JP4982716B2 - 糖質混合物とその製造方法並びに用途 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖質混合物とその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質（当該糖質を、その構造にちなんで、本明細書では、以後、環状四糖と称することもある。）とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物とその製造方法並びに用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルコースを構成糖とする非還元性糖質として、近年、新たな四糖類が報告された。即ち、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第２２６巻、６４１乃至６４８頁（１９９４年）には、主として４つのグルコース残基がα−１、３結合とα−１，６結合で交互に連なっているアルテルナン（ａｌｔｅｒｎａｎ）に加水分解酵素アルテルナナーゼ（ａｌｔｅｒｎａｎａｓｅ）を作用させることにより、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖が生成し、これを有機溶媒の一種であるメタノール共存下で晶出させることが示されている。
【０００３】
環状四糖は、環状構造を有することから、各種化合物を包接する能力を有するとともに、非還元性故に、アミノカルボニル反応を起こさず、褐変、劣化を懸念することなく各種用途に加工、利用できることが期待される。しかしながら、環状四糖の製造原料としてのアルテルナンや、環状四糖の製造に必要な酵素であるアルテルナナーゼの入手が困難である上、それらを産生する微生物も容易に入手できる状態になかった。
【０００４】
斯かる状況下、本発明者等は、先に特願２０００−２２９５５７号明細書で開示したように、パノースなどのα−イソマルトシルグルコ糖質から環状四糖を生成する新規な酵素であるα−イソマルトシル転移酵素を発見し、この新規酵素を利用して、澱粉原料から製造されるパノースなどのα−イソマルトシルグルコ糖質からの環状四糖の製造方法を確立した。さらに、本発明者等は、先に特願２０００−２３４９３７号明細書で開示したように、澱粉原料にα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素と前記α−イソマルトシル転移酵素を組み合わせて作用させることにより、安価な澱粉原料から、直接、環状四糖を効率よく製造する方法を確立した。
【０００５】
しかしながら、上記した環状四糖の製造方法では、澱粉原料を用いるため、環状四糖とともに、副生するグルコース、マルトース、イソマルトース、パノースなどの還元性糖質を含有する糖質となる。製造された環状四糖を含有する糖質は、環状四糖自体は非還元性であっても、共存する還元性糖質のために還元性を示す。このため、環状四糖を含有する製品を非還元性とするためには、幾多の精製工程を経て還元性糖質を除去し、高純度の環状四糖製品とする必要がある。
【０００６】
澱粉を原料として製造される澱粉部分分解物、例えば、澱粉液化物、各種デキストリン、各種マルトオリゴ糖などは、通常、その分子の末端に還元基を有し還元性を示す糖質（以下、本明細書では、本還元性糖質を還元性澱粉糖と称することもある。）であることが知られている。一般に、還元性澱粉糖は、固形物当りの還元力の大きさをデキストロース・エクイバレント（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ，ＤＥ）として表している。この値の大きいものは、例えば、加工食品などに用いた場合、通常、分子が小さく低粘度で、甘味が強いものの、反応性が強く、アミノ酸や蛋白質などのアミノ基を持つ物質とアミノカルボニル反応を起こし易く、褐変し、悪臭を発生して、品質を劣化し易い性質のあることが知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、環状四糖と還元性糖質とを含有してなる糖質の欠点を解消するためのものであって、環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる還元性を低減させた糖質混合物、及び、その製造方法を確立し、併せて、この還元性を低減させた糖質混合物の用途を提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、前記課題を解決するために、環状四糖とともに還元性糖質を含有する糖質の還元性を低減させる方法に着目し、種々研究を続けてきた。その結果、該糖質を水素添加して還元性を低減させることにより、非還元性糖質である環状四糖に悪影響を与えること無く、還元性糖質が対応する糖アルコールに変換され、環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物となり、その後の精製工程も容易であって前記課題を解決できることを見いだし、本発明を完成した。
【０００９】
【発明の実施の形態】
まず、本発明で用いる環状四糖生成酵素としては、パノース若しくはイソマルトシルマルトースのようなα−イソマルトシルグルコ糖質から環状四糖を生成する酵素であるα−イソマルトシル転移酵素、及び澱粉からα−イソマルトシルグルコ糖質を生成する酵素であるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素があげられる。これら酵素としては、例えば、特願２０００−２２９５５７号明細書および特願２０００−２３４９３７号明細書で開示されるバチルス グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）、バチルス グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）など由来のα−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素が好適に用いられる。
【００１０】
本発明で使用される澱粉は、とうもろこし澱粉、米澱粉、小麦澱粉などの地上澱粉であっても、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、タピオカ澱粉などの地下澱粉であってもよい。澱粉を液化するには、通常、澱粉を水に懸濁した澱粉乳、望ましくは濃度１０ｗ／ｗ％（以下、本明細書では、特にことわらない限り、ｗ／ｗ％を％と略称する。）以上、更に望ましくは約２０乃至５０％とし、これを加熱して機械的に液化しても、酸又は酵素で液化してもよい。液化の程度は、比較的低いＤＥ２０未満のものが適しており、望ましくはＤＥ１５未満、更に望ましくはＤＥ１０未満のものが好適である。酸で液化する場合には、例えば、塩酸、燐酸、蓚酸などで液化し、その後、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、炭酸ナトリウムなどで必要ｐＨに中和して利用すればよい。酵素で液化する場合には、α−アミラーゼ、とりわけ、耐熱性の液化型α−アミラーゼの使用が適している。
