KR20020037056A - α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 그 제조방법 및 용도 - Google Patents

α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 그 제조방법 및 용도 Download PDF

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cyclic tetrasaccharide
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구보타미치오
쓰사키게이지
히가시야마다카노부
후쿠다시게하루
미야케도시오
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도시오 미야께
가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
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Abstract

본 발명의 목적은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 그 제조방법, 및 이 효소를 사용하여 제조되는 환상(環狀) 4당 및 이것을 함유하는 당질을 제공함에 있다. 즉, 구체적으로는, 본 발명의 목적은 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질로부터, 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이를 촉진함으로써 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지며, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질을 생성하는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 확립하고, 이 효소를 사용하는 α-이소말토실 전이방법과, α-이소말토실글루코 당질 생성방법과, α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 사용하여 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당의 제조방법, 및 이 방법으로 얻어지는 당질의 용도에 의하여 해결된다.

Description

α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 그 제조방법 및 용도{α-ISOMALTOSYLGLUCOSACCHARIDE-FORMING ENZYME, PROCESS AND USES OF THE SAME}
글루코오스를 구성 당으로 하는 당질, 예를 들면, 전분을 원료로 하여 제조되는 전분 부분 분해물로서는, 아밀로오스, 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 말토올리고 당, 이소말토올리고 당 등이 알려져 있다. 이들 당질은 통상적으로 분자의 양단(兩端)이 각각 비환원 말단과 환원 말단으로 되어 있고, 환원성을 나타내는 것이 알려져 있다. 일반적으로 전분 부분 분해물은 고형물 당(當)의 환원력의 크기를 덱스트로오스 이퀴발렌트(Dextrose Equivalent=DE)로서 나타내고 있다. 이 값이 큰 것은 통상적으로 분자가 작고 저점도이며, 단 맛이 강하지만, 반응성이 강하여 아미노산이나 단백질 등의 아미노기를 가진 물질과 아미노 카르보닐 반응을 일으키기 쉽고, 갈변(褐變)하여 악취를 발생하며, 품질을 열화(劣化)하기 쉬운 성질을 가진 것이 알려져 있다. 이러한 결점을 개선하기 위해서, 전분 부분 분해물의 구성 당인 글루코오스를 변화시키지 않고, 그 환원력을 저감 혹은 소멸시키는 방법이 오래전부터 기대되고 있었다. 예를 들면, 문헌[Journal of American Chemical Society, 제71권, 353 내지 358 페이지 (1949년)]에 개시되어 있는 바와 같이, 전분에 마세란스 아밀라아제(macerans amylase)를 작용시킴으로써 6 내지 8분자의 글루코오스가 α-1,4 글루코실 결합한 α-, β- 또는 γ-환상 덱스트린을 생성시키는 방법이 알려져 있다. 현재로서는 전분으로부터 이들 환상 덱스트린이 공업적 규모로 생산되며, 이들 환상 덱스트린은 그것들이 가진 비환원성이고, 무미하며, 포접능(包接能) 등의 특성을 살린 용도에 이용되고 있다. 또한, 이미 본 출원인이 일본국 특개 평 7-143876호 공보 및 특개 평 7-213283호 공보 등에 개시한 바와 같이, 말토올리고당 등 전분 부분 분해물에 비환원성 당질생성 효소 및 트레할로오스 유리 효소를 작용시킴으로써 2분자의 글루코오스가 α,α- 결합한 트레할로오스를 생성시키는 방법도 알려져 있다. 현재로서는 전분으로부터 트레할로오스가 공업적 규모로 생산되며, 비환원성이고 온화하며 고품질의 단 맛 특성 등을 살린 용도에 이용되고 있다. 이와 같이 글루코오스를 구성 당으로 하는 비환원성 당질로서, 글루코오스 중합도가 2인 α,α-트레할로오스, 글루코오스 중합도가 6 내지 8인 α-, β-, γ-환상 덱스트린은 각각의 특성을 살려서 공업적 규모로 생산, 이용되고 있지만, 그 종류가 한정되어 있어 더욱 다양한 비환원성 당질 내지 저환원성 당질의 제공이 요망되고 있다.
한편, 최근, 글루코오스를 구성 당으로 하는 새로운 환상의 4당류가 보고되었다. 즉, 문헌 [European Journal of Biochemistry, 제226권, 641 내지 648 페이지 (1994년)]에는 주로, 글루코오스 잔기가 α-1,3 결합과 α-1,6 결합이 교대로 연결되어 있는 알테르난(alternan)에 가수분해효소 알테르나나아제(alternanase)를 작용시킴으로써 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상(環狀) 4당(본 명세서에서는 특히 명시하지 않는 한, 이 당질을 "환상 4당"이라고 약칭할 경우도 있음)이 생성하고, 이것을 유기용매의 일종인 메탄올 공존 하에 결정석출시키는 것이 개시되어 있다.
환상 4당은 환상구조를 가지고, 비환원성의 당질이므로 포접능을 나타내고, 휘발성 유기물을 안정화하는 작용이나 아미노 카르보닐 반응을 일으키지 않으며, 갈변, 열화를 우려함이 없이 이용, 가공할 수 있는 것이 기대된다.
그러나 환상 4당의 제조에 필요한 원료인 알테르난이나 효소인 알테르나나아제의 입수가 곤란한 외에도 이들을 산생(産生)하는 미생물도 입수할 수 있는 상태는 아니다.
이러한 상황하에 본 발명자들은 이미 일본국 특허출원 2000-149484호 명세서 및 특허출원 2000-229557호 명세서에 개시한 바와 같이, 비환원 말단의 결합 양식으로서, α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질(본 명세서에 있어서는 이 당질을 「α-이소말토실글루코 당질」이라고 약칭할 경우도 있음)을 원료로 하고, 여기에 이 당질의 α-이소말토실 부분과 그 이외의 글루코 당질부분을 특이적으로 절단하고 이 α-이소말토실 부분을 그 수용체에다 전이해서 환상 4당을 생성하는 α-이소말토실 전이효소를 작용시켜 환상 4당을 생산하는데 성공하였다. 이 α-이소말토실 전이효소는 α-이소말토글루코 당질로부터 α-이소말토실 전이함으로써 환상 4당을 생성하는 효소이며, 아래에 나온 이화학적 성질을 가진 효소이다.
(1) 작용
비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질로부터 α-이소말토실 전이를 포함하는 반응에 의해, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상(環狀) 4당을 생성함.
(2) 분자량
SDS-겔 전기영동법에 의해 약 82,000 달톤 내지 약 136,000 달톤의 범위내에서 분자량을 가짐.
(3) 등전점
앰폴라인 함유 전기영동법에 의해 pI 약 3.7 내지 약 8.3의 범위내에서 등전점을 가짐.
(4) 최적온도
pH 6.0에서 30분간 반응의 조건하에서 약 45℃ 내지 약 50℃의 범위내에서 최적온도를 가짐.
(5) 최적 pH
35℃에서 30분간 반응의 조건하에서 pH 약 5.5 내지 약 6.5의 범위내에서 최적 pH를 가짐.
(6) 온도 안정성
pH 6.0에서 60분간 유지하는 조건에서 약 45℃ 이하에서 안정 온도영역을 가짐.
(7) pH 안정성
4℃에서 24시간 유지하는 조건에서 pH 약 3.6 내지 약 pH 10.0의 범위내에서 안정 pH 영역을 가짐.
그러나 환상 4당의 원료당질에 대해서 보면, 풍부하고 염가로 공급되는 전분으로부터의 생산이 기대되지만, 실제로는, α-이소말토실 전이효소가 전분에 직접 작용하지 않으므로, 미리 전분을 앞서 나온 특정 구조를 가진 α-이소말토실글루코 당질, 예를 들면, 파노오스나 이소말토실말토오스 등의 비교적 저분자의 이소말토올리고당으로 변환시킨 다음에, 여기에 α-이소말토실 전이효소를 작용시켜 환상 4당을 생성시키는 수법이 채용되고 있다.
한편, 원료로부터의 환상 4당의 생성율에 대해서 보면, 파노오스를 사용했을 경우, 원료 파노오스 중량당 약 44%이다. 마찬가지로, 이소말토실말토오스를 사용할 경우, 약 31%인데 대해서, 전분을 사용할 경우에는, 미리, α-아밀라아제, 전분지절(枝切) 효소(starch debranching enzyme), β-아밀라아제 및 α-글루코시다아제 등을 작용시켜서 파노오스 등의 비교적 저분자의 이소말토올리고당을 생성시킬 필요가 있을 뿐만 아니라, 환상 4당의 생성율도 약 15%로서 극히 낮은 것이 밝혀지고 있다.
전분으로부터의 환상 4당의 산생은 이렇게 낮은 생성율에서도 실용가능하지만, 경비상승이 우려된다. 이러한 상황하에서 전분 등의 용이하게 입수할 수 있는 재료를 원료로 하는, 환상 4당의 생성율이 높은 신규의 환상 4당의 제조방법의 확립이 요망된다.
본 발명은 신규의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 그 제조방법 및 용도에 관한 것으로서, 상세하게는 신규의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 이 효소를 제조하는 방법, 이 효소를 사용한 α-글루코실 전이(轉移)방법, α-이소말토실글루코 당질의 생성 방법, 더욱이 이 효소와 α-이소말토실 전이효소를 병용한 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상(環狀) 4당의 제조방법 및 이들 당질을 함유시킨 조성물에 관한 것이다.
도 1은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소 반응에 의해 얻어진 당질을 고속 액체 크로마토그래피에 의해 측정했을 때의 용출 패턴을 나타내는 도면.
도 2는 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소 반응에 의해 얻어진 환상 4당의 핵자기 공명 스펙트럼(1H-NMR 스펙트럼)을 나타내는 도면.
도 3은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소 반응에 의해 얻어진 환상 4당의 핵자기 공명 스펙트럼(13C-NMR 스펙트럼)을 나타내는 도면.
도 4는 환상 4당의 구조가, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}인 것을 나타내는 도면.
도 5는 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 6은 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 7은 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 8은 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 9는 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 10은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 11은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 12는 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 13은 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 14는 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 15는 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 16은 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 17은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 18은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 19는 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실 전이효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 20은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실 전이효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 21은 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 22는 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 23은 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 24는 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 25는 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 26은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 27은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실 전이효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 28은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실 전이효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 29는 본 발명의 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 30은 본 발명의 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 31은 본 발명의 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 32는 본 발명의 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 33은 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 34는 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 35는 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실 전이효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 36은 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실 전이효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 37은 아르드로박터 라모서스 S1 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 38은 아르드로박터 라모서스 S1 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 39는 아르드로박터 라모서스 S1 유래의 α-이소말토실 전이효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 40은 아르드로박터 라모서스 S1 유래의 α-이소말토실 전이효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 41은 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소반응에 의해 얻어진α-이소말토실말토트리오스의1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 42는 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소반응에 의해 얻어진 α-이소말토실말토테트라오스의1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 43은 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소반응에 의해 얻어진 α-이소말토실말토트리오스의13C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 44는 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소반응에 의해 얻어진 α-이소말토실말토테트라오스의13C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 45는 본 발명의 환상 4당의 5 내지 6 함수결정의 현미경 사진을 디스플레이 위에 표시한 중간조 화상.
도 46은 본 발명의 환상 4당의 5 내지 6 함수결정상 분말을 분말 Ⅹ선 회절법으로 해석했을 때의 회절 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 47은 본 발명의 환상 4당의 5 내지 6 함수결정상 분말을 열중량 측정했을 때의 열중량 곡선을 나타내는 도면.
도 48은 본 발명의 환상 4당의 1 함수결정 분말을 분말 Ⅹ선 회절법으로 해석했을 때의 회절 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 49는 본 발명의 환상 4당의 1 함수결정 분말을 열중량 측정했을 때의 열중량 곡선을 나타내는 도면.
도 50은 본 발명의 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말을 40℃에서 진공건조하여 얻어지는 환상 4당 무수결정 분말을 분말 Ⅹ선 회절법으로 해석했을 때의 회절 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 51은 본 발명의 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말을 120℃에서 진공건조하여 얻어지는 환상 4당 무수결정 분말을 분말 Ⅹ선 회절법으로 해석했을 때의 회절 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 52는 본 발명의 무수환상 4당 분말을 열중량 측정했을 때의 열중량 곡선을 나타내는 도면.
[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]
이하, 본 발명의 신규의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 산생능을 가진, 미생물 C9주, C11주, N75주 및 A19주의 동정(同定)시험 결과를 나타낸다. 그리고 이 동정시험은,『미생물의 분류와 동정』(長谷川武治편, 일본국의 學會出版 센터, 1985년)에 준하여 하였다.
<미생물 C9주>
<A. 세포형태>
육즙 한천 배양, 27℃
통상적으로 0.5 내지 1.0 × 1.5 내지 5㎛의 간균(桿菌). 다형성(多形性) 없음. 운동성 있음. 구형(球形)의 포자를 세포내의 끝에 형성. 팽윤한 포자낭을 형성. 그램 양성.
<B. 배양 성질＞
(1) 육즙 한천 평판배양, 27℃
형상: 원형. 크기는 2일간 배양에서 1 내지 2mm.
주연(周緣): 전연(全緣)
융기: 반(半) 렌즈상
광택: 둔광(鈍光)
표면: 평활
색조: 불투명, 담황색
(2) 육즙 한천 사면배양, 27℃
생육: 중간 정도
형상: 방산상(放散狀)
(3) 육즙 젤라틴 천자(穿刺)배양, 27℃
액화함.
<C. 생리학적 성질>
(1) VP 시험: 음성
(2) 인돌의 생성: 음성
(3) 질산으로부터의 가스 생성: 양성
(4) 전분의 가수분해: 양성
(5) 색소의 생성: 가용성 색소의 생성은 없음.
(6) 우레아제: 양성
(7) 옥시다아제: 양성
(8) 카탈라아제: 양성
(9) 생육의 범위: pH 5.5 내지 9.0
온도 10 내지 35℃
(10) 산소에 대한 태도: 호기성
(11) 탄소원의 이용성과 산생성(酸生成)의 유무
탄소원 이용성 산생성
D-글루코오스 이용함 양성
글리세롤 이용함 양성
수크로오스 이용함 양성
락토오스 이용함 양성
(12) DNA의 GC [구아닌(G) + 시토신(C)] 함량: 40%
이상의 균학적 성질에 근거하여 문헌[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 제2권 (1986년)]을 참고로 해서, 공지균과의 이동(異同)을 검토하였다. 그 결과, 이 균은 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus)에 속하는 미생물인 것이 밝혀졌다. 또한, 이 균은 전분 부분 분해물로부터 α-이소말토실글루코 당질을 생성하는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소, 및 이 당질로부터 α-이소말토실기를 전이해서 환상 4당을 생성하는 α-이소말토실 전이효소를 산생하는 문헌 미기재의 특징을 가지고 있다.
이들 결과로부터 본 발명자들은 이 균을 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C9로 명명하고, 2000년 4월 25일자로 일본국 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1 쵸오메 1-1 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술총합 연구소 특허생물 기탁 센터에 기탁하여 수탁 번호 FERM BP-7143으로서 수탁되었다.
<미생물 C11>
<A. 세포형태>
육즙 한천 배양, 27℃
통상적으로 0.5 내지 1.0 × 1.5 내지 5㎛의 간균(桿菌). 다형성(多形性) 없음. 운동성 있음. 구형(球形)의 포자를 세포내의 끝에 형성. 팽윤한 포자낭을 형성. 그램 양성.
<B. 배양 성질>
(1) 육즙 한천 평판배양, 27℃
형상: 원형. 크기는 2일간 배양에서 1 내지 2mm.
주연(周緣): 전연(全緣)
융기: 반(半) 렌즈상
광택: 둔광(鈍光)
표면: 평활
색조: 불투명, 담황색
(2) 육즙 한천 사면배양, 27℃
생육: 중간 정도
형상: 방산상(放散狀)
(3) 육즙 젤라틴 천자(穿刺)배양, 27℃
액화함.
<C. 생리학적 성질>
(1) VP 시험: 음성
(2) 인돌의 생성: 음성
(3) 질산으로부터의 가스 생성: 양성
(4) 전분의 가수분해: 양성
(5) 색소의 생성: 가용성 색소의 생성은 없음.
(6) 우레아제: 양성
(7) 옥시다아제: 양성
(8) 카탈라아제: 양성
(9) 생육의 범위: pH 5.5 내지 9.0
온도 10 내지 35℃
(10) 산소에 대한 태도: 호기성
(11) 탄소원의 이용성과 산생성(酸生成)의 유무
탄소원 이용성 산생성
D-글루코오스 이용함 양성
글리세롤 이용함 양성
수크로오스 이용함 양성
락토오스 이용함 양성
(12) DNA의 GC 함량: 39%
이상의 균학적 성질에 근거하여 문헌[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 제2권 (1986년)]을 참고로 해서, 공지균과의 이동(異同)을 검토하였다. 그 결과, 이 균은 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus)에 속하는 미생물인 것이 밝혀졌다. 또한, 이 균은 전분 부분 분해물로부터 α-이소말토실글루코 당질을 생성하는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소, 및 이 당질로부터 α-이소말토실기를 전이해서 환상 4당을 생성하는 α-이소말토실 전이효소를 산생하는 문헌 미기재의 특징을 가지고 있다.
이들 결과로부터 본 발명자들은 이 균을 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C11로 명명하고, 2000년 4월 25일자로 일본국 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1 쵸오메 1-1 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술총합 연구소 특허생물 기탁 센터에 기탁하여 수탁 번호 FERM BP-7144로서 수탁되었다.
<미생물 N75>
<A. 세포형태>
육즙 한천 배양, 27℃
통상적으로 0.5 내지 1.0 × 1.5 내지 5㎛의 간균(桿菌). 다형성(多形性) 없음. 운동성 있음. 구형(球形)의 포자를 세포내의 끝에 형성. 팽윤한 포자낭을 형성. 그램 양성.
<B. 배양 성질>
(1) 육즙 한천 평판배양, 27℃
형상: 원형. 크기는 2일간 배양에서 1 내지 2mm.
주연(周緣): 전연(全緣)
융기: 반(半) 렌즈상
광택: 둔광(鈍光)
표면: 평활
색조: 불투명, 담황색
(2) 육즙 한천 사면배양, 27℃
생육: 중간 정도
형상: 방산상(放散狀)
(3) 육즙 젤라틴 천자(穿刺)배양, 27℃
액화함.
<C. 생리학적 성질>
(1) VP 시험: 음성
(2) 인돌의 생성: 음성
(3) 질산으로부터의 가스 생성: 양성
(4) 전분의 가수분해: 양성
(5) 색소의 생성: 가용성 색소의 생성은 없음.
(6) 우레아제: 음성
(7) 옥시다아제: 양성
(8) 카탈라아제: 양성
(9) 생육의 범위: pH 5.7 내지 9.0
온도 10 내지 35℃
(10) 산소에 대한 태도: 호기성
(11) 탄소원의 이용성과 산생성(酸生成)의 유무
탄소원 이용성 산생성
D-글루코오스 이용함 양성
글리세롤 이용함 양성
수크로오스 이용함 양성
락토오스 이용함 양성
(12) DNA의 GC 함량: 40%
이상의 균학적 성질에 근거하여 문헌[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 제2권 (1986년)]을 참고로 해서, 공지균과의 이동(異同)을 검토하였다. 그 결과, 이 균은 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus)에 속하는 미생물인 것이 밝혀졌다. 또한, 이 균은 전분 부분 분해물로부터 α-이소말토실글루코 당질을 생성하는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소, 및 이 당질로부터 α-이소말토실기를 전이해서 환상 4당을 생성하는 α-이소말토실 전이효소를 산생하는 문헌 미기재의 특징을 가지고 있다.
이들 결과로부터 본 발명자들은 이 균을 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) N75로 명명하고, 2001년 5월 16일자로 일본국 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1 쵸오메 1-1 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술총합 연구소 특허생물 기탁 센터에 기탁하여 수탁 번호 FERM BP-7591로서 수탁되었다.
<미생물 A19>
<A. 세포형태>
(1) 육즙 한천 배양, 27℃
통상적으로 0.4 내지 0.8 × 1.0 내지 4.0 ㎛의 간균(桿菌). 다형성(多形性) 있음. 운동성 없음. 무포자. 그램 양성.
(2) EYG 한천배지, 27℃
간균(桿菌)-구균의 생육 사이클을 나타냄.
<B. 배양 성질>
(1) 육즙 한천 평판배양, 27℃
형상: 원형. 크기는 1일간 배양에서 2 내지 3mm.
주연(周緣): 전연(全緣)
융기: 반(半) 렌즈상
광택: 둔광(鈍光)
표면: 평활
색조: 불투명, 황색
(2) 육즙 한천 사면배양, 27℃
생육: 중간 정도
형상: 필라멘트상
(3) 육즙 젤라틴 천자(穿刺)배양, 27℃
액화하지 않음.
<C. 생리학적 성질>
(1) 전분의 가수분해: 음성
(2) 색소의 생성: 가용성 색소의 생성은 없음.
(3) 우레아제: 양성
(4) 옥시다아제: 양성
(5) 카탈라아제: 양성
(6) 산소에 대한 태도: 호기성
(7) 세포벽의 주요 디아미노산: 리신
(8) 세포벽의 펩티도글리칸형: 리신-알라닌
(9) 세포벽의 N-아실형: 아세틸
(10) 세포벽의 구성당: 갈락토오스, 글루코오스, 람노오스, 만노오스
(11) 비타민 요구성: 없음
(12) DNA의 GC 함량: 62%
(13) DNA-DNA 호몰로지(homology): 아르드로박터 글로비포르미스(ATCC 8010)와의 사이에 66.5%의 DNA-DNA 호몰로지를 나타냄.
이상의 균학적 성질에 근거하여 문헌[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 제2권 (1986년)]을 참고로 해서, 공지균과의 이동(異同)을 검토하였다. 그 결과, 이 균은 아르드로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis)에 속하는 미생물인 것이 밝혀졌다. 또한, 이 균은 전분 부분 분해물로부터 α-이소말토실글루코 당질을 생성하는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소, 및 이 당질로부터 α-이소말토실기를 전이해서 환상 4당을 생성하는 α-이소말토실 전이효소를 산생하는 문헌 미기재의 특징을 가지고 있다.
이들 결과로부터 본 발명자들은 이 균을 신규 미생물 아르드로박터 글로비포르미스 A19로 명명하고, 2001년 5월 16일자로 일본국 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1 쵸오메 1-1 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술총합 연구소 특허생물 기탁 센터에 기탁하여 수탁 번호 FERM BP-7590으로서 수탁되었다.
본 발명에 있어서는 상기 균주에만 한정되지 않고, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 산생능을 가진 미생물인 한, 바실루스속, 아르드로박터속, 및 그 이외의 속에 속하는 미생물은 물론이고, 이들 미생물의 변이주도 적절히 사용할 수 있다. 그리고 상기 균주 이외의 다른 미생물을 스크리닝하는 방법은 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 이화학적 성질을 지표로 하여 공지의 미생물 스크리닝 방법을 이용함으로써 용이하게 스크리닝할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용할 수 있는 α-이소말토실글루코 당질로부터 α-이소말토실기를 전이하여 환상 4당을 생성하는 α-이소말토실 전이효소로서, 본 발명자들이 일본국의 오카야마켄 오까야마시의 토양으로부터 단리(單離)한 아르드로박터(Arthrobacter)속에 속하는 미생물(이하,「미생물 S1주」라 함.) 유래의 α-이소말토실 전이효소도 유리하게 사용할 수 있다. 이 미생물 S1주의 동정시험 결과를 아래에 나타낸다. 그리고 이 동정시험은『미생물의 분류와 동정』(長谷川武治편, 일본국의 學會出版 센터, 1985년)에 준하여 하였다.
<미생물 S1주>
<A. 세포형태>
(1) 육즙 한천 배양, 27℃
통상적으로 0.3 내지 0.7㎛ × 0.8 내지 3.5㎛의 간균(桿菌). 다형성(多形性) 있음. 운동성 없음. 무포자. 그램 양성.
(2) EYG 한천배지, 27℃
간균(桿菌)-구균의 생육 사이클을 나타냄.
<B. 배양 성질>
(1) 육즙 한천 평판배양, 27℃
형상: 원형. 크기는 1일간 배양에서 2 내지 3 mm.
주연(周緣): 전연(全緣)
융기: 반(半) 렌즈상
광택: 둔광(鈍光)
표면: 평활
색조: 불투명, 담황색
(2) 육즙 한천 사면배양, 27℃
생육: 중간 정도
형상: 필라멘트상
(3) 육즙 젤라틴 천자(穿刺)배양, 27℃
액화하지 않음.
<C. 생리학적 성질>
(1) 전분의 가수분해: 음성
(2) 색소의 생성: 가용성 색소의 생성은 없음.
(3) 우레아제: 양성
(4) 옥시다아제: 양성
(5) 카탈라아제: 양성
(6) 산소에 대한 태도: 호기성
(7) 세포벽의 주요 디아미노산: 리신
(8) 세포벽의 펩티도글리칸형: 리신-알라닌
(9) 세포벽의 N-아실형: 아세틸
(10) 세포벽의 구성당: 갈락토오스, 글루코오스, 람노오스, 만노오스
(11) 비타민 요구성: 없음
(12) DNA의 GC 함량: 65%
(13) DNA-DNA 호몰로지(homology): 아르드로박터 라모서스(ATCC 13727)와의 사이에 84.4%의 DNA-DNA 호몰로지를 나타냄.
이상의 균학적 성질에 근거하여 문헌[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 제2권 (1986년)]을 참고로 해서, 공지균과의 이동(異同)을 검토하였다. 그 결과, 이 균은 아르드로박터 라모서스(Arthrobacter ramosus)에 속하는 신규 미생물이고, α-이소말토실글루코 당질로부터 α-이소말토실기를 전이해서 환상 4당을 생성하는, 본 발명에 의한 α-이소말토실 전이효소를 산생하는 문헌 미기재의 특징을 가진 미생물임이 판명되었다.
이들 결과로부터 본 발명자들은 이 균을 아르드로박터 라모서스 S1으로 명명하고, 2001년 5월 16일자로 일본국 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1 쵸오메 1-1 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술총합 연구소 특허생물 기탁 센터에 기탁하여 수탁 번호 FERM BP-7592로서 수탁되었다.
본 발명에 있어서는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 산생능을 가진 미생물인 한, 상기 미생물 S1주의 변이주도 적절히 사용할 수 있다. 그리고 미생물 S1주의 변이체를 스크리닝하는 방법은 본 발명에 의한 α-이소말토실 전이효소의 이화학적 성질을 지표로 하여 공지의 미생물 스크리닝 방법을 이용함으로써 용이하게스크리닝할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 미생물의 배양에 사용하는 배지는 이 미생물이 생육할 수 있고, α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 산생할 수 있는 영양배지이면 좋고, 합성배지 및 천연배지의 어느것이라도 좋다. 탄소원으로서는 이 미생물이 생육에 이용할 수 있는 것이면 좋은데, 예를 들면, 식물유래의 전분이나 피토글리코겐, 동물이나 미생물 유래의 글리코겐이나 풀룰란, 또한, 이들의 부분 분해물이나 글루코오스, 푸룩토오스, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 당밀 등의 당질, 그리고 시트르산, 숙신산 등의 유기산도 사용할 수 있다. 배지에 있어서의 이들 탄소원의 농도는 탄소원의 종류에 따라 적당히 선택된다. 질소원으로서는, 예를 들면, 암모늄염, 질산염 등의 무기 질소화합물 및, 예를 들면, 뇨소, 콘 스티이프 리커(corn steep liquor), 카제인, 펩톤, 효모 엑스, 육류 엑스 등의 유기 질소 함유물이 사용된다. 또한, 무기성분으로서는, 예를 들면, 칼슘염, 마그네슘염, 칼륨염, 나트륨염, 인산염, 망간염, 아연염, 철염, 구리염, 몰리브덴염, 코발트염 등이 적절히 사용된다. 더욱이 필요에 따라 아미노산, 비타민 등도 적절히 사용할 수 있다.
배양은, 통상적으로, 온도 4 내지 40℃, 바람직하게는 20 내지 37℃ 및 pH 4 내지 10, 바람직하게는 5 내지 9로부터 선택되는 조건에서 호기적으로 실시된다. 배양 시간은 미생물이 증식하기 시작하는 시간 이상이면 좋은데, 바람직하게는 10시간 내지 150시간이다. 또한, 배양액의 용존산소 농도에는 특히 제한은 없지만, 보통은 0.5 내지 20 ppm이 바람직하고, 예를 들면, 통기량을 조절하거나, 교반하거나, 통기에 산소를 추가하거나, 또한, 퍼멘터(fermentor) 내의 압력을 높이는 등의 수단이 채용된다. 또한, 배양방식은 회분(回分)배양 또는 연속배양의 어느것이라도 좋다.
이렇게 하여 미생물을 배양한 후, 본 발명의 효소를 회수한다. α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성은 균체를 포함하여 배양물 전체에 나타나며, 제균액(除菌液)을 조(粗)효소액으로 하여 채취할 수도 있고, 배양물 전체를 조효소액으로서 사용할 수도 있다. 배양물로부터 균체를 제거하기 위해서는 공지의 고액(固液) 분리법이 채용된다. 예를 들면, 배양물 그 자체를 원심분리하는 방법, 혹은, 프리코우트 필터(precoat filter) 등을 사용하여 여과 분리하는 방법, 평막(平膜), 중공사 막 등의 막여과에 의해 분리하는 방법 등이 적당히 채용된다. 위에서 설명한 바와 같이 균체 제거후의 배양액은 조효소액으로 하여 사용할 수도 있는데, 일반적으로는 황산 암모늄 염석법, 아세톤 및 알코올 침전법, 감압 농축, 평막, 중공막 등의 막농축법에 의해 이 효소를 농축해서 이용한다.
