하는 농도 60 질량％의 시럽을 얻었다. 얻어진 시럽을 당액으로 해서, 강산성 양이온 교환 수지(앰버라이트 CR-1310, Na형, 오르가노 주식회사 제조)를 사용한 칼럼 분획을 하였다.
즉, 수지를 내경 5.4cm의 쟈켓 부착 스테인레스제 칼럼 4개에 충전하고, 직렬로 연결해서 수지층 전장(全長)을 20m로 하였다. 칼럼 내 온도 60℃로 유지하면서, 당액을 수지에 대하여 5v/v％ 첨가하고, 여기에 60℃의 온수를 SV O.13에서 흘려서 분획하고, 용출액의 당조성을 HPLC법으로 모니터하여, 이소사이클로말토올리고당 함유 획분을 함유하는 저분자 획분을 채취하고, 정제하여 농축하고, 분무건조함으로써, 이소사이클로말토올리고당 함유 분말을 고형물당 수율 약 54％로 얻었다.
이 제품은, 고형물당, 이소사이클로말토올리고당류를 51.5 질량％, 기타의 당질을 48.5 질량％ 함유하고 있고, 저환원성이어서, 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
<실시예 4>
옥수수 전분을 농도 약 1 질량％의 전분유(澱粉乳)로 하고, 여기에 농도 0.1 질량％가 되도록 탄산 칼슘을 가하여 pH 6.0으로 조정하고, 여기에 α-아밀라아제(상품명 『네오스피타제』, 나가세 생화학 공업 주식회사제)를 전분 고형물 그램당 0.2％가 되도록 가하고, 85 내지 90℃에서 20분간 반응시키고, 이어서 120℃에서 20분간 오토클레이브하고, 약 40℃로 급냉해서 DE 약 3의 액화 용액을 얻어, 여기에 실시예 1의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 함유하는 농축액을 전분 고형물 1 그램당 2.44ml(약 1 단위)와 이소아밀라아제(주식회사 林原 생물화학 연구소 제조)를 전분 고형물 1 그램당 1000 단위의 비율이 되도록 가하고, pH 6.0, 온도 40℃에서 48시간 반응시켰다.
이 반응액을 95℃로 가열해서 30분간 유지한 후, pH 5.0, 온도 50℃로 하고, 여기에 α-글루코시다아제(상품명 『트란스글루코시다아제 L 「아마노」』, 일본국의 天野 엔자임 주식회사제)를 전분 1 그램당 1000 단위 및 글루코아밀라아제(상품명 『글루코치무』, 나가세 생화학 공업 주식회사제)를 전분 1 그램당 100 단위의 비율이 되도록 가해서, pH 5.0, 온도 50℃에서 16시간 반응시켰다. 이 반응액을 95℃로 가열해서 30분간 유지한 후, 냉각하고, 여과해서 얻어지는 여액을, 통상적인 방법에 따라, 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축하여, 농도 60 질량％의 이소사이클로말토올리고당 함유 시럽을 고형물당 수율 약 95％로 얻었다.
이 제품은, 고형물당, 이소사이클로말토올리고당류 32.6 질량％, 글루코오스 63.0 질량％, 및 그 밖의 당질을 4.4 질량％ 함유하고 있고, 저환원성이며, 적당한 점도를 가지고 있어, 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
<실시예 5>
실시예 4의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 함유 시럽을 오토클레이브에 넣고, 촉매로서 라네이 니켈을 고형분에 대하여 약 9 질량％ 첨가하고, 교반하면서 온도를 130℃로 올리고, 수소압을 75kg/cm2로 올려서 수소첨가함으로써, 이소사이클로말토올리고당 함유 시럽에 함유되는 글루코오스 및 그 밖의 환원성 당질을, 이들의 당 알코올로 변환하였다. 이 반응액으로부터 라네이 니켈을 제거하고, 통상적인 방법에 의해 탈색, 탈염해서 정제하여 농축하고, 진공건조하여 분쇄함으로써, 이소사이클로말토올리고당 함유 분말을 고형물당 수율 약 90％로 얻었다.
이 제품은, 고형물당, 이소사이클로말토올리고당 32.5 질량％, 소르비톨 63.2 질량％, 및 그 밖의 당 알코올을 4.3 질량％ 함유하고 있어, 실질적으로 환원력을 나타내지 않고, 아미노카르보닐 반응을 일으키기 어려우므로 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
<실시예 6: 감미료>
실시예 3의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 함유 분말 0.8 질량부에, 트레할로오스 함수결정(주식회사 林原상사 판매, 등록상표 『Treha』) 0.2 질량부, α-글리코실스테비오시드(일본국의 東洋精糖 주식회사 판매, 상품명 『αG 스위트』) 0.01 질량부, 및 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르(상품명 『아스파르테임』) 0.01 질량부를 균일하게 혼합하고, 과립 성형기에서 과립상 감미료를 얻었다.
이 제품은, 감미의 질이 우수하고, 수크로오스의 약 2배의 감미도를 가지고 있다. 이 제품은, 실온 보존 하, 변질 열화의 우려도 없이 안정한 감미료로서 적합하다.
<실시예 7: 하드 캔디>
농도 55％ 수크로오스 용액 100 질량부에 실시예 4의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 함유 시럽 50 질량부를 가열 혼합하고, 이어서 감압하에서 수분 2％ 미만이 될 때까지 가열 농축하고, 여기에 시트르산 0.6 질량부 및 적당량의 레몬 향료와 착색료를 혼화하여, 통상적인 방법에 따라서 성형하여 제품을 얻었다.
이 제품은 씹는 느낌, 정미, 풍미도 양호하고, 수크로오스의 결정 석출도 일으키지 않으며, 흡습성이 적고, 끈적거림도 없는, 안정하고도 고품질의 하드 캔디이다.
<실시예 8: 츄잉 검>
츄잉 검 베이스 3 질량부를 연해질 정도로 가열 용융하고, 여기에 무수 말티톨 2 질량부, 크실리톨 2 질량부, 실시예 5의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 함유 분말 2 질량부, 및 트레할로오스 함수결정 1 질량부를 가하고, 더욱이 적당량의 향료와 착색료를 혼합하여, 통상적인 방법에 따라 롤에 의해 섞어 개고, 성형, 포장해서 제품을 얻었다.
이 제품은, 텍스처, 정미, 풍미 양호하고, 낮은 충치 유발성, 저칼로리의 츄잉 검으로서 적합하다.
<실시예 9: 가당 연유>
원유(原乳) 100 질량부에 실시예 2의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 함유 시럽 4 질량부 및 수크로오스 2 중량부를 용해하여 플레이트 히터에서 가열 살균하고, 이어서 농도 70％로 농축하여, 무균상태로 통조림함으로써 제품을 얻었다.
이 제품은, 온화한 감미로서 풍미도 좋아, 프루츠, 커피, 코코아, 홍차 등의 조미용으로 유리하게 이용할 수 있다.
<실시예 10: 유산균 음료>
탈지 분유 175 질량부, 실시예 3의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 함유 분말 100 질량부 및 락토수크로오스 고함유 분말(주식회사 林原상사 판매, 등록상표 『乳果 올리고』)을 물 1,500 질량부에 용해하고, 65℃에서 30분간 살균하여, 40℃로 냉각 후, 여기에 통상적인 방법에 따라, 유산균의 스타터를 30 질량부 식균하고, 37℃에서 8시간 배양해서 유산균 음료를 얻었다.
이 제품은, 풍미 양호하고, 올리고당, 이소사이클로말토올리고당을 함유하며, 유산균을 안정하게 유지할 뿐만 아니라, 비피더스균 증식 촉진 작용, 정장 작용을 가진 유산균 음료로서 적합하다.