【００１１】
このようにして得られる澱粉を液化した溶液に、α−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとともに作用させるには、これら酵素が作用しうるｐＨ、温度で行えばよく、通常、ｐＨ４乃至１０、好ましくは、ｐＨ５乃至８、温度約１０乃至８０℃、好ましくは、約３０乃至７０℃で行われる。また、澱粉を液化した溶液にこれら酵素を加える順序は問わず、いずれかの酵素を先に加え、他の酵素をその後に加えて作用させることも、また、これら酵素を同時に加えて作用させることも随意である。
【００１２】
酵素の使用量は、作用条件、反応時間によって適宜選べばよく、通常、基質である液化澱粉に対して、固形物グラム当たり、α−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の場合、それぞれ約０．０１乃至１００単位から選ばれ、また、澱粉枝切酵素の場合、約１乃至１０，０００単位から選ばれ、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの場合、約０．０５乃至５００単位から選ばれる。このようにして得られる非還元性の環状四糖とともに還元性を示すグルコース、マルトース、イソマルトース、パノースなどの澱粉糖を含む還元性糖質は、本発明の原料用還元性糖質として有利に利用できる。
【００１３】
反応液は、常法により、濾過、遠心分離などして不溶物を除去した後、活性炭で脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂で脱塩して精製し、濃縮し、シラップ状製品とする。更に、乾燥して粉末状製品にすることも随意である。必要ならば、更に、精製、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコール及びアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離などの方法を１種又は２種以上組み合わせて精製することにより、非還元性の環状四糖含量を高め、かつ残存する還元性澱粉糖含量を低減させた糖質混合物も、また、逆に、還元性澱粉糖含量を高め、かつ残存する非還元性の環状四糖を低減させた糖質も、何れも本発明の原料用還元性糖質として有利に利用できる。
【００１４】
とりわけ、工業的大量生産方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーの採用が好適であり、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより夾雑糖類を除去して、原料用還元性糖質を製造することも有利に実施できる。この際、固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。このようにして得られる原料用還元性糖質は、環状四糖と還元性糖質との重量比で、通常、１：９９乃至９９：１、望ましくは１０：９０乃至９０：１０の範囲にある。
【００１５】
このようにして得られる環状四糖とともに還元性糖質を含む糖質を水素添加するには、環状四糖を分解することなく、これに含まれる還元性糖質が対応する糖アルコールに還元されればよく、例えば、原料の糖質の濃度を約３０乃至７０％水溶液にし、オートクレーブに入れ、触媒として、糖質固形物当り、ラネーニッケルを約４乃至１０％を添加し、攪拌しながら温度を９０乃至１５０℃に上げて水素添加を完了、望ましくは、実質的に非還元性となるＤＥを０．５未満に低減させるまで水素添加を行い、次いでラネーニッケルを除去し、更に、常法に従って、活性炭による脱色、イオン交換樹脂による脱塩などの精製工程を経た後、濃縮し、シラップ状製品にすることも、また、シラップを乾燥させて非晶質粉末状製品にすることも、更に、シラップを晶出させマスキットとし、これを粉末化して結晶含有粉末製品にすることも随意である。このようにして製造される還元性を低減させた糖質混合物は、環状四糖に加えて、ソルビトール、マルチトール、イソマルチトール及びパニトールから選ばれる１種又は２種以上の糖アルコールを含有している。本発明の環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物は、その特徴をさらに引き出すために、環状四糖と糖アルコールとの重量比で、望ましくは１：９９乃至９９：１、更に望ましくは１０：９０乃至９０：１０の範囲が好適である。
【００１６】
本発明の環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物（以下、本明細書では、当該混合物を本発明の糖質混合物と称することもある。）は、ＤＥ０．５未満と還元性が極めて低く安定であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸を有する物質と混合しても、褐変することも、異臭を発生することもなく、混合した他の素材を損なうことも少ない。また、還元力が低いにもかかわらず低粘度であり、良質で上品な甘味を有している。また、経口摂取により、主成分の環状四糖のみならずマルチトール、イソマルチトール及びパニトールなどのオリゴ糖アルコールは比較的消化吸収されにくく低カロリー甘味料として利用される。また、本発明の糖質混合物は虫歯誘発菌などによって、醗酵されにくく、虫歯を起こしにくい甘味料としても利用できる。
【００１７】
また、本発明の糖質混合物は、安定な甘味料であることにより、結晶高含有製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤の糖衣剤として利用することも有利に実施できる。また、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、他の糖の晶出防止性、難醗酵性、糊化澱粉の老化防止性などの性質を具備している。
【００１８】
また、本発明の糖質混合物は、甘味料、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、飲食物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
【００１９】
また、本発明の糖質混合物は、そのまま甘味付けのための調味料として使用することができる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、マルトース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メープルシュガー、イソマルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ラクトスクロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、パラチニット、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、レバウディオシド、α−グリコシルレバウディオシド、グリチルリチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、スクラロース、アセスルファムＫ、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料の１種又は２種以上の適量と混合して使用してもよく、また必要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。