이렇게 하여 얻어지는 본 발명의 효소를 함유하는 제균액 및 그 농축액은 그대로 또는 이들의 용액 중에 함유되는 이 효소를 공지의 방법에 의해 고정화해서 사용할 수도 있다. 이 경우, 예를 들면, 이온 교환체에의 결합법, 수지 및 막 등과의 공유결합법·흡착법, 고분자 물질을 사용한 포괄법 등을 적절히 채용할 수 있다.
상기 효소액 중에는, 통상, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소가 공존하고 있다. 필요에 따라 공지의 방법에 의해 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 분리·정제하여 이용할 수도 있다. 한가지 예로서, 배양액의 처리물을 황산 암모늄 염석하여 농축한 조효소 표품을 투석후, 『세파비이즈(Sepabeads) FP-DA13』수지를 사용한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 이어서, 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피, 『부틸-토요퍼얼(Butyl-Toyopearl) 650M』 겔을 사용한 소수 크로마토그래피, 더욱이 다시 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 사용하여 정제함으로써 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 전기영동적으로 단일의 효소로서 얻을 수 있다.
본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 이화학적 성질의 특징은, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질로부터, 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이함으로써 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지며, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질을 생성하고, 덱스트란 생성능을 가지지 않으며, EDTA에 의해 활성이 저해되는 효소인데, 상세하게는 아래의 이화학적 성질을 가진다. 그리고 상기 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질로서는 말토올리고당, 말토덱스트린, 아밀로덱스트린, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 액화 전분, 호화(糊化) 전분 및 글리코겐으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질을 예시할 수 있다.
(1) 작용
비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질로부터, 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이함으로써 비환원 말단의 결합으로서 α-1,6 글루코실 결합 양식을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질을 생성한다.
(2) 분자량
SDS-겔 전기영동법에 의해 약 74,000 내지 160,000 달톤의 범위내의 분자량을 가짐.
(3) 등전점
앰폴라인 함유 전기영동법에 의해 pI 약 3.8 내지 7.8의 범위내에서 등전점을 가짐.
(4) 최적온도
pH 6.0에서 60분간 반응에서 약 40 내지 50℃의 범위내에서 최적온도를 가짐.
pH 6.0에서 60분간 반응에서 1mM Ca2+존재하에 약 45 내지 55℃의 범위내에서 최적온도를 가짐.
pH 8.4에서 60분간 반응에서 60℃에서 최적온도를 가짐. 또는,
pH 8.4에서 60분간 반응에서 1mM Ca2+존재하에 65℃에서 최적온도를 가짐.
(5) 최적 pH
35℃에서 60분간 반응에서 pH 약 6.0 내지 8.4의 범위내에서 최적 pH를 가짐.
(6) 온도 안정성
pH 6.0에서 60분간 유지하는 조건에서 45℃ 이하에서 온도 안정 영역을 가짐.
pH 6.0에서 60분간 유지하는 조건에서 1mM Ca2+존재하에 약 50℃ 이하에서 온도 안정 영역을 가짐.
pH 8.0에서 60분간 유지하는 조건에서 약 55℃ 이하에서 온도 안정 영역을 가짐. 또는,
pH 8.0에서 60분간 유지하는 조건에서 1mM Ca2+존재하에 약 60℃ 이하에서 온도 안정 영역을 가짐.
(7) pH 안정성
4℃에서 24시간 유지하는 조건에서 pH 약 4.5 내지 10.0의 범위내에서 안정 pH 영역을 가짐.
(8) N 말단 아미노산 서열
티로신-발린-세린-세린-로이신-글리신-아스파라긴-로이신-이소로이신,
히스티딘-발린-세린-알라닌-로이신-글리신-아스파라긴-로이신-로이신, 또는
알라닌-프롤린-로이신-글리신-발린-글루타민-아르기닌-알라닌-글루타민-페닐알라닌-글루타민-세린-글리신.
본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 기질로서는 전분, 아밀로펙틴, 아밀로오스, 글리코겐 등의 α-1,4 글루코실 결합을 가지는 다당(多糖)이나, 이들을 아밀라아제 또는 산 등에 의해 부분적으로 가수분해 해서 얻어지는 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 말토올리고당 등의 부분 분해물이 사용된다. 이들 α-1,4 결합을 가지는 글루코 당질을, 더욱 브랜칭 엔자임(branching enzyme) 등의 가지붙임 효소(EC 2.4.1.18)로 처리한 당질을 사용하는 것도 마음대로이다. 아밀라아제에 의해 분해한 부분 분해물로서는, 예를 들면, 문헌[『Handbook of Amylases and Related Enzymes』, 퍼가몬·프레스사 (동경) (1988년)]에 기재되어 있는, α-아밀라아제(EC 3.2.1.1), β-아밀라아제(EC 3.2,1.2), 말토트리오스 생성 아밀라아제(EC 3.2.1.116), 말토테트라오스 생성 아밀라아제(EC 3.2.1.60), 말토펜타오스 생성 아밀라아제, 말토헥사오스 생성 아밀라아제(EC 3.2.1.98) 등의 아밀라아제로 분해한 부분 분해물을 사용할 수 있다. 더욱이는 부분 분해물을 조제할 때, 풀룰라나아제(EC pulullanase)(3.2.1.41) 및 이소아밀라아제(EC 3.2.1.68) 등의 전분 지절(枝切) 효소를 작용시키는 것도 마음대로이다.
기질로서의 전분은 옥수수, 밀, 쌀 등의 곡류에서 유래하는 지상전분이어도 좋고, 또한 감자, 고구마, 타피오카 등의 지하전분이어도 좋으며, 바람직하게는 전분을 호화(糊化) 및/ 또는 액화한 용액으로 하여 사용할 수 있다. 그 전분의 부분 분해의 정도는 낮을 수록 환상 4당의 생성율이 높아지게 되므로 DE 약 20 이하, 바람직하게는 약 12 이하, 더욱 바람직하게는 약 5 이하가 적합하다.
이 효소의 전이 수용체로서는 상기한 기질 자체가 수용체가 될 수 있을 뿐만아니라, 글루코오스, 크실로오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 아라비노오스, 푸코오스, 소르보오스, 및 N-아세틸글루코사민 등의 단당류, 트레할로오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 락토오스, 및 수크로오스 등의 올리고당류, 말티톨, L-아스코르브산 등을 사용할 수 있다.
기질농도는 특히 한정되지 않고, 예를 들면, 기질농도 0.1w/w% (이하, 본 명세서에서는 별달리 명시하지 않는 한, "w/w％"을 간단히 "％"로 약칭함)의 저농도 용액으로 하여 사용했을 경우라도 본 발명의 효소반응은 진행하는데, 공업적으로는 1% 이상이 바람직하다. 또한, 기질용액 중에 완전히 용해하지 않는 불용성 기질을 함유하는 형태의 현탁상 용액이어도 좋다. 바람직하게는 농도 40% 이하이고, 더욱 바람직하게는 30% 이하가 더욱 바람직하다.
반응 온도는 반응이 진행하는 온도, 즉 65℃ 부근까지의 온도에서 하면 좋다. 바람직하게는 30℃ 내지 55℃ 부근의 온도를 사용한다. 반응 pH는 통상적으로 4.5 내지 10의 범위로 조정하면 좋다. 바람직하게는 pH 약 5.5 내지 9의 범위로 조정한다. 반응시간은 효소반응의 진행에 따라 적당히 선택한다.
이 효소의 반응에 의해 생성한 α-이소말토실글루코 당질에 대하여 α-이소말토실 전이효소를 작용시킴으로써 현저한 량의 환상 4당을 제조할 수 있다. α-이소말토실 전이효소의 작용은, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 작용시켜 이 효소를 실활시킨 후에 해도 좋다. 바람직하게는, α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 병용하여 작용시킨다. 예를 들면, 전분 또는 그 부분 분해물이나 글리코겐의 수용액에 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 공존시켜 병용하여 작용시킴으로써 전분 또는 그 부분 분해물로부터는 환상 4당이 고형물당 약 30% 이상의 높은 생성율로, 그리고 글리코겐의 경우는 약 80% 이상의 높은 생성율로 환상 4당을 얻을 수 있다. 이 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 병용에 있어서의 환상 4당의 생성 메커니즘은 두가지 효소의 반응특성으로부터 아래와 같이 추측된다.
(1) 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질, 예를 들면 전분, 글리코겐, 또는 이들의 부분 분해물 등의 당질의 비환원 말단의 α-1,4 글루코실기에 작용하여 글루코오스기를 다른 비환원 말단 글루코오스기의 6위치의 히드록실기에다 분자간 전이시켜, 비환원 말단에 α-이소말토실기를 가진 당질이 생성한다.
(2) α-이소말토실 전이효소는, 비환원 말단에 이소말토실기를 가진 당질에 작용하여, 그 이소말토실기를 다른 비환원 말단에 위치하는 이소말토실기를 가진 당질의 비환원 말단 글루코오스기의 3위치의 히드록실기에다 분자간 전이시켜, 비환원 말단에 이소말토실-1,3-이소말토실기를 가진 당질을 생성한다.
(3) 이어서, α-이소말토실 전이효소는, 그 비환원 말단에 이소말토실-1,3-이소말토실기를 가진 당질에 작용하여 분자내 전이작용에 의해 이소말토실-1,3-이소말토실기를 상기 당질로부터 떼어버리고, 이것을 환상화해서 환상 4당을 생성한다.
(4) 떼어버려진 당질은, 다시 (1)에서부터 (3)의 반응을 경유함으로써 환상 4당을 생성하고, 다시 이들 반응이 반복되므로 현저한 량의 환상 4당을 축적한다.
이상 설명한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 병용에 의해 상기한 바와 같이 양쪽 효소가 그들의 기질에 반복하여 작용하므로 환상 4당의 생성율이 현저하게 향상하는 것이라고 추측된다.
또한, 이 환상 4당 생성반응의 경우, 다른 전이효소를 더욱 병용하여 환상 4당의 생성율을 향상시키는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 즉, 예를 들면, 농도 약 15%의 전분 부분 분해물에 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 양자를 병용하여 작용시킴으로써, 약 55%의 생성율로 환상 4당을 얻게 되므로, 동일한 조건에서 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소와 시클로말토덱스트린글루카노트란스페라제의 3자를 병용해서 작용시킴으로써 환상 4당의 최고 생성율을 더욱 약 5 내지 10% 높여서 약 60 내지 65%로 향상시킬 수 있다.
또한, 환상 4당을 생성시킬 때에 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 산생능과, 이 생성효소에서 생성하는 α-이소말토실글루코 당질의 α-이소말토실 부분과 그 이외의 글루코 당질 부분을 특이적으로 절단하여, 이 α-이소말토실 부분을 전이하는 α-이소말토실 전이효소 산생능을 가진 미생물을 사용하는 배양 방법에 의해 환상 4당을 제조할 수도 있다.
이러한 미생물을 사용하는 환상 4당을 생성하는 방법에서 사용하는 배양배지는, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질을 함유하고, 또한 이 미생물이 생육할 수 있는 합성배지 또는 천연배지의 어느것이라도 사용할 수 있다. 그 밖의 배양조건은 상기한 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 산생하는 조건을 채용할 수 있다.
상기의 반응 또는 배양에 의해 얻어진 용액은 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질을 포함하는 용액으로 하여 그대로 사용할 수도 있다. 일반적으로는, 이들 당질은 정제해서 사용된다. 정제방법으로서는 공지의 방법을 적당히 채용하면 좋은데, 예를 들면, 활성탄에서의 탈색, H형 또는 OH형 이온교환 수지에서의 탈염, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 활성탄 칼럼 크로마토그래피, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 등의 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획, 알코올 및 아세톤 등의 유기용매에 의한 분별, 적당한 분리성능을 가진 막에 의한 분리, 더욱이는 아밀라아제, 예를 들면, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 글루코아밀라아제(EC 3.2.1.3) 등, 혹은 글루코시다아제(EC 3.2.1.20) 등의 효소를 사용하여 잔존해 있는 기타의 당질의 분해, 효모에서의 발효 처리, 알칼리 처리 등에 의한 잔존해 있는 환원성 당질의 분해 제거 등의 정제방법을 1종 또는 2종 이상 조합하여 정제할 수 있다.
특히, 공업적 대량생산 방법으로서는 이온 교환 칼럼 크로마토그래피가 바람직한데, 예를 들면, 일본국 특개 소 58-23799호 공보, 특개 소 58-72598호 공보 등에 개시되어 있는 강산성 양이온(cation) 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 협잡 당류를 제거함으로써 목적물의 함량을 향상시킨 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질을 유리하게 제조할 수 있다. 이 경우, 고정상(固定床) 방식, 이동상 방식, 의사(擬似) 이동상 방식 중의 어느쪽의 방식을 사용하는 것도 마음대로이다.
이렇게 하여 얻어진 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질을 농축하여 시럽상 제품으로 한다. 더욱이 건조하여 분말상 제품으로 하는 것도 마음대로이다.
환상 4당결정을 제조하기 위해서는, 예를 들면, 유기용매 존재하 또는 순도 약 50% 이상, 농도 약 30% 내지 90%의 환상 4당 고함유액을 조정관(助晶罐; crystallizer)에 넣고, 환상 4당 고형물당 0.1 내지 20%의 종(種)결정 공존하에서 온도 95℃ 이하, 바람직하게는 10 내지 90℃의 범위에서 교반하면서 서냉(徐冷)하여 환상 4당결정을 함유하는 매스키트를 제조한다. 매스키트로부터 환상 4당결정 또는 이것을 함유하는 함밀(含蜜) 결정을 제조하는 방법은, 예를 들면, 분밀(分蜜)방법, 블록 분쇄방법, 유동 조립(造粒) 방법, 분무건조 방법 등 공지의 방법을 채용하면 좋다.
이렇게 하여 제조되는 본 발명의 환상 4당은 상품으로서 저감미를 가진 비환원성의 백색분말이고, 안정한 당질이며, 다른 소재, 특히 아미노산, 올리고펩티드, 단백질 등의 아미노산을 가진 물질과 혼합, 가공하더라도 갈변하지도 않고, 불쾌한 냄새를 발생하지도 않으며, 혼합한 기타의 소재를 손상하는 일도 적다.
또한, 본 발명의 환상 4당은 포접능(包接能)을 가지고 있으므로 향기성분, 유효성분 등의 휘산(揮散) 및 품질열화를 방지하여, 향기성분, 유효성분의 안정화 유지에 극히 우수하다. 이 경우, 필요하면, 시클로(환상)덱스트린류, 분기 시클로덱스트린류, 시클로덱스트란류, 시클로프룩탄류 등, 다른 환상 당질을 병용함으로써 포접능에 의한 안정화를 강화하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 시클로덱스트린류 등의 환상 당질로서는 고순도의 것에 한정할 필요는 없고, 저순도의 환상 당질, 예를 들면, 다량의 말토덱스트린과 함께 각종의 시클로덱스트린을 함유한 전분 부분 분해물들도 유리하게 이용할 수 있다.
더욱이 본 발명의 환상 4당은 아밀라아제나 α-글루코시다아제에 의하여 분해되지 않으므로 경구섭취해도 소화 흡수되지 않고, 또한 장내 세균에 의해 발효되기 어려우므로 극히 저칼로리의 수용성 식물섬유로서 이용할 수 있다. 충치 유발균 등에 의해서도 발효되기 어려우므로 충치를 일으키기 어려운 감미료로서도 이용할 수 있다. 분말상물(powdery product)의 부착 및 고결(固結)을 방지할 수도 있다. 더욱이 본 발명의 환상 4당 자체는 무독, 무해한 천연감미료이어서 아무런 위험성도 없는 안정한 감미료이므로, 결정 제품의 경우에는 풀룰란, 히드록시에틸 스타치, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제와 병용해서 정제(錠劑)와 당의정으로서 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 또한, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 기타의 당의 결정 방지성, 난(難)발효성 등의 성질을 구비하고 있다.
따라서, 본 발명의 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질은 감미료, 정미(呈味) 개량제, 품질 개량제, 안정제, 변색 방지제, 부형제 등으로서 음식물, 기호물, 사료, 이료(餌料), 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명의 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질은 그대로 단 맛 부여를 위한 조미료로서 사용할 수 있다. 필요하면, 예컨대, 가루엿, 포도당, 이성화 당, 설탕, 맥아당, 트레할로오스, 벌꿀, 메이플 슈거, 소르비톨, 말티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, α-글리코실 스테비오시드, 라칸카 감미물, 글리시리진, 토오마틴, L-아스파르틸 L-페닐알라닌 메틸 에스테르, 사카린, 아세술팜 K, 수크랄로오스, 글리신, 알라닌 등의 기타 감미료와 병용하는 것도, 또한, 덱스트린, 전분, 락토오스(乳糖) 등과 같은 증량제와 병용할 수도 있다. 특히, 메소-에리드리톨, 크실리톨, 말티톨 등의 저칼로리 감미료나 α-글리코실 스테비오시드, 토오마틴, L-아스파르틸 L-페닐알라닌 메틸 에스테르, 사카린, 아세술팜 K, 수크랄로오스 등의 1종 또는 2종 이상의 고감미도 감미료와 병용하여 저칼로리 감미료 또는 다이어트 감미료 등으로서 바람직하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질은 그대로 또는 필요에 따라 증량제, 부형제, 결합제 등과 혼합하여 과립, 구상, 단봉상, 판상, 입방체, 정제 등, 각종 형상으로 성형하여 사용하는 것도 마음대로이다.
더욱이 본 발명의 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질의 단 맛은, 신 맛, 짠 맛, 떫은 맛, 감미로운 맛, 쓴 맛 등의 다른 맛을 가진 각종의 물질과 잘 조화하고, 내산성, 내열성도 크므로 일반 음식물의 단 맛 부여, 정미 개량 및 품질개량 등에 유리하게 이용할 수 있다. 예를 들면, 간장, 분말 간장, 된장, 분말 된장, 모로미(정제 술), 히시오(정제 간장), 후리카케(조미된 어육), 마요네즈, 드레싱, 식초, 초간장, 초밥용 분말초, 츄카노 모토(중화요리용 인스탄트 믹스), 텐츠유(일본식 튀김식품용 소오스), 멘츠유(일본식 면류의 소오스), 소오스, 케첩, 야키니쿠 노 타레(일본식 불고기용 소오스), 카레 루우, 인스탄트 스튜 믹스, 인스탄트 수우프 믹스, 다시 노 모토(우려낸 진한 국물), 복합 조미료, 미린(감미의 술), 신 미린(합성 미린), 테이블 슈거, 커피 슈거 등의 각종 조미료에 대한 감미료, 더욱이는 정미 개량제, 품질 개량제 등으로서 사용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 또한, 예를 들면, 센배이(쌀 크래커), 아라레(주사위 모양의 떡의 튀김), 오코시(기장과 쌀로 만든 떡), 규히(전분죽), 모치(떡류), 만두, 우이로(단맛의 젤리), 팥소류, 요캉(단맛의 팥 젤리), 미즈 요캉(연질의 아즈키팥 젤리), 킹요쿠(요캉의 일종), 젤리, 카스테라, 눈깔 사탕 등의 각종 일본식 과자; 빵, 비스켓, 크래커, 쿠우키, 파이, 푸딩, 버터 크림, 카스터드 크림, 슈우 크림, 와플, 스펀지 케이크, 도넛, 초콜렛, 츄잉 검, 카라멜, 누가, 캔디 등의 각종 양과자; 아이스 크림, 셔어벳 등의 빙과; 과실의 시럽 절임, 얼음 꿀 등의 시럽류; 플라워 페이스트, 땅콩 페이스트, 프루트 페이스트 등의 페이스트류; 잼, 마말레이드, 과실 피클, 당과 등의 과실, 야채의 가공식품; 후쿠진 츠케(적색의 무우피클), 베타라 츠케(통무우 피클의 일종), 센마이 츠케(갖썰은 무피클의 일종), 라쿄 츠케(골파 절임) 등의 절인 야채류; 단무지, 배추절임용 프리믹스 등의 절인 야채의 프리믹스; 햄, 소시지 등의 육류 가공품; 어육 햄, 어육 소시지, 어묵, 어단, 생선튀김 등의 어육제품; 성게, 물오징어의 젓갈, 가공 다시마, 말린 오징어채, 미린 조미 복어 말림, 대구, 도미, 새우 등의 조미된 어육분말 등의 각종 진미류; 김, 산나물, 말린 오징어, 작은 물고기, 조개 등으로 제조되는 간장조림 식품류; 콩자반, 감자 샐러드, 다시마 말이 등의 반찬식품; 유유제품; 축육, 어육, 과실, 야채의 병조림 및 통조림류; 합성주, 증양주(增釀酒), 청주, 과실주, 발포성 술, 맥주 등의 주류; 커피, 코코아, 쥬스, 탄산음료, 락트산음료, 락트산균 음료 등의 청량 음료수; 즉석 푸딩 믹스, 즉석 핫 케이크 믹스, 즉석 쥬스, 즉석 커피, 즉석 단팥죽, 즉석 수우프 등의 즉석식품; 더욱이는 이유식, 치료식, 드링크제, 펩티드 식품, 냉동 식품 등의 각종 음식물에의 단 맛 부여에, 정미개량에, 품질개량 등에 유리하게 실시할 수 있다. 또한, 갓 구워낸 일본 과자와 서양 과자의 풍미유지에도 유리하게 사용할 수 있음과 아울러 가축, 가금(家禽), 그 밖에 꿀벌, 누에, 물고기 등의 사육동물을 위한 사료, 이료 등, 기호성을 향상시킬 목적으로 사용할 수도 있다. 그 외, 담배, 치약, 입술 연지, 립 크림, 내복액, 정제, 토로키, 간유 드롭, 입안 청량제, 입안 향기제, 양치질제 등, 각종의 고형물, 페이스트상, 액상 등으로 하여 기호물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에의 감미제로서, 또는 정미 개량제, 교미제(矯味劑)로서, 더욱이 품질 개량제, 안정제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다. 품질 개량제, 안정제로서는 유효성분, 활성 등을 상실하기 쉬운 각종 생리활성 물질 또는 이것을 함유하는 건강식품, 의약품 등에 유리하게 적용할 수 있다. 예를 들면, 인터페론-α, 인터페론―β, 인터페론―γ, 종양괴사 인자(TNF)-α, 종양괴사 인자-β, 매크로파아지 유주(遊走) 저지 인자, 콜로니 자극 인자, 트랜스퍼 팩터, 인터로이킨 II 등의 림포카인 함유액,; 인슐린, 성장 호르몬, 프롤락틴, 에리드로포이에틴, 난세포 자극 호르몬 등의 호르몬 함유액; BCG 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 폴리오 생백신, 천연두 백신, 파상풍 톡소이드, 반시뱀 항독소, 인간 면역 글로볼린 등의 생물제제 함유액; 페니실린, 에리트로마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 황산 가나마이신 등의 항생물질 함유액; 티아민, 리보플라빈, L-아스코르브산, 간유, 캐로티노이드, 에르고스테롤, 토코페롤 등의 비타민 함유액; EPA, DHA, 아라키돈산 등의 고도 불포화 지방산 또는 그 에스테르 유도체, 리파아제, 에스테라아제, 우로키나아제, 프로테아제, β-아밀라아제, 이소아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제 등의 효소 함유액; 약용 인삼 엑스, 자라 엑스, 클로렐라 엑스, 알로에 엑스, 프로폴리스 엑스 등의 엑스류; 또는 로얄 젤리 등의 각종 생리활성 물질, 더욱이는, 바이러스, 락트산균, 효모 등의 생균 페이스트 등의 유효성분이나 활성을 상실함이 없이 안정한 고품질의 액상, 페이스트상 또는 고상의 건강식품이나 의약품 등을 용이하게 제조할 수 있다.
위에서 설명한 본 발명의 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질에 의한 향기성분의 휘산(揮散) 방지[보향(保香)], 활성성분의 열화 방지, 보습, 이수(離水) 방지, 기타 당질의 결정석출 방지, 단백질 변성방지, 지질 열화 방지, 유화(乳化) 상태의 안정화 등의 효과나, 그 자체의 안정성·부형성 등은, 당연하겠지만 피부외용에 통상적으로 이용되는 기타의 성분과 배합했을 경우에도 효과적으로 발휘된다. 그리고 본 발명의 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질은 다른 천연의 당질과 마찬가지로 피부에 적용했을 때의 자극이 극히 낮고, 또한 피부에 있어서의 수분의 유지에도 주효하므로, 이 당질은 피부외용 조성물에 배합해서 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 이러한 피부외용 조성물에 있어서 본 발명의 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질은 통상적으로, 피부에의 적용이 허용되는 기타 성분의 1종 또는 2종 이상, 예를 들면, 피부에의 외용(外用)이 허용되는 유지류, 왁스류, 탄화수소류, 지방산류, 에스테르류, 알코올류, 계면활성제, 색소, 향료, 호르몬류, 비타민류, 식물 엑스, 동물 엑스, 미생물 엑스, 염류, 자외선 흡수제, 감광 색소, 항산화제, 방부·살균제, 제한(制汗)·소취제, 청량제, 킬레이트제, 미백제, 소염제,효소, 당질, 아미노산류, 증점제 등으로부터 적당히 선택되는 1종 또는 2종 이상과 함께 배합된다. 이 피부외용 조성물은, 예를 들면, 화장품 분야에 있어서는 로션, 크림, 유액(乳液), 겔, 분말, 페이스트, 블록 등의 형태로, 비누, 화장 비누, 피부세척 분말, 세안 크림, 세안 포옴, 페이셜 린스, 보디 샴푸, 보디 린스, 샴푸, 린스, 머리세척 분말 등의 청정용 화장품, 세트 로션, 헤어 블로우, 틱크, 헤어 크림, 포마드, 헤어 스프레이, 헤어 리퀴드, 헤어 토닉, 헤어 로션, 양모료(養毛料), 염모료(染毛料), 두피용 트리트먼트, 헤어 코스메틱, 윤기내는 헤어 오일, 헤어 오일, 빗질 기름 등의 두발 화장품, 화장수, 바니싱 크림, 에몰리엔트 크림, 에몰리엔트 로션, 팩용 화장료(젤리상 필 오프 타이프, 젤리상 닦아내기형, 페이스트상 씻어 버리기형, 분말상 등), 클렌징 크림, 콜드 크림, 핸드 크림, 핸드 로션, 유액(乳液), 보습액, 애프터 쉐이빙 로션, 쉐이빙 로션, 프리쉐이빙 로션, 애프터쉐이빙 크림, 애프터쉐이빙 포옴, 프리쉐이빙 크림, 화장용 기름, 베이비 오일 등의 기초화장품, 파운데이션(액상, 크림상, 고형 등), 탤컴(talcum) 파우더, 베이비 파우더, 보디 파우더, 퍼퓸 파우더, 메이컵 베이스, 분(크림상, 페이스트상, 액상, 고형, 분말 등), 아이 세도우, 아이 크림, 마스카라, 눈썹을 그리는 먹, 속눈썹 화장료, 볼 연지, 볼 화장수 등의 메이컵 화장품, 향수, 페이스트 향수, 분말 향수, 오데 콜로뉴(eau de Cologne), 퍼퓸 콜로뉴, 오도 트와레 등의 방향(芳香) 화장품, 선탠 크림, 선탠 로션, 선탠 오일, 햇볕에 탐 방지 크림, 햇볕에 탐 방지 로션, 햇볕에 탐 방지 오일 등의 선탠·햇볕에 탐 방지용 화장품, 매니큐어, 페디큐어, 네일 칼라, 네일 락카, 에나멜 리무버, 네일 크림, 손톱 화장료 등의 손톱 화장품,아이 라이너 화장품, 입술 연지, 립 크림, 페이스트 연지, 립 글로스 등의 입술 화장품, 치약, 구강세척 등의 구강 화장품, 바드 솔트(bath salt), 바드 오일(bath oil), 목욕용 화장료 등의 입욕용 화장품 등의 용도에 이용되도록 제공된다. 또한, 예를 들면, 의약품 분야에 있어서는, 이 피부외용 조성물은 찜질제, 분무제, 도포제, 욕제, 첩부제, 연고제, 파스타제, 리니멘트제, 로션제, 퍼프제 등의 형태로 제공된다.