<실시예 11: 분말 쥬스>
분무건조에 의해 제조한 오렌지 과즙분말 33 질량부에 대하여, 실시예 5의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 함유 분말 50 질량부, 무수결정 말티톨 10 질량부, 무수 시트르산 0.65 질량부, 말산 0.1 질량부, 2-0-α-글루코실―L-아스코르브산 0.2 질량부, 시트르산 소오다 0.1 질량부, 풀룰란 0.5 질량부 및 분말 향료의 적당량을 잘 혼합 교반하고, 분쇄해서 미분말로 해서, 이것을 유동층 조립기(造粒機)에서 배풍(排風) 온도 40℃로 하고, 여기에 실시예 2의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 함유 시럽을 바인더로 해서 적당량 스프레이하여 30분간 조립(造粒)하고, 계량하여 포장해서 제품을 얻었다.
이 제품은 과즙 함유율 약 30％의 분말 쥬스이다. 또한, 이 제품은, 이상한 맛, 이상한 냄새가 없고, 고품질이어서, 저칼로리의 쥬스로서 상품가치가 높은 것이다.
<실시예 12: 커스터드 크림>
콘 스타치 100 질량부, 실시예 2의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 함유 시럽 100 질량부, 트레할로오스 함수결정 60 질량부, 수크로오스 40 질량부, 및 식염 1 질량부를 충분히 혼합하고, 계란 280 질량부를 가해서 교반하고, 여기에 끓인 우유 1,000 질량부를 서서히 첨가하고, 다시 불로 가열하면서 교반을 계속하여 콘 스타치가 완전히 호화해서 전체가 반투명해졌을 때에 가열을 중지하고, 이것을 냉각해서 적당량의 바닐라 향료를 가해서, 계량, 충전, 포장하여 제품을 얻었다.
이 제품은, 매끈매끈한 광택을 가지고, 풍미 양호하며, 전분의 노화도 억제되어, 고품질의 커스터드 크림이다.
<실시예 13: 햄>
돼지 넓적다리 고기 1,000 질량부에 식염 15 질량부 및 질산 칼륨 3 질량부를 균일하게 갈아 혼합하고, 냉실에서 1주야 퇴적한다. 이것을 물 500 질량부, 식염 100 질량부, 질산 칼륨 3 질량부, 실시예 5의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 함유 분말 40 질량부 및 향신료로 이루어진 염지액(鹽漬液)에 냉실에서 7일간 담그고, 이어서 통상적인 방법에 따라, 냉수로 세정하여, 끈으로 감아 졸라서 훈연(熏煙)하고, 쿠킹하여, 냉각, 포장해서 제품을 얻었다.
이 제품은 색조도 좋고, 풍미 양호한 고품질의 햄이다.
<실시예 14: 분말 펩티드>
40％ 식품용 대두 펩티드 용액(일본국의 不二製油 주식회사 판매, 상품명 『하이뉴토 S』) 1 질량부에, 실시예 3의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 함유 분말 2 질량부를 혼합하고, 플라스틱제 배트에 넣어, 50℃에서 감압건조하고, 분쇄해서 분말 펩티드를 얻었다.
이 제품은 풍미 양호하고, 프리믹스, 빙과 등의 저칼로리 제과재료로서 유용할 뿐만 아니라, 경구 유동식, 경관 유동식을 위한 난(難)소화성의 식물(食物) 섬유, 정장제량으로서도 유용하다.
<실시예 15: 화장용 크림>
모노스테아르산 폴리옥시에틸렌 글리콜 2 질량부, 자기 유화형 모노스테아르산 글리세린 5 질량부, 실시예 5의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 함유 분말 2 질량부, α-글루코실 루틴(주식회사 林原 판매, 상품명 αG 루틴) 1 질량부, 유동 파라핀 1 질량부, 트리옥탄산 글리세린 10 질량부 및 방부제 적당량을 통상적인 방법에 따라서 가열 용해하고, 여기에 L-락트산 2 질량부, 1,3-부틸렌 글리콜 5 질량부 및 정제수 66 질량부를 가하고, 호모게나이저에 의해 유화(乳化)하고, 다시 향료 적당량을 가해서 교반 혼합하여 화장용 크림을 제조하였다.
이 제품은, 항산화성을 가지고, 안정성은 높으며, 고품질의 햇볕에 탐 방지, 피부 미화제, 색백제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
<실시예 16: 치약>
제2인산 칼슘 45 질량부, 라우릴 황산 나트륨 1.5 질량부, 글리세린 25 질량부, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 라우레이트 0.5 질량부, 실시예 3의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 함유 분말 10 질량부, 사카린 0.02 질량부를 물 18 질량부와 혼합해서 치약을 얻었다.
이 제품은, 계면 활성제의 세정력을 떨어지게 함이 없고, 싫은 맛을 개량하며, 사용 후 느낌도 양호하다.
<실시예 17: 유동식용 고체 제제>
실시예 2의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 함유 시럽 100 질량부, 트레할로오스 함수결정 200 질량부, 말토테트라오스 고함유 분말 200 질량부, 분말난황 270 질량부, 탈지 분유 209 질량부, 염화 나트륨 4.4 질량부, 염화 칼륨 1.8 질량부, 황산 마그네슘 4 질량부, 티아민 0.01 질량부, L-아스코르브산 나트륨 0.1 질량부, 비타민 E 아세테이트 0.6 질량부 및 니코틴산 아미드 0.04 질량부로 이루어진 배합물을 제조하고, 이 배합물 25 그램씩을 방습성 라미네이트 작은 자루에 충전하여, 히이트 시일해서 제품을 얻었다.
이 제품은 유동식으로서 경구적, 또는 비강, 위, 장 등에 경관적 사용 방법에 의해 이용되어, 생체에의 에너지 보급용으로 유리하게 이용할 수 있다.
<실시예 18: 외상 치료용 고약>
실시예 5의 방법으로 얻은 이소사이클로말토올리고당 함유 분말 100 질량부 및 말토오스 300 질량부에, 요오드 3 질량부를 용해한 메탄올 50 질량부를 가해서 혼합하고, 다시 10w/v％ 풀룰란 수용액 200 질량부를 더해서 혼합하여, 적당한 정도의 퍼짐성과 부착성을 나타내는 외상 치료용 고약을 얻었다.
이 제품은 경시 변화가 적은 상품가치가 높은 고약이다. 또한, 이 제품은 요오드에 의한 살균 작용뿐만 아니라, 말토오스에 의한 세포에의 에너지 보급제로서도 작용하므로 치유 기간이 단축되고, 창면(創面)도 깨끗하게 낫는다.
본 발명에 의하면, 종래 미지였던 아래의 일반식 1로 나타내어지는 구조를 가진 신규의 이소사이클로말토올리고당을, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 사용해서 대량으로 제조하여 제공하는 것이 가능해진다. 전혀 신규인 이소사이클로말토올리고당의 제공을 가능하게 하는 본 발명은, 음식물, 화장품, 의약품 등의 여러 가지 이용 분야에 공헌하는 것이 되어, 그 산업적 의의는 극히 크다.
일반식 1:
Cyclo{→6)-[α-D-Glcp -(1→4)]n-α-D-Glcp -(1→}
(위의 식에서 n은 4 또는 5를 의미한다.)