【００２０】
また、本発明の環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物、とりわけ、粉末状製品は、そのままで、又は必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成型して使用することも随意である。
【００２１】
また、本発明の環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付け、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【００２２】
例えば、アミノ酸、ペプチド類、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、核酸系調味料、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調味料として有利に使用できる。
【００２３】
また、例えば、せんべい、あられ、おこし、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、キャンディーなどの洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプレッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素類、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しなどの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻などの惣菜食品、ヨーグルト、チーズなどの乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、清酒、合成酒、リキュール、洋酒などの酒類、コーヒー、紅茶、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付けに、呈味改良に、また、品質改良などに有利に利用できる。
【００２４】
また、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のために飼料、餌料などの嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、又は呈味改良剤、矯味剤として、さらには品質改良剤、安定剤などとして有利に利用できる。
【００２５】
品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性などを失い易い各種生理活性物質又はこれを含む健康食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、ツモア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌、ローヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペースト状又は固状の健康食品や医薬品などに容易に製造できることとなる。
【００２６】
以上述べたような各種組成物に本発明の環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物を含有させる方法は、その製品が完成するまでの工程に含有させればよく、例えば、混和、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶出、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常０．１％以上、望ましくは１％以上含有させるのが好適である。
【００２７】
次に実験により本発明をさらに具体的に説明する。
【００２８】
【実験１】
＜培養物からの環状四糖の調製＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１』、松谷化学株式会社製造）５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』、アサヒビール株式会社製造）１．５ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地１００ｍｌを、５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス グロビスポルス Ｃ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養した後、遠心分離して菌体を除き培養上清を得た。さらに、その培養上清をオートクレーブ（１２０℃、１５分間）し、放冷した後、不溶物を遠心分離して除き上清を回収した。
【００２９】
得られた上清中の糖質を調べるため、展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル６０』（アルミプレート、２０×２０ｃｍ）を用い２回展開するシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」と略す。）を行ない、上清中の糖質を分離した。検出法として、分離した全糖質を硫酸−メタノール法で発色し、また、還元糖質をジフェニルアミン−アニリン法で発色して調べたところ、Ｒｆ値が約０．３１の位置に硫酸−メタノール法で陽性、かつ、ジフェニルアミン−アニリン法で陰性の非還元性糖質が検出された。
【００３０】
先に得た上清約９０ｍｌをｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野製薬株式会社製造）を固形物１グラム当り１，５００単位とグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）を固形物１グラム当り７５単位添加して２４時間処理し、続いて、水酸化ナトリウムでｐＨを１２に調整し２時間煮沸して、残存する還元糖を分解した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤアイオンＰＫ２１８』と『ダイヤイオンＷＡ３０』を用いて脱色、脱塩し、さらに、三菱化学製カチオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』とオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』で再度脱塩し、活性炭で脱色し、精密濾過した後、エバポレータで濃縮し凍結真空乾燥して固形物として約０．６ｇの糖質粉末を得た。
【００３１】