본 발명의 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질과 함께 피부외용 조성물에 배합할 수 있는 기타의 성분을 아래에서 보다 구체적으로 설명하면, 유지류로서는, 예를 들면, 아보가도유, 아몬드유, 올리브유, 참깨 기름, 사플라와기름, 대두유, 동백 기름, 퍼시크 기름, 피마자기름, 면실유 등의 식물성 기름(상온에서 액체), 카카오 지방, 야자 지방, 파암유, 목랍 등의 식물성 지방(상온에서 고체), 밍크유, 난황유, 터틀 기름 등의 동물성 기름을 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 왁스류로서는, 예를 들면, 호호바유(hohoba oil), 카르나우바 왁스, 칸델릴라 왁스 등의 식물성 왁스, 향유고래 기름, 망치고래 기름, 밀랍, 고래 왁스, 라놀린 등의 동물성 왁스, 몬탄 왁스 등의 광물성 왁스를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 탄화수소류로서는, 예를 들면, 파라핀(별명 「고형 파라핀」), 유동 파라핀, 세레신, 마이크로크리스탈린 왁스, 와세린 등의 광물성 탄화수소, 스콸란, 스콸렌 등의 동물기원의 탄화수소를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 지방산류로서는, 예를 들면, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 베헨산, 운데실렌산, 라놀린 지방산, 경질 라놀린 지방산, 연질 라놀린 지방산, 이소스테아르산 및 이들 화합물의 유도체를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 알코올류로서는, 예를 들면, 라우릴 알코올, 세탄올, 세토스테아릴 알코올, 스테아릴 알코올, 올레일 알코올, 베헤닐 알코올, 라놀린 알코올, 수소첨가 라놀린 알코올, 헥실데칸올, 옥틸도데칸놀, 폴리에틸렌 글리콜 등의 고급 알코올(다가 알코올을 포함함), 에탄놀, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세린 등의 저급 알코올(다가 알코올을 포함함) 및 이들 화합물의 유도체를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 에스테르류로서는, 예를 들면, 라우르산 헥실, 미리스트산 이소프로필, 미리스트산 미리스틸, 미리스트산 세틸, 미리스트산 옥틸 도데실, 팔미트산 이소프로필, 스테아르산 부틸, 스테아르산 콜레스테릴, 아세트산 콜레스테릴, n-락트산 콜레스테릴, 카프로산 콜레스테릴, 라우르산 콜레스테릴, 미리스트산 콜레스테릴, 팔미트산 콜레스테릴, 스테아르산 콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산 콜레스테릴, 올레산 데실, 올레산 옥틸도데실, 라놀린 지방산 이소프로필, 트리미리스트산 글리세린, 디올레산 프로필렌 글리콜, 락트산 미리스틸, 락트산 세틸, 아세트산 라놀린, 디메틸옥탄산 헥실데실 및 이들 화합물의 유도체를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 계면활성제로서는, 예를 들면, 라우르산 아연, 미리스트산 아연, 팔미트산 아연, 스테아르산 마그네슘, 라우릴 황산 나트륨, 라우릴 황산 트리에탄올아민, 세틸 황산 나트륨, 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르 황산 나트륨, 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르 황산 트리에탄올아민, 폴리옥시에틸렌 세틸에테르 인산, 폴리옥시에틸렌 알킬페닐에테르 인산, N-라우로일 사르코신산 나트륨, 야자유 지방산 사르코신 트리에탄올아민, 야자유 지방산 메틸타우르산 나트륨, 대두 인지질 등의 음 이온성 계면활성제, 염화 스테아릴트리메틸암모늄, 염화 디스테아릴디메틸암모늄, 염화 벤즈알코늄, 염화 세틸피리디늄, 브롬화 알킬이소퀴놀리늄, 도데실디메틸 2-페녹시에틸암모늄 브로마이드 등의 양(陽) 이온성 계면활성제, β-라우릴아미노프로피온산 나트륨, 라우릴디메틸아미노 아세트산 베타인, 2-알킬-N-카르복시메틸-N-히드록시에틸 이미다졸리늄 베타인 등의 양쪽 이온성 계면활성제, 자기유화형 모노스테아르산 글리세린, 친유형 모노스테아르산 글리세린, 디올레산 프로필렌 글리콜, 모노라우르산 소르비탄, 모노올레산 소르비탄, 수크로오스 지방산 에스테르, 운데실렌산 모노에탄올아미드, 야자유 디에탄올아미드, 모노올레산 폴리에틸렌 글리콜, 락트산 미리스틸, 락트산 세틸, 폴리옥시에틸렌 세틸에테르, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐에테르, 모노라우르산 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 모노라우르산 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 모노스테아르산 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 트리올레산 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 테트라올레산 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 등의 비이온성 계면활성제나, 이상의 화합물의 유도체를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 색소로서는, 예를 들면, 아마란드(amaranth), 에리드로신(erythrosine), 로오즈 벤갈(rose bengal), 애시드 레드(acid red), 레이크 레드 C(lake red C), 리돌 레드(lithol red), 로다민(rhodamine), 브릴리안트 레이크 레드(brilliant lake red), 에오신(eosine) YS, 비올라민(violamine) R, 브릴리안트 파스트 스칼렛(brilliant fast scarlet), 퐁소(Ponceau) R 등의 적색 타르계 색소, 디브로모풀루오레세인, 퍼머넌트 오렌지, 에리드로신 황 NA, 오렌지 Ⅰ등의 오렌지 타르계 색소, 타트라진, 선셋트 옐로우, 우라닌, 벤지딘 옐로우 G, 나프톨 옐로우 S, 옐로우 AB 등의 황색 타르계 색소, 파스트 그린 FCF, 알리자린 시아닌 그린 F, 라이트 그린 SF 옐로우, 나프톨 그린 B 등의 녹색 타르계 색소, 브릴리안트 블루 FCF, 인디고 카르민, 인디고, 파텐트 블루 NA, 카르반드렌 블루, 수단 블루 등의 청색 타르계 색소, 레조르신 브라운 등의 갈색 타르계 색소, 알리즈린 퍼풀, 알리즈롤 퍼플 등의 보라색 타르계 색소, 나프톨 블루 블랙 등의 흑색 타르계 색소, 산화 아연, 산화 티탄, 수산화 코발트, 수산화 알루미늄, 탈크, 카올린, 운모, 벤토나이트, 망간 바이올렛, 운모 티탄 등의 무기안료, β-카로틴, 리코핀, 크로신 등의 카로티노이드계 색소, 시소닌, 새프롤 옐로우, 루틴, 케르세틴 등의 플라보노이드계 색소, 리포플라빈 등의 플라빈계 색소, 코치닐, 알리자닌, 시코닌 등의 퀴논계 색소나, 이상의 화합물의 유도체를 들 수 있다.
피부외용 혹은 화장품용으로 일반적으로 이용되는 향료는, 대별하면, 천연향료인 동물성 향료 및 식물성 향료 이외에 합성 향료 및 이들을 적당히 배합한 조합 향료로 분류된다. 본 발명에서 이용할 수 있는 동물성 향료로서는, 예를 들면, 사향노루, 사향 고양이, 용연향(ambergris) 등의 향기를 들 수 있다. 식물성 향료로서는, 예를 들면, 아니스의 열매, 바실의 잎, 캐러웨이의 과실, 시나몬의 나무 껍질, 코리안다의 종자, 라벤더의 꽃, 너트메그의 종자, 페퍼민트의 잎, 장미꽃, 로즈마리의 꽃종 또는 잎, 타임(thyme)의 잎 등으로부터 수증기 증류 등에 의해 얻어지는 증류물[정유류(精油類], 히아신스의 꽃, 재스민의 꽃, 미모사의 꽃, 장미의 꽃, 바닐라의 종자 등으로부터 얻어지는 추출물(일반적으로 성상, 제법에 따라 앱솔루트(absolute)류, 레지노이드류, 올레오 레진류, 팅크류로 분류됨) 등을 들 수 있다. 합성 향료로서는, 예를 들면, 아세토페논, 아니솔, 벤질 알코올, 아세트산 부틸, 캠퍼, 시트랄, 시트로넬롤, 커민알데히드, 에스트라골, 에틸바닐린, 아세트산 게라닐, 리나롤, 멘톨, 메틸 p-크레졸, 살리실산 메틸, 페닐 아세트산, 바닐린 및 이들 화합물의 유도체를 들 수 있다. 그리고 본 발명에 있어서는 이상과 같은 향료를 적당히 배합한 조합 향료를 이용할 수도 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 호르몬류로서는, 예를 들면, 에스트론, 에스토라디올 등의 난포 호르몬류, 프로게스테론, 프레그네놀론 등의 황체 호르몬류, 코르티존, 히드로코르티존, 프레드니존, 프레드니졸론 등의 부신피질 호르몬류를 들 수 있고, 비타민류로서는, 예를 들면, 레티놀, 레티노산, α-, β-, 및 γ-카로텐, 이들의 유도체 등의 비타민 A에 속하는 화합물, 티아민(비타민 B1), 리보플라빈(비타민 B2), 피리독신, 피리독살, 피리독사민(이상 비타민 B6), 이들의 유도체 등의 비타민 B에 속하는 화합물, L-아스코르브산, 2-0-α-D-글루코실-L-아스코르브산을 비롯한 글리코실-L-아스코르브산, L-아스코르브산 혹은 글리코실-L-아스코르브산의 아실화 유도체(별명 「지용성 비타민 C」), L-아스코르브산 황산 에스테르 등, 기타의 L-아스코르브산유도체 등의 비타민 C에 속하는 화합물, 에르고칼시페롤, 콜레칼시페롤, 이들의 유도체 등의 비타민 D에 속하는 화합물, α-, β-, γ- 및 δ－토코페롤, α-, β-, γ- 및 δ－토코트리엔올, 이들의 유도체 등의 비타민 E에 속하는 화합물을 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 식물 추출물로서는, 위에서 설명한 향료로서 이용되는 식물 추출물 이외에, 예를 들면, 카밀레 추출물, 세이지 추출물, 알로에 추출물, 샐비어 추출물, 아시타바 추출물, 아보가도 추출물, 쐐기풀 추출물, 회향풀 추출물, 우론차 추출물, 황벽 추출물, 보리 추출물, 오크라 추출물, 올스파이스 추출물, 해초 추출물, 모과 추출물, 감초 추출물, 퀸스 시이드 추출물, 치자나무 추출물, 얼룩조릿대 추출물, 계피 추출물, 홍차 추출물, 쌀겨 추출물, 쌀겨 발효 추출물, 스테비아 추출물, 셀러리 추출물, 용담과 월년초 추출물, 대두 추출물, 타임 추출물, 차 추출물, 동백 추출물, 토우키 추출물, 옥수수 추출물, 당근 추출물, 해당화 추출물, 노송나무 추출물, 수세미 추출물, 잇꽃 추출물, 소나무 추출물, 복숭아 추출물, 유칼리 추출물, 범의귀 추출물, 유자나무 추출물, 백합 추출물, 율무쌀 추출물, 쑥 추출물, 남조(藍藻) 추출물, 해조 추출물, 사과 추출물, 여주 추출물, 레터스 추출물의 이외에, 히노키티올(hinokitiol), 아줄렌, 클로로필, 글리시리진 등의 식물로부터의 단리 화합물 등을 들 수 있다. 본 발명에서 이용할 수 있는 동물 추출물로서는, 예를 들면, 태반 추출물을 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 미생물 엑스로서는, 예를 들면, 효모 엑스를 들 수 있다. 이 피부 외용 조성물에 있어서 염류로서는 피부 외용이 통상 허용되어 있는 염류를 일반적으로 이용할 수 있는 외에, 바닷물, 해양 심층물, 바닷물 건조물,광천염 등의 천연염(용액을 포함한다)도 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 자외선 흡수제로서는, 예를 들면, 파라아미노벤조산 에틸, 파라디메틸아미노벤조산 에틸헥실에스테르, 시노키사토, 파라디메틸아미노신남산 에틸헥실에스테르, 2-(히드록시-5-메틸페닐)벤조토리아졸, 옥시벤조존, 우로카닌산, 우로카닌산 에틸 및 이들의 화합물의 유도체의 외에, 5-클로로우라실, 구아닌, 시토신 등의 자외선 차폐능을 가진 유기물질을 들 수 있고, 감광 색소로서는, 예컨대, 2,2'[3'-[2-(3-헵틸-4-메틸-2-티아졸린-2-일리덴)에틸리덴]프로페닐렌]비스[3-헵틸-4-메틸]티아졸리늄 요다이드(별명「PLATONIN」), 2-[2-(3-헵틸-4-메틸-2-타아졸린-2-일리덴)메틴]-3-헵틸-4-메틸 티아졸리늄 요다이드(별명 「PIONIN」), 6-[2-[(5-브로모-2-피리딜)아미노]비닐]-1-에틸-2-피콜리늄 요다이드(별명 「TAKANAL」), 2-(2-아닐리노비닐)-3,4-디메틸-옥사졸리늄 요다이드(별명 「LUMINEX」) 및 이들의 화합물의 유도체를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 항산화제로서는, 이미 설명한 성분으로서 항산화 작용을 가진 것 외에, 예를 들면, 몰식자산 프로필, 몰식자산 부틸, 몰식자산 옥틸, 몰식자산 도데실, 노르디히드로구아이아렌산(별명 "NDGA"), t-부틸히드록시아니솔(별명 "BHA"), 디부틸히드록시톨루엔(별명 "BHT"), 4-히드록시메틸-1-2,6-디-t-부틸페놀 및 이들 화합물의 유도체를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 방부·살균제로서는, 이미 설명한 성분으로서 방부 또는 살균 작용을 가진 것 외에, 예를 들면, 페놀, 파라클로로메타크레졸, 레조르신, 파라옥시벤조산 에스테르, 크레졸 등의 페놀류, 벤조산, 소르브산, 살리실산, 붕산 등의 산류(모두 염의 형태를 포함함), 헥사클로로펜, 비티오놀, 디클로로펜 등의 할로겐화 비스페놀류, 3,4,4'-트리클로로카르바니리드, 운데실렌산 모노에탄올아미드 등의 아미드류, 염화 벤즈알코늄, 염화 벤제토늄, 염화 데칼리늄 등의 4급 암모늄 화합물 외에, 염산 클로르헥시딘, 1-히드록시피리딘-2-티온, 염화 리소자임, 및 이상의 화합물의 유도체를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 제한(制汗)·소취제로서는, 염화 알루미늄, 염화아연, 클로로히드록시 알루미늄, 알루미늄 클로로히드록시 알란토이네이트, 알루미늄 디히드록시 알란토이네이트, 알루미늄 클로로하이드레이트 등을 들 수 있고, 청량제로서는, 예를 들면, 멘톨, 박하유, 페퍼민트유, 캠퍼, 티몰, 스피란톨, 살리실산 메틸 등을 들 수 있고, 킬레이트제로서는, 예를 들면, 에틸디아민 4아세트산 유도체, 트리폴리인산, 헥사메타아크릴산, 디히드로에틸글리신, 구연산, 주석산, 글루콘산, 당산(sugar acid)을 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 미백제로서는, 이미 설명한 성분으로서 미백작용을 가진 것 외에, 예를 들면, 안티센스 올리고누클레오티드(예를 들면, 타이로시네이스(tyrosinase) 유전자에 대한 안티센스 올리고누클레오티드) 등의 핵산, 코지산, 락트산, 안트라닐산, 쿠마린, 벤조트리아졸, 이미다졸린, 피리미딘, 디옥산, 푸란, 파이론, 니코틴산, 아르부틴, 바이칼린, 바이칼레인, 및 베르베린과, 이들 화합물의 유도체, 멜라닌 색소생성 억제제, 타이로시네이스 생성 억제제, 타이로시네이스 저해제를 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 소염제로서는, 이미 설명한 성분으로서 소염 작용을 나타내는 것 외에, 알란토인, 알란토인 아세틸-DL-메티오닌, 알란토인 β-글리시레틴산, 이크타몰, 인도메타신, 아세틸살리실산, 염산 디페닐히드라민, 구아이아줄렌, 카마줄렌, 말레산 클로로페니라민, 글리시리진산, 글리시레틴산, 자근 추출물 등을 들 수 있고, 효소로서는 고초균, 방선균, 효모 등의 미생물이나, 식물, 동물에서 유래하는 프로테아제, 리파아제, 리소자임 등을 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 당질로서는, 수크로오스, 말토오스, 프룩토오스, 락토오스, 트레할로오스 등의 소당류, 시클로덱스트린류 등의 환상 4당 이외의 환상 당질류, 말티톨, 소르비톨, 만니톨, 크실리톨, 아라비톨 등의 당 알코올류, 히알루론산, 콘드로이틴 황산, 풀룰란, 셀룰로오스, 전분, 덱스트란, 펙틴, 카라기이난, 구아 검, 물엿, 아라비아 검, 트라가칸트 검, 크산탄 검, 키틴 등의 다당류 및 이들의 유도체 또는 부분 분해물을 들 수 있고, 아미노산으로서는, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 시스틴, 아스파라긴, 글루타민, 2-피롤리돈-5-카르복실산, 히드록시프롤린, 피페콜린산, 사르코신, 호모시스테인, 호모세린, 시트룰린, 아스파라긴산, 글루탐산, 시스테인 술폰산, 아르기니숙신산, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, β-알라닌, 타우린, β-아미노부티르산, γ－아미노부티르산이나, 이상의 화합물의 염을 들 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 증점제로서는, 이미 설명한 성분으로서 증점작용을 가지는 것 외에, 예를 들면, 퀸스 시이드, 알긴산 나트륨, 카타온화 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 전분, 일긴산 프로필렌 글리콜, 콜라겐, 케라틴, 카제인, 알부민, 젤라틴, 히드록시프로필 트리메틸암모늄 클로라이드, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈-비닐아세테이트 공중합물, 폴리에틸렌 이민, 폴리아크릴산 나트륨, 폴리비닐메틸 에테르, 카르복시비닐 폴리머 등의 수용성 고분자, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 황산 나트륨 등의 전장 외에 각종의 기름 성분 등을 들 수 있다.
한편, 이상의 예시에서는 염의 형태를 취할 수 있는 성분에 대해서 그 염의 형태를 모두 예시하고 있는 것은 아니지만, 피부 외용제가 허용하는 염이면 예시된 이외의 염이어도 본 발명에서 적당히 이용할 수 있는 것은 말할 필요도 없다.
이상 설명한 바와 같은 각종 조성물에 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질을 함유시키는 방법으로서는, 그 제품이 완성될 때까지의 공정에서 함유시키면 좋은데, 예를 들면, 혼화, 혼련, 용해, 융해, 침지, 침투, 살포, 도포, 피복, 분무, 주입, 결정석출, 고화 등, 공지의 방법이 적절히 선택된다. 그 양은, 통상적으로 0.1％ 이상, 바람직하게는 1% 이상 함유시키는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실험을 이용해서 상세히 설명한다.
실험 1: 배양물로부터의 비환원성 환상 당질의 조제
전분 부분 분해물(상품명 『PINE-DEX #1』, 일본국의 松谷화학 주식회사 제조) 5w/v％, 효모 추출물(상품명 『ASAHIMEAST』, 일본국의 Asahi Brewery 주식회사 제조) 1.5w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v%, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％, 및 물로 된 액체배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml을 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하고, 냉각한 후, 바실루스글로비스포루스 C9 (FERM BP-7143)을 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 다음에 원심분리하여 균체를 제거하고 배양 상청(上淸)을 얻었다. 다시 이 배양 상청을 오토클레이브 처리(120℃, 15분간)하고, 방냉한 후, 생성한 불용물(不溶物)을 원심분리하여 제거함으로써 상청을 회수하였다.
수득한 상청 중의 당질을 조사하기 위해서, 전개 용매로서 n-부탄올, 피리딘, 물 혼합액(용량비 6:4:1)을 사용하고, 박층 플레이트로서 메르크사제 『KIESELGEL 60』(알루미늄 플레이트, 20 × 20cm)를 사용하여 2회 전개하는 실리카 겔 박층 크로마토그래피(이하, 간단히「TLC」라 함)를 하여 상청 중의 당질을 분리하였다. 검출법으로서, 분리한 전체 당질을 황산-메탄올법으로 발색하고, 또한, 환원 당질을 디페닐아민-아닐린법으로 발색하여 조사한 결과, Rf값이 약 0.31인 위치에서 황산-메탄올법에서 양성, 그리고 디페닐아민-아닐린법에서는 음성인 비환원성 당질이 검출되었다.
앞서 얻은 상청 약 90ml을 pH 5.0, 온도 45℃로 조정한 후, α-글루코시다아제(상품명 『TRANSGLUCOSIDASE L AMANO』, 일본국의 天野제약 주식회사 제조)를 고형물 1 그램당 1,500 단위와 글루코아밀라아제(일본국의 나가세 생화학공업 주식회사 판매)를 고형물 1 그램당 75 단위 첨가해서 24시간 처리하고, 계속해서 수산화 나트륨으로 pH를 12로 조정하고 2시간 끓여 잔존하는 환원 당을 분해하였다. 불용물을 여과해서 제거한 후, 일본국의 Mitsubishi화학제 이온교환 수지 『DIAION PK218』과 『DIAION WA30』을 사용하여 탈색, 탈염하고, 더욱이 일본국의 Mitsubishi화학제 양이온 교환 수지 『DIAION SK-1B』와 일본국의 Organo사제 음이온 교환 수지 『AMBERLITE IRA411』로 다시 탈염하고, 활성탄으로 탈색하여 정밀여과한 후, 에바포레레이터에서 농축하고 동결 진공건조하여 고형물으로서 약 0.6g의 당질분말을 얻었다.
얻어진 당질의 조성을 고속 액체 크로마토그래피법(이하, 간단히 「HPLC」라 함)에 의해 조사한 결과, 도 1에 나온 바와 같이, 용출시간 10.84분에서 단일 피이크만이 검출되었고, 순도는 99.9% 이상이어서 극히 고순도인 것이 밝혀졌다. 그리고 HPLC는 『Showdex KS-801 칼럼』(일본국의 昭和電工 주식회사 제조)을 사용하여 칼럼온도 60℃, 유속 0.5ml/min 물(water)의 조건으로 하고, 검출은 시차 굴절계(differential refractometer) 『RI-8012』(일본국의 Tosoh 주식회사 제조)를 사용하여 하였다.
그리고 환원력을 소모기·넬슨법(Somogyi-Nelson method)으로 측정한 결과, 그 환원력은 검출 한계 이하이어서, 이 표품(標品)은 실질적으로 비환원성 당질이라고 판단된다.
실험 2: 비환원성 당질의 구조해석
실험 1의 방법으로 얻어진 비환원성 당질에 대해 고속 원자 충격법에 의한 질량분석(통칭 「FAB-MS」)한 결과, 질량수 649의 프로톤 부가 분자 이온이 현저하게 검출되어 이 당질의 질량수가 648인 것이 밝혀졌다.
또한, 통상의 방법에 따라 황산을 사용하여 가수분해하고, 가스 크로마토그래피법으로 구성당을 조사한 결과, D-글루코오스 만이 검출되어, 이 당질의 구성당은 D-글루코오스인 것도 밝혀지고, 질량수를 고려하면 이 당질은 D-글루코오스 4분자로 된 환상 당질인 것이 판명되었다.
더욱이 이 당질을 사용하여 핵자기 공명법(통칭,「NMR」)을 한 결과, 도 2에 나온1H-NMR 스펙트럼과 도 3에 나온13C-NMR 스펙트럼이 얻어졌는데, 이들 스펙트럼을 기지(旣知) 당질의 것과 이동(異同)을 비교한 결과, 문헌[『European Journal of Biochemistry』, 641 내지 648 페이지 (1994년)]에 기재되어 있는 비환원성 환상당질인 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 스펙트럼과 일치하여, 이 당질의 구조가 도 4에 나온 환상 4당, 즉, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}인 것이 판명되었다.
실험 3: 바실루스 글로비스포루스 C9로부터의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 산생
전분 부분 분해물(상품명 『PINE-DEX #4』, 일본국의 松谷화학 주식회사 제조) 4.0w/v％, 효모 추출물(상품명 『ASAHIMEAST』, 일본국의 Asahi Brewery 주식회사 제조) 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v%, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％, 및 물로 된 액체배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하고, 냉각한 후, 바실루스 글로비스포루스 C9 (FERM BP-7143)을 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 것을 종배양(種培養)으로 하였다.
용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고 가열멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서 48시간 통기교반 배양하였다. 배양후, 배양액 중의 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성은 약 0.45 단위/ml이고, α-이소말토실 전이효소 활성은 약 1.5 단위／ml이며, 환상 4당 생성 활성은 약 0.95 단위/ml이고, 원심분리(10,000rpm, 30분간)하여 회수한 상청 약 18L의 효소활성을 측정한 결과, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 약 0.45 단위/m1의 활성(총 활성 약 8,110 단위)이고, α-이소말토실 전이효소는 약 1.5 단위/ml의 활성(총 활성 약 26,900 단위)이며, 환상 4당 생성 활성은 약 0.95 단위/ml(총 활성 약 17,100 단위)이었다.
그리고 효소활성은 다음과 같이 해서 측정하였다. 즉, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소활성의 측정은, 말토트리오스를 농도 2w/v％가 되도록 100mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜서 기질액으로 하고, 그 기질액 0.5ml에 효소액 0.5ml 가하여 35℃에서 60분간 효소반응시킨 후 이 반응액을 10분간 끓여 반응을 정지시킨 다음, 이 반응액 중에서 주로 생성하는 이소말토실말토오스와 말토오스 중에서 이 말토오스량을 실험 1에 기재된 HPLC법으로 정량함으로써 실시하였다. α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 활성 1 단위는 상기한 조건하에서 1분간에 1μ몰의 말토오스를 생성하는 효소량으로 하였다. 본 명세서를 통해서 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소활성은 이상과 같이 해서 측정되는 단위를 의미한다.
또한, α-이소말토실 전이효소의 효소활성의 측정은, 파노오스를 농도 2w/v％이 되도록 100mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 기질액으로 하고, 이 기질액 0.5m1에 효소액 0.5ml 가하여 35℃에서 30분간 효소반응하고, 그 반응액을 10분간 끓여 반응을 정지시킨 후, 그 반응액 중에 주로 생성하는 환상 4당과 글루코오스 중에서, 이 글루코오스량을 글루코오스 옥시다아제법으로 정량함으로써 하였다. α-이소말토실 전이효소의 활성 1 단위는, 상기의 조건하에서 1분간에 1μ몰의 글루코오스를 생성하는 효소량으로 하였다. 본 명세서를 통해서 α-이소말토실 전이효소의 효소활성은 이상과 같이 해서 측정되는 단위를 의미한다.
환상 4당 생성 활성의 측정은, 전분 부분 분해물(상품명 『PINE-DEX #100』, 일본국의 松谷화학 주식회사 제조)을 농도 2w/v％가 되도록 50 mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 기질액으로 하고, 이 기질액 0.5ml에 효소액 0.5ml을 가하고 35℃에서 60분간 효소반응하여, 이 반응액을 100℃에서 10분간 열처리하여 반응을 정지시킨 후, 더욱이 α-글루코시다아제(상품명 『TRANSGLUCOSIDASE L AMANO』, 일본국의 天野제약 주식회사 제조) 70 단위/ml와 글루코아밀라아제(일본국의 나가세 생화학공업 주식회사 판매) 27 단위/ml을 함유한 50mM 아세트산 완충액(pH 5.0) 1ml을 가하여 50℃에서 60분간 처리하고, 이 액을 100℃에서 10분간 열처리하여 효소를 실활시킨 후, 환상 4당의 량을 실험 1에 기재된 HPLC법으로 정량함으로써 실시하였다. 환상 4당 생성 활성 1 단위는 상기의 조건하에서 1분간에 1μ몰의 환상 4당을 생성하는 효소량으로 하였다. 본 명세서를 통해서 환상 4당 생성 활성은 이상과 같이 해서 측정되는 활성(단위)을 의미한다.
실험 4: 바실루스 글로비스포루스 C9 유래 효소의 조제
실험 4-1: 바실루스 글로비스포루스 C9 유래 효소의 정제
실험 3에서 얻어진 배양상청 약 18L을 80% 포화 황산 암모늄액으로 염석하고 4℃에서 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하여 10mM 인산 완충액(pH 7.5)에 용해후, 이 완충액에 대하여 투석해서 조(粗)효소액 약 400ml을 얻었다. 이 조효소액은 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성을 8,110 단위와, α-이소말토실 전이효소 활성을 24,700 단위와, 환상 4당 생성활성을 약 15,600 단위 가지고 있었다. 이 조효소액을 일본국의 Mitsubishi화학 주식회사제 『Sepabeads FP-DA13』 겔을 사용한 이온 교환 크로마토그래피(겔 용량 1,000ml)에 사용하였다. 이 경우, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소, α-이소말토실 전이효소 및 환상 4당 모두가, 『Sepabeads FP-DA13』 겔에 흡착하지 않고 비흡착 획분으로 용출하였다. 이 효소액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 이 투석액을 원심분리해서 불순물을 제거하고, 미합중국의 Amersham사제 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피티니 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다. 효소활성 성분을 『Sephacryl HR S-200』 겔에 흡착시키고, 황산 암모늄 1M로부터 0M까지의 리니어 그래디언트, 더욱 계속하여 말토테트라오스 0mM으로부터 100mM까지의 리니 그래디언트로 용출시킨 결과, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소는 분리하여 용출하고, α-이소말토실 전이효소 활성은 황산 암모늄의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 0M 부근에서 용출하며, 본 발명의 α-이소말토실글루코당질생성 효소활성은 말토테트라오스의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 30mM 부근에서 용출하였다. 따라서, α-이소말토실 전이효소 활성획분과 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성획분을 따로따로 모아 회수하였다. 또한, 환상 4당생성 활성은 이 칼럼 크로마토그래피의 어느쪽의 획분에도 나타나지 않은 것이 확인되었으므로, 얻어진 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 획분과 α-이소말토실 전이효소 획분을 혼합한 효소액은 환상 4당생성 활성을 나타내는 것이 판명되었고, 전분 부분 분해물로부터 환상 4당을 생성하는 활성은 α-이소말토실 전이효소와 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 두가지 효소활성의 공동 작용에 의해 발휘되는 것이 판명되었다.
이하, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 따로따로 정제하는 방법에 대해서 설명한다.
실험 4-2: α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 정제
실험 4-1에서 얻은 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔량 350ml)에 사용하였다. 이 효소를,『Butyl-Toyopearl 650M』 겔에 흡착시키고, 황산 암모늄 1M로부터 0M까지의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소가 용출하고, 이 효소활성을 나타내는 획분을 모아 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성량, 비활성, 수율을 표 1에 나타낸다.