<110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
<120> Isocyclomaltooligosaccharides, isocyclomaltooligosaccharide-forming
enzyme, their preparation and uses
<130> 10107902
<150> JP2004-278971
<151> 2004-09-27
<160> 23
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Bacillus circulans
<400> 1
Ala Ser Ile Gly Thr Val Thr Glu Asn Asp Thr Ile Tyr Gln Ile Met
1 5 10 15
Val Asp Arg Phe
20
<210> 2
<211> 960
<212> PRT
<213> Bacillus circulans
<400> 2
Ala Ser Ile Gly Thr Val Thr Glu Asn Asp Thr Ile Tyr Gln Ile Met
1 5 10 15
Val Asp Arg Phe Asn Asp Gly Asp Ser Ser Asn Asn Ala Thr Gly Ala
20 25 30
Ala Ile Arg Tyr Gly Glu Asn Ser Glu Glu Asp Phe Arg Tyr Met Lys
35 40 45
Gly Gly Asp Trp Gln Gly Val Ile Asp Lys Leu Pro Tyr Ile His Asn
50 55 60
Met Gly Tyr Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro Val Ala Glu Pro Gln Met
65 70 75 80
Thr Asn Arg Glu Asn Asn Gly Thr Gly Lys Asn Thr Ala Tyr His Gly
85 90 95
Tyr Asn Val Lys Asp Pro Asn Lys Ala Asn Pro Tyr Phe Gly Thr Lys
100 105 110
Glu Lys Leu Lys Glu Leu Val Asp Ser Ala His Ala Leu Gly Ile Lys
115 120 125
Val Ile Ile Asp Val Val Pro Asn His Ile Gly Asp Tyr Met Leu Gly
130 135 140
Thr Gln Ala Phe Tyr Asp Ile Pro Ser Leu Gln Pro Ala Ala Pro Phe
145 150 155 160
Asn Asn Pro Ala Trp Tyr His His Asn Gly Asp Ile Asn Trp Ser Leu
165 170 175
Ala Asp Gly Arg Tyr Asp Gln Trp Ala Gln Asp Tyr Leu Glu Asn His
180 185 190
Asp Leu Gly Gly Leu Asp Asp Ile Asp Phe Asp Val Pro Ala Ala Lys
195 200 205
Gln Ala Ile Phe Ser Ser Ile Lys Gly Trp Phe Asp Tyr Thr Gly Ala
210 215 220
Asp Gly Ala Arg Val Asp Ala Ala Lys Leu Met Lys Pro Thr Asp Ile
225 230 235 240
Gly Glu Leu Gln Asn Leu Leu Gly Val Asn Thr Phe Gly Glu Asn Phe
245 250 255
Asp Gly Asn Ala Glu Phe Val Ser Arg Trp Val Gly Thr Asn Lys Glu
260 265 270
Trp Gly Met Leu Asp Phe Pro Leu Phe Phe Ser Val Leu Asn Ser Phe
275 280 285
Ala Tyr Gly Gln Ser Phe Asp Ala Asn Ile Lys Gly Thr Leu Ala Gln
290 295 300
Asp Ser Tyr Tyr Gly Gly Asn Ala Asn His Met Val Thr Phe Ile Asp
305 310 315 320
Asn His Asp Arg Asn Arg Phe Leu Thr Glu Ala Gly Gly Ser Val Glu
325 330 335
Lys Leu Gln Asn Ala Leu Ser Phe Ile Phe Thr Val Arg Gly Thr Pro
340 345 350
Val Val Phe Gln Gly Thr Glu Gln Asn Lys Gly Asn Gly Asn Gly Gln
355 360 365
Ile Met Thr Gly Gly Ile Ala Asp Thr Trp Asn Arg Trp Ser Met Val
370 375 380
Lys Arg Asp Ala Asn Gly Asn Val Leu Glu Asn Tyr Phe Asn Glu Asn
385 390 395 400
Ala Ser Thr Phe Lys His Val Ala Lys Leu Asn Glu Ile Arg Lys Asn
405 410 415
Asn Pro Ala Leu Arg Thr Gly Thr Gln Arg Glu Met Trp Ser Ala Gln
420 425 430
Asn Leu Tyr Ala Phe Ser Arg Arg Ile Asp Thr Gly Thr Asn Val Gly
435 440 445
Gln Glu Val Ile Ser Ala Phe Ser Asn Ala Ser Gly Gly Ser Gln Thr
450 455 460
Val Thr Leu Pro Leu Arg Ala Glu Ser Thr Leu Thr Ala Gly Thr Val
465 470 475 480
Leu Val Asn Gln Leu Asn Pro Ser Asp Thr Val Thr Val Gln Ala Gly
485 490 495
Gly Val Thr Gly Lys Gln Ile Thr Val Thr Leu Gly Ala Asn Ser Ala
500 505 510
Lys Ile Tyr Ala Lys Thr Gln Pro Val Thr Asp Thr Gln Ala Pro Ser
515 520 525
Val Pro Gly Asn Val Thr Ala Thr Val Gln Asn Ala Ser Ser Ala Leu
530 535 540
Val Ser Trp Ser Ala Ser Thr Asp Asn Val Gly Val Thr Gly Tyr Glu
545 550 555 560
Ile Tyr Arg Asn Gly Val Lys Ile Gly Thr Ser Ala Thr Thr Ser Phe
565 570 575
Thr Asp Asn Gly Leu Val Gly Ser Thr Asn Tyr Ser Tyr Thr Val Lys
580 585 590
Ala Tyr Asp Ala Ala Met Asn Leu Ser Ala Phe Ser Ala Ala Ala Leu
595 600 605
Ile Val Thr Pro Ala Gly Asn Ser Val Thr Ile Tyr Tyr Lys Gln Gly
610 615 620
Tyr Thr Asn Pro Tyr Ile His Tyr Arg Pro Val Gly Gly Thr Trp Thr
625 630 635 640
Thr Ser Pro Gly Val Ala Ile Pro Ala Ala Glu Val Ala Gly Tyr Asn
645 650 655
Lys Ile Thr Ile Asn Ile Gly Ala Ala Thr Gln Leu Glu Ala Cys Phe
660 665 670
Asn Asn Gly Ser Gly Ile Trp Asp Ser Asn Gly Gly Ser Asn Tyr Leu
675 680 685
Phe Gly Thr Gly Thr Trp Thr Tyr Thr Pro Thr Gly Asn Ile Gln Ala
690 695 700
Gly Gly Pro Val Thr Pro Thr Ala Ser Pro Thr Ala Thr Pro Thr Val
705 710 715 720
Ala Pro Thr Ala Thr Pro Thr Val Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ala
725 730 735
Thr Pro Thr Val Ala Pro Thr Ala Thr Pro Thr Val Ala Pro Thr Ala
740 745 750
Thr Pro Val Pro Thr Ala Thr Pro Ala Gly Asn Thr Ala Thr Ile Tyr
755 760 765
Tyr Lys Asn Thr Ala Phe Ser Asn Ser Tyr Ile His Tyr Lys Leu Asp
770 775 780
Gly Ala Thr Thr Trp Thr Thr Ser Pro Gly Val Pro Met Gln Ala Ser
785 790 795 800
Thr Phe Ser Gly Tyr Lys Ser Ile Thr Ile Pro Leu Gly Thr Ala Thr
805 810 815
Gly Leu Thr Ala Ala Phe Asn Asn Gly Ser Gly Thr Trp Asp Ser Asn
820 825 830
Gly Gly Asn Asn Tyr His Phe Gly Thr Gly Ser Ser Ser Leu Val Gly
835 840 845
Gly Ser Leu Thr Thr Gly Glu Pro Gln Ala Asp Ser Val Thr Phe Arg
850 855 860
Val Ser Val Pro Gly Ser Thr Pro Ala Asn Ala Pro Val Tyr Leu Thr
865 870 875 880
Gly Ser Phe Asn Ser Trp Asn Ala Ala Asp Thr Ala Tyr Leu Leu Thr
885 890 895
Arg Gly Ser Asp Gly Val Tyr Ser Val Thr Leu Asn Leu Pro Ala Gly
900 905 910
Thr Ala Val Thr Tyr Lys Leu Thr Arg Gly Ser Trp Ala Thr Val Glu
915 920 925
Thr Thr Ser Ser Gly Ala Asp Ile Thr Asn Arg Thr Leu Thr Pro Ala
930 935 940
Gly Gly Ala Gln Thr Val Thr Ile Ser Val Gln Arg Trp Lys Asp Gln
945 950 955 960
<210> 3
<211> 2880
<212> DNA
<213> Bacillus circulans
<400> 3
gcgagtattg gtacagtaac cgagaatgac acgatctatc agattatggt tgaccgcttc 60