得られた糖質の組成を高速液体クロマトグラフィー法（以下、ＨＰＬＣと略称する。）で調べたところ、図１に示すように、溶出時間１０．８４分に単一ピークのみが検出され、純度は９９．９％以上で極めて高純度であることが判明した。なお、ＨＰＬＣは、『ショウデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）ＫＳ−８０１カラム』（昭和電工株式会社製造）を用いカラム温度６０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ水の条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー株式会社製造）を用いて行なった。
【００３２】
また、還元力をソモギ−・ネルソン法で測定したところ、その還元力は検出限界以下であり、本標品は実質的に非還元性糖質であると判断される。
【００３３】
【実験２】
＜非還元性糖質の構造解析＞
実験１の方法で得られた非還元性糖質について、高速原子衝撃法による質量分析（通称「ＦＡＢ−ＭＳ」）したところ、質量数６４９のプロトン付加分子イオンが顕著に検出され、本糖質の質量数が６４８であることが判明した。
【００３４】
また、常法に従って、硫酸を用い加水分解し、ガスクロマトグラフィー法で構成糖を調べたところ、Ｄ−グルコースのみが検出され、本糖質の構成糖はＤ−グルコースであることも判明し、質量数を考慮すると、本糖質はＤ−グルコース４分子からなる環状糖質であることがわかった。
【００３５】
さらに、本糖質を用いて核磁気共鳴法（通称ＮＭＲ）を行ったところ、図２に示す１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと、図３に示す１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが得られ、これらスペクトルを既知糖質のものと異同を比較したところ、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、６４１乃至６４８頁（１９９４年）に記載されている非還元性環状糖質サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝のスペクトルと一致し、本糖質の構造が図４に示す環状四糖、即ち、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝であることが判明した。
【００３６】
【実験３】
＜バチルス グロビスポルス Ｃ９からのα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の生産＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学株式会社製造）４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』（アサヒビール株式会社製造）１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス グロビスポルス Ｃ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００３７】
容量３０ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．４５単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．５単位／ｍｌで、環状四糖生成活性は約０．９５単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は約０．４５単位／ｍｌの活性（総活性約８，１１０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素は約１．５単位／ｍｌの活性（総活性約２６，９００単位）で、環状四糖生成活性は約０．９５単位／ｍｌ（総活性約１７，１００単位）であった。
【００３８】
なお、酵素活性は次のようにして測定した。即ち、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性の測定は、マルトトリオースを濃度２ｗ／ｖ％となるよう１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で６０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に主に生成するイソマルトシルマルトースとマルトースのうち、このマルトース量を、実験１に記載のＨＰＬＣ法で定量することによって行った。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのマルトースを生成する酵素量とした。
【００３９】
また、α−イソマルトシル転移酵素活性の測定は、パノースを濃度２ｗ／ｖ％となるよう１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で３０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に主に生成する環状四糖とグルコースのうち、このグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量することによって行った。α−イソマルトシル転移酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのグルコースを生成する酵素量とした。
【００４０】
環状四糖生成活性の測定は、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社製造）を濃度２ｗ／ｖ％となるよう５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で６０分間酵素反応し、その反応液を１００℃で１０分間熱処理して反応を停止させた後、更に、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野製薬製造）７０単位／ｍｌとグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）２７単位／ｍｌとを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１ｍｌを加えて、５０℃で６０分間処理し、その液を１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた後、環状四糖量を実験１に記載のＨＰＬＣ法で定量することによって行った。環状四糖生成活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルの環状四糖を生成する酵素量とした。
【００４１】
【実験４】
＜バチルス グロビスポルス Ｃ９由来酵素の調製＞
【実験４−１】
＜バチルス グロビスポルス Ｃ９由来酵素の精製＞