표 1
공 정 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성량(단위) 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 비활성(단위/mg 단백질) 수 율(%)
배양 상청 8,110 0.12 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 7,450 0.56 91.9
이온교환 칼럼 크로마토그래피 용출액 5,850 1.03 72.1
어피니티 칼럼 크로마토그래피 용출액 4,040 8.72 49.8
소수 칼럼 크로마토그래피 용출액 3,070 10.6 37.8
어피니티 칼럼 크로마토그래피 용출액 1,870 13.6 23.1
정제한 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 7.5w／v％ 농도의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 겔 전기영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드(protein band)는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.
실험 4-3: α-이소말토실 전이효소의 정제
실험 4-1에 기재된 어피니티 크로마토그래피에 의해 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 획분으로부터 분리된 α-이소말토실 전이효소 획분을, 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 일본국 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한소수 크로마토그래피(겔량 350ml)에 사용하였다. 이 효소를, 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔에 흡착시키고, 황산 암모늄 1M으로부터 0M까지의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소가 용출하고, 이 효소활성을 나타내는 획분을 모아 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리하여 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이효소 활성량, 비활성, 수율을 표 2에 나타낸다.
표 2
공 정 본 발명의 α-이소말토실 전이효소 활성량(단위) 본 발명의 α-이소말토실 전이효소 비활성(단위/mg 단백질) 수 율(%)
배양 상청 26,900 0.41 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 24,700 1.85 91.8
이온교환 칼럼 크로마토그래피 용출액 19,400 3.41 72.1
어피니티 칼럼 크로마토그래피 용출액 13,400 18.6 49.8
소수 칼럼 크로마토그래피 용출액 10,000 21.3 37.2
어피니티 칼럼 크로마토그래피 용출액 6,460 26.9 24.0
실험 5: α-이소말토실글루코 당질생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소의 성질
실험 5-1: α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 성질
실험 4- 2의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 글루코 당질생성 효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(벨기이국의 Bio-Rad Laboratories사 판매)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 140,000 ± 20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(미합중국의 Amersham사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 사용하고, 영동후 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정하여 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.2 ± 0.5이었다.
이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그리고 온도의 영향에 대해서는 Ca2+비존재하와 1mM 존재하에서 측정하였다. 이들 결과를 도 5 (온도의 영향), 도 6 (pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적온도는 pH 6.0, 60분간의 반응에서 약 40℃ (Ca2+비존재), 약 45℃ (Ca2+1mM 존재), 최적 ｐH는 35℃, 60분간의 반응에서 약 6.0 내지 6.5이었다. 이 효소의 온도 안정성은 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 Ca2+비존재하 또는 1mM 존재하에서 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은 이 효소를 각 pH의 50mM 완충액중에서 4℃에서 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 7 (온도 안정성), 도 8 (pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 35℃까지 (Ca2+비존재), 약 40℃까지 (Ca2+1mM 존재)이고, pH 안정성은 약 4.5 내지 9.0이었다.
이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.
표 3
금속 이온 상대 활성(%) 금속 이온 상대 활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 4
Zn2+ 92 Ba2+ 65
Mg2+ 100 Sr2+ 80
Ca2+ 115 Pb2+ 103
Co2+ 100 Fe2+ 98
Cu2+ 15 Fe3+ 97
Ni2+ 98 Mn2+ 111
Al3+ 99 EDTA 20
표 3의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은 Hg2+, Cu2+, EDTA에 의해 현저하게 저해되고, Ba2+, Sr2+에 의해 저해되었다. Ca2+, Mn2+에 의해 활성화되는 것도 밝혀졌다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을 "프로테인 시퀀서(PROTEIN SEQUENCER) 모델 473A"(미합중국의 Applied Biosystems사제)을 사용하여 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호(SEQ ID NO:) 1에 나온 부분 아미노산 서열, 즉 티로신-발린-세린-세린-로이신-글리신-아스파라긴-로이신-이소로이신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있는 것이 판명되었다.
실험 5-2: α-이소말토실 전이효소의 성질
실험 4-3의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(벨기이국의 Bio-Rad Laboratories사제)와 비교하여, 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 112,000 ± 20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(Amersham사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 사용하고, 영동후 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.5 ± 0.5이었다.
이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 결과를 도 9 (온도의 영향), 도 10 (pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적온도는 pH 6.0, 30분간 반응에서 약 45℃, 최적 pH는 35℃, 30분간 반응에서 약 6.0이었다. 이 효소의 온도 안정성은 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은 이 효소를 각 pH의 50mM 완충액중에서 4℃에서 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하여 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 11 (온도 안정성), 도 12 (pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 40℃까지이고, pH 안정성은 pH 약 4.0 내지 9.0이었다.
이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.
표 4
금속 이온 상대 활성(%) 금속 이온 상대 활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 1
Zn2+ 88 Ba2+ 102
Mg2+ 98 Sr2+ 101
Ca2+ 101 Pb2+ 89
Co2+ 103 Fe2+ 96
Cu2+ 57 Fe3+ 105
Ni2+ 102 Mn2+ 106
Al3+ 103 EDTA 104
표 4의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은 Hg2+에 의해 현저하게 저해되고, Cu2+에 의해 저해되었다. 또한, Ca2+에 의해 활성화되지 않는 것도, 그리고 EDTA에 의해 저해되지 않는 것도 판명되었다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을 "프로테인 시퀀서 모델 473A"(Applied Biosystems사제)을 사용하여 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호(SEQ ID NO:) 2에 나온 부분 아미노산 서열, 즉, 이소로이신―아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린-아스파라긴-글리신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있음이 판명되었다.
실험 6: 바실루스 글로비스포루스 C11로부터의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 산생
전분 부분 분해물 『PINE-DEX #100』 4.0ｗ/v％, 효모 추출물 『ASAHIMEAST』 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％, 및 물로 된 액체배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크에100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃에서 20분간 멸균하여 냉각하고, 바실루스 글로비스포루스 C11(FERM BP-7144)을 접종하고, 27℃, 230 rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다.
용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고, 가열멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1v／v％을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서 48시간 통기교반 배양하였다. 배양후, 배양액중의 이 효소활성은 약 0.55 단위/ml이고, α-이소말토실 전이효소 활성은 약 1.8단위／ml이며, 환상 4당생성 활성은 약 1.1 단위/ml이고, 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 상청 약 18L의 효소활성을 측정한 결과, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 약 0.51 단위/ml의 활성(총 활성 약 9,180 단위)이고, α-이소말토실 전이효소는 약 1.7 단위/ml의 활성(총 활성 약 30,400 단위)이며, 환상 4당생성 활성은 약 1.1 단위/ml(총 활성 약 19,400 단위)이었다.
실험 7: 바실루스 글로비스포루스 C11 유래 효소의 조제
실험 7-1: 바실루스 글로비스포루스 C11유래 효소의 정제
실험 6에서 얻어진 배양상청 약 18L을 80% 포화 황산 암모늄액으로 염석하고 4℃, 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)하여 회수해서 10mM 인산 완충액(pH 7.5)에 용해후, 이 완충액에 대하여 투석해서 조효소액 약 416ml를 얻었다. 이 조효소액은, 본 발명의 α-이소말토실 글루코 당질생성 효소활성을 8,440 단위, α-이소말토실 전이효소 활성을 약 28,000 단위, 환상 4당생성 활성을 약 17,700 단위를 가진 것이 밝혀졌다. 이 조효소액을 실험 4-1에 기재한 『Sepabeads FP-DA13』 겔을 사용한 이온교환 크로마토그래피에 사용하였다. 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성, α-이소말토실 전이효소 활성, 환상 4당생성 효소 모두가『Sepabeads FP-DA13』 겔에 흡착하지 않고, 비흡착 획분으로 용출하였다. 이 효소액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, Amersham사제의 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다. 활성효소를, 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔에 흡착시켜, 황산 암모늄 1M으로부터 0M까지의 리니어 그래디언트, 더 계속하여 말토테트라오스 0mM로부터 100M까지의 리니 그래디언트로 용출시킨 결과, α-이소말토실 전이효소와 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 분리해서 용출하고, α-이소말토실 전이효소 활성은 황산 암모늄의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 0.3 M 부근에서 용출하며, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성은 말토테트라오스의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 30mM 부근에서 용출하였다. 여기서 α-이소말토실 전이효소 활성 획분과 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 획분을 따로따로 회수하였다. 실험 4에 기재된 C9주의 경우와 마찬가지로 환상 4당생성 활성은 이 칼럼 크로마토그래피의 어느쪽의 획분에도 나타나지 않음이 확인되었고, 또한 얻어진 α-이소말토실 전이효소 획분과 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 획분을 혼합한 효소액은 환상 4당생성 활성을 나타내는 것도 확인되었으며, 전분 부분 분해물로부터 환상 4당을 생성하는 활성은 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 두가지 효소활성의 공동 작용에 의해 발휘되는 것이 밝혀졌다.
이하, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 별도로 정제하는 방법에 대해서 설명한다.
실험 7-2: α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 정제
본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔량 350ml)에 사용하였다. 이 효소를 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔에 흡착시키고, 황산 암모늄 1M으로부터 0M까지의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 흡착된 효소가 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 용출되어, 이 효소활성을 나타내는 획분을 모아 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HR S-200』 겔을 이용한 어피니티 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성량, 비활성, 수율을 표 5에 나타낸다.
표 5
공 정 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성량(단위) 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 비활성(단위/mg 단백질) 수 율(%)
배양 상청 9,180 0.14 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 8,440 0.60 91.9
이온교환 칼럼 크로마토그래피 용출액 6,620 1.08 72.1
어피니티 칼럼 크로마토그래피 용출액 4,130 8.83 45.0
소수 칼럼 크로마토그래피 용출액 3,310 11.0 36.1
어피니티 칼럼 칼럼 크로마토그래피 용출액 2,000 13.4 21.8
정제한 α-이소말토실 글루코 당질생성 효소 표품을 7.5w/v％ 농도의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 겔 전기영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.
실험 7- 3: α-이소말토실 전이효소의 정제
실험 7-1에 기재한 어피니티 크로마토그래피에 의해 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 획분으로부터 분리된 α-이소말토실 전이효소 획분을, 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔량 350ml)에 사용하였다. 이 효소를『Butyl-Toyopearl 650M』 겔에 흡착시켜, 황산 암모늄 1M으로부터 0M까지의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 흡착한 효소가 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 용출되어, 이 효소활성을 나타내는 획분을 모아 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이효소 활성량, 비활성, 수율을 표 6에 나타낸다.
표 6
공 정 α-이소말토실 전이효소 활성량(단위) α-이소말토실 전이효소 비활성(단위/mg 단백질) 수 율(%)
배양 상청 30,400 0.45 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 28,000 1.98 92.1
이온교환 칼럼 크로마토그래피 용출액 21,800 3.56 71.7
어피니티 칼럼 크로마토그래피 용출액 13,700 21.9 45.1
소수 칼럼 크로마토그래피 용출액 10,300 23.4 33.9
어피니티 칼럼 크로마토그래피 용출액 5,510 29.6 18.1
실험 8: α-이소말토실글루코 당질생성 효소 및 α-이소말토실글루코 전이효소의 성질
실험 8-1: α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 성질
실험 7-2의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(벨기이국의 Bio-Rad Laboratories 주식회사제)와 비교하여 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 137,000 ± 20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(Amersham사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 사용하고, 영동후 단백 밴드및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.2 ± 0.5이었다.
이 효소활성에 미치는 온도 및 pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그리고 온도의 영향에 대해서는, Ca2+비존재하와 1mM 존재하에서 측정하였다. 이들 결과를 도 13 (온도의 영향), 도 14 (pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적온도는, pH 6.0, 60분간 반응에서 약 45℃ (Ca2+비존재), 약 50℃ (Ca2+1mM 존재), 최적 pH는, 35℃, 60분간 반응에서 약 6.0이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 Ca2+비존재 또는 1mM 존재하에서 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 각 pH의 50mM 완충액중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 15 (온도 안정성), 도 16 (pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 40℃까지 (Ca2+비존재), 약 45℃까지 (Ca2+1mM 존재)이고, pH 안정성은 약 5.0 내지 10.0이었다.
이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 결과를 표 7에 나타낸다.
표 7
금속 이온 상대 활성(%) 금속 이온 상대 활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 4
Zn2+ 91 Ba2+ 65
Mg2+ 98 Sr2+ 83
Ca2+ 109 Pb2+ 101
Co2+ 96 Fe2+ 100
Cu2+ 23 Fe3+ 102
Ni2+ 93 Mn2+ 142
Al2+ 100 EDTA 24
표 7의 결과로부터 명확한 바와 같이, 이 효소활성은, Hg2+, Cu2+, EDTA에 의해 현저하게 저해되고, Ba2+, Sr2+에 의해 저해되었다. Ca2+, Mn2+에 의해 활성화되는 것도 밝혀졌다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을 "프로테인 시퀀서 모델 473A"(Applied Biosystems사제)을 사용하여 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호(SEQ ID NO:) 1에 나온 부분 아미노산 서열 N 말단 티로신-발린-세린-세린-로이신-글리신-아스파라긴-로이신-이소로이신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있음이 판명되었다.
이 N 말단 부분 아미노산 서열 결과를 실험 5- 1의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 N 말단 서열과 비교하면 동일한 것이 판명되고, α-이소말토실글루코 당질생성 효소에서 공통적으로 확인된 N 말단 아미노산 서열은, 서열표에 있어서의 서열 번호 1에 나온 아미노산 서열인 티로신-발린-세린-세린-로이신-글리신-아스파라긴-로이신-이소로이신의 N 말단 아미노산서열인 것이 판명되었다.
실험 8-2: α-이소말토실 전이효소의 성질
실험 7-3의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(벨기이국의 Bio-Rad Laboratories사 판매)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 102,000 ± 20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(Amersham사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 사용하고, 영동후 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정하여 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.6 ± 0.5이었다.
이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 결과를 도 17 (온도의 영향), 도 18 (pH 의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적온도는, pH 6.0, 30분간 반응에서 약 50℃, 최적 pH는, 35℃, 30분간 반응에서 약 5.5 내지 6,0이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각후 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 각 pH의 50mM 완충액중에서 4℃, 24시간 유지한 후 pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 19 (온도 안정성), 도 20 (pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 40℃까지이고, pH 안정성은 약 4.5 내지 9.0이었다.
이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 결과를 표 8에 나타낸다.
표 8
금속 이온 상대 활성(%) 금속 이온 상대 활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 2
Zn2+ 83 Ba2+ 90
Mg2+ 91 Sr2+ 93
Ca2+ 91 Pb2+ 74
Co2+ 89 Fe2+ 104
Cu2+ 56 Fe3+ 88
Ni2+ 89 Mn2+ 93
Al3+ 89 EDTA 98
표 8의 결과로부터 명확한 바와 같이, 이 효소활성은, Hg2+에 의해 현저하게 저해되고, Cu2+에 의해 저해되었다. 또한, Ca2+에 의해 활성화되지 않는 것도, 그리고 EDTA에 의해 저해되지 않는 것도 판명되었다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, "프로테인 시퀀서 모델 473A"(Applied Biosystems사제)을 사용하여 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호(SEQ ID NO:) 3에 나온 부분 아미노산 서열인 이소로이신-아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린-티로신-글리신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있는 것이 판명되었다. 이 N 말단 부분 아미노산 서열 결과를 실험 5-2의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 N 말단 서열과 비교하여, α-이소말토실 전이효소에서 공통적으로 확인된 N 말단 아미노산 서열은, 서열표에 있어서의 서열 번호 4에 나온 아미노산 서열인 이소로이신-아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린의 N 말단아미노산 서열인 것이 밝혀졌다.
실험 9: α-이소말토실글루코 당질생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소의 아미노산 서열
실험 9-1: α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 내부 부분 아미노산 서열
실험 7-2의 방법으로 얻어진 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품의 일부를 10mM Tris-염산 완충액(pH 9.0)에 대하여 투석한 후, 이 완충액으로 약 1mg/ml의 농도가 되도록 희석하였다. 이 시료액(1ml)에 10㎍의 트립신(일본국의 和光純藥 주식회사 판매)을 가하고, 30℃, 22시간 반응시킴으로써 펩티드화하였다. 생성한 펩티드를 단리하기 위해서 역상(逆相) HPLC를 하였다. "μ-Bondapak C18 칼럼"(지름 2.1mm × 길이 150mm, 미합중국의 Waters사제)을 사용하고, 유속 0.9ml/분, 실온에서 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산-8% (v/v) 아세토니트릴 용액으로부터 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산-40% (v/v) 아세토니트릴 용액까지의 120분간의 리니어 그래디언트의 조건에서 하였다. 칼럼으로부터 용출한 펩티드를 파장 210nm의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 기타의 펩티드로부터 양호하게 분리된 3가지 펩티드 [P64 (유지시간 약 64분), P88 (유지시간 약 88분), P99 (유지시간 약 99분)]을 분취하고, 각각을 진공건조한 후, 200㎕의 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산-50% (v/v) 아세토니트릴 용액에 용해하였다. 이들 펩티드 시료를 프로테인 시퀀서에서 처리하여 각각 8잔기까지 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 5 내지 7에 나온 아미노산 서열이 얻어졌다. 얻어진 내부 부분 아미노산 서열을 표 9에 나타낸다.
표 9
펩티드명 내부 부분 아미노산 서열
P64 아스파라긴산-알라닌-세린-알라닌-아스파라긴-발린-트레오닌-트레오닌
P88 트립토판-세린-로이신-글리신-페닐알라닌-메티오닌-아스파라긴-페닐알라닌
P99 아스파라긴-티로신-트레오닌-아스파라긴산-알라닌-트립토판-메티오닌-페닐알라닌
실험 9-2: α-이소말토실 전이효소의 내부 부분 아미노산 서열
실험 7-3의 방법으로 얻어진 정제 α-이소말토실 전이효소 표품의 일부를 10mM Tris-염산 완충액(pH 9.0)에 대하여 투석한 후, 이 완충액으로 약 1mg/ml의 농도가 되도록 희석하였다. 이 시료액(1ml)에 10㎍의 Lysyl Endopeptidase(일본국의 和光純藥 주식회사 판매)을 가하고, 30℃, 22시간 반응시킴으로써 펩티드화하였다. 생성한 펩티드를 단리하기 위해서, 역상 HPLC를 하였다. "μ-Bondapak C18 칼럼"(지름 2.1mm × 길이 150mm, Waters사제)을 사용하고, 유속 0.9ml/분, 실온에서 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산-8% (v/v) 아세토니트릴 용액으로부터 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산-40% (v/v) 아세토니트릴 용액까지의 120분간의 리니어 그래디언트의 조건에서 하였다. 칼럼으로부터 용출한 펩티드를 파장 210nm의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 기타의 펩티드로부터 양호하게 분리된 3가지 펩티드 [P22 (유지시간 약 22분), P63 (유지시간 약 63분), P71 (유지시간 약 71분)]을 분취하고, 각각을 진공건조한 후, 200㎕의 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산-50% (v/v) 아세토니트릴 용액에 용해하였다. 이들 펩티드 시료를 프로테인 시퀀서에서 처리하여 각각 8잔기까지 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열번호 8 내지 10에 나온 아미노산 서열을 얻어졌다. 얻어진 내부 부분 아미노산 서열을 표 10에 나타낸다.
표 10
펩티드명 내부 부분 아미노산 서열
P22 글리신-아스파라긴-글루탐산-메티오닌-아르기닌-아스파라긴-글루타민-티로신
P63 이소로이신-트레오닌-트레오닌-토립토판-프롤린-이소로이신-글루탐산-세린
P71 트립토판-알라닌-페닐알라닌-글리신-로이신-트립토판-메티오닌-세린
실험 10: 바실루스 글로비스포루스 N75로부터의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 산생
전분 부분 분해물 『PINE-DEX #4』 4.0w/v％, 효모 추출물 『ASAHIMEAST』 1.8ｗ/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하여 냉각하고, 바실루스 글로비스포루스 N75(FERM BP-7591)을 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다.
용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고, 가열 멸균하여 냉각하고, 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서 48시간 통기교반 배양하였다. 배양후, 배양액중의 이 효소활성은 약 0.34 단위/ml이고, α-이소말토실 전이효소 활성은 약 1.1 단위/ml이며, 환상 4당생성 활성은 약 0.69 단위/ml이고, 원심분리(10,000rpm, 30분간)하여 회수한 상청 약 18L의 효소활성을 측정한 결과, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 약 0.33 단위/ml의 활성(총 활성 약 5,940 단위)이고, α-이소말토실 전이효소는 약 1.1 단위/ml의 활성(총 활성 약 19,800 단위)로, 환상 4당생성 활성은 약 0.67 단위/ml (총 활성 약 12,100 단위)이었다.
실험 11: 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 효소의 조제
실험 11-1: 바실루스 글로비스포루스 N75유래 효소의 정제
실험 10에서 얻어진 배양상청 약 18L을 60% 포화 황산 암모늄액으로 염석하고 4℃, 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)하여 회수하고, 10mM Tris-염산 완충액(pH 8.3)에 용해후, 이 완충액에 대하여 투석해서 조효소액 약 450ml을 얻었다. 이 조효소액은, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성을 4,710 단위, α-이소말토실 전이효소 활성을 약 15,700 단위, 환상 4당생성 활성을 약 9,590 단위를 가진 것이 확인되었다. 이 조효소액을 실험 4-1에 기재한 『Sepabeads FP-DA13』 겔을 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 사용하였다. 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성은 『Sepabeads FP-DA13』 겔에 흡착하였고, α-이소말토실 전이효소 활성은 『Sepabeads FP-DA13』 겔에 흡착하지 않고 비흡착 획분으로 용출하였다. 계속해서, NaCl 농도 0M으로부터 1M까지의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성은, NaCl의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 0.25M 부근에서 용출하였다. 따라서, α-이소말토실 전이효소 활성 획분과 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 획분을 따로따로 모아 회수하였다. 실험 4에 기재된 C9주의 경우 및 실험 7에 기재된 C11주의 경우와 마찬가지로 환상 4당생성 활성은 이 칼럼 크로마토그래피의 어느쪽의 획분에도 나타나지 않은 것이 판명되었고, 또한, 얻어진 α-이소말토실 전이효소 획분과 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 획분을 혼합한 효소액은 환상 4당생성 활성을 나타내는 것도 판명되었으며, 전분 부분 분해물로부터 환상 4당을 생성하는 활성은 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 양쪽 효소활성의 공동 작용에 의해 발휘되는 것이 밝혀졌다.
이하, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 따로따로 정제하는 방법에 대해서 설명한다.
실험 11-2: α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 정제
본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, Amersham사제 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다. 효소를, 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔에 흡착시키고, 황산 암모늄 1M으로부터 0M까지의 리니어 그래디언트, 다시 계속하여 말토테트라오스 0mM으로부터 100mM까지의 리니 그래디언트로 용출시킨 결과, 겔에 흡착된 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 말토테트라오스의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 30mM 부근에서 용출하였고, 이 효소활성을 나타내는 획분을 모아 회수하였다. 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔량 350ml)에 사용하였다. 이 효소를『Butyl-Toyopearl 650M』 겔에 흡착시키고, 황산 암모늄 1M로부터 0M까지의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 흡착된 효소가 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 용출하였고, 이 효소활성을 나타내는 획분을 모아 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성량, 비활성, 수율을 표 11에 나타낸다.
표 11
공 정 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성량(단위) α-이소말토실글루코 당질생성 효소 비활성(단위/mg 단백질) 수 율(%)
배양 상청 5,940 0.10 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 4,710 0.19 79.3
이온교환 칼럼용출액 3,200 2.12 53.9
어피니티 칼럼용출액 2,210 7.55 37.2
소수 칼럼 용출액 1,720 10.1 29.0
어피니티 칼럼용출액 1,320 12.5 22.2
정제한 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 7.5w/v％ 농도의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 겔 전기영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.
실험 11-3: α-이소말토실 전이효소의 정제
실험 11-1에 기재된 이온 교환 크로마토그래피에 의해 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 획분으로부터 분리된 α-이소말토실 전이효소 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, Amersham사제 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다. 이 효소를『Sephacry HR S-200』 겔에 흡착시키고, 황산 암모늄 1M으로부터 0M까지의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 흡착된 효소가 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 용출하였고, 이 효소활성을 나타내는 획분을 모아 회수하였다. 다시 효소 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고,『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한 소수 칼럼 크로마토그래피(겔량 380ml)에 사용하였다. 이 효소를 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔에 흡착시키고 황산 암모늄 1M으로부터 0M까지의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 흡착된 효소가 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 용출하였고, 이 효소활성을 나타내는 획분을 모아 회수하였다. 이 회수액을 10mM Tris 염산 완충액(pH 8.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Super Q-Toyopearl 650C』 겔을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔량 380ml)에 사용하였다. 이 효소는,『Super Q-Toyopearl 650C』 겔에 흡착하지 않고 비흡착 획분으로 용출 하였으며, 얻어진 용출획분을 회수하여 최종정제 효소 표품으로 하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이효소 활성량, 비활성, 수율을 표 12에 나타낸다.
표 12
공 정 α-이소말토실 전이효소 활성량(단위) α-이소말토실 전이효소 비활성(단위/mg 단백질) 수 율(%)
배양 상청 19,000 0.33 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 15,700 0.64 82.6
이온교환 칼럼 크로마토그래피 용출액 12,400 3.56 65.3
어피니티 칼럼 크로마토그래피 용출액 8,320 11.7 43.8
소수 칼럼 크로마토그래피 용출액 4,830 15.2 25.4
어피니티 칼럼 크로마토그래피 용출액 3,850 22.6 20.3
정제한 α-이소말토실 전이효소 표품을 7.5% w/v％ 농도의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 겔 전기영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.
실험 12: α-이소말토실글루코 당질생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소의 성질
실험 12-ｌ: α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 성질
실험 11-2의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(벨기이국의의 Bio-Rad Laboratories사 판매)와 비교하여 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 136,000 ± 20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(미합중국의 Amersham사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 사용하고, 영동후 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 7.3±0.5이었다.
이 효소활성에 미치는 온도, ｐH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그리고 온도의 영향에 대해서는 Ca2+비존재하와 1mM 존재하에서 측정하였다. 이들 결과를 도 21 (온도의 영향), 도 22 (pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적온도는 pH 6.0, 60분간 반응에서 약 50℃ (Ca2+비존재), 약 55℃ (Ca2+1mM 존재), 최적 pH는 35℃, 60분간 반응에서 약 6.0이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 Ca2+비존재하 또는 1mM 존재하에서 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 각 pH의 50mM 완충액중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하여 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 23 (온도 안정성), 도 24 (pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 45℃까지 (Ca2+비존재), 약 50℃까지 (Ca2+1mM 존재)이고, pH 안정성은 약 5.0 내지 9.0이었다.
이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 결과를 표 13에 나타낸다.
표 13
금속 이온 상대 활성(%) 금속 이온 상대 활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 1
Zn2+ 82 Ba2+ 84
Mg2+ 96 Sr2+ 85
Ca2+ 108 Pb2+ 86
Co2+ 93 Fe2+ 82
Cu2+ 7 Fe3+ 93
Ni2+ 93 Mn2+ 120
Al3+ 98 EDTA 35
표 13의 결과로부터 명확한 바와 같이, 이 효소활성은 Hg2+, Cu2+, EDTA에 의해 현저하게 저해되었다. Ca2+, Mn2+에 의해 활성화되는 것도 밝혀졌다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, "프로테인 시퀀서 모델 473A"(Applied Biosystems사제)을 사용하여 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호(SEQ ID NO:) 11에 나온 부분 아미노산 서열인 히스티딘-발린-세린-알라닌-로이신-글리신-스파라긴-로이신-로이신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있는 것이 판명되었다.
이 N 말단 부분 아미노산 서열 결과를 실험 5-1의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래 및 실험 8-1의 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 N 말단 서열과 비교하면, 제1번째 및 제4번째, 제9번째의 아미노산이 다르기는 하지만 유사성이 많은 것이 밝혀졌다.
실험 12-2: α-이소말토실 전이효소의 성질
실험 11-3의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량마아커(벨기이국의 Bio-Rad Laboratories사 판매)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 112,000 ± 20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(Amersham사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 사용하고, 영동후 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 7.8 ± 0.5이었다.
이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 결과를 도 25 (온도의 영향), 도 26 (pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적온도는, pH 6.0, 30분간 반응에서 약 50℃, 최적 pH는 35℃, 30분간 반응에서 약 6.0이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 각 pH의 50mM 완충액중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하여 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 27 (온도 안정성), 도 28 (pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 45℃까지이고, pH 안정성은 약 4.5 내지 10이었다.
이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 결과를 표 14에 나타낸다.
표 14
금속 이온 상대 활성 (%) 금속 이온 상대 활성 (%)
무첨가 100 Hg2+ 0.5
Zn2+ 75 Ba2+ 102
Mg2+ 95 Sr2+ 91
Ca2+ 100 Pb2+ 69
Co2+ 92 Fe2+ 97
Cu2+ 15 Fe3+ 90
Ni2+ 91 Mn2+ 101
Al3+ 94 EDTA 92
표 14의 결과로부터 명확한 바와 같이, 이 효소활성은, Hg2+에 의하여 현저하게 저해되고, Cu2+에 의하여 되었다. 또한, Ca2+에 의하여 활성화되지 않는 것도, 그리고 EDTA에 의하여 저해되지 않는 것도 판명되었다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, "프로테인 시퀀서 모델 473A"(Applied Biosystems사제)을 사용하여 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호(SEQ ID NO:) 3에 나온 부분 아미노산 서열인 이소로이신-아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린-티로신-글리신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있는 것이 판명되었다. 이 N 말단 부분 아미노산 서열 결과를 실험 5-2의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래 및 실험 8-2의 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실 전이효소의 N 말단 서열과 비교하면, α-이소말토실 전이효소의 공통되는 N 말단 아미노산 서열은, 서열표에 있어서의 서열 번호 4에 나온 아미노산 서열인 이소로이신-아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린의 N 말단 아미노산 서열인 것이 밝혀졌다.