aatgacgggg attcttccaa taacgcaaca ggagctgcca tccgctatgg ggagaactct 120
gaggaggatt tccgttacat gaagggcggc gactggcagg gggtcattga caagctcccg 180
tatattcaca atatgggcta tactgcgatc tggatctcgc ccgtagccga gccgcagatg 240
actaaccgtg agaacaacgg aacaggcaag aacactgcct accacggcta caatgtcaaa 300
gatccgaaca aggccaaccc ttacttcggc accaaagaaa agctgaaaga gcttgtagac 360
tccgcgcatg cgctcggaat taaggtcatc attgatgtcg ttcccaacca catcggcgat 420
tacatgctgg gcactcaggc tttttacgat atcccatcct tgcagcctgc cgctccgttc 480
aataatccgg cctggtatca ccacaatggg gacattaact ggtcgcttgc cgatggacgg 540
tacgatcagt gggctcagga ttatctggag aatcatgatc tgggtggtct ggatgatatc 600
gacttcgatg ttcctgccgc caagcaggct attttcagct cgatcaaggg ctggtttgac 660
tatacggggg cagacggcgc ccgtgttgat gcggccaagc tgatgaagcc gaccgatatc 720
ggcgagctgc agaatttgct gggcgtgaat acgtttgggg agaatttcga cggcaatgcc 780
gaattcgtct cccgctgggt cggtaccaac aaggagtggg ggatgctcga cttcccgtta 840
ttcttctccg tgctgaacag cttcgcgtac gggcagtctt ttgacgcgaa tattaaaggc 900
actctggctc aagactccta ctacggcggc aacgccaacc atatggttac cttcatcgac 960
aatcatgacc gcaaccgctt cctgacggag gccgggggca gtgtagagaa gctgcagaat 1020
gcgttgtcct ttattttcac cgtgcgcgga acgcctgtcg tcttccaggg aaccgagcag 1080
aacaagggca acggcaacgg gcagatcatg acgggcggga tcgccgatac gtggaaccgc 1140
tggtcgatgg tgaagcggga tgcaaacggc aatgtgctgg agaattattt caatgagaat 1200
gctagtacct tcaagcatgt agccaagctg aacgagatcc gcaaaaataa cccggccctg 1260
cgcaccggca cccagcgcga aatgtggtcc gcacagaatc tgtatgcctt ctcccggcgg 1320
attgataccg gcacgaatgt cggccaggaa gtgatctccg cattcagtaa tgcgtctggg 1380
ggatcacaga cagtgacgct gccgctgcgc gccgaaagca cgcttaccgc aggtacggtt 1440
ctggtgaatc agctgaaccc ctccgatact gtgaccgtgc aggcgggcgg tgttaccggt 1500
aagcaaatta cagttaccct aggcgccaat tcggccaaaa tctacgccaa aacacaaccg 1560
gtaaccgata cgcaagcacc aagtgttccc ggaaatgtaa cagccaccgt acagaatgcc 1620
tccagcgcgt tggtatcctg gtcagcatcc accgataatg tcggggtgac tgggtatgaa 1680
atttaccgca atggagtgaa gatcggaact tcggcaacga cctcttttac agataacgga 1740
ctggtaggca gcaccaatta ttcttatacg gtaaaagcgt atgatgccgc catgaatctg 1800
tcggccttca gcgcagccgc cctgattgtc acccctgccg gtaacagtgt gacgatctac 1860
tacaagcagg gttacaccaa tccgtacatt cattaccgcc cggtgggcgg gacttggacg 1920
acatctccgg gtgtagccat tccagccgcc gaagtagcag gctataacaa aatcacaatc 1980
aatatcggcg cagccacgca gctcgaagcc tgcttcaaca acggcagcgg catctgggac 2040
agcaacggcg gcagcaatta cctgttcggg acaggcactt ggacctatac gcctacaggc 2100
aatattcagg caggcggtcc ggtgacgcca acagcatcgc cgacggcgac accaaccgta 2160
gccccaacgg ctacaccgac cgtgacacca acaccaactc caacggctac accgaccgta 2220
gctccaaccg caacaccaac cgttgcgcca acggcgacac ctgtgccaac cgccactccg 2280
gcgggcaaca ccgcgacgat ctattacaag aatacagcat tcagtaactc gtatatccat 2340
tacaagctgg atggggcaac cacctggacg acctcaccgg gagtgcctat gcaggcctca 2400
accttcagcg gctacaagtc cattaccatt ccgctcggca ctgcaaccgg attgaccgca 2460
gcgttcaata acggcagcgg cacttgggac agcaatggcg ggaataacta tcatttcggt 2520
actggcagct ccagcctggt aggggggagc ttaaccacag gggaaccgca agcagacagc 2580
gtgaccttcc gggtcagcgt tcccgggtcc accccggcga atgctccagt ctacctgaca 2640
ggatcgttca acagctggaa tgcggcagat acggcctacc tgctgacccg cggaagtgat 2700
ggcgtctatt ccgtcacctt gaatcttccg gcaggcactg ctgtaacgta taagctgaca 2760
cgtggaagct gggctacggt agagaccaca tccagcggcg cggatattac caaccggacg 2820
ctcacgcccg caggcggagc acagaccgtg acaataagtg tgcagcgctg gaaggatcag 2880
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> Bacillus circulans
<400> 4
Asn Thr Ala Tyr His Gly Tyr Asn Val Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Bacillus circulans
<400> 5
Ala Asn Pro Tyr Phe Gly Thr Lys Glu Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Bacillus circulans
<400> 6
Gly Gly Asp Trp Gln Gly Val Ile Asp Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> Bacillus circulans
<400> 7
Glu Leu Val Asp Ser Ala His Ala Leu Gly Ile Lys
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> Bacillus circulans
<400> 8
Asn Thr Ala Phe Ser Asn Ser Tyr Ile His Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> Bacillus circulans
<400> 9
Asp Thr Ala Tyr Leu Leu Thr Arg Gly Ser Asp Gly Val Tyr Ser
1 5 10 15
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> Bacillus circulans
<400> 10
Leu Pro Tyr Ile His Asn Met Gly Tyr Thr Ala Ile Trp Ile
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> Bacillus circulans
<400> 11
Asp Ile Pro Ser Leu Gln Pro Ala Ala Pro Phe Asn Asn
1 5 10
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> Bacillus circulans
<400> 12
Pro Thr Asp Ile Gly Glu Leu Gln Asn Leu Leu Gly Val Asn Thr
1 5 10 15
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gayacnatht aycarat 17
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
taycaratha tggtnga 17
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
acrttrtanc crtgrta 17
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
ccrtgrtang cngtrtt 17
<210> 17
<211> 251
<212> DNA
<213> Bacillus circulans
<400> 17
tat cag att atg gtt gac cgc ttc aat gac ggg gat tct tcc aat aac 48
Tyr Gln Ile Met Val Asp Arg Phe Asn Asp Gly Asp Ser Ser Asn Asn
1 5 10 15
gca aca gga gct gcc atc cgc tat ggg gag aac tct gag gag gat ttc 96
Ala Thr Gly Ala Ala Ile Arg Tyr Gly Glu Asn Ser Glu Glu Asp Phe
20 25 30
cgt tac atg aag ggc ggc gac tgg cag ggg gtc att gac aag ctc ccg 144