실험 13: α-이소말토실글루코 당질생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소의 아미노산 서열
실험 13-1: α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 내부 부분 아미노산 서열
실험 11- 2의 방법으로 얻어진 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품의 일부를 10mM Tris-염산 완충액(pH 9.0)에 대하여 투석한 후, 이 완충액으로 약 1mg/ml의 농도가 되도록 희석하였다. 이 시료액(1ml)에 20㎍의 리실 엔도펩티다아제(일본국의 和光純藥 주식회사 판매)를 가하고, 30℃, 24시간 반응시킴으로써 펩티드화하였다. 생성한 펩티드를 단리하기 위해서 역상 HPLC를 하였다. 『μ-Bondasphere C18 칼럼』(지름 3.9mm ×길이 150mm, 미합중국의 Waters사제)을 사용하고, 유속 0.9ml/분, 실온에서 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산-8% (v/v) 아세토니트릴 용액으로부터 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산-36% (v/v) 아세토니트릴 용액까지의 120분간의 리니어 그래디언트의 조건에서 하였다. 칼럼으로부터 용출한 펩티드를 파장 210nm의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 기타의 펩티드로부터 양호하게 분리된 3가지 펩티드 [PN59 (유지시간 약 59분), PN67 (유지시간 약 67분), PN87 (유지시간 약 87분)]를 분취하고, 각각 진공건조한 후, 200㎕의 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산-50% (v/v) 아세토니트릴 용액에 용해하였다. 이들 펩티드 시료를 프로테인 시퀀서에 사용하여 각각 8잔기까지 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 12 내지 14에 나온 아미노산 서열이 얻어졌다. 얻어진 내부 부분 아미노산 서열을 표 15에 나타낸다.
표 15
펩디드명 내부 부분 아미노산 서열
PN59 아스파라긴산-페닐알라닌-세린-아스파라긴-아스파라긴-프롤린-트레오닌-발린
PN67 티로신-트레오닌-발린-아스파라긴-알라닌-프롤린-알라닌-알라닌
PN87 티로신-글루탐산-알라닌-글루탐산-세린-알라닌-글루탐산-로이신
실험 13-2: α-이소말토실 전이효소의 내부 부분 아미노산 서열
실험 11-3의 방법으로 얻어진 정제 α-이소말토실 전이효소 표품의 일부를 10mM Tris-염산 완충액(pH 9.0)에 대하여 투석한 후, 이 완충액으로 약 1mg/ml의 농도가 되도록 희석하였다. 이 시료액(1ml)에 20㎍의 리실 엔도펩티다아제(일본국의 和光純藥 주식회사 판매)를 가하고, 30℃, 24시간 반응시킴으로써 펩티드화하였다. 생성한 펩티드를 단리하기 위해서 역상 HPLC를 하였다. 『μ-Bondasphere C18 칼럼』(지름 3.9mm ×길이 150mm, Waters사제)을 사용하고, 유속 0.9ml/분, 실온에서 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산-4% (v/v) 아세토니트릴 용액으로부터 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산-42.4% (v/v) 아세토니트릴 용액까지의 90분간의 리니어 그래디언트의 조건에서 하였다. 칼럼으로부터 용출한 펩티드를 파장 210nm의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 기타의 펩티드로부터 양호하게 분리된 3가지 펩티드 [PN21 (유지시간 약 21분), PN38 (유지시간 약 38분), PN69 (유지시간 약 69분)]를 분취하고, 각각 진공건조한 후, 200㎕의 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산-50% (v/v) 아세토니트릴 용액에 용해하였다. 이들 펩티드 시료를 프로테인 시퀀서에 사용하여 각각 8잔기까지(단, PN21은 6잔기까지) 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 15 내지 17에 나온 아미노산 서열이 얻어졌다. 얻어진 내부 부분 아미노산 서열을 표 16에 나타낸다.
표 16
펩디드명 내부 부분 아미노산 서열
PN21 아스파라긴-트립토판-트립토판-메티오닌-세린-리신
PN38 트레오닌-아스파라긴산-글리신-글리신-글루탐산-메티오닌-발린-트립토판
PN69 아스파라긴-이소로이신-티로신-로이신-프롤린-글루타민-글리신-아스파라긴산
실험 14: 아르드로박터 글로비포르미스 A19로부터의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 산생
전분 부분 분해물 『PINE-DEX #4』 4.0w/v％, 효모 추출물 『ASAHIMEAST』 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체배지를 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하고, 냉각하여 아르드로박터 글로비포르미스 A19(FERM BP-7590)을 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다.
용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고, 가열 멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1 v/v％을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 9.0로 유지하면서, 48시간 통기교반 배양하였다. 배양후, 배양액중의 이 효소활성은 약 1.1 단위/ml이고, α-이소말토실 전이효소 활성은 약 1.7 단위/ml이며, 환상 4당생성 활성은 약 0.35 단위/ml이고, 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 상청 약 18L의 효소활성을 측정한 결과, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 약 1.06 단위/ml의 활성(총 활성 약 19,100 단위)이고, α-이소말토실 전이효소는 약 1.6 단위/ml의 활성(총 활성 약 28,800 단위)이며,환상 4당생성 활성은 약 0.27 단위/ml (총 활성 약 4,860 단위)이었다.
그리고 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 활성측정은, 기질을 위한 완충액으로서 100mM 글리신-NaOH 완충액(pH 8.4)을 사용한 이외에는 실험 3에 기재된 방법과 마찬가지로 하였다.
실험 15: 아르드로박터 글로비포르미스 A19유래 효소의 조제
실험 15-1: 아르드로박터 글로비포르미스 A19유래 효소의 정제
실험 14에서 얻어진 배양상청 약 18L을 60% 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃, 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하여 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해후, 이 완충액에 대하여 투석하여 조효소액 약 850ml을 얻었다. 이 조효소액은, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 8,210 단위, α-이소말토실 전이효소 활성을 약 15,700 단위, 환상 4당생성 활성을 약 2,090 단위를 가진 것이 판명되었다. 이 조효소액을, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『DEAE-Toyopearl 650S』 겔을 사용한 이온 교환칼럼 크로마토그래피(겔량 380ml)에 사용하였다. 활성효소를,『DEAE-Toyopearl 650S』 겔에 흡착시켜, NaCl 농도 0M으로부터 0.5M까지의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소는 분리되어 용출하였고, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성은 NaCl의 리니어 그래디언트에서 그 농도 약 0.2M 부근에서 용출하였고, α-이소말토실 전이효소 활성은 NaCl의 리니어 그래디언트에서 그 농도 약 0.3M 부근에서 용출하였다. 따라서, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성 획분과 α-이소말토실 전이효소활성 획분을 별도로 회수하였다. 또한, 환상 4당생성 활성은 이 칼럼 크로마토그래피의 어느쪽의 획분에도 나타나지 않았음이 판명되었고, 또한, 얻어진 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 획분과 α-이소말토실 전이효소 획분을 혼합한 효소액은 환상 4당생성 활성을 나타내는 것도 판명되었으며, 전분 부분 분해물로부터 환상 4당을 생성하는 활성은 α-이소말토실 전이효소와 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 양쪽 효소활성의 공동 작용에 의해 발휘되는 것이 판명되었다.
이하, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 따로따로 정제하는 방법에 대해서 설명한다.
실험 15-2: α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 정제
본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 획분을 1M황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, Amersham사제 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔을 이용한 어피니티 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다. 효소를 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔에 흡착시키고, 황산 암모늄 1M으로부터 0M까지의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 본 발명의 흡착된 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는, 황산 암모늄의 리니어 그래디언트에서 그 농도 약 0.2M 부근에서 용출하였고, 이 효소활성을 나타내는 획분을 모아 회수하여 최종정제 표품으로 하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성량, 비활성, 수율을 표 17에 나타낸다.
표 17
공 정 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성량(단위) α-이소말토실글루코 당질생성 효소 비활성(단위/mg 단백질) 수 율(%)
배양 상청 19,100 0.11 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 8,210 0.48 43.0
이온교환 칼럼 크로마토그래피 용출액 6,890 4.18 36.1
어피니티 칼럼 크로마토그래피 용출액 5,220 35.1 27.3
정제한 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 7.5w/v％ 농도의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 겔 전기영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.
실험 15-3: α-이소말토실 전이효소의 부분 정제
실험 15-1에 기재된 이온 교환 크로마토그래피에 의해 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 획분으로부터 분리된 α-이소말토실 전이효소 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, Amersham사제 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 칼럼 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다. 이 효소를 『Sephacryl HR S-200』 겔에 흡착시키고, 황산 암모늄 1M으로부터 0M까지의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 흡착한 효소는 황산 암모늄 농도 약 0M 부근에서 용출하였고, 이 효소활성을 나타내는 획분을 모아 회수하여 부분 정제 효소 표품으로 하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이효소 활성량, 비활성, 수율을 표 18에 나타낸다.
표 18
공 정 α-이소말토실 전이효소 활성량(단위) α-이소말토실 전이효소 비활성(단위/mg 단백질) 수 율(%)
배양 상청 28,800 0.18 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 15,700 0.97 54.5
이온교환 칼럼 크로마토그래피 용출액 7,130 4.01 24.8
어피니티 칼럼 크로마토그래피 용출액 1,800 11.9 6.3
부분 정제한 α-이소말토실 전이효소 표품을 7.5w/v% 농도의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 겔 전기영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 주(main) 단백 밴드 이외에 3종의 부(minor) 단백 밴드가 나타났다.
실험 16: α-이소말토실글루코 당질생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소의 성질
실험 16-1: α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 성질
실험 15-2의 방법으로 얻은 정제 α,-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(겔 농도 7.5w/v%)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(벨기이국의 Bio-Rad Laboratories사 판매)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 94,000 ± 20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(Amersham사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드겔 전기영동법에 사용하고, 영동후 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 4.3 ± 0.5이었다.
이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그리고 온도의 영향에 대해서는, Ca2+비존재하와 1mM 존재하에 측정하였다. 이들 결과를 도 29 (온도의 영향), 도 30 (pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적온도는, pH 8.4, 60분간 반응에서 약 60℃ (Ca2+비존재), 약 65℃ (Ca2+1mM 존재), 최적 pH는, 35℃, 60분간 반응에서 약 8.4이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 글리신-NaOH 완충액, pH 8.0)을 Ca2+비존재하 또는 1mM 존재하에서 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 각 pH의 50mM 완충액중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 8.0으로 조정하여 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 31 (온도 안정성), 도 32 (pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 55℃까지 (Ca2+비존재), 약 60℃까지 (Ca2+1mM 존재)이고, pH 안정성은 약 5.0 내지 9.0이었다.
이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 결과를 표 19에 나타낸다.
표 19
금속 이온 상대 활성(%) 금속 이온 상대 활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 0
Zn2+ 56 Ba2+ 99
Mg2+ 97 Sr2+ 102
Ca2+ 106 Pb2+ 43
Co2+ 93 Fe2+ 36
Cu2+ 0 Fe3+ 35
Ni2+ 46 Mn2+ 98
Al3+ 37 EDTA 2
표 19의 결과로부터 명확한 바와 같이, 이 효소활성은 Hg2+, Cu2+, EDTA에 의하여 현저하게 저해되는 것이 밝혀졌다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, "프로테인 시퀀서 모델 473A"(Applied Biosystems사제)을 사용하여 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호(SEQ ID NO:) 18에 나온 아미노산 서열 N 말단 알라닌-프롤린-로이신-글리신-발린-글루타민-아르기닌-알라닌-글루타민-페닐알라닌-글루타민-세린-글리신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있는 것이 판명되었다.
실험 16-2: α-이소말토실 전이효소의 성질
실험 15-3의 방법으로 얻은 부분 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 이용하고, 이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 결과를 도 33 (온도의 영향), 도 34 (pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적온도는 pH 6.0, 30분간 반응에서 약 50℃, 최적 pH는 35℃, 30분간 반응에서 약 6.5이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 각 pH의 50mM 완충액중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하여 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 35 (온도 안정성), 도 36 (pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 45℃까지이고, pH 안정성은 약 4.5 내지 9.0이었다.
실험 17: 아르드로박터 라모서스 S1으로부터의 α-이소말토실 전이효소의 산생
전분 부분 분해물 『PINE-DEX #4』 4.O w/v％, 효모 추출물 『ASAHIMEAST』 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1ｗ/v%, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체배지를 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하고 냉각하여 아르드로박터 라모서스 S1 (FERM BP-7592)을 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 것을 종배양액으로 하였다. 용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고, 가열멸균하고 냉각해서 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고, 27℃, pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서 48시간 통기교반 배양하였다. 배양후의 배양액중의 이 효소활성은 약 0.45 단위/ml이며, 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 상청 약 18L의 이 효소활성은 0.44 단위/ml (총 효소활성 약 7,920 단위)이었다.
실험 18: 아르드로박터 라모서스 S1으로부터의 α-이소말토실 전이효소의 정제
실험 17에서 얻어진 배양상청 약 18L을 80% 포화 황산 암모늄액으로 염석하고 4℃, 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하여 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해후, 이 완충액에 대하여 투석하여 이 효소활성을 6,000 단위 함유하는 조효소액 약 380ml을 얻었다. 이 조효소액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거한 후, 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 칼럼 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다. 이 효소를 『세파크릴(Sephacryl) HR S-200』 겔에 흡착시키고, 황산 암모늄 1M으로부터 0M까지의 리니어 그래디언트, 및 이것에 계속하여 말토테토라오스 0w/v％로부터 5w/v％까지의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 흡착한 효소는 말토테토라오스 농도 약 2w/v％ 부근에서 용출하였고, 이 효소활성을 나타내는 획분을 회수하였다. 더욱이 효소 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한 소수 칼럼 크로마토그래피(겔량 380m1)에 사용하였다. 이 효소를 『Butyl-Toyopearl 650M』겔에 흡착시키고, 황산 암모늄 1M으로부터 0M까지의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 겔에 흡착한 효소는 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 용출하였고, 이 효소활성을 나타내는 획분을 회수하여 정제 표품으로 하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이효소의 활성량, 비활성, 수율을 표 20에 나타낸다.
표 20
공 정 α-이소말토실 전이효소 활성량(단위) α-이소말토실 전이효소 비활성(단위/mg 단백질) 수 율(%)
배양 상청 7,920 0.47 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 6,000 3.36 75.8
이온교환 칼럼 크로마토그래피 용출액 5,270 29.9 66.5
소수 칼럼 크로마토그래피 용출액 4,430 31.1 55.9
7.5w/v％ 농도의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 SDS-PAGE에 의해, 이 실험에서 정제한 α-이소말토실 전이효소 표품의 순도를 검정한 결과, 이 효소 표품의 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.
실험 19: α-이소말토실 전이효소의 성질
실험 18의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(벨기이국의 Bio-Rad Laboratories사 판매)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 116,000 ± 20,000 달톤이었다.
이 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 2w/v％『앰폴라인』(미합중국의 Amersham사 제조) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 사용하고, 영동후 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점(pI)은 약 4.2 ± 0.5이었다.
이 효소의 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 도 37 (온도의 영향), 도 38 (pH의 영향)에 나타내었다. 이 효소의 최적온도는 pH 6.0, 30분간 반응에서 약 50℃, 최적 pH는 35℃, 30분간 반응에서 약 6.0이었다. 이 효소의 온도 안정성은 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 pH가 다른 50mM 완충액중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하여 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 39 (온도 안정성), 도 40 (pH 안정성)에 나타내었다. 이들 도면에 나온 바와 같이 이 효소의 상기한 조건하에서의 안정 온도영역은 약 45℃ 이하이며, 또한, 이 효소의 상기한 조건하에서의 안정 pH 영역은 pH 약 3.6 내지 약 9.0이었다.
이 효소의 활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 21에 나타낸다.
표 21
금속 이온 상대활성(%) 금속 이온 상대활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 0.1
Zn2+ 78 Ba2+ 97
Mg2+ 99 Sr2+ 101
Ca2+ 103 Pb2+ 85
Co2+ 91 Fe2+ 105
Cu2+ 2 Fe3+ 75
Ni2+ 87 Mn2+ 98
Al3+ 93 EDTA 91
표 21의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은 Hg2+에 의해 현저하게 저해되고, Cu2+에 의해서도 저해되었다. 또한, Ca2+에 의해서 활성화되지 않는 것도,EDTA에 의해서 저해되지 않는 것도 판명되었다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, "프로테인 시퀀서 모델 473A"(Applied Biosystems사제)을 사용하여 분석하였다. 이 효소의 N 말단 아미노산 서열은, 서열표에 있어서의 서열 번호 19에 나온, 아스파라긴산-트레오닌-로이신-세린-글리신-발린-페닐알라닌-히스티딘-글리신-프롤린으로 나타내어지는 서열인 것이 판명되었다.
실험 20: 각종 당질에 대한 작용
각종 당질을 사용하여 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 기질이 될 수 있는 것인가 아닌가의 시험을 하였다. 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 파노오스, 이소파노오스, 트레할로오스, 코지비오스, 니게로오스, 네오트레할로오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 말티톨, 말토트리이톨, 락토오스, 수크로오스, 에를로오스, 셀라기노오스, 말토실 글루코시드, 이소말토실 글루코시드를 함유한 용액을 조제하였다.
이들 용액에 실험 4-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품, 또는 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품, 실험 11-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품, 실험 15-2의 방법으로 얻은 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 기질 고형물 1그램당 각각 2 단위씩 가하여 기질농도를 2w/v％이 되도록 조정하고, 이것을 30℃, pH 6.0 (아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 효소의 경우, pH 8.4)에서 24시간 작용시켰다. 효소반응 전후의 반응액을 실험 1 기재의 TLC법에 의해 분석하여 각각의 당질에 대한 효소작용의 유무를 확인하였다. 그 결과를 표 22에 나타낸다.
표 22
기 질 효 소 작 용
C9 효소 C11 효소 N75 효소 A19 효소
말토오스 ＋ ＋ ＋ ＋
말토트리오스 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
말토테트라오스 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋
말토펜타오스 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋
말토헥사오스 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋
말토헵타오스 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋
이소말토오스 － － － －
이소말토트리오스 － － － －
파노오스 － － － －
이소파노오스 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
트레할로오스 － － － －
코지비오스 ＋ ＋ ＋ ＋
니게로오스 ＋ ＋ ＋ ＋
네오트레할로오스 ＋ ＋ ＋ ＋
셀로비오스 － － － －
겐티비오스 － － － －
말티톨 － － － －
말토트리이톨 ＋ ＋ ＋ ＋
락토오스 － － － －
수크로오스 － － － －
에를로오스 ＋ ＋ ＋ ＋
셀라기노오스 － － － －
말토실 글루코시드 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
이소말토실 글루코시드 － － － －
주) 효소반응 전후에서,
「-」은 변화가 없었던 것을 나타내고,
「+」은 기질의 스폿(spot)이 약간 감소하고, 다른 생성물이 생성한 것을 나타내며,
「++」은 기질의 스폿이 상당히 감소하고, 다른 생성물이 생성한 것을 나타내고,
「+++」은 기질의 스폿이 대부분 소실하고, 다른 생성물이 생성한 것을 나타낸다.
표 22의 결과로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 시험한 여러가지 당질 중에서 글루코오스 중합도 3 이상이고, 비환원 말단에 말토오스 구조를 가진 당질에 잘 작용하는 것이 밝혀졌다. 또한, 글루코오스 중합도가 2인 당질에서는 말토오스, 코비오스, 니게로오스, 네오트레할로오스, 말토트리이톨, 에를로오스에도 약간 작용하는 것이 밝혀졌다.
실험 21: 말토올리고당으로부터의 생성물
실험 21-1: 생성물의 조제
농도 1%의 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스의 각각 수용액에 실험 7-2의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 각각 고형물 1 그램당 2 단위(말토오스 및 말토트리오스), 0.2 단위(말토테트라오스), 0.1 단위(말토펜타오스)가하고, 35℃, pH 6.0에서 8시간 작용시키고 100℃에서 10분간 유지해서 반응을 정지하였다. 그 효소 반응액의 당조성을 HPLC법을 사용하여 측정하였다. HPLC는,『YMC Pack ODS-AQ303』 칼럼(일본국의 주식회사 YMC제조)을 사용하여 칼럼온도 40℃, 유속 0.5ml/min 물(water)의 조건에서 하고, 검출은 시차(示差) 굴절계 『RI-8012』(일본국의 Tosoh 주식회사 제조)를 사용하여 하였다. 그 결과를 표 23에 나타낸다.
표 23
반응에서 생성한 당질의 종류 기 질
말토오스 말토트리오스 말토테트라오스 말토펜타오스
글루코오스 8.5 0.1 0.0 0.0
말토오스 78.0 17.9 0.3 0.0
말토트리오스 0.8 45.3 22.7 1.9
말토테트라오스 0.0 1.8 35.1 19.2
말토펜타오스 0.0 0.0 3.5 34.4
말토헥사오스 0.0 0.0 0.0 4.6
이소말토오스 0.5 0.0 0.0 0.0
글루코실말토오스 8.2 1.2 0.0 0.0
글루코실말토트리오스 2.4 31.5 6.8 0.0
X 0.0 2.1 30.0 11.4
Y 0.0 0.0 1.4 26.8
Z 0.0 0.0 0.0 1.7
기타 0.6 0.1 0.2 0.0
표 중에서
글루코실말토오스는 α-이소말토실글루코오스(별명, 62-O-α-글루코실말토오스, 또는 파노오스)이고,
글루코실말토트리오스는 α-이소말토실글루코오스(별명, 63-O-α-글루코실말토트리오스)이며,
X는 실험 11-2에 기재한 α-이소말토실말토트리오스(별명, 64-O-α-글루코실말토테트라오스)이고,
Y는 실험 11-2에 기재한 α-이소말토실말토테트라오스(별명, 65-O-α-글루코실말토펜타오스)이며,
Z는 확인되지 아니한 당질이다.
표 23의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소의 작용의 결과, 기질인 말토오스로부터는 주로 글루코오스와 α-이소말토실글루코오스(별명, 62-O-α-글루코실말토오스, 또는 파노오스)가 생성하고, 기질인 말토트리오스로부터는 주로 말토오스와 α-이소말토실글루코스(별명, 63-O-α-글루코실말토트리오스)가 생성하며, 소량이지만 글루코오스, 말토테트라오스, α-이소말토실글루코오스(별명, 62-O-α-글루코실말토오스, 또는 파노오스), 생성물 Ⅹ가 생성하는 것이 밝혀졌다. 기질인 말토테트라오스로부터는 주로 말토트리오스와 생성물 Ⅹ가 생성하고, 소량이지만 말토오스, 말토펜타오스, α-이소말토실글루코오스(별명, 63-O-α-글루코실말토트리오스), 생성물 Y가 생성하는 것이 밝혀졌다. 기질인 말토펜타오스로부터는 주로 말토테트라오스와 생성물 Y가 생성하고, 소량이지만 말토트리오스, 말토헥사오스, 및 생성물 Ⅹ, 생성물 Z가 생성하는 것이 밝혀졌다.
기질인 말토테트라오스로부터의 주생성물인 생성물 Ⅹ, 및 기질인 말토펜타오스로부터의 주생성물인 생성물 Y의 단리·정제를 하였다. 분취용 HPLC 칼럼 『YMC Pack ODS-A R355-15S-15 12A』(일본국의 주식회사 YMC사제)을 사용해서 정제하고, 상기한 말토테트라오스로부터의 반응물, 말토펜타오스로부터의 반응물 각각으로부터 순도 99.9% 이상의 생성물 Ⅹ 표품을 고형물 수율 약 8.3%로, 그리고 순도 99.9% 이상의 생성물 Y를 고형물 수율 약 11.5%로 단리하였다.
실험 21-2: 생성물의 구조해석
실험 21-1의 방법으로 얻은 생성물 Ⅹ 및 생성물 Y를 사용하고, 통상의 방법에 따라서 메틸화 분석과 NMR 분석을 하였다. 메틸화 분석의 결과는 표 24에 정리하였다. NMR 분석 결과에 대해서는1H-NMR 스페트럼을 도 41 (생성물 Ⅹ), 도 42 (생성물 Y)에,13C-NMR 스펙트럼을 도 43 (생성물 Ⅹ), 도 44 (생성물 Y)에, 생성물 Ⅹ 및 Y의 귀속을 표 25에 정리하였다.
표 24
분석된 메틸화물의 종류 조 성 비
생성물 Ⅹ 생성물 Y
2,3,4-트리메틸화물 1.00 1.00
2,3,6-트리메틸화물 3.05 3.98
2,3,4,6-테트라메틸화물 0.82 0.85
이들 결과로부터 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소에 의한 말토테트라오스로부터의 생성물 Ⅹ는 말토테트라오스의 비환원 말단 글루코오스의 6위치 히드록실기에 글루코오스기가 α 결합한 5당이며, 구조식 1로 나타내어지는 α-이소말토실말토트리오스(별명, 64-O-α-글루코실말토테트라오스)인 것이 밝혀졌다.
구조식 1:
α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp
또한, 말토펜타오스로부터의 생성물 Y는 말토펜타오스의 비환원 말단 글루코오스의 6위치 히드록실기에 글루코실기가 α 결합한 6당이며, 구조식 2로 나타내어지는 α-이소말토실말토테트라오스(별명, 65-O-α-글루코실말토펜타오스)인 것이 밝혀졌다.
구조식 2:
αD-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp
표 25
글루코오스 번호 탄소번호 NMR 화학 시프트값 (ppm)
생성물 X 생성물 Y
a 1a 100.8 100.8
2a 74.2 74.2
3a 75.8 75.7
4a 72.2 72.2
5a 74.5 74.5
6a 63.2 63.1
b 1b 102.6 102.6
2b 74.2 74.2
3b 75.8 75.7
4b 72.1 72.1
5b 74.0 74.0
6b 68.6 68.6
c 1c 102.3 102.3
2c 74.2 74.2
3c 76.0 76.0
4c 79.6 79.5
5c 73.9 73.9
6c 63.2 63.1
d 1d 102.2 102.3
2d 74.0(α), 74.4(β) 74.2
3d 76.0 76.0
4d 79.8 79.5
5d 73.9 73.9
6d 63.2 63.1
e 1e 94.6(α), 98.5(β) 102.1
2e 74.2(α), 76.7(β) 74.0(α), 74.4(β)
3e 75.9(α), 78.9(β) 76.0
4e 79.6(α), 79.4(β) 79.8
5e 72.6(α), 77.2(β) 73.9
6e 63.4(α), 63.4(β) 63.1
f 1f 94.6(α), 98.5(β)
2f 74.2(α), 76.7(β)
3f 76.0(α), 78.9(β)
4f 79.6(α), 79.5(β)
5f 72.6(α), 77.2(β)
6f 63.3(α), 63.3(β)
이상으로부터 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 말토올리고당에 대한 작용은 아래와 같이 판단되었다.
(1) 이 효소는 기질로서 α-1,4 결합으로 된 글루코오스 중합도가 2 이상인 말토올리고당에 작용하여, 그 비환원 말단의 글루코실 잔기를 다른 분자의 비환원 말단의 글루코실 잔기의 6위치에 전이하는 작용을 가진 분자간의 6-글루코실 전이를 촉매하여, 비환원 말단에 6-O-α-글루코실기를 가진, 글루코오스 중합도가 1 증가한 α-이소말토실글루코 당질(별명, 6-O-α-글루코실말토올리고당)과, 글루코오스 중합도가 1 감소한 말토올리고당을 생성한다.
(2) 이 효소는 4-글루코실 전이도 약간 촉매하여, 말토올리고당으로부터 글루코오스 중합도가 1증가한 말토올리고당과, 글루코오스 중합도가 1 감소한 말토올리고당을 약간 생성한다.
실험 22: 환원력 생성 시험
본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소가 환원력 생성능을 가지는 것인가 아닌가를 조사하기 위해서 아래의 시험을 하였다. 농도 1%의 말토테트라오스 수용액에 실험 4-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 및 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소, 실험 11-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소, 실험 15-2의 방법으로 얻은 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 기질 고형물 1 그램당 0.25 단위 가하고, 35℃, pH 6.0 (아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 효소의 경우, pH 8.4)에서 작용시키고, 그 반응액의 일부를 경시적으로 채취하며, 100℃에서 10분간 유지해서 반응을 정지하여 반응액의 환원력을 측정하였다. 즉, 그 효소반응 전후의 용액의 환원 당량(糖量)을 소모기-넬슨법으로 측정하고, 또한, 동시에 그 효소반응 전후의 용액의 전체 당량(糖量)을 안트론-황산법으로 측정하여 환원력 생성율(％)을 아래의 계산식을 사용해서 산출하였다.
계산식:
그 결과를 표 26에 나타낸다.
표 26
반응시간(시간) 환원력율(%)
C9 효소 C11 효소 N75 효소 A19 효소
0 0.0 0.0 0.0 0.0
1 0.0 0.1 0.1 0.0
2 0.1 0.0 0.0 0.1
4 0.1 0.1 0.0 0.0
8 0.0 0.0 0.1 0.1
표 26의 결과로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는, 말토테트라오스를 기질로 하여 작용시키면, 반응물의 환원력을 실질적으로 증가하지 않는 것, 즉, 이 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 가수분해 작용을 나타내지 않거나 검출할 수 없을 정도로 극히 약간인 것이 밝혀졌다.
실험 23: 덱스트란 생성 시험
본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소가 덱스트란 생성작용을 가지는 것인가 아닌가를 조사하기 위해서 문헌 [Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 제56권, 169 내지 173 페이지 (1992년)]에 기재된 방법에 준해서 시험을 하였다. 즉, 농도 1％의 말토테트라오스 수용액에 실험 4-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9주 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 및실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11주 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소, 실험 11-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75주 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소, 실험 15-2의 방법으로 얻은 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을, 기질 고형물 1 그램당 0.25 단위 가하고, 35℃, pH 6.0 (아르드로박터 글로비포르미스 A19 효소의 경우, pH 8.4)에서 4시간 및 8시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 유지하고 반응을 정지하였다. 그 효소 반응액의 50㎕을 원심관에 넣고, 여기에 3배량의 에탄올을 가하여 충분히 교반한 후, 4℃에서 30분간 정치하였다. 이어서 원심분리(15,000rpm, 5분간)하고, 그 상청을 제거한 후, 1ml의 75w/w%의 에탄올을 가하고 교반하여 세정하였다. 다시, 원심분리해서 그 상청을 제거하고, 진공건조한 후, 1ml의 탈이온수를 가하여 충분히 교반하였다. 그 액중의 전체 당량(糖量)(글루코오스 환산)을 페놀 황산법으로 측정하여 시험의 전체 당량(糖量)으로 하였다. 반응의 블랭크(blank)로서, 100℃에서 10분간 열처리해서 실활시킨 바실루스 글로비스포루스 C9 유래 또는 바실루스 글로비스포루스 C11 유래, 바실루스 글로비스포루스 N75 유래, 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 사용하여 마찬가지로 하여 블랭크의 전체 당량(糖量)으로 하였다. 덱스트란 생성량은 아래의 계산식으로 계산하였다.
계산식:
덱스트란 생성량(mg/ml) = [(시험의 전체 당량(糖量)) - (블랭크의 전체 당량(糖量))]×20
그 결과를 표 27에 나타낸다.
표 27
반응시간(시간) 생성 덱스트란(mg/ml)
C9 효소 C11 효소 N75 효소 A19 효소
4 0.0 0.0 0.0 0.0
8 0.0 0.0 0.0 0.0
표 27의 결과로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 말토테트라오스에 작용시켜도 덱스트란을 생성하지 않는 것, 즉, 이 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 덱스트란 생성 작용을 실질적으로 가지지 않거나 ,그 생성량은 검출한계 이하인 것이 밝혀졌다.
실험 24: 전이(轉移) 수용체 특이성
각종 당질을 사용하여 이 효소의 전이 수용체가 될 수 있는 것인가 아닌가의 시험을 하였다. D-글루코오스, D-크실로오스, L-크실로오스, D-갈락토오스, D-프룩토오스, D-만노오스, D-아라비노오스, D-푸코오스, D-프시코오스, L-소르보오스, L-람노오스, 메틸-α-글루코시드, 메틸-β-글루코시드, N-아세틸-글루코사민, 소르비톨, 트레할로오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 글리세롤, 말티톨, 락토오스, 수크로오스, α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, L-아스코르브산의 용액을 조제하였다.
이들 수용체 용액(농도 1.6%)에, 당공여체로서 전분 부분 분해물 『PINE-DEX #100』(농도 4%)을 가하고, 실험 4-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품 또는 실험 7-2의 방법으로얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품, 실험 11-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75주 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소, 실험 15-2의 방법으로 얻은 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 당공여체 고형물 1 그램당 각각 1 단위씩 가하여 이것을 30℃, pH 6.0 (아르드로박터 글로비포르미스 A19 효소의 경우, pH 8.4)에서 24시간 작용시켰다. 효소반응후의 반응액을, 수용체가 단당 또는 2당인 경우는 가스 크로마토그래피법(이하, 간단히 「GLC법」이라 함)에 의하여, 그리고 수용체가 3당 이상의 경우는 HPLC법에 의하여 분석하고, 각각의 당질이 이 효소의 전이 수용체가 되는지를 확인하였다. 그리고 GLC에 있어서 GLC 장치는 『GC-16A.』(일본국의 주식회사 島津제작소제), 칼럼은 일본국의 GL Science 주식회사제 『2% SILICONE OV-17/CHROMOSOLV W』를 충전한 스테인레스제 칼럼(3mmφ×2m), 캐리어 가스는 질소 가스를 유량 40ml/분에서 160℃로부터 320℃까지 7.5℃／분의 속도로 승온하고, 검출은 수소염 이온 검출기로 분석하였다. HPLC에서는, HPLC의 장치는 일본국의 Tosoh 주식회사제 『CCPD』, 칼럼은 『ODS-AQ-303』(일본국의 주식회사 YMC사제), 용리액은 물을 유속 0.5ml/분으로 하고, 검출은 시차 굴절계로 분석하였다. 결과를 표 28에 나타낸다.
표 28
당 질 전 이 생 성 물
C9 효소 C11 효소 N75 효소 A19 효소
D-글루코오스 ＋ ＋ ＋ ＋
D-크실로오스 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋
L-크실로오스 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋
D-갈락토오스 ＋ ＋ ＋ ±
D-프룩토오스 ＋ ＋ ＋ ＋
D-만노오스 － － － ±
D-아라비노오스 ± ± ± ±
D-푸코오스 ＋ ＋ ＋ ±
D-프시코오스 ＋ ＋ ＋ ＋
L-소르보오스 ＋ ＋ ＋ ＋
L-람노오스 － － － －
메틸-α-글루코시드 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
메틸-β-글루코시드 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
N-아세틸-글루코사민 ＋ ＋ ＋ －
소르비톨 － － － －
트레할로오스 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
이소말토오스 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋
이소말토트리오스 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ±
셀로비오스 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
겐티비오스 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋
글리세롤 ＋ ＋ ＋ ＋
말티톨 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
락토오스 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
수크로오스 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
α-사이클로덱스트린 － － － －
β-사이클로덱스트린 － － － －
γ-사이클로덱스트린 － － － －
L-아스코르브산 ＋ ＋ ＋ ＋
표 중에서,
「-」는 수용체에의 당 전이물이 검출되지 않았음을 나타내고,
「±」은 수용체에의 당 전이물이 검출되었지만, 그 생성량이 1% 미만이었던 것을 나타내며,
「+」은 수용체에의 당 전이물이 1 이상 10 미만이었던 것을 나타내고,
「++」은 수용체에의 당 전이물이 10% 이상이었던 것을 나타낸다.
표 28의 결과로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 전이 수용체로서 여러가지의 당질을 이용할 수 있고, 바실루스 글로비스포루스 C9, C11, N75주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는, 특히, D-/L-크실로오스, 메틸-α-글루코시드, 메틸-β-글루코시드, 트레할로오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 말티톨, 락토오스 및 수트로오스에 잘 전이하고, 이어서 D-글루코오스, D-프룩토오스, D-푸코오스, D-프시코오스, L-소르보오스, N-아세틸글루코사민, 글리세롤 및 L-아스코르브산에 전이하고, 더욱이, D-아라비노오스에도 전이하는 것이 밝혀지고, 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는, 특히, 메틸-α-글루코시드, 메틸-β-글루코시드, 트레할로오스, 셀로비오스, 말티톨, 락토오스 및 수크로오스에 잘 전이하고, 이어서 D-글루코오스, D-/L-크실로오스, D-프룩토오스, D-프시코오스, L-소르보오스, 이소말토오스, 겐티비오스, 글리세롤 및 L-아스코르브산에 전이하고, 더욱이, D-갈락토오스, D-만노오스, D-아라비노오스, D-푸코오스 및 이소말토트리오스에도 전이하는 것이 밝혀졌다.
이상에서 설명한 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 성질에 대해서, 이미 보고되어 있는 6-글루코실 전이 작용을 가진 효소, 문헌 [Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 제56권, 제169 내지 173 페이지 (1992년)]에 기재된 덱스트린·덱스트라나아제 및 『일본 농예화학회지』, 제37권, 제668 내지 672 페이지 (1963년)에 기재된 트란스글루코시다아제와 비교하였다. 그 결과를 표 29에 정리하였다.
표 29
성 질 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 덱스트린·덱스트라나아제 트란스글루코시다아제
C9 효소 C11 효소 N75 효소 A19 효소 (대조) (대조)
가수분해능 가수분해 하지 않음 가수분해 하지 않음 가수분해 하지 않음 가수분해 하지 않음 가수분해 하지 않음 주로 가수분해함
최적 pH 6.0-6.5 6.0 6.0 8.4 4.0-4.2 3.5
EDTA에 의한 저해 저해됨 저해됨 저해됨 저해됨 저해되지않음 저해되지않음
표 29로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 기지의 덱스트린·덱스트라나아제 및 트란스글루코시다아제와는 전혀 다른 신규의 이화학적 성질을 가진 것이 밝혀졌다.
실험 25: 환상 4당의 생성
각종 당질을 사용하여 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소의 작용에 의한 환상 4당 생성 시험을 하였다. 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 아밀로오스, 가용성 전분, 전분 부분 분해물(상품명 『PINE-DEX #100』, 일본국의 松谷화학 주식회사제) 또는 글리코겐(굴 유래, 일본국의 和光純藥 주식회사 판매)의 용액을 조제하였다.
이들의 수용액(농도 0.5%)에 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 고형물 1 그램당 1 단위와, 실험 7-3의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 고형물 1 그램당 10 단위를 가하고, 이들을 30℃, pH 6.0에서 작용시켰다. 작용조건은 아래의 4개의 계(系)에서 하였다.
(1) α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활하고, 계속해서 α-이소말토실 전이효소를 24시간 작용시킨 후 효소를 열실활시켰다.
(2) α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 동시에 24시간 작용시킨 후 효소를 열실활시켰다.
(3) α-이소말토실글루코 당질생성 효소만을 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활시켰다.
(4) α-이소말토실 전이효소만을 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활시켰다.
이들 열실활시킨 반응액중의 환상 4당의 생성량을 조사하기 위해서 실험 1과 마찬가지의 α-글루코시다아제·글루코아밀라아제 처리하고, 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하여 HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 이들 결과를 표 30에 나타낸다.
표 30
성 질 환상 4당 생성량(%)
α-이소말토실글루코 당질생성 효소 작용후, α-이소말토실 전이효소를 작용 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 동시에 작용 α-이소말토실글루코 당질생성 효소만을 작용 α-이소말토실 전이효소만을 작용
말토오스 4.0 4.2 0.0 0.0
말토트리오스 10.2 12.4 0.0 0.0
말토테트라오스 11.3 21.5 0.0 0.0
말토펜타오스 10.5 37.8 0.0 0.0
아밀로오스 3.5 31.6 0.0 0.0
가용성 전분 5.1 38.2 0.0 0.0
전분 부분분해물 6.8 63.7 0.0 0.0
글리코겐 10.2 86.9 0.0 0.0
표 30의 결과로부터 명백한 바와 같이, 시험에 사용된 어떠한 당질도 α-이소말토실글루코 당질생성 효소만의 작용 및 α-이소말토실 전이효소만의 작용에서는 환상 4당은 전혀 생성하지 않았음에 대하여, α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 병용함으로써 환상 4당이 생성하였다. 그 생성량은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 작용시킨 후에 α-이소말토실 전이효소를 작용시켰을 경우에는 약 11% 이하로서 비교적으로 낮은데 대하여 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 동시에 작용시키면 어느쪽의 당질에서도 환상 4당의 생성량은 향상하고, 특히, 글리코겐에서는 약 87%로 증가하고, 전분 부분 분해물에서는 약 64%로 증가하는 것이 판명되었다.
이 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 병용에 있어서의 환상 4당의 생성 메커니즘은 양쪽 효소의 반응특성으로부터 아래와 같이 추측된다.
(1) 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 글리코겐이나 전분 부분 분해물 등의 α-1,4 글루칸 쇄(鎖)의 비환원 말단 글루코오스기에 작용하여, 그 글루코오스기를 다른 α-1,4 글루칸 쇄의 비환원 말단 글루코오스기의 6위치 히드록실기에 분자간 전이시켜, 비환원 말단에 α-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 쇄(鎖)가 생성한다.
(2) α-이소말토실 전이효소는, 비환원 말단에 이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 쇄(鎖)에 작용하여 그 이소말토실기를, 다른 비환원 말단에 이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 쇄(鎖)의 비환원 말단 글루코오스기의 3위치 히드록실기에 분자간 전이시켜 비환원 말단에 이소말토실-1,3-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 쇄(鎖)가 생성한다.
(3) 이어서, α-이소말토실 전이효소는 그 비환원 말단에 이소말토실-1,3-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 쇄(鎖)에 작용하여, 분자내 전이 작용에 의해 이소말토실-l,3-이소말토실기를 α-1,4 글루칸 쇄(鎖)로부터 떼어버리고 환상화해서 환상 4당이 생성한다.
(4) 분리된 α-1,4 글루칸 쇄(鎖)는, 다시, (1)로부터 (3)의 반응을 받음으로써 더욱 환상 4당이 생성한다. α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소와의 병용으로 상기한 바와 같이 양쪽 효소가 반복하여 작용함으로써 환상 4당의 생성량이 증가한다고 추측되었다.
실험 26: 전분액화 정도의 영향
옥수수 전분을 농도 15%의 전분유(澱粉乳)로 하고, 여기에 탄산 칼슘을 0.1% 가하여 pH 6.0으로 조정하고, α-아밀라아제(상품명 『TERMAMYL 60L, 덴마크국의 Novo사제)를 전분 1 그램당 0.2 내지 2.0%을 가하여 95℃에서 10분간 반응시킨 다음에, 120℃에서 20분간 오토클레이브 처리하고, 약 35℃로 급냉하여 DE 3.2 내지 20.5의 액화 용액을 얻고, 여기에 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글구로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 고형물 1 그램당 2 단위와, 실험 7-3의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 고형물 1 그램당 20 단위를 가하고, 35℃에서 24시간 반응시켰다. 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 계속해서 실험 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제를 사용하여 처리하여 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하고, HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 이들결과를 표 31에 나타낸다.
표 31
α-아밀라아제 사용량 전분당(%) DE 환상 4당 생성율(%)
0.2 3.2 54.5
0.4 4.8 50.5
0.6 7.8 44.1
1.0 12.5 39.8
1.5 17.3 34.4
2.0 20.5 30.8
표 31의 결과로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소에 의한 환상 4당의 생성은 전분의 액화의 정도에 의해 영향을 받고, 액화의 정도가 낮을수록, 즉, DE값이 낮을수록 전분으로부터의 환상 4당의 생성율은 높고, 반대로 액화의 정도가 높을수록, 즉, DE값이 높을수록 전분으로부터의 환상 4당의 생성율이 낮은 것이 밝혀졌다. 구체적으로는, 전분의 부분 분해의 정도는 약 20 이하, 바람직하게는 DE 약 12 이하, 더욱 바람직하게는 DE 약 5 이하가 적합하다는 것이 밝혀졌다.
실험 27: 전분 부분 분해물 농도의 영향
전분 부분 분해물 『PINE-DEX #100』(DE 약 2 내지 5)의 최종농도 0.5 내지 40%의 수용액을 조제하고, 각각에, 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 고형물 1 그램당 1 단위와, 실험 7-3의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 고형물 1 그램당 10 단위 가하고, 이들 두가지 효소를 병용하여 30℃, pH 6.0에서 48시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 계속해서, 실험 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제를 사용하여 처리하여 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하고, HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 이들 결과를 표 32에 나타낸다.
표 32
PINE-DEX 농도(%) 환상 4당 생성량(%)
0.5 63.6
2.5 62.0
5 60.4
10 57.3
15 54.6
20 51.3
30 45.9
40 39.5
표 32의 결과로부터 명백한 바와 같이, 전분 부분 분해물의 농도가 0.5%의 저농도에서는 환상 4당의 생성량은 약 64%인데 대해, 농도 40%의 고농도에서는 환상 4당의 생성량은 약 40%로서, 기질인 전분 부분 분해물의 농도에 의존해서 환상 4당의 생성량이 변화하는 것이 판명되었다. 이 결과로부터 환상 4당의 생성량은 전분 부분 분해물이 저농도일 수록 높아지는 경향인 것이 판명되었다.
실험 28: 시클로덱스트린 글루카노트란스페라제 첨가 효과
전분 부분 분해물 『PINE-DEX #100』 수용액(농도 15%)을 조제하고, 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 고형물 1 그램당 1 단위와, 실험 7-3의 방법으로 얻은 C11주 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 고형물 1 그램당 10 단위와, 바실루스 스테아로더어모필루스 유래의 시클로덱스트린 글루카노트란스페라제(CGTase)를 고형물 1 그램당 0 내지 0.5 단위 가하고, 이들 효소를 병용해서 30℃, pH 6.0에서 48시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 계속해서, 실험 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제를 사용하여 처리하여 잔존하는 환원성 올리고 당을 가수분해하고, HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 이들 결과를 표 33에 나타낸다.
표 33
CGTase 첨가량(단위) 환상 4당 생성량(%)
0 54.6
2.5 60.1
5 63.1
10 65.2
표 33의 결과로부터 명백한 바와 같이, CGTase를 첨가함으로써 환상 4당의 생성량이 증가하는 것이 판명되었다.
실험 29: 환상 4당의 조제
옥수수 유래 피토글리코겐(일본국의 Q.P.주식회사제)의 수용액(약 100L)을 농도 4w/v％, pH 6.0, 온도 30℃로 조정한 후, 실험 7-2의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 고형물 1 그램당 1 단위와, 실험 7-3의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 고형물 1 그램당 10 단위 가하고 48시간 작용시킨 후, 100℃에서 10분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 이 반응액의 일부를 채취하여 HPLC에 의해 환상 4당 생성량을 조사한 결과, 당조성으로서 약 84%이었다. 이 반응액을 pH 5.0, 온도 45℃로 조정한 후, 실험 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제를 사용하여 처리하여 잔존하는 환원성 올리고당 등을 가수분해하고, 더욱이 수산화 나트륨으로 pH를 5.8로 조정하고, 온도 90℃에서 1시간 유지하여 효소를 실활 시키고 불용물을 여과하여 제거하였다. 이 여액을 역침투막을 사용하여 고형분 농도 약 16%까지 농축한 후, 통상의 방법에 따라서 탈색, 탈염, 여과, 농축한 결과, 고형분 약 3,700g을 함유하는 당용액 약 6.2kg을 얻었다.
얻어진 당액을 일본국의 Organo사제의 이온교환 수지 『Amberlite CR-1310 (Na형)』을 충전한 칼럼(겔량 약 225L)에 사용하고, 칼럼 온도 60℃에서 유속 약 45L/h의 조건으로 크로마토 분리를 하였다. 용출액의 당조성을 실험 1에 기재한 HPLC법에 의해 모니터링하여 환상 4당의 순도가 98% 이상인 획분을 회수하고, 통상의 방법에 따라 탈염, 탈색, 여과, 농축한 결과, 고형분 약 2,500g을 함유하는 당용액 약 7.5kg을 얻었다. 얻어진 당용액의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 환상 4당의 순도는 약 99.5%이었다.
실험 30: 환상 4당의 수용액으로부터의 결정화
실험 29의 방법으로 얻어진 순도 약 98% 이상의 환상 4당 획분을 에바포레이터에서 고형물 농도 약 50%로 농축한 후, 이 농축 당액 약 5kg을 원통상의 플라스틱 용기에 넣고 완만하게 회전시키면서 약 20시간 동안 온도를 65℃로부터 20℃까지 강하시킴으로써 결정석출시킨 결과, 백색의 결정상 분말이 얻어졌다. 그 현미경 사진의 한가지 예를 도 45에 나타낸다. 계속해서, 원심 여과기를 이용해서 분밀(分蜜)하여 결정상물을 습중량으로서 1,360g을 회수하였다. 다시 60℃에서 3시간 건조하여 환상 4당 결정상 분말을 1,170g 얻었다. 얻어진 결정 분말의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 환상 4당의 순도는 99.9% 이상으로서 극히 고순도이었다.
이 환상 4당의 결정상 분말을 분말 Ⅹ선 회절법에 의해 해석한 결과, 도 46에 나온 바와 같이, 주된 회절각(2θ)으로서 10.1°, 15.2°, 20.3° 및 25.5°를 특징으로 하는 회절 스펙트럼이 얻어졌다. 또한, 이 결정상 분말의 수분을 카알 피셔법으로 측정한 결과, 수분은 13.0%이었는데, 이로부터 환상 4당 1 분자당 5 내지 6 분자의 물을 함유하는 결정인 것이 판명되었다.
더욱이 이 환상 4당의 결정 분말을 열중량 측정한 결과, 도 47에 나온 열중량 곡선이 얻어지고, 그 중량변화와 온도와의 관계로부터 온도 150℃까지의 상승에서 4 내지 5 분자의 물에 상당하는 중량감소가 나타나고, 계속해서 온도 250℃ 부근에서 1 분자의 물에 상당하는 중량감소가 나타나며, 더욱이 온도 280℃ 부근에서부터 환상 4당 자체의 열분해로 생각되는 중량감소가 관찰되었다. 이들 사실로부터 본 발명의 환상 4당의 5 내지 6 함수결정은 상압에서 온도를 150℃까지 상승시킴으로써 결정 분자당 4 내지 5 분자의 물이 이탈해서 1 분자의 물을 함유하는 결정으로 되고, 더욱이 온도 250℃까지 1 분자의 물이 결정으로부터 이탈해서 무수결정으로 되는 것이 판명되었다.
실험 31: 환상 4당의 1 함수결정으로의 변환
실험 30의 방법으로 얻게 되는 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말을 유리 용기에 넣고, 미리 온도 140℃로 보온한 오일 배스(oil bath) 중에서 이 유리 용기를 30분간 유지하였다. 얻어진 환상 4당 분말을 분말 Ⅹ선 회절법으로 해석한 결과, 열처리 전의 5 내지 6 함수결정의 분말 Ⅹ선 회절과는 전혀 달리, 도 48에 나온 바와 같이, 주된 회절각(2θ)로서 8.3°, 16.6°, 17.0° 및 18.2°를 특징으로 하는 회절 스펙트럼이 얻어졌다. 또한, 이 결정상 분말의 수분을 카알 피셔법으로 측정한 결과, 수분이 약 2.7%이었는데, 이로부터 환상 4당 1 분자당 1 분자의 물을 함유하는 것이 판명되었다. 더욱이 이 결정분말을 열중량 측정한 결과, 도 49도에 나온 열중량 곡선이 얻어지고, 그 중량변화와 온도와의 관계로부터 온도 270℃ 부근에서 1분자의 물에 상당하는 중량감소가 나타나고, 더욱이 온도 290℃ 부근에서부터 환상 4당 자체의 열분해로 생각되는 중량감소가 관찰되었다. 이들 결과로부터 본 발명의 환상 4당 결정상물은 1 함수 결정인 것이 밝혀졌다.
실험 32: 무수결정으로의 변환
실험 30의 방법으로 얻게 되는 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말을 온도 40℃ 내지 120℃에서 각각 16시간 진공건조하였다. 얻어진 환상 4당 분말의 수분을 카알 피셔법으로 측정한 결과, 진공건조 온도 40℃의 경우는 수분이 약 4.2%이며, 진공건조 온도 120℃의 경우는 수분이 약 0.2%이어서 실질적으로 무수(無水)인 것이 판명되었다. 이들 진공건조한 환상 4당 분말을 분말 Ⅹ선 회절법으로 해석한 결과, 진공건조 전의 5 내지 6 함수결정의 분말 Ⅹ선 회절 및 1 함수결정의 것과는 전혀 다르고, 도 50 (진공건조 온도 40℃), 도 51 (진공건조 온도 120℃)에 나온 바와 같이 주된 회절각(2θ)으로서 10.8°, 14.7°, 15.0°, 15.7° 및 21.5°를 특징으로 하는 회절 스펙트럼이 얻어졌다. 이들 두가지 회절 스펙트럼 사이에서의 피이크 강도의 강약은 나타나기는 하지만, 기본적으로 피이크의 회절각도는 동일하여 결정학적으로 동일 무수결정이라고 추측되었다. 또한, 회절 스펙트럼의 베이스라인은 산 모양의 패턴을 나타내고, 진공건조 전의 환상 4당의 5 내지 6 함수결정의 것 및 1 함수결정의 것과 비교하여 결정화도가 저하해 있어 비결정 상태 [아모르포스(amorphous)]의 환상 4당이 존재하고 있는 것이 밝혀졌다. 여기에 근거하여 진공건조 40℃의 경우의 수분을 약 4.2% 함유하는 환상 4당 분말은 그 수분을 함유하는 환상 4당 아모르포스와 환상 4당 무수결정이 혼재하는 분말이라고 추측되었다. 이상으로부터 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말을 진공건조함으로써 5 내지 6 함수결정은 물분자를 잃어버리고 비결정 상태의 아모르포스와 무수결정으로 변환하는 것이 판명되었다. 그리고 수분 0.2%의 무수 환상 4당 분말에 대해서 실험 31과 마찬가지로 열중량 분석한 결과, 도 52에 나온 바와 같이 온도 270℃ 부근에서부터 환상 4당의 열분해로 생각되는 중량감소만이 관찰되었다.
실험 33: 환상 4당의 물에 대한 포화농도
온도 10 내지 90℃에서의 물에 대한 환상 4당의 포화농도를 조사하기 위해서, 밀봉 마개를 가진 유리제 용기에 물 10ml을 넣고, 거기에 실험 30의 방법으로 얻게 되는 환상 4당의 5 내지 6 함수결정을 각 온도에서 완전히 용해하는 양 이상의 양을 가한 후, 유리 용기를 밀봉하고 포화에 달할 때까지 온도 10 내지 90℃에서 보온하면서 2일 동안 교반하였다. 각각의 온도의 환상 4당 포화용액을 정밀여과해서 용해하지 않은 환상 4당을 제거한 후, 그 여액의 수분을 건조 감량법으로 조사하여 각 온도에서의 포화농도를 구하였다. 결과를 표 34에 나타낸다.
표 34
온도(℃) 포화농도(%)
10 30.3
30 34.2
50 42.6
70 53.0
90 70.5
실험 34: 열안정성
실험 30의 방법으로 얻게 되는 환상 4당의 5 내지 6 함수결정을 물에 용해하여 농도 10w/v％의 환상 4당 수용액을 조제하고, 이 용액 8ml을 유리제 시험관에 넣고 밀봉한 후, 120℃에서 30 내지 90분간 가열하였다. 방냉후, 이들 용액의 착색도의 측정과, HPLC법에 의한 순도측정을 하였다. 착색도는 480nm에 있어서의 1cm 셀에서의 흡광도에 의해 평가하였다. 그 결과는 표 35에 나타낸다.
표 35
가열시간(분) 착색도(A480nm) 순도(%)
0 0.00 100
30 0.00 100
60 0.00 100
90 0.00 100
표 35의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당 수용액은 120℃의 고온가열이라도 착색은 없고, 당조성의 순도의 저하도 없으므로 환상 4당은 열에 대하여 안정한 당질인 것이 판명되었다.
실험 35: pH 안정성
실험 30의 방법으로 얻게 되는 환상 4당의 5 내지 6 함수결정을 각종의 완충액(20mM)에 용해하여, 환상 4당을 농도 4w/v%, pH를 2 내지 10으로 조정한 환상 4당 용액을 조제하였다. 각각의 용액 8ml을 유리제 시험관에 채취하고 밀봉한 후 100℃에서 24시간 가열한 다음 방냉후, 이들 용액의 착색도의 측정과, HPLC법에 의한 순도측정을 하였다. 착색도는 480nm에 있어서의 1cm 셀에서의 흡광도에 의해 평가하였다. 결과는 표 36에 나타낸다.
표 36
pH(완충액의 종류) 착색도(A480nm) 순도(%)
2.0 (아세트산) 0.00 93
3.0 (아세트산) 0.00 100
4.0 (아세트산) 0.00 100
5.0 (아세트산) 0.00 100
6.0 (Tris-염산) 0.00 100
7.0 (Tris-염산) 0.00 100
8.0 (Tris-염산) 0.00 100
9.0 (암모늄) 0.00 100
10.0 (암모늄) 0.00 100
표 36의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당 수용액은 100℃의 고온에서 24시간 가열하더라도 pH 2 내지 10의 넓은 범위에서 착색은 없고, pH 2에서 당조성의 순도는 약간 저하하지만, pH 3 내지 10의 범위에서는 전혀 당조성의 순도는 저하하지 않고, 환상 4당은 넓은 pH 범위, 환언하면, pH 3 내지 5의 산성쪽, pH 6 내지 8의 중성쪽, pH 9 내지 10의 알칼리쪽에서 펄펄 끓여도 극히 안정한 당질인 것이 밝혀졌다.
실험 36: 아미노 카르보닐 반응
실험 30의 방법으로 얻게 되는 환상 4당의 5 내지 6 함수결정을 물에 용해하고, 더욱이 여기에 시판 시약특급의 글리신과 인산 완충액을 가하고 50mM 인산 완충액으로 pH 7.0으로 조정한 1w/v％ 글리신을 함유하는 10w/v％ 환상 4당 용액을조제하였다. 이 용액 4ml을 유리제 시험관에 넣고 밀봉한 후, 100℃에서 30 내지 90분간 가열하였다. 실내에서 방냉후 이들의 착색도를 측정하여 아미노 카르보닐 반응성을 조사하였다. 착색도는 480nm에 있어서의 1cm 셀에서의 흡광도에 의해 평가하였다. 결과를 표 37에 나타낸다.