Arg Tyr Met Lys Gly Gly Asp Trp Gln Gly Val Ile Asp Lys Leu Pro
35 40 45
tat att cac aat atg ggc tat act gcg atc tgg atc tcg ccc gta gcc 192
Tyr Ile His Asn Met Gly Tyr Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro Val Ala
50 55 60
gag ccg cag atg act aac cgt gag aac aac gga aca ggc aag aac act 240
Glu Pro Gln Met Thr Asn Arg Glu Asn Asn Gly Thr Gly Lys Asn Thr
65 70 75 80
gcc tac cac gg 251
Ala Tyr His
<210> 18
<211> 2985
<212> DNA
<213> Bacillus circulans
<400> 18
atg aaa aga gaa cgt aac cgc cta ctt att ccc gtt cta atc gca tcc 48
Met Lys Arg Glu Arg Asn Arg Leu Leu Ile Pro Val Leu Ile Ala Ser
1 5 10 15
att gta ctg tct atc acg atg agt ctg ttt gtt gta ccg cct tct aag 96
Ile Val Leu Ser Ile Thr Met Ser Leu Phe Val Val Pro Pro Ser Lys
20 25 30
gcg gag gct gcg agt att ggt aca gta acc gag aat gac acg atc tat 144
Ala Glu Ala Ala Ser Ile Gly Thr Val Thr Glu Asn Asp Thr Ile Tyr
35 40 45
cag att atg gtt gac cgc ttc aat gac ggg gat tct tcc aat aac gca 192
Gln Ile Met Val Asp Arg Phe Asn Asp Gly Asp Ser Ser Asn Asn Ala
50 55 60
aca gga gct gcc atc cgc tat ggg gag aac tct gag gag gat ttc cgt 240
Thr Gly Ala Ala Ile Arg Tyr Gly Glu Asn Ser Glu Glu Asp Phe Arg
65 70 75 80
tac atg aag ggc ggc gac tgg cag ggg gtc att gac aag ctc ccg tat 288
Tyr Met Lys Gly Gly Asp Trp Gln Gly Val Ile Asp Lys Leu Pro Tyr
85 90 95
att cac aat atg ggc tat act gcg atc tgg atc tcg ccc gta gcc gag 336
Ile His Asn Met Gly Tyr Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro Val Ala Glu
100 105 110
ccg cag atg act aac cgt gag aac aac gga aca ggc aag aac act gcc 384
Pro Gln Met Thr Asn Arg Glu Asn Asn Gly Thr Gly Lys Asn Thr Ala
115 120 125
tac cac ggc tac aat gtc aaa gat ccg aac aag gcc aac cct tac ttc 432
Tyr His Gly Tyr Asn Val Lys Asp Pro Asn Lys Ala Asn Pro Tyr Phe
130 135 140
ggc acc aaa gaa aag ctg aaa gag ctt gta gac tcc gcg cat gcg ctc 480
Gly Thr Lys Glu Lys Leu Lys Glu Leu Val Asp Ser Ala His Ala Leu
145 150 155 160
gga att aag gtc atc att gat gtc gtt ccc aac cac atc ggc gat tac 528
Gly Ile Lys Val Ile Ile Asp Val Val Pro Asn His Ile Gly Asp Tyr
165 170 175
atg ctg ggc act cag gct ttt tac gat atc cca tcc ttg cag cct gcc 576
Met Leu Gly Thr Gln Ala Phe Tyr Asp Ile Pro Ser Leu Gln Pro Ala
180 185 190
gct ccg ttc aat aat ccg gcc tgg tat cac cac aat ggg gac att aac 624
Ala Pro Phe Asn Asn Pro Ala Trp Tyr His His Asn Gly Asp Ile Asn
195 200 205
tgg tcg ctt gcc gat gga cgg tac gat cag tgg gct cag gat tat ctg 672
Trp Ser Leu Ala Asp Gly Arg Tyr Asp Gln Trp Ala Gln Asp Tyr Leu
210 215 220
gag aat cat gat ctg ggt ggt ctg gat gat atc gac ttc gat gtt cct 720
Glu Asn His Asp Leu Gly Gly Leu Asp Asp Ile Asp Phe Asp Val Pro
225 230 235 240
gcc gcc aag cag gct att ttc agc tcg atc aag ggc tgg ttt gac tat 768
Ala Ala Lys Gln Ala Ile Phe Ser Ser Ile Lys Gly Trp Phe Asp Tyr
245 250 255
acg ggg gca gac ggc gcc cgt gtt gat gcg gcc aag ctg atg aag ccg 816
Thr Gly Ala Asp Gly Ala Arg Val Asp Ala Ala Lys Leu Met Lys Pro
260 265 270
acc gat atc ggc gag ctg cag aat ttg ctg ggc gtg aat acg ttt ggg 864
Thr Asp Ile Gly Glu Leu Gln Asn Leu Leu Gly Val Asn Thr Phe Gly
275 280 285
gag aat ttc gac ggc aat gcc gaa ttc gtc tcc cgc tgg gtc ggt acc 912
Glu Asn Phe Asp Gly Asn Ala Glu Phe Val Ser Arg Trp Val Gly Thr
290 295 300
aac aag gag tgg ggg atg ctc gac ttc ccg tta ttc ttc tcc gtg ctg 960
Asn Lys Glu Trp Gly Met Leu Asp Phe Pro Leu Phe Phe Ser Val Leu
305 310 315 320
aac agc ttc gcg tac ggg cag tct ttt gac gcg aat att aaa ggc act 1008
Asn Ser Phe Ala Tyr Gly Gln Ser Phe Asp Ala Asn Ile Lys Gly Thr
325 330 335
ctg gct caa gac tcc tac tac ggc ggc aac gcc aac cat atg gtt acc 1056
Leu Ala Gln Asp Ser Tyr Tyr Gly Gly Asn Ala Asn His Met Val Thr
340 345 350
ttc atc gac aat cat gac cgc aac cgc ttc ctg acg gag gcc ggg ggc 1104
Phe Ile Asp Asn His Asp Arg Asn Arg Phe Leu Thr Glu Ala Gly Gly
355 360 365
agt gta gag aag ctg cag aat gcg ttg tcc ttt att ttc acc gtg cgc 1152
Ser Val Glu Lys Leu Gln Asn Ala Leu Ser Phe Ile Phe Thr Val Arg
370 375 380
gga acg cct gtc gtc ttc cag gga acc gag cag aac aag ggc aac ggc 1200
Gly Thr Pro Val Val Phe Gln Gly Thr Glu Gln Asn Lys Gly Asn Gly
385 390 395 400
aac ggg cag atc atg acg ggc ggg atc gcc gat acg tgg aac cgc tgg 1248
Asn Gly Gln Ile Met Thr Gly Gly Ile Ala Asp Thr Trp Asn Arg Trp
405 410 415
tcg atg gtg aag cgg gat gca aac ggc aat gtg ctg gag aat tat ttc 1296
Ser Met Val Lys Arg Asp Ala Asn Gly Asn Val Leu Glu Asn Tyr Phe
420 425 430
aat gag aat gct agt acc ttc aag cat gta gcc aag ctg aac gag atc 1344
Asn Glu Asn Ala Ser Thr Phe Lys His Val Ala Lys Leu Asn Glu Ile
435 440 445
cgc aaa aat aac ccg gcc ctg cgc acc ggc acc cag cgc gaa atg tgg 1392
Arg Lys Asn Asn Pro Ala Leu Arg Thr Gly Thr Gln Arg Glu Met Trp
450 455 460
tcc gca cag aat ctg tat gcc ttc tcc cgg cgg att gat acc ggc acg 1440
Ser Ala Gln Asn Leu Tyr Ala Phe Ser Arg Arg Ile Asp Thr Gly Thr
465 470 475 480
aat gtc ggc cag gaa gtg atc tcc gca ttc agt aat gcg tct ggg gga 1488
Asn Val Gly Gln Glu Val Ile Ser Ala Phe Ser Asn Ala Ser Gly Gly
485 490 495
tca cag aca gtg acg ctg ccg ctg cgc gcc gaa agc acg ctt acc gca 1536
Ser Gln Thr Val Thr Leu Pro Leu Arg Ala Glu Ser Thr Leu Thr Ala
500 505 510
ggt acg gtt ctg gtg aat cag ctg aac ccc tcc gat act gtg acc gtg 1584
Gly Thr Val Leu Val Asn Gln Leu Asn Pro Ser Asp Thr Val Thr Val
515 520 525
cag gcg ggc ggt gtt acc ggt aag caa att aca gtt acc cta ggc gcc 1632
Gln Ala Gly Gly Val Thr Gly Lys Gln Ile Thr Val Thr Leu Gly Ala
530 535 540
aat tcg gcc aaa atc tac gcc aaa aca caa ccg gta acc gat acg caa 1680
Asn Ser Ala Lys Ile Tyr Ala Lys Thr Gln Pro Val Thr Asp Thr Gln
545 550 555 560
gca cca agt gtt ccc gga aat gta aca gcc acc gta cag aat gcc tcc 1728
Ala Pro Ser Val Pro Gly Asn Val Thr Ala Thr Val Gln Asn Ala Ser
565 570 575
agc gcg ttg gta tcc tgg tca gca tcc acc gat aat gtc ggg gtg act 1776
Ser Ala Leu Val Ser Trp Ser Ala Ser Thr Asp Asn Val Gly Val Thr
580 585 590
ggg tat gaa att tac cgc aat gga gtg aag atc gga act tcg gca acg 1824
Gly Tyr Glu Ile Tyr Arg Asn Gly Val Lys Ile Gly Thr Ser Ala Thr
595 600 605
acc tct ttt aca gat aac gga ctg gta ggc agc acc aat tat tct tat 1872
Thr Ser Phe Thr Asp Asn Gly Leu Val Gly Ser Thr Asn Tyr Ser Tyr
610 615 620
acg gta aaa gcg tat gat gcc gcc atg aat ctg tcg gcc ttc agc gca 1920
Thr Val Lys Ala Tyr Asp Ala Ala Met Asn Leu Ser Ala Phe Ser Ala
625 630 635 640
gcc gcc ctg att gtc acc cct gcc ggt aac agt gtg acg atc tac tac 1968
Ala Ala Leu Ile Val Thr Pro Ala Gly Asn Ser Val Thr Ile Tyr Tyr
645 650 655
aag cag ggt tac acc aat ccg tac att cat tac cgc ccg gtg ggc ggg 2016
Lys Gln Gly Tyr Thr Asn Pro Tyr Ile His Tyr Arg Pro Val Gly Gly
660 665 670
act tgg acg aca tct ccg ggt gta gcc att cca gcc gcc gaa gta gca 2064
Thr Trp Thr Thr Ser Pro Gly Val Ala Ile Pro Ala Ala Glu Val Ala
675 680 685
ggc tat aac aaa atc aca atc aat atc ggc gca gcc acg cag ctc gaa 2112
Gly Tyr Asn Lys Ile Thr Ile Asn Ile Gly Ala Ala Thr Gln Leu Glu
690 695 700
gcc tgc ttc aac aac ggc agc ggc atc tgg gac agc aac ggc ggc agc 2160
Ala Cys Phe Asn Asn Gly Ser Gly Ile Trp Asp Ser Asn Gly Gly Ser
705 710 715 720
aat tac ctg ttc ggg aca ggc act tgg acc tat acg cct aca ggc aat 2208
Asn Tyr Leu Phe Gly Thr Gly Thr Trp Thr Tyr Thr Pro Thr Gly Asn
725 730 735
att cag gca ggc ggt ccg gtg acg cca aca gca tcg ccg acg gcg aca 2256
Ile Gln Ala Gly Gly Pro Val Thr Pro Thr Ala Ser Pro Thr Ala Thr
740 745 750
cca acc gta gcc cca acg gct aca ccg acc gtg aca cca aca cca act 2304
Pro Thr Val Ala Pro Thr Ala Thr Pro Thr Val Thr Pro Thr Pro Thr
755 760 765
cca acg gct aca ccg acc gta gct cca acc gca aca cca acc gtt gcg 2352
Pro Thr Ala Thr Pro Thr Val Ala Pro Thr Ala Thr Pro Thr Val Ala
770 775 780
cca acg gcg aca cct gtg cca acc gcc act ccg gcg ggc aac acc gcg 2400
Pro Thr Ala Thr Pro Val Pro Thr Ala Thr Pro Ala Gly Asn Thr Ala
785 790 795 800
acg atc tat tac aag aat aca gca ttc agt aac tcg tat atc cat tac 2448
Thr Ile Tyr Tyr Lys Asn Thr Ala Phe Ser Asn Ser Tyr Ile His Tyr
805 810 815
aag ctg gat ggg gca acc acc tgg acg acc tca ccg gga gtg cct atg 2496
Lys Leu Asp Gly Ala Thr Thr Trp Thr Thr Ser Pro Gly Val Pro Met
820 825 830
cag gcc tca acc ttc agc ggc tac aag tcc att acc att ccg ctc ggc 2544
Gln Ala Ser Thr Phe Ser Gly Tyr Lys Ser Ile Thr Ile Pro Leu Gly
835 840 845
act gca acc gga ttg acc gca gcg ttc aat aac ggc agc ggc act tgg 2592
Thr Ala Thr Gly Leu Thr Ala Ala Phe Asn Asn Gly Ser Gly Thr Trp
850 855 860
gac agc aat ggc ggg aat aac tat cat ttc ggt act ggc agc tcc agc 2640
Asp Ser Asn Gly Gly Asn Asn Tyr His Phe Gly Thr Gly Ser Ser Ser
865 870 875 880
ctg gta ggg ggg agc tta acc aca ggg gaa ccg caa gca gac agc gtg 2688
Leu Val Gly Gly Ser Leu Thr Thr Gly Glu Pro Gln Ala Asp Ser Val
885 890 895
acc ttc cgg gtc agc gtt ccc ggg tcc acc ccg gcg aat gct cca gtc 2736
Thr Phe Arg Val Ser Val Pro Gly Ser Thr Pro Ala Asn Ala Pro Val
900 905 910
tac ctg aca gga tcg ttc aac agc tgg aat gcg gca gat acg gcc tac 2784
Tyr Leu Thr Gly Ser Phe Asn Ser Trp Asn Ala Ala Asp Thr Ala Tyr
915 920 925
ctg ctg acc cgc gga agt gat ggc gtc tat tcc gtc acc ttg aat ctt 2832
Leu Leu Thr Arg Gly Ser Asp Gly Val Tyr Ser Val Thr Leu Asn Leu
930 935 940
ccg gca ggc act gct gta acg tat aag ctg aca cgt gga agc tgg gct 2880
Pro Ala Gly Thr Ala Val Thr Tyr Lys Leu Thr Arg Gly Ser Trp Ala
945 950 955 960
acg gta gag acc aca tcc agc ggc gcg gat att acc aac cgg acg ctc 2928
Thr Val Glu Thr Thr Ser Ser Gly Ala Asp Ile Thr Asn Arg Thr Leu
965 970 975
acg ccc gca ggc gga gca cag acc gtg aca ata agt gtg cag cgc tgg 2976
Thr Pro Ala Gly Gly Ala Gln Thr Val Thr Ile Ser Val Gln Arg Trp
980 985 990
aag gat cag 2985
Lys Asp Gln
995
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
gcaattaacc ctcactaaag gg 22
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
aaaaacatat gaaaagagaa cgtaaccgcc 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
cggcaacgcc aaccacatgg ttaccttcat 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
atgaaggtaa ccatgtggtt ggcgttgccg 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
aaaaaggatc cttactgatc cttccagcgc 30
Claims (29)
- 일반식 1로 나타내어지는 구조를 가진 이소사이클로말토올리고당.일반식 1:Cyclo{→6)-[α-D-Glcp -(1→4)]n-α-D-Glcp -(1→}(위의 식에서 n은 4 또는 5를 의미한다.)
- 제1항 기재의 이소사이클로말토올리고당과 함께 기타의 당질을 함유해서 된 이소사이클로말토올리고당 함유 당질.
- 제2항에 있어서, 형태가, 시럽, 분말 또는 고상물 중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 이소사이클로말토올리고당 함유 당질.
- 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1,4 글루칸에 작용하여, 일반식 1로 나타내어지는 구조를 가진 이소사이클로말토올리고당을 생성하는 작용을 가진 이소사이클로말토올리고당 생성 효소.일반식 1:Cyclo{→6)-[α-D-Glcp -(1→4)]n-α-D-Glcp -(1→}(위의 식에서 n은 4 또는 5를 의미한다.)