표 37
가열시간(분) 착색도(A480nm)
0 0.00
30 0.00
60 0.00
90 0.00
표 37의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당은 글리신 공존하에서 가열하여도 착색은 없고, 글리신과의 갈변을 일으키지 않는, 바꾸어 말하면, 아미노 카르보닐 반응(메일라아드 반응이라고도 함)을 일으키기 어려운 안정한 당질인 것이 밝혀졌다.
실험 37: 아미노 카르보닐 반응
실험 30의 방법으로 얻게 되는 환상 4당의 5 내지 6 함수결정과 시판 폴리 펩톤(일본국의 日本製藥제)을 탈이온수에 용해하여 5w/v％ 폴리펩톤을 함유하는 10w/v％ 환상 4당 용액을 조제하였다. 이 용액 4ml을 유리제 시험관에 넣고 밀봉한 후, 120℃에서 30 내지 90분간 가열하였다. 실내에서 방냉후, 이들의 착색도를 측정하여 아미노 카르보닐 반응성을 조사하였다. 동시에, 폴리 펩톤만을 함유하는 용액을 블랭크(blank)로 하여 마찬가지로 가열하였다. 착색도는 480nm에 있어서의 1cm 셀에서의 흡광도로부터 블랭크의 흡광도를 뺀 값에 근거해서 평가하였다. 그결과를 표 38에 나타낸다.
표 38
가열시간(분) 착색도(A480nm)
0 0.00
30 0.00
60 0.00
90 0.00
표 38의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당은 폴리펩톤 공존하에서 가열하여도 폴리펩톤과의 갈변을 일으키지 않는, 환언하면, 아미노 카르보닐 반응을 일으키기 어려운 안정한 당질인 것이 밝혀졌다.
실험 38: 포접(inclusion) 작용
실험 30의 방법으로 얻게 되는 환상 4당의 5 내지 6 함수결정을 탈이온수에 용해하여 20% 수용액을 조제하였다. 이 수용액 100g당, 메탄올 2g, 에탄올 3g, 아세트산 4.6g을 가하여 포접을 하였다. 그 후, 각각을 여과하고, 여액을 동결건조하여 미포접물을 제거하였다. 대조로서, 포접능을 가진 것으로 알려져 있는 분기 시클로덱스트린(상품명 『ISOELITE P』, 일본국의 Maruha 주식회사 판매)을 사용하여 마찬가지로 하였다.
동결건조 분말중의 포접물의 량을 측정하기 위해서, 각각의 동결건조 분말 1g을 5ml의 물에 용해하고, 거기에 5ml의 디에틸 에테르를 가하여 추출하고, 다시, 추출을 반복한 후 디에틸 에테르 중의 추출물을 가스 크로마토그래피법으로 정량하였다. 결과를 표 39에 나타낸다.
표 39
포접물 포접량(mg/g-동결건조 분말)
환상 4당 ISOELITE P(대조)
메탄올 6.71 2.92
에탄올 17.26 8.92
아세트산 67.74 30.57
표 39의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당은 포접능을 가지고 있고, 그 포접능은 분기 사이클로덱스트린에 비하여 중량당 약 2배나 높은 것이 판명되었다.
실험 39: 감미도
실험 30의 방법으로 얻게 되는 환상 4당의 5 내지 6 함수결정을 탈이온수에 용해하여 고형물 농도 10 내지 30%의 수용액으로 하고, 이들 수용액을 감미도 시험용액으로 하였다. 한편, 수크로오스(시판 그래뉼러당) 6% 수용액을 기준으로 하여 8명의 패널러에 의해 관능시험을 하였다. 그 결과, 환상 4당의 감미도는 수크로오스의 약 27%이었다.
실험 40: 소화성 시험
실험 30의 방법으로 얻게 되는 환상 4당의 5 내지 6 함수결정을 사용하고,『일본 영양식량학회지』, 제43권, 제23 내지 29 페이지 (1990년)에 기재된 岡田 등의 방법에 준하여 시험관내에서의 타액 아밀라아제, 합성 위액(胃液), 췌액(膵液) 아밀라아제, 소장(小腸) 점막 효소에 의한 환상 4당의 소화성을 조사하였다. 대조로서, 난(難)소화성 당질로서 알려져 있는 말티톨을 사용하였다. 결과를 표 40에 나타낸다.
표 40
소화효소 소화효소에 의한 분해율(%)
환상 4당 말티톨(대조)
타액 아밀라아제 0.0 0.0
합성 위액 0.0 0.0
췌액 아밀라아제 0.0 0.0
소장 점막 효소 0.74 4.0
표 40의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당은 타액 아밀라아제, 합성 위액, 췌액 아밀라아제에 의해 전혀 소화되지 않고 소장 점막 효소에 의해 약간 소화되었지만, 그 정도는 0.74%로서 낮은 값이며, 대조의 난소화성 당질 말티톨의 값과 비교하면 1/5 이하이어서 환상 4당이 극히 소화되기 어려운 당질인 것이 판명되었다.
실험 41: 발효성 시험
실험 30의 방법으로 얻게 되는 환상 4당의 5 내지 6 함수결정을 사용하고, 문헌 [『Journal of Nutritional Science and Vitaminology』, 제37권, 제529 내지 544 페이지 (1991년)]에 기재된 Oku 등의 방법에 준하여 래트 맹장 내용물에 의한 환상 4당의 발효성을 조사하였다. 맹장 내용물은 위스타계 수컷 래트를 에테르 마취하에서 도살하여 혐기적으로 채취하고, 4배량의 0.1M 탄산수소 나트륨 수용액에 현탁한 것을 사용하였다. 환상 4당은 맹장 내용물 중량당 약 7%를 첨가하고, 첨가 직후 및 12시간 후에 잔존하는 환상 4당의 량을 가스 크로마토그래피법으로 정량하였다. 그 결과, 첨가 직후의 환상 4당의 농도는 맹장 내용물 ｇ당 68.0mｇ, 12시간후의 환상 4당의 농도는 맹장 내용물 ｇ당 63.0mg로서 93%가 발효되지 않고 잔존하고 있는 것이 판명되어 환상 4당은 극히 발효되기 어려운 당질인 것이 판명되었다.
실험 42: 자화성(資化性) 시험
실험 30의 방법으로 얻게 되는 환상 4당의 5 내지 6 함수결정을 사용하고, 문헌 ["A Color Atlas of Anaerobic Bacteria", edited by Tomotari MITSUOKA, published by Kabushiki Kaisha Sobunsha, Tokyo, Japan (1984)]에 기재된 방법에 준하여 각종 장내 세균의 자화성을 조사하였다. 즉, 미리 배양해 둔 신선한 균을, 환상 4당을 0.5% 첨가한 PYF 배지 5ml에 약 107CFU 접종하고, 혐기 조건하에서 37℃에서 4일 동안 배양하였다. 대조로서, 자화되기 쉬운 당질인 글루코오스를 사용하여 하였다. 자화성의 판정은, 배양후의 배양액의 pH가 6.0 이상인 경우 자화되지 않음(-)으로 하고, 6.0 미만의 경우 자화됨(+)으로 하였다. 더욱이 배양액 중에 잔존하는 당질을 안트론법으로 측정하여 당질의 감소량을 조사하여 자화성의 판정을 확인하였다. 결과를 표 41에 나타낸다.
표 41
장내 세균주 자화성
환상 4당 글루코오스(대조)
Bacteroides vulgatusJCM5826 － ＋
Bifidobacterium adolescentisJCM1275 － ＋
Clostridium perfringensJCM3816 － ＋
Escherichia coli IFO 3301 － ＋
Eubacterium aerofaciensATCC25986 － ＋
Lactobacillus acidophilusJCM1132 － ＋
표 41의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당은 시험한 장내 세균주의 어느것에 의해서도 자화되지 않고, 대조의 글루코오스는 어느것에 의해서도 자화되는 것이 확인되었다. 따라서 환상 4당이 장내세균에 의해 극히 자화되기 어려운 당질인 것이 판명되었다.
실험 43: 급성독성 시험
마우스를 사용하여 실험 30의 방법으로 얻게 되는 환상 4당의 5 내지 6 함수결정을 경구투여 해서 급성독성 시험을 하였다. 그 결과, 환상 4당은 저독성의 물질이고, 투여가능한 최대 투여량에 있어서도 사망예는 나타나지 않았다. 따라서, 정확한 값이라고는 할 수 없지만, 그 LD50값은 50g/kg 마우스 체중 이상이었다.
이상의 실험 40 내지 43의 결과로부터 환상 4당은 경구섭취하여도 소화, 흡수되기 어렵고, 무칼로리 내지 저칼로리의 가식(可食)소재로서 다이어트 감미료, 고감미도 감미료의 부형제, 다이어트 음식물의 증점제, 증량제, 부형제, 더욱이 식물섬유, 지방대체 식품재료 등으로서의 이용을 기대할 수 있다.
이하, 본 발명의 환상 4당, 그것을 함유하는 당질의 제조방법을 실시예 A에서, 그리고 환상 4당, 그것을 함유하는 당질을 함유시킨 조성물을 실시예 B에서 설명한다.
실시예 A-1
바실루스 글로비스포루스 C9 (FERM BP-7143)을 실험 3의 방법에 준하여 퍼멘터에서 48시간 배양하였다. 배양후, SF막을 사용하여 제균여과하여 약 18L의 배양여액을 회수하고, 더욱이 그 여액을 UF막 농축하여 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 8.8 단위/ml과 α-이소말토실 전이효소를 26.7 단위/ml를 함유하는 농축 효소액 약 1L을 회수하였다.
감자 전분유(澱粉乳)를 농도 약 2% 전분유로 하고, 여기에 최종농도 1mM이 되도록 염화 칼슘을 첨가하여 pH 6.0으로 조정하고 95℃에서 약 20분간 가열해서 호화(糊化)를 한 다음에 약 35℃에서 냉각하고, 여기에 상기 방법으로 조제한 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 함유하는 농축 효소액을 전분 고형물 1 그램당 0.25ml의 비율이 되도록 가하고, pH 6.0, 온도 35℃에서 48시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃로 가열하여 10분간 유지한 후 냉각하고, 여과해서 얻게 되는 여액을 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱이 농축하여 분무건조함으로써 환상 4당 함유 분말을 원료 전분 고형물당 수율 약 90%로 얻었다.
이 제품은 고형물당, 글루코오스 0.7%, 이소말토오스 1.4%, 말토오스 11.1%, 환상 4당 62.1%, 및 그 밖의 당질을 24.7% 함유하고 있고, 온화한 감미, 적당한 정도의 점도, 보습성, 포접성을 가지므로, 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수(離水) 방지제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제, 분말화 기재(基材) 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-2
감자전분을 농도 약 6% 전분유로 하고, 여기에 농도 0.1%이 되도록 탄산 칼슘을 첨가하여 pH 6.0으로 조정하고, 여기에 α-아밀라아제(상품명 『TERMAMYL 60L』, Novo사제)를 전분 고형물 그램당 0.2%이 되도록 가하고, 95℃에서 10분간 반응시킨 다음에 120℃에서 20분간 오토클레이브 처리하고, 다시 약 35℃로 급냉해서 DE 약 4의 액화 용액을 얻고, 여기에 실시예 A-1의 방법으로 조제한 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 함유하는 농축액을 전분 고형물 1 그램당 0.25ml의 비율이 되도록 가하고, pH 6.0, 온도 35℃에서 48시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃로 가열하여 10분간 유지한 후 냉각하고 여과해서 얻게 되는 여액을, 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염하여 정제하고, 더욱 농축해서 농도 60%의 환상 4당 함유 시럽을 원료 전분 고형물당 수율 약 90%로 얻었다.
이 제품은 고형물당 글루코오스 0.9%, 이소말토오스 1.5%, 말토오스 11.3%, 환상 4당 60.1%, 및 그 밖의 당질을 26.2% 함유하고 있고, 온화한 감미, 적당한 점도, 보습성, 포접성을 가지므로 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수(離水) 방지제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-3
바실루스 글로비스포로스 C11(FERM BP-7144)를 실험 6의 방법에 준하여 퍼멘터에서 48시간 배양하였다. 배양후, SF막을 사용하여 제균여과 하여 약 18L의 배양여액을 회수하고, 더욱이 그 여액을 UF막 농축하여 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 9.0 단위/ml과 α-이소말토실 전이효소를 30.2 단위/ml를 함유하는 농축 효소액 약 1L을 회수하였다. 타피오카 전분을 농도 약 25% 전분유로 하고,여기에 α-아밀라아제(상품명 『NEO-SPITASE』, 일본국의 Nagase 생화학공업 주식회사제)를 전분 고형물 그램당 0.2% 가하고, 85 내지 90℃에서 약 20분간 반응시킨 다음에 120℃에서 20분간 오토클레이브 처리하고, 다시 약 35℃로 급냉해서 DE 약 4의 액화 용액을 얻어, 여기에 상기의 방법으로 조제한 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 함유하는 농축 효소액을 전분 고형물 1 그램당 0.25ml의 비율이 되도록 가하고, 더욱이 시클로말토덱스트린 글루카노트란스페라제(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소 제조)를 전분 고형물 1 그램당 10 단위가 되도록 가하여 pH 6.0, 온도 35℃에서 48시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃에서 30분간 유지한 후, pH 5.0, 온도 50℃로 조정한 다음에 α-글루코시다아제(상품명 『트란스글루코시다아제 L AMANO』, 일본국의 Amano제약 주식회사제)를 고형물 1 그램당 300 단위 가하고 24시간 반응시키고, 더욱이 글루코아밀라아제제(劑)(상품명 『GLUCOZYME』, 일본국의 Nagase생화학공업 주식회사제)를 고형물 1 그램당 30 단위 가하여 17시간 반응시키고, 그 반응액을 95℃로 가열하여 30분간 유지한 후 냉각하고 여과해서 얻게 되는 여액을, 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염하여 정제하고, 더욱 농축해서 농도 60%의 환상 4당 함유 시럽을 원료 전분 고형물당 수율 약 90%로 얻었다.
이 시럽은 고형물당 글루코오스 38.4%, 환상 4당 58.1%, 그 밖의 당질을 3.5% 함유하고 있고 온화한 감미, 적당한 점도, 보습성, 포접성을 가지므로, 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수있다.
실시예 A-4
옥수수 전분을 농도 약 20%의 전분유로 하고, 여기에 탄산 칼슘 0.1% 가하여 pH 6.5로 조정하고, α-아밀라아제(상품명 『TERMAMYL 60L』, 덴마크국의 Novo사제)를 전분 그램당 0.3% 가하고, 95℃에서 15분간 반응시킨 다음에 120℃에서 20분간 오토클레이브 처리하고, 다시 약 35℃로 급냉하여 DE 약 4의 액화용액을 얻어 여기에 실시예 A-3의 방법으로 얻은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 함유하는 농축 효소액을 전분 고형물 1 그램당 0.25ml의 비율이 되도록 가하고, 더욱이 시클로말토덱스트린 글루카노트란스페라제(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소 제조)를 전분 고형물 1 그램당 10 단위가 되도록 가하여 pH 6.0, 온도 35℃에서 48시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃에서 30분간 유지한 후, pH 5.0, 온도 50℃로 조정한 다음, α-글루코시다아제제(劑)(상품명 『트란스글루코시다아제 L AMAN0』, 일본국의 天野제약 주식회사 제조)를 고형물 1 그램당 300 단위 가하여 24시간 반응시키고, 다시 글루코아밀라아제제(劑)(상품명 『GLUCOZYME』, 일본국의 Nagase 생화학 공업 주식회사제)를 고형물 1 그램당 30 단위 가하여 17시간 반응시키고, 그 반응액을 95℃로 가열해 30분간 유지한 후, 냉각하고 여과해서 얻게 되는 여액을, 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 0H형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축하여 농도 60%의 환상 4당 함유 시럽을 원료 전분 고형물당 수율 약 90%로 얻었다.
이 시럽은 고형물당 글루코오스 34.2%, 환상 4당 62.7%, 그 밖의 당질을3.1% 함유하고 있고 온화한 감미, 적당한 점도, 보습성, 포접성을 가지므로, 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-5
실시예 A-3의 방법으로 얻어진 환상 4당 함유 시럽을, 강산성 양이온 교환 수지(상품명 『AMBERLITE CR-1310 (Na형)』, 일본국의 Organo 주식회사제)를 사용한 칼럼 분획을 하였다. 수지를 안지름 5.4cm의 재키트 부착 스테인레스제 칼럼 4개에 충전하여 직렬로 연결시켜 수지층 전장(全長) 20m로 하였다. 칼럼내 온도 60℃로 유지하면서 당액을 수지에 대하여 5v/v％ 가하고, 여기에 60℃의 온수를 SV 0.13으로 흘려서 분획하고, 용출액의 당조성을 HPLC법으로 모니터링하여 환상 4당 고함유 획분을 채취하고, 정제함으로써 환상 4당 고함유액을 원료 고형물당 수율 약 21%로 얻었다. 이 고함유액은 고형물당 약 98%의 환상 4당을 함유하고 있었다.
이 용액을 농도 약 70%로 농축한 후, 결정 석출기에 넣고, 종정(種晶)으로서 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 약 2%를 가하여 서서히 냉각하여 결정 석출율 약 45%의 매스키트를 얻었다. 이 매스키트를 건조탑위의 노즐로부터 150kg／cm2의 고압으로 분무하였다. 이와 동시에 85℃의 열풍을 건조탑 상부로부터 송풍하고, 저부에 설치된 이송용 금망 컨베이어 위에 결정 분말을 포집하여 컨베이어 아래로부터 45℃의 온풍을 보내면서 이 분말을 건조탑 밖으로 서서히 이동시켜 꺼내었다. 이 결정 분말을 숙성탑에 충전하고, 온풍을 보내면서 10시간 숙성시켜 결정화와 건조를 완료하여 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말을 얻었다.
이 제품은 환원성이 극히 낮고, 아미노 카르보닐 반응을 일으키기 어려우며, 흡습성도 나타내지 않고, 취급이 용이하며, 온화한 저감미, 적당한 점도, 보습성, 포접성, 난소화성을 가지므로, 감미료, 저칼로리 식품소재, 정미 개량제, 풍미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-6
실시예 A-4의 방법으로 얻어진 환상 4당 함유 시럽을 원당액으로 하고, 환상 4당의 함량을 높이기 위해서 실시예 A-5의 방법에 준해서 염형 강산성 양이온 교환 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피를 하고, 환상 4당 고함유 획분을 채취하여 정제함으로써 환상 4당 고함유액을 원료 전분 고형물당 수율 약 60%로 얻었다. 이 고함유액은 고형물당 약 90%의 환상 4당을 함유하고 있었다.
이 용액을 농도 약 85%로 농축해서 결정 석출기에 넣고, 교반하면서 서서히 냉각하여 결정석출을 조장하고, 이것을 플라스틱제 바트(vat)에 꺼내어 실온에서 2일간 방치하여 결정석출, 숙성시켜서 블록을 조제하였다. 이어서 이 블록을 절삭기에서 분쇄해서 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말을 얻었다.
이 제품은 실질적으로 흡습성을 나타내지 않고, 취급이 용이하며, 온화한 저감미, 적당한 점도, 보습성, 포접성, 난소화성을 가지므로, 감미료, 저칼로리 식품소재, 정미 개량제, 풍미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-7
실시예 A-6의 방법으로 얻어진 환상 4당 고함유액을 농축하면서 연속 결정석출시켜 얻게 되는 매스키트를 바스켓형 원심분리기에서 분밀(分蜜)하고, 결정을 소량의 물로 스프레이하여 세정해서 고순도의 환상 4당의 5 내지 6 함수결정을 고형물당 약 55%의 수율로 얻었다.
이 제품은 고형물당 98% 이상의 고순도 환상 4당의 5 내지 6 함수결정이며, 환원성이 극히 낮고, 아미노 카르보닐 반응을 일으키기 어려우며, 흡습성도 나타내지 않고, 취급이 용이하며, 온화한 저감미, 적당한 점도, 보습성, 포접성, 난소화성을 가지므로, 감미료, 저칼로리 식품소재, 정미 개량제, 풍미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물, 더욱이는 공업시약, 화학원료 등으로도 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-8
옥수수 유래 피토글리코겐 5.0w/v％, 효모 추출물 『ASAHIMEAST』 1.0w/v%, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％, 및 물로 된 액체배지를, 용량 30L의 퍼멘터에 약 20L 넣고, 121℃, 20분간 멸균하고 냉각하여 온도 27℃로 한 후, 실험 6의 방법에 준해서 종배양한 바실루스 글로비스포루스 C11 (FERM BP-7144)의 종배양액 1v/v％을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 7.0으로 유지하면서 72시간 통기교반 배양하였다. 그 배양액을 121℃, 20분간 가열 살균한 후 냉각하고 원심분리하여 그 상청을 회수하고, 다시 그 상청을 UF막 여과해서 얻게 되는 여액을, 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제함으로써 환상 4당 함유액을 원료 피토글리코겐 고형물당 수율 약 40%로 얻었다. 이 함유액은 고형물당 약 87%의 환상 4당을 함유하고 있었다.
이 환상 4당 함유액을 농축하면서 연속 결정석출시켜 얻게 되는 매스키트를 바스켓형 원심분리기에서 분밀하고, 결정을 소량의 물을 스프레이하여 세정해서 순도 98% 이상의 고순도 환상 4당의 5 내지 6 함수결정을 원료 피토글리코겐 고형물당 수율 약 25%로 얻었다.
이 제품은 고순도의 환상 4당의 5 내지 6 함수결정이며, 환원성이 극히 낮고, 아미노 카르보닐 반응을 일으키기 어려우며, 흡습성도 나타내지 않고, 취급이 용이하며, 온화한 저감미, 적당한 점도, 보습성, 포접성, 난소화성을 가지므로, 감미료, 저칼로리 식품소재, 정미 개량제, 풍미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물, 더욱이는 공업시약, 화학원료 등으로도 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-9
바실루스 글로비스포루스 N75 (FERM BP-7591)를 실험 10의 방법에 준하여 퍼멘터에서 48시간 배양하였다. 배양후, SF막을 사용하여 제균여과하여 약 18L의 배양여액을 회수하고, 더욱이 그 여액을 UF막 농축하여 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 6.0 단위/ml와 α-이소말토실 전이효소를 20.0 단위/ml를 함유하는 농축 효소액 약 800ml을 회수하였다. 옥수수 전분을 농도 약 30%의 전분유로 하고, 여기에 탄산 칼슘 0.1% 가하여 pH 6.5로 조정하고, α-아밀라아제(상품명 『TERMAMYL 60L』, 덴마크국의 Novo사제)를 전분 그램당 0.3% 가하여 95℃에서 15분간 반응시킨 다음에 120℃에서 20분간 오토클레이브 처리하고, 다시 약 51℃로 급냉해서 DE 약 4의 액화 용액을 얻고, 여기에 상기의 방법으로 조제한 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 함유하는 농축 효소액을 전분 고형물 1 그램당 0.4ml의 비율이 되도록 가하고, 더욱이 시클로말토덱스트린 글루카노트란스페라아제(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소 제조)를 전분 고형물 1 그램당 3 단위가 되도록 가하고 pH 5.5, 온도 51℃에서 48시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃에서 30분간 유지한 후, pH 5.0, 온도 50℃로 조정한 후, α-글루코시다아제제(劑)(상품명 『트란스글루코시다아제 L AMAN0』, 일본국의 天野제약 주식회사 제조)를 고형물 1 그램당 300 단위 가하고 24시간 반응시키고, 다시 글루코아밀라아제제(劑)(상품명 『GLUCOZYME』, 일본국의 Nagase 생화학 공업 주식회사제)를 고형물 1 그램당 20 단위 가하고 17시간 반응시키고, 그 반응액을 95℃로 가열해 30분간 유지한 후 냉각하고, 여과하여 얻게 되는 여과액을, 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온 교환수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축하여 환상 4당을 고형물당 44.0% 함유하는 시럽을 얻었다. 얻어진 환상 4당 함유 시럽을 원당액으로 하고, 환상 4당의 함량을 높이기 위해서 실시예 A-5의 방법에 준해서 염형 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 하여 환상 4당 고함유 획분을 채취하고, 정제하여 농축하고 분무하여 건조함으로써 환상 4당 함유 분말을 원료 전분 고형물당 수율 약 45%로 얻었다.
이 제품은 고형물당 글루코오스 3.7%, 환상 4당 80.5%, 및 그 밖의 당질을 15.8% 함유하고 있고 온화한 감미, 적당한 점도, 보습성, 포접성을 가지므로, 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-10
아르드로박터 글로비포르미스 A19 (FERM BP-7590)를 실험 14의 방법에 준하여 퍼멘터에서 48시간 배양하였다. 배양후, SF막을 사용하여 제균여과하여 약 18L의 배양여액을 회수하고, 더욱이 그 여액을 UF막 농축하여 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 15.2 단위/ml과 α-이소말토실 전이효소를 23.0 단위/ml를 함유하는 농축 효소액 약 1L을 회수하였다.
감자전분을 농도 약 5% 전분유로 하여, 여기에 농도 0.1%이 되도록 탄산 칼슘을 가하여 pH 6.0으로 조정하고, 여기에 α-아밀라아제(상품명 『TERMAMYL 60L』, 덴마크국의 Novo사제)를 전분 고형물 그램당 0.2%이 되도록 가하여 95℃에서 10분간 반응시킨 다음에 120℃에서 20분간 오토클레이브 처리하고, 다시 약 40℃로 급냉해서 DE 약 4의 액화 용액을 얻고, 여기에 상기의 방법으로 조제한 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 함유하는 농축액을 분말 고형물 1 그램당 0.5ml의 비율이 되도록 첨가하고, pH 6.0, 온도 40℃에서 48시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃에서 가열하여 10분간 유지한 후, 냉각하고 여과해서 얻게 되는 여액을, 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축해서 농도 70%의 환상 4당 함유 시럽을 원료 전분 고형물당 수율 약 90%로 얻었다.
이 제품은 고형물당 글루코오스 2.5%, 이소말토오스 6.3%, 환상 4당 30.1% 함유하고 있고, 온화한 감미, 적당한 점도, 보습성, 포접성을 가지므로, 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-1: 감미료
실시예 A-7의 방법으로 얻은 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 0.8 중량부에 트레할로오스 함수결정(일본국의 주식회사 林原상사 판매, 등록상표 『TREHA』) 0.2 중량부, α-글리코실스테비오시드(일본국의 東洋精糖 주식회사 판매, 상품명 『αG SWEET』) 0.01 중량부, 및 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르(상품명 『ASPALTAME』) 0.01 중량부를 균일히 혼합하고, 과립 성형기에서 과립상 감미료를 얻었다. 이 제품은 감미의 질이 좋아 수크로오스의 약 2배의 감미도를 가지고 있다. 이 제품의 칼로리는 환상 4당의 5 내지 6 함수결정이 난(難)소화성, 난(難)발효성이고 실질적으로 무칼로리이므로, 감미도당 수크로오스의 약 10분의 1이다. 더욱이 이 제품은 실온 보존하에서 변질 열화의 우려가 없고, 안정하다. 따라서 이제품은 고품질의 저칼로리, 낮은 충치 유발성 감미료로서 적합하다.
실시예 B-2: 하드 캔디
농도 55% 수크로오스 용액 100 중량부에 실시예 A-2의 방법으로 얻은 환상 4당 함유 시럽 50 중량부를 가열 혼합하고, 이어서 감압하에서 수분 2% 미만이 될 때까지 가열 농축하고, 여기에 시트르산 0.6 중량부 및 적당량의 레몬 향료와 착색료를 혼화하고, 통상의 방법에 따라 형성하여 제품을 얻었다. 이 제품은 식감, 정미(呈味), 풍미도 양호하고, 수크로오스의 결정석출도 일으키지 않으며, 흡습성이 적고, 녹아 끈적거리지 않는 안정한 고품질의 하드 캔디이다.
실시예 B-3: 츄잉 검
츄잉 검 베이스 3 중량부를 연해지는 정도까지 가열 용융하고, 여기에 무수결정 말티톨 2 중량부, 크실리톨 2 중량부, 실시예 A-7의 방법으로 얻은 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 2 중량부, 및 트레할로오스 함수결정 1 중량부를 가하고, 더욱이 적당량의 향료와 착색료를 혼합하여 통상의 방법에 따라 로울러에서 혼련하여, 형성, 포장해서 제품을 얻었다. 이 제품은 텍스쳐, 정미, 풍미가 양호하고, 낮은 충치 유발성 및 저칼로리의 츄잉 검으로서 적합하다.
실시예 B-4: 가당 연유
원유(原乳) 100 중량부에 실시예 A-5의 방법으로 얻은 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말 2 중량부 및 수크로오스 2 중량부를 용해하고, 플레이트 히이터에서 가열 살균하고, 이어서 농도 70%로 농축하여 무균상태로 통조림해서 제품을 얻었다. 이 제품은 온화한 감미이고 풍미도 좋으므로 과실, 커피, 코코아, 홍차 등의조미용으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-5: 락트산균 음료
탈지 분유 175 중량부, 실시예 A-4의 방법으로 얻은 환상 4당 함유 시럽 130 중량부 및 락토수크로오스 고함유 분말(주식회사 林原상사 판매, 등록상표 『NYUKAOLIGO』) 50 중량부를 물 1,150 중량부에 용해하고, 65℃에서 30분간 살균하여 40℃로 냉각후, 여기에 통상의 방법에 따라 락트산균의 스타아터(starter)를 30 중량부 식균(植菌)하고, 37℃에서 8시간 배양해서 락트산균 음료를 얻었다. 이 제품은 풍미양호하고, 올리고당, 환상 4당을 함유하며, 락트산균을 안정하게 유지할 뿐만 아니라 비피이더스균 증식 촉진 작용, 정장작용을 가진 락트산균 음료로서 적합하다.
실시예 B-6: 분말 쥬스
분무건조에 의해 제조한 오렌지 과즙분말 33 중량부에 대하여, 실시예 A-7의 방법으로 얻은 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말 50 중량부, 무수결정 말티톨 10 중량부, 무수 시트르산 0.65 중량부, 사과산 0.1 중량부, 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산 0.2 중량부, 시트르산 소오다 0.1 중량부, 풀룰란 0.5 중량부 및 분말향료 적당량을 잘 혼합교반하고, 분쇄하여 미분말로 해서, 이것을 유동층 조립기(granulator)에 넣고 배풍(排風)온도 40℃로 하여, 여기에 실시예 A-5의 방법으로 얻은 환상 4당 고함유 농축액을 바인더로 하여 적당량 스프레이하여 30분간 조립(造粒)하고, 계량, 포장해서 제품을 얻었다. 이 제품은 과즙 함유율 약 30%의 분말 쥬스이다. 또한, 이 제품은 불쾌한 맛과 냄새가 없고 고품질이어서 저칼로리의 쥬스로서 상품가치가 높은 것이다.
실시예 B-7: 커스타드 크림
옥수수 전분 100 중량부, 실시예 A-2의 방법으로 얻은 환상 4당 함유 시럽 100 중량부, 트레할로오스 함수결정 60 중량부, 수크로오스 40 중량부, 및 식염 1 중량부를 충분히 혼합하여 계란 280 중량부를 가하고 교반하여, 여기에 끓인 우유 1,000 중량부를 서서히 가하고, 다시 불위에서 교반을 계속하여 옥수수 전분이 완전히 호화(糊化)하여 전체가 반투명이 되었을 때에 가열을 중단하고, 이것을 냉각해서 적당량의 바닐라 향료를 가하여, 계량, 충전, 포장해서 제품을 얻었다. 이 제품은 매끈매끈한 광택을 가지며, 풍미양호하고, 전분의 노화도 억제되어 고품질의 커스타드 크림이다.
실시예 B-8: 초콜릿
카카오 페이스트 40 중량부, 카카오 버타 10 중량부 및 실험 24의 방법에 준해서 얻은 환상 4당의 1 함수결정 50 중량부를 혼합해서 리파이너를 통과시켜 입도를 내린 후, 콘체(conche)에 넣고 50℃에서 2 주야 혼련하였다. 이 동안에 레시틴 0.5 중량부를 첨가해서 충분히 분산시켰다. 이어서 온도 조절기로 31℃로 조절하고, 버터가 굳어지기 직전에 모울드에 부어 넣고, 기포를 제거한후 10℃의 냉각 터널을 통과시켜 고화시켰다. 이것을 모울드로부터 꺼내어 포장하여 제품을 얻었다. 이 제품은 흡습성이 없고, 빛깔, 광택 모두 좋으며, 내부조직도 양호해서 입안에서 매끈매끈하게 녹고, 상품의 감미와 부드러운 풍미를 가진다. 또한 이 제품은 낮은 충치 유발성, 저칼로리의 초콜릿으로서 유용하다.
실시예 B-9: 우이로 노 모토(Uiro-no-moto; 단 맛의 쌀 젤리)
쌀가루 90 중량부에 옥수수 전분 20 중량부, 무수결정 말티톨 70 중량부, 실시예 A-1의 방법으로 얻은 환상 4당 함유 분말 50 중량부, 및 풀룰란 4 중량부를 균일히 혼합해서 우이로 노 모토를 제조하였다. 우이로 노 모토와 적당량의 분말차와 물을 혼련하고, 이것을 용기에 넣고 60분간 증기 찜하여 분말차 우이로 노 모토를 제조하였다. 이 제품은 양호한 광택과 식감도 양호하고 풍미도 좋다. 또한, 전분의 노화도 억제되어 저장기간도 길고, 저칼로리의 우이로 노 모토로서도 적합하다.
실시예 B-10: 팥소
원료 팥 10 중량부에, 통상의 방법에 따라 물을 가하여 펄펄 끓여 떫은 맛과 기포를 제거하고, 또한 수용성 협잡물을 제거하여 팥소 원료 약 21 중량부를 얻었다. 이 생 팥소에 수크로오스 14 중량부, 실시예 A-3의 방법으로 얻은 환상 4당 함유 시럽 5 중량부 및 물 4 중량부를 가하여 펄펄 끓이고, 여기에 소량의 샐러드 오일을 첨가하고, 생 팥소가 깨어지지 않도록 잘 혼합하여 제품인 팥소를 약 35 중량부 얻었다. 이 제품은 구울때의 색깔이 좋고 이수현상도 없이 안정하며, 맛, 풍미가 양호하므로 팥소 빵, 만두, 경단, 빙과 등의 제과재료로서 적합하다.
실시예 B-11: 빵
밀가루 100 중량부, 이스트 2 중량부, 수크로오스 5 중량부, 실시예 A-1의 방법으로 얻은 환상 4당 함유 분말 1 중량부 및 이스트 푸우드 0.1 중량부를 통상의 방법에 따라 물로 반죽한 후에 26℃에서 2시간 발효시킨 다음, 30분간 숙성하고구웠다. 이 제품은 색상, 텍스쳐도 양호하고 적당한 탄력, 온화한 감미를 가진 고품질의 빵이다.
실시예 B-12: 햄
돼지고기 썰은 것 1,000 중량부에 식염 15 중량부 및 질산 칼륨 3 중량부를 균일히 혼합하여 냉실에 1 주야 퇴적한다. 이것을 물 500 중량부, 식염 100 중량부, 질산 칼륨 3 중량부, 실시예 A-5의 방법으로 얻은 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말 40 중량부 및 향신료로 된 염지액(鹽漬液) 중에서 냉실에서 7일 동안 담그고, 이어서 통상의 방법에 따라 냉수로 세정하여 끈으로 감아 조르고, 훈연하여 쿠킹하고, 냉각, 포장해서 제품을 얻었다. 이 제품은 색조도 좋으며, 풍미 양호한 고품질의 햄이다.
실시예 B-13: 분말 펩티드
40% 식품용 대두 펩티드 용액(일본국의 不二製油주식회사 판매, 상품명 『HINUTE S』) 1 중량부에 실시예 A-6의 방법으로 얻은 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말 2 중량부를 혼합하고, 플라스틱제 바트(vat)에 넣어 50℃에서 감압건조하고 분쇄해서 분말 펩티드를 얻었다. 이 제품은 풍미가 양호하고, 프리믹스, 빙과 등의 저칼로리 제과재료로서 유용할 뿐만 아니라, 경구 유동식, 경관(經管) 유동식을 위한 난소화성의 식물섬유, 정장재료로서도 유용하다.
실시예 B-14: 분말난황
생달걀로부터 조제한 난황을 플레이트식 가열 살균기에서 60 내지 64℃로 살균하여 얻게 되는 액상 난황 1 중량부에 대하여 실험 25의 방법에 준해서 얻은 환상 4당 무수결정 함유 분말 4 중량부의 비율로 혼합한 후, 바트에 옮기고, 하루밤 방치하여 환상 4당의 5 내지 6 함수결정으로 변환시켜서 블록을 조제하였다. 이 블록을 절삭기에서 분말화하여 분말난황을 얻었다.
이 제품은 프리믹스, 빙과, 구운과자, 유화제 등의 저칼로리 제과재료로서 유용할 뿐만 아니라 경구 유동식, 경관 유동식을 위한 난소화성 식물섬유, 정장재료로서도 유용하다. 또한, 피부 미용제, 육모제(育毛劑) 등으로서도 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-15: 목욕용제
유자(중국 레몬)의 껍질 쥬스 1 중량부에 대하여 실험 25의 방법에 준해서 얻은 환상 4당 무수결정 함유 분말 10 중량부의 비율로 혼합하고, 환상 4당의 5 내지 6 함수결정을 석출, 숙성시킨 후, 분말화하여 유자의 껍질 엑기스 함유 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말을 얻었다.
이 분말 5 중량부에 소염(燒鹽: grilled salt) 90 중량부, 트레할로오스 함수결정 2 중량부, 무수 규산 1중량부 및 α-글루코실 헤스페리딘(주식회사 林原상사 판매, 상품명 αG hesperidin) 0.5 중량부를 혼합해서 목욕용제를 제조하였다.
이 제품은 유자 향기도 풍부하고, 입욕용의 탕에 100 내지 10,000배로 희석해서 사용하면 좋고, 입욕후는, 피부를 습윤하거나 매끄럽게 해서, 목욕후에 한기를 느끼지 않는 고품질의 목욕용제다.
실시예 B-16: 화장용 크림
모노스테아르산 폴리옥시에틸렌 글리콜 2 중량부, 자기유화형 모노스테아르산 글리세린 5 중량부, 실시예 A-8의 방법으로 얻은 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말 2 중량부, α-글루코실 루틴(일본국의 주식회사 林原상사 판매, 상품명 αG RUTIN) 1 중량부, 유동 파라핀 1 중량부, 글리세릴 트리-2-에틸헥사노에이트 10 중량부 및 방부제 적당량을 통상의 방법에 따라 가열, 용해하고, 여기에 L-락트산 2 중량부, 1,3-부틸렌 글리콜 5 중량부 및 정제수 66 중량부를 가하여 호모게나이저에서 유화하고, 더욱이 향료 적당량을 가하여 교반혼합하여 화장용 크림을 제조하였다. 이 제품은 항산화성을 가지고, 안정성이 높으므로 고품질의 햇볕에 탐 방지, 피부 미용제, 색백제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-17: 치약
제2인산 칼슘 45 중량부, 라우릴 황산 나트륨 1.5 중량부, 글리세린 25 중량부, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 라우레이트 0.5 중량부, 실시예 A-2의 방법으로 얻은 환상 4당 함유 시럽 15 중량부, 사카린 0.02 중량부 및 방부제 0.05 중량부를 물 13 중량부와 혼합해서 치약을 얻었다. 이 제품은 계면활성제의 세정력을 저하함이 없이 싫은 맛을 개량하고, 사용후의 촉감도 양호하다.
실시예 B-18: 유동식용 고체제제
실시예 A-6의 방법으로 얻은 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말 100 중량부, 트레할로오스 함수결정 200 중량부, 말토테트라오스 고함유 분말 200 중량부, 분말난황 270 중량부, 탈지 분유 209 중량부, 염화 나트륨 4.4 중량부, 염화 칼륨 1.8 중량부, 황산 마그네슘 4 중량부, 티아민 0.01 중량부, L-아스코르브산 나트륨 0.1 중량부, 비타민 E 아세테이트 0.6 중량부 및 니코틴산 아미드 0.04 중량부로된 배합물을 조제하고, 이 배합물 25 그램씩 방습성 라미네이트 작은 포대에 충전하고 히이트 시일하여 제품을 얻었다.
이 제품은 환상 4당에 의해 난소화성의 식물섬유를 강화하고, 정장작용이 우수한 유동식이다. 1 포대분을 약 150 내지 300ml의 물에 용해해서 유동식으로 하여 경구적 또는 코속, 위, 장 등에 경관적 사용방법에 의해 이용되어 생체에의 에너지 보급용으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-19: 정제
아스피린 50 중량부에 실시예 A-7의 방법으로 얻은 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말 14 중량부, 옥수수 전분 4 중량부를 충분히 혼합한 후 통상의 방법에 따라 타정기(打錠機)에 의해 타정하여 두께 5.25mm, 1정 680mg의 정제를 제조하였다.
이 제품은 환상 4당의 부형성을 이용한 것으로서 흡습성이 없고 물리적 강도도 충분하며, 더욱이 수중에서의 붕괴는 극히 양호하다.
실시예 B-20: 당의정
중량 150mg의 소정(素錠: crude tablet)을 심제(芯劑)로 하고, 여기에 실시예 A-7의 방법으로 얻은 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말 40 중량부, 풀룰란(평균 분자량 20만) 2 중량부, 물 30 중량부, 탈크(talc) 25 중량부 및 산화 티탄 3 중량부로 된 초벌액(first solution)을 사용하여 정제중량이 약 230mg이 될 때까지 당의(糖衣)하고, 그 다음에, 동일한 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말 65 중량부, 풀룰란 1 중량부 및 물 34 중량부로 된 마무리액을 사용하여 당의하고, 더욱이왁스액으로 광택을 내어 광택이 있는 외관이 우수한 당의정을 얻었다. 이 제품은 내충격성이 우수하고 고품질을 장기간 유지한다.
실시예 B-21: 외상치료용 고약
실시예 A-7의 방법으로 얻은 환상 4당의 5 내지 6 함수결정 분말 100 중량부 및 말토오스 300 중량부에, 요오드 3 중량부를 용해한 메탄올 50 중량부를 가하여 혼합하고, 더욱이 10w/v％ 풀룰란 수용액 200 중량부를 가하여 혼합하여 적당한 확전성과 부착성을 나타내는 외상치료용 고약을 얻었다. 이 제품은 환상 4당에 의해 요오드와 메탄올의 휘산을 방지하고, 경시 변화가 적은, 상품가치가 높은 고약이다.
또한, 이 제품은 요오드에 의한 살균 작용뿐만 아니라, 말토오스에 의한 세포에의 에너지 보급제로서도 작용하므로 치유 기간이 단축되고, 상처면도 깨끗하게 낫는다.
본원발명은, α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 그 제조방법, 이 효소를 사용하여 얻을 수 있는 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질, 및 이들의 용도를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기과제를 해결하기 위해서, 전분을 원료로 하여 전분으로부터 환상 4당을 고수율로 얻기 위해서 사용할 수 있는 신규의 효소에 기대를 하여, 이러한 효소 산생능(産生能)을 가진 미생물을 널리 검색해 왔다. 그 결과, 의외로, 이미 일본국 특허출원 2000-149484호 및 특허출원 2000-229557호 명세서에 개시한, 토양으로부터 분리한 바실루스(Bacillus)속(屬) 또는 아르드로박터(Arthrobacter)속(屬)에 속하는 미생물로서, α-이소말토실 전이효소 산생능을 가진 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C9주(株), 바실루스 글로비스포루스 C11주, 바실루스 글로비스포루스 N75주, 또는, 아르드로박터 글로비포르미스(Arthrobacterglobiformis) A19주(이하, 각각 「미생물 C9주」, 「미생물 C11주」, 「미생물 N75주」 및 「미생물 A19주」라 함)가, 본 발명자들이 목표로 삼고 있었던 신규의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 산생능도 아울러 가진 것을 발견하였다. 전분 부분 분해물을 비롯한 비교적 고분자의 글루코 당질에 이 신규의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 작용시킴으로써 본 발명자들이 목표로 삼고 있었던 환상 4당의 생성율을 현저하게 향상시킬 수 있는 사실을 신규로 발견하였고, 또한 이 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 여러 가지 성질을 밝힘과 아울러 그 제조방법을 확립하고, 더욱이 이 효소에 의한 α-글루코실 전이반응 방법, α-이소말토실글루코 당질의 생성방법, 및 이 효소와 α-이소말토실 전이효소를 병용한 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질 및 그 제조방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다. 아울러, 이렇게 하여 얻어지는 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질을 함유시킨 음식물, 화장품, 의약품 등의 조성물을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 신규의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 그 제조방법 및 용도에 관한 것으로서, 상세하게는 신규의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 이 효소를 제조하는 방법, 이 효소를 산생하는 미생물, 이 효소를 사용한 α-글루코실 전이 방법, α-이소말토실글루코 당질의 생성방법, 더욱이, 이 효소와 α-이소말토실 전이효소를 병용한 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당의 제조방법 및 이들 당질을 함유시킨 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 산업상 유용한 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당, 이것을 함유하는 당질 및 조성물을 공업적으로 저렴하고도 대량으로 제조하는 것이 가능해 졌다. 이러한 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질은 실질적으로 비환원성 내지 저환원성이고, 아미노 카르보닐 반응을 일으키기 어려우며, 흡습성도 나타내지 않고, 취급이 용이하며, 온화한 저감미, 적당한 점도, 보습성, 포접성, 난소화성을 가지므로, 감미료, 저칼로리 식품소재, 정미 개량제, 풍미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다. 본 발명은 이렇게도 현저한 작용 효과를 가진 발명이므로 이 분야에 공헌하는 바가 실로 큰 의의가 있는 발명이다.

Claims (42)

  1. 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질로부터, 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이함으로써 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지며, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질을 생성하는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소.
  2. 제1항에 있어서, 덱스트란 생성능을 가지지 않으며, EDTA에 의해 활성이 저해되는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질이, 말토올리고당, 말토덱스트린, 아밀로덱스트린, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 액화 전분, 호화 전분 및 글리코겐으로 된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질인 α－이소말토실글루코 당질생성 효소.
  4. 아래의 이화학적 성질을 가진 α-이소말토실글루코 당질생성 효소.
    (1) 작용
    비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스중합도가 2 이상인 당질로부터, 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이함으로써 비환원 말단의 결합으로서 α-1,6 글루코실 결합 양식을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질을 생성함.
    (2) 분자량
    SDS-겔 전기영동법에 의하여 약 74,000 내지 160,000 달톤의 범위내의 분자량을 가짐,
    (3) 등전점
    앰폴라인 함유 전기영동법에 의해 pI 약 3.8 내지 7.8의 범위내의 등전점을 가짐.
    (4) 최적온도
    pH 6.0, 60분간 반응에서 약 40 내지 50℃의 범위내에서 최적온도를 가짐.
    pH 6.0, 60분간 반응에서 1mM Ca2+존재하에 약 45 내지 55℃의 범위내에서 최적온도를 가짐.
    pH 8.4, 60분간 반응에서 60℃에서 최적온도를 가짐. 또는
    pH 8.4, 60분간 반응에서 1mM Ca2+존재하에 65℃에서 최적온도를 가짐.
    (5) 최적 pH
    35℃, 60분간 반응에서 pH 약 6.0 내지 약 8.4의 범위내에서 최적 pH를 가짐.
    (6) 온도 안정성
    pH 6.0, 60분간 유지하는 조건에서 약 45℃ 이하에서 온도 안정영역을 가짐.
    pH 6.0, 60분간 유지하는 조건에서 1mM Ca2+존재하에 약 50℃ 이하에서 온도 안정영역을 가짐.
    pH 8.0, 60분간 유지하는 조건에서 약 55℃ 이하에서 온도 안정영역을 가짐. 또는,
    pH 8.0, 60분간 유지하는 조건에서 1mM Ca2+존재하에 약 60℃ 이하에서 온도 안정영역을 가짐.
    (7) pH 안정성
    4℃, 24시간 유지하는 조건에서 pH 약 4.5 내지 약 10.0의 범위내에서 안정 pH 영역을 가짐.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 서열표에 있어서의 서열 번호 ｌ, 서열 번호 5 내지 7, 서열 번호 11 내지 14, 및 서열 번호 18에 나온 아미노산 서열로 된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 서열을 가진 α-이소말토실글루코 당질생성 효소.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, Ca2+및 Mn2+에 의하여 그 활성이 안정화 및/또는 부활화(賦活化)되는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, α-이소말토실글루코 당질생성 효소가 정제 효소 또는 조효소인 것을 특징으로 하는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소.
  8. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 기재된 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 산생능을 가진 미생물을 영양배지에서 배양하여 얻게 되는 배양물로부터, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 기재된 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 채취하는 것을 특징으로 하는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 미생물이 바실루스속 또는 아르드로박터속의 미생물인 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 바실루스속의 미생물이, 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C9 (FERM BP-7143), 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C11 (FERM BP-7144), 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) N75 (FERM BP-7591), 및 이들의 변이주로 된 군으로부터 선택되는 1종인 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 아르드로박터속의 미생물이, 아르드로박터글로비포르미스(Arthrobacter globiformis) A19 (FERM BP-7590), 또는 그 변이주인 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 제조방법.
  12. 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질을 함유하는 용액에, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 기재된 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 작용시켜 α-글루코실 전이반응시키는 것을 특징으로 하는 α-글루코실 전이반응 방법.
  13. 제12항에 있어서, 제12항 기재의 α-글루코실 전이반응시에, D-글루코오스, D-크실로오스, L-크실로오스, D-갈락토오스, D-프룩토오스, D-만노오스, D-아라비노오스, D-푸코오스, D-프시코오스, L-소르보오스, 메틸-α-글루코오스, 메틸-β-글루코오스, N-아세틸글루코사민, 트레할로오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 글리세롤, 말티톨, 락토오스, 수크로오스, 및 L-아스코르브산으로 된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 수용체 공존하에서 반응시켜 당전이물을 생성시키는 것을 특징으로 하는 α-글루코실 전이반응 방법.
  14. 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질을 함유하는 용액에, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 기재된 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 작용시켜 α-글루코실 전이반응시킴으로써 α-이소말토실글루코 당질을 생성시키는 것을 특징으로 하는 α-이소말토실글루코 당질의 생성방법.
  15. 제14항에 있어서, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질이, 말토올리고당, 말토덱스트린, 아밀로덱스트린, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 액화 전분, 호화 전분 및 글리코겐으로 된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질인 α-이소말토실글루코 당질의 생성방법.
  16. 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질을 함유하는 용액에, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 기재된 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와, 이 효소의 작용에 의해 생성되는 α-이소말토실글루코 당질의 α-이소말토실 부분과 그 이외의 글루코 당질 부분을 특이적으로 절단하여, 절단되어 나온 α-이소말토실 부분을 수용체에다 전이하는 α-이소말토실 전이효소를 작용시킴으로써 얻게 되는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질.
  17. 제16항에 있어서, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질이, 말토올리고당, 말토덱스트린, 아밀로덱스트린, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 액화 전분, 호화전분 및 글리코겐으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질인 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질.
  18. 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질을 함유하는 용액에, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 기재된 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와, 이 효소를 작용시켜서 생성되는 α-이소말토실글루코 당질의 α-이소말토실 부분과 그 이외의 글루코 당질 부분을 특이적으로 절단하여, 절단되어 나온 α-이소말토실 부분을 수용체에다 전이하는 α-이소말토실 전이효소를 작용시킴으로써 얻게 되는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당과 더불어 다른 당질을 함유하는 용액으로 하고, 이것을 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피 처리하여 얻게 되는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질.
  19. 제16항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질이, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상4당을 고형물당 30w/w％ 이상 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질.
  20. 제16항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질이, 시럽, 매스키트, 비정질 분말, 비정질 고상물, 결정분말, 또는 결정 고상물의 형태로 있는 것을 특징으로 하는 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질.
  21. 제20항에 있어서, 상기 결정이, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당의 5 내지 6 함수결정, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당의 1 함수결정, 및 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당의 무수결정으로 된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 결정이, 유기용매를 사용함이 없이 수용액으로부터 결정석출시킨 것을 특징으로 하는 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질.
  23. 제16항 또는 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, 환상 4당을 함유하는 당질이, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당과 더불어, 글루코오스, 말토오스, 및 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지며, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질로 된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질을 함유하는 당질인 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질.
  24. 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질을 함유시킨 영양배지에, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 기재된 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 산생능과, 이 효소를 작용시켜서 생성하는 α-이소말토실글루코 당질의 α-이소말토실 부분과 그 이외의 글루코 당질 부분을 특이적으로 절단하여, 절단되어 나온 α-이소말토실 부분을 수용체에다 전이하는 α-이소말토실 전이효소 산생능을 가진 미생물을 배양해서 얻어지는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질.
  25. 제24항에 있어서, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질이, 말토올리고당, 말토덱스트린, 아밀로덱스트린, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 액화 전분, 호화 전분 및 글리코겐으로 된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질인 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 미생물이 바실루스속 또는 아르드로박터속의 미생물인, 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질.
  27. 제26항에 있어서, 상기 바실루스속에 속하는 미생물이, 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C9 (FERM BP-7143), 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C11 (FERM BP-7144), 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) N75 (FERM BP-7591), 및 이들의 변이주로 된 군으로부터 선택되는 1종인 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질.
  28. 제26항에 있어서, 상기 아르드로박터속의 미생물이, 아르드로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis) A19 (FERM BP-7590), 및 그 변이주로 된 군으로부터 선택되는 1종인 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질.
  29. 제24항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 배양물 또는 이것으로부터 얻게 되는 당질에, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 α－글루코시다아제로 된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소를 작용시킨 후, 수득한 혼합물을 탈색, 탈염, 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획, 막에 의한 분리, 미생물에 의한 발효처리 및 알칼리 처리에 의한 분해제거 방법으로 된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 정제방법으로 처리해서 얻게 되는, 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질.
  30. 제16항, 제18항 또는 제24항에 있어서, 상기 α-이소말토실 전이효소가 아래의 이화학적 성질을 가진 효소인 것을 특징으로 하는 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질.
    (1) 작용
    비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지며, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질로부터, α-이소말토실 전이를 포함하는 반응에 의해 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당을 생성함.
    (2) 분자량
    SDS-겔 전기영동법에 의해 약 82,000 달톤 내지 약 136,000 달톤의 범위내의 분자량을 가짐.
    (3) 등전점
    앰폴라인 함유 전기영동법에 의해 pI 약 3.7 내지 pI 약 8.3의 범위내에서 등전점을 가짐.
    (4) 최적온도
    pH 6.0, 30분간 반응의 조건하에서 약 45℃ 내지 약 50℃의 범위내에서 최적온도를 가짐.
    (5) 최적 pH
    35℃, 30분간 반응의 조건하에서 pH 약 5.5 내지 pH 약 6.5의 범위내에서 최적 pH를 가짐.
    (6) 온도 안정성
    pH 6.0, 60분간 유지하는 조건에서 약 45℃ 이하에서 온도 안정영역을 가짐.
    (7) pH 안정성
    4℃, 24시간 유지하는 조건에서 pH 약 3.6 내지 pH 약 10.0의 범위내에서 안정 pH 영역을 가짐.
  31. 전분을 호화 및/또는 액화한 용액에, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 기재된 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와, 이 효소를 작용시켜서 생성하는 α-이소말토실글루코 당질의 α-이소말토실 부분과 그 이외의 글루코 당질 부분을 특이적으로 절단하여, 절단되어 나온 α-이소말토실 부분을 수용체에다 전이하는 α-이소말토실 전이효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질의 제조방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 전분을 호화 및/또는 액화한 용액이 DE(dextrose equivalent) 20 이하의 용액인 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질의 제조방법.
  33. 제31항 또는 제32항 있어서, 상기 전분을 호화 및/또는 액화한 용액에, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 기재된 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소와 함께 시클로말토덱스트린 글루카노트란스페라제를 작용시키고, 필요에 따라서, 더욱이 α-아밀라아제, β-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 α-글루코시다아제로 된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질의 제조방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중의 어느 한 항에 있어서, 더욱 탈색, 탈염, 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획, 막에 의한 분리, 미생물에 의한 발효처리 및 알칼리 처리에 의한 분해제거로 된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 정제방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질의 제조방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중의 어느 한 항에 있어서, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당을, 고형물당 30w/w％ 이상 함유하고 있는 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질의 제조방법.
  36. 제31항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 있어서, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질이, 시럽, 매스키트, 비정질 분말, 비정질 고상물, 결정 분말, 또는 결정 고상물의 형태로 있는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질의 제조방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 결정이, 유기용매를 사용함이 없이 수용액으로부터 결정석출시킨 것인 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질의 제조방법.
  38. 제31항 또는 제33항에 있어서, 상기 α-이소말토실 전이효소가, 아래의 이화학적 성질을 가진 효소인 것을 특징으로 하는 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질의 제조방법.
    (1) 작용
    비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지며, 이 비환원말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질로부터, α-이소말토실 전이를 포함하는 반응에 의해, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당을 생성함.
    (2) 분자량
    SDS-겔 전기영동법에 의해 약 82,000 달톤 내지 약 136,000 달톤의 범위내의 분자량을 가짐.
    (3) 등전점
    앰폴라인 함유 전기영동법에 의해 pI 약 3.7 내지 pI 약 8.3의 범위내에서 등전점을 가짐.
    (4) 최적온도
    pH 6.0, 30분간 반응의 조건하에서 약 45℃ 내지 약 50℃의 범위내에서 최적온도를 가짐.
    (5) 최적 pH
    35℃, 30분간 반응의 조건하에서 pH 약 5.5 내지 pH 약 6.5의 범위내에서 최적 pH를 가짐.
    (6) 온도 안정성
    pH 6.0, 60분간 유지하는 조건에서 약 45℃ 이하에서 온도 안정영역을 가짐.
    (7) pH 안정성
    4℃, 24시간 유지하는 조건에서 pH 약 3.6 내지 pH 약 10.0의 범위내에서 안정 pH 영역을 가짐.
  39. 제16항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 기재된 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질을 함유시킨 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질을, 감미성, 난발효성, 낮은 충치 유발성, 저칼로리성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 이수 방지성, 고결 방지성, 포접성, 보향성(保香性), 안정성, 다른 당의 결정석출 방지성, 전분노화 방지성, 단백질 변성 방지성, 지방질 열화 방지성, 내산성, 내열성, 및 아미노 카르보닐 반응을 일으키기 어려운 특성을 가진 당질로서, 더욱이 감미료, 낮은 충치 유발성 식품소재, 저칼로리 식품소재, 정미 개량제, 풍미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 보향제(保香劑), 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제, 및 분말화 기재로서의 사용 목적으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 사용 목적으로 함유시킨 조성물.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 조성물이 음식물, 화장품 또는 의약품인 조성물.
  42. 제39항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 있어서, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당을 고형물당 0.1w/w％ 이상 함유시킨 조성물.
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