- 제4항에 있어서, 아래의 이화학적 성질을 가진 이소사이클로말토올리고당 생성 효소.(1) 분자량SDS-겔 전기 영동법에서, 약 106,000±20,000 달톤.(2) 등전점앰폴라인 함유 등전점 전기 영동법에서, pI 7.5±0.5.(3) 최적 온도pH 6.0에서 30분간의 반응 조건하에서, 50 내지 55℃。(4) 최적 pH30℃에서 30분간의 반응 조건하에서, pH 4.5 내지 8.0.(5) 온도 안정성pH 6.0에서 60분간의 유지 조건하에서, 35℃까지 안정.1mM 칼슘 이온 존재하에서는, 40℃까지 안정.(6) pH 안정성4℃에서 24시간 유지의 조건하에서, pH 4.5 내지 9.0에서 안정.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 서열표에서의 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 N 말단 아미노산 서열로서 가진 이소사이클로말토올리고당 생성 효소.
- 제4항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 서열표에서의 서열번호 2로 나 타내어지는 아미노산 서열 또는 서열표에서의 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서, 그 효소 활성을 유지하는 범위에서 1개 또는 2개 이상의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가한 아미노산 서열을 가진 이소사이클로말토올리고당 생성 효소.
- 제4항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1,4 글루칸이, 말토올리고당, 말토덱스트린, 아밀로덱스트린, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 용성 전분, 액화 전분, 호화 전분 및 글리코겐으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질인 이소사이클로말토올리고당 생성 효소.
- 제4항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 이소사이클로말토올리고당 생성 효소가 미생물 유래의 효소인 이소사이클로말토올리고당 생성 효소.
- 제9항에 있어서, 미생물이 바실루스속(屬)에 속하는 미생물인 이소사이클로말토올리고당 생성 효소.
- 제10항에 있어서, 바실루스속에 속하는 미생물이, 바실루스 서큘란스(Bacillus circulans) AM7(일본국의 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소, 특허생물 기탁 센터, 기탁 번호 FERM BP-10111) 또는 그 변이주인 이소사이클로말토올리고당 생성 효소.
- 바실루스 서큘란스(Bacillus circulans) AM7(일본국의 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소, 특허생물 기탁 센터, 기탁 번호 FERM BP-10111) 또는 그 변이주인 제4항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 기재한 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 산생능을 가진 미생물.
- 제4항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 기재한 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 코드하는 DNA.
- 제13항에 있어서, 서열표에서의 서열번호 3으로 나타내어지는 염기서열 또는 서열표에서의 서열번호 3으로 나타내어지는 염기서열에 있어서, 코드하는 효소의 활성을 유지하는 범위에서 1개 또는 2개 이상의 염기가 결실, 치환 혹은 부가한 염기서열, 또는 그것들에 상보적인 염기서열을 가진 DNA.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 유전자 코드의 축중(縮重)에 근거하여, 코드하는 아미노산 서열을 변경함이 없이 서열표에서의 서열번호 3으로 나타내어지는 염기서열에서의 염기의 1개 또는 2개 이상을 다른 염기로 치환한 DNA.
- 제13항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 바실루스속의 미생물에서 유래하는 DNA.
- 제13항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 기재한 DNA와, 자율 복제 가능한 벡터를 함유해서 된 복제 가능한 재조합 DNA.
- 제17항에 있어서, 자율 복제 가능한 벡터가 플라스미드 벡터 pBluescript II SK(+)인 재조합 DNA.
- 제17항 또는 제18항 기재의 재조합 DNA를 적당한 숙주에 도입해서 된 형질 전환체.
- 제19항에 있어서, 숙주가 대장균인 형질 전환체.
- 제4항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 기재한 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 산생능을 가진 미생물을 영양배지에서 배양해서 얻어지는 배양물로부터, 제4항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 기재한 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 채취하는 것을 특징으로 하는 이소사이클로말토올리고당 생성 효소의 제조 방법.
- 제19항 또는 제20항 기재의 형질 전환체를 배양하고, 배양물로부터 재조합형 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 채취하는 것을 특징으로 하는 재조합형 이 소사이클로말토올리고당 생성 효소의 제조 방법.
- 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1,4 글루칸을 함유하는 용액에, 제4항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 기재한 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 또는 제12항 기재의 이소사이클로말토올리고당 생성 효소 산생능을 가진 미생물을 작용시키는 것을 특징으로 하는 일반식 1로 나타내어지는 구조를 가진 이소사이클로말토올리고당의 생성 방법.일반식 1:Cyclo{→6)-[α-D-Glcp -(1→4)]n-α-D-Glcp -(1→}(위의 식에서 n은 4 또는 5를 의미한다.)
- 제23항에 있어서, 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-1,4 글루칸이, 말토올리고당, 말토덱스트린, 아밀로덱스트린, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 용성 전분, 액화 전분, 호화 전분 및 글리코겐으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질인 이소사이클로말토올리고당의 생성 방법.
- 전분을 호화 및/또는 액화한 용액에, 제4항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 기재한 이소사이클로말토올리고당 생성 효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는 일반식 1로 나타내어지는 구조를 가진 이소사이클로말토올리고당 또는 이것을 함유하는 당조성물의 제조 방법.일반식 1:Cyclo{→6)-[α-D-Glcp -(1→4)]n-α-D-Glcp -(1→}(위의 식에서 n은 4 또는 5를 의미한다.)
- 제25항에 있어서, 전분을 호화 및/또는 액화한 용액이, DE 20 이하의 용액인 이소사이클로말토올리고당 또는 이들을 함유하는 당조성물의 제조 방법.
- 제25항 또는 제26항에 있어서, 전분을 호화 및/또는 액화한 용액에, 제4항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 기재한 이소사이클로말토올리고당 생성 효소와 함께 이소아밀라아제 또는 풀룰라나아제를 작용시키고, 필요에 따라서, 추가로 α-아밀라아제, β-아밀라아제, 사이클로말토덱스트린글루카노트란스페라아제, 글루코아밀라아제, α-글루코시다아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는 이소사이클로말토올리고당 또는 이들을 함유하는 당조성물의 제조 방법.
- 제25항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 기재한 전분을 호화 및/또는 액화한 용액에, 제4항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 기재한 이소사이클로말토올리고당 생성 효소와 함께 이소아밀라아제 또는 풀룰라나아제를 작용시키고, 필요에 따라서, 추가로 α-아밀라아제, β-아밀라아제, 사이클로말토덱스트린글루카노트란스페라아제, 글루코아밀라아제, α-글루코시다아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상 의 효소를 작용시킨 후, 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획, 막에 의한 분리, 미생물에 의한 발효 처리 및 알칼리 처리에 의한 분해 제거로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 정제 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 이소사이클로말토올리고당 또는 이들을 함유하는 당조성물의 제조 방법.
- 제1항 기재의 이소사이클로말토올리고당, 또는 제2항 또는 제3항 기재의 이소사이클로말토올리고당 함유 당질을 함유시켜서 된 음식물, 화장품 또는 의약품.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004278971 | 2004-09-27 | ||
| JPJP-P-2004-00278971 | 2004-09-27 | ||
| PCT/JP2005/017642 WO2006035725A1 (ja) | 2004-09-27 | 2005-09-26 | イソサイクロマルトオリゴ糖及びイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素とそれらの製造方法並びに用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20070083773A true KR20070083773A (ko) | 2007-08-24 |
| KR101223381B1 KR101223381B1 (ko) | 2013-01-16 |
Family
ID=36118871
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020077009259A KR101223381B1 (ko) | 2004-09-27 | 2005-09-26 | 이소사이클로말토올리고당 및 이소사이클로말토올리고당생성 효소와 이들의 제조 방법 및 용도 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7732426B2 (ko) |
| EP (1) | EP1808497B1 (ko) |
| JP (1) | JP4983258B2 (ko) |
| KR (1) | KR101223381B1 (ko) |
| CN (1) | CN101044244B (ko) |
| AU (1) | AU2005288314B2 (ko) |
| CA (1) | CA2581487C (ko) |
| WO (1) | WO2006035725A1 (ko) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9101160B2 (en) | 2005-11-23 | 2015-08-11 | The Coca-Cola Company | Condiments with high-potency sweetener |
| JP2008031055A (ja) * | 2006-06-29 | 2008-02-14 | Shunkosha:Kk | 酢酸を含有してなる摂取用組成物 |
| US8017168B2 (en) | 2006-11-02 | 2011-09-13 | The Coca-Cola Company | High-potency sweetener composition with rubisco protein, rubiscolin, rubiscolin derivatives, ace inhibitory peptides, and combinations thereof, and compositions sweetened therewith |
| CN101820907B (zh) * | 2007-08-15 | 2013-05-01 | 切尔卡西亚有限公司 | 针对过敏原去敏化的肽 |
| JP5532256B2 (ja) * | 2008-05-06 | 2014-06-25 | 長崎県公立大学法人 | 糖質定量方法および糖質定量キット |
| JP2011256111A (ja) * | 2008-10-03 | 2011-12-22 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 敗血症の予防及び治療剤 |
| JP6053406B2 (ja) * | 2012-09-13 | 2016-12-27 | 株式会社林原 | 新規α−グルカン転移酵素とそれらの製造方法並びに用途 |
| WO2014122449A1 (en) * | 2013-02-05 | 2014-08-14 | Green Biologics Ltd | Cyclodextrin glucanotransferase |
| CN107001528A (zh) | 2014-07-09 | 2017-08-01 | 米德瑞（美国）有限公司 | 低聚糖组合物及其制备方法 |
| CA2975095A1 (en) | 2015-01-26 | 2016-08-04 | Cadena Bio, Inc. | Oligosaccharide compositions for use as animal feed and methods of producing thereof |
| TWI640323B (zh) * | 2016-10-24 | 2018-11-11 | 樂業生化科技有限公司 | 可食用且能使皮膚保有良好皮膚屏障的皮膚清潔劑組成物 |
| JP7136765B2 (ja) * | 2017-03-24 | 2022-09-13 | 株式会社林原 | オートファジー誘導剤とその用途 |
| EP3895711A4 (en) | 2018-12-13 | 2022-10-26 | Hayashibara Co., Ltd. | CYCLOISOMALTOTETRAOSE, CYCLOISOMALTOTETRAOSE PRODUCTION ENZYMES AND MANUFACTURING PROCESSES AND USES THEREOF |
| JPWO2020226165A1 (ko) * | 2019-05-08 | 2020-11-12 | ||
| CN112159828B (zh) * | 2020-09-30 | 2022-07-05 | 江南大学 | 一种难消化分枝状葡聚糖及其加工方法 |
| JP7002624B1 (ja) * | 2020-11-12 | 2022-01-20 | 群栄化学工業株式会社 | 穀物糖化液およびその製造方法 |
| CN115926015B (zh) * | 2023-01-30 | 2023-06-27 | 山东百龙创园生物科技股份有限公司 | 一种低聚合度聚葡萄糖及其制备方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5823799A (ja) | 1981-08-03 | 1983-02-12 | 株式会社林原生物化学研究所 | 高純度マルト−スの製造方法 |
| JPS5872598A (ja) | 1981-10-26 | 1983-04-30 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 高純度イソマルト−スの製造方法 |
| DE69325700T2 (de) * | 1992-12-28 | 1999-12-30 | Hayashibara Biochem Lab | Nichtreduzierendes saccharidbildendes Enzym, und dessen Herstellung und Verwendungen |
| JP3559585B2 (ja) | 1993-06-03 | 2004-09-02 | 株式会社林原生物化学研究所 | トレハロース遊離酵素とその製造方法並びに用途 |
| JP4919198B2 (ja) * | 2000-05-22 | 2012-04-18 | 株式会社林原生物化学研究所 | α−イソマルトシル転移酵素とその製造方法並びに用途 |
| US7098013B2 (en) * | 2000-11-16 | 2006-08-29 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Polypeptide having α-isomaltosyl-transferase activity |
| EP1361274B1 (en) * | 2001-01-12 | 2010-04-21 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Polypeptide having alpha-isomaltosylglucosaccharide synthase activity |
| US6562600B1 (en) * | 2001-06-25 | 2003-05-13 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Production of cyclic alternan tetrasaccharides from oligosaccharide substrates |
| JP4568035B2 (ja) | 2003-08-28 | 2010-10-27 | 株式会社林原生物化学研究所 | 環状マルトシルマルトース及び環状マルトシルマルトース生成酵素とそれらの製造方法並びに用途 |
-
2005
- 2005-09-26 CN CN2005800357037A patent/CN101044244B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-09-26 AU AU2005288314A patent/AU2005288314B2/en not_active Ceased
- 2005-09-26 KR KR1020077009259A patent/KR101223381B1/ko active IP Right Grant
- 2005-09-26 EP EP05785977.9A patent/EP1808497B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-09-26 US US11/663,919 patent/US7732426B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-09-26 JP JP2006537729A patent/JP4983258B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-09-26 WO PCT/JP2005/017642 patent/WO2006035725A1/ja active Application Filing
- 2005-09-26 CA CA2581487A patent/CA2581487C/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-04-21 US US12/764,927 patent/US8633005B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1808497B1 (en) | 2014-10-08 |
| AU2005288314B2 (en) | 2010-11-25 |
| US7732426B2 (en) | 2010-06-08 |
| CN101044244B (zh) | 2010-05-05 |
| CN101044244A (zh) | 2007-09-26 |
| EP1808497A1 (en) | 2007-07-18 |
| US20080131468A1 (en) | 2008-06-05 |
| AU2005288314A1 (en) | 2006-04-06 |
| CA2581487C (en) | 2013-07-30 |
| JP4983258B2 (ja) | 2012-07-25 |
| WO2006035725A1 (ja) | 2006-04-06 |
| CA2581487A1 (en) | 2006-04-06 |
| EP1808497A4 (en) | 2013-03-20 |
| US8633005B2 (en) | 2014-01-21 |
| JPWO2006035725A1 (ja) | 2008-05-15 |
| KR101223381B1 (ko) | 2013-01-16 |
| US20100285562A1 (en) | 2010-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101223381B1 (ko) | 이소사이클로말토올리고당 및 이소사이클로말토올리고당생성 효소와 이들의 제조 방법 및 용도 | |
| KR100647405B1 (ko) | 코지비오스 포스포릴라아제, 그 제조방법 및 용도 | |
| KR100362689B1 (ko) | 환원성이감소된당질조성물과그제조방법및용도 | |
| KR20020037056A (ko) | α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 그 제조방법 및 용도 | |
| KR101129098B1 (ko) | 환상 말토실 말토오스 및 환상 말토실 말토오스 생성효소와이들의 제조 방법 및 용도 | |
| KR100391375B1 (ko) | 내열성 비환원성 당질 생성 효소와 그 제조방법 및 용도 | |
| WO2006054474A1 (ja) | デキストリンデキストラナーゼとその製造方法並びに用途 | |
| KR100875576B1 (ko) | 이소말토오스의 제조방법 및 용도 | |
| KR100877278B1 (ko) | α-이소말토실 전이효소 활성을 가진 폴리펩티드 | |
| KR100853353B1 (ko) | α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드 | |
| JP5255603B2 (ja) | 環状マルトシルマルトース及び環状マルトシルマルトース生成酵素とそれらの製造方法並びに用途 | |
| KR100932810B1 (ko) | 이소말토오스 및 이소말티톨의 제조방법과 그것들의 용도 | |
| JP4982716B2 (ja) | 糖質混合物とその製造方法並びに用途 | |
| JPH10304882A (ja) | コージビオースホスホリラーゼとその製造方法並びに用途 | |
| KR19980042214A (ko) | 트레할로오스 포스포릴라아제, 그 제조방법 및 용도 | |
| KR20210104074A (ko) | 시클로이소말토테트라오스, 시클로이소말토테트라오스 생성효소, 및 그 제조방법과 용도 | |
| GB2420345A (en) | 3-alpha-glycosyl alpha, alpha-trehalose compound, process for producing the same, and use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20151222 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170102 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20171222 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20181129 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20191128 Year of fee payment: 8 |