実験３で得られた培養上清約１８ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４００ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を８，１１０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を２４，７００単位、環状四糖生成活性を約１５，６００単位有していた。この粗酵素液を三菱化学株式会社製『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量１，０００ｍｌ）に供した。この際、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性、α−イソマルトシル転移酵素活性および環状四糖生成活性のいずれも、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この酵素液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不純物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエント、更に続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とは分離して溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性は硫安のリニアグラジエントでその濃度が約０Ｍ付近に溶出し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジエントでその濃度が約３０ｍＭ付近に溶出した。そこで、α−イソマルトシル転移酵素活性画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分とを別々に集め回収した。また、環状四糖生成活性は本カラムクロマトグラフィーのいずれの画分にも認められないことがわかり、また、得られたα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とα−イソマルトシル転移酵素画分とを混合した酵素液は環状四糖生成活性を示すこともわかり、澱粉部分分解物から環状四糖を生成する活性はα−イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素との両酵素活性の共同作用によって発揮されることが判明した。
【００４２】
以下、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを別々に精製する方法について述べる。
【００４３】
【実験４−２】
＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製＞
実験４−１で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表１に示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
【００４６】
【実験４−３】
＜α−イソマルトシル転移酵素の精製＞
実験４−１に記載のアフィニティークロマトグラフィーによってα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分と分離したα−イソマルトシル転移酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表２に示す。
【００４７】
【表２】
【００４８】
【実験５】
＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素の性質＞
【実験５−１】
＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質＞
実験４−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１４０，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００４９】
精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．２±０．５であった。
【００５０】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。なお、温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を図５（温度の影響）、図６（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で約４０℃（Ｃａ２＋非存在）、約４５℃（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）、至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０乃至６．５であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）をＣａ２＋非存在下または１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図７（温度安定性）、図８（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約３５℃まで（Ｃａ２＋非存在）、約４０℃まで（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）で、ｐＨ安定性は約４．５乃至９．０であった。
【００５１】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表３に示す。
【００５２】
【表３】
【００５３】
表３の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、ＥＤＴＡで著しく阻害され、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋で阻害された。Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋で活性化されることも判明した。
【００５４】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー モデル４７３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。
【００５５】
【実験５−２】
＜α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験４−３の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１１２，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００５６】
精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．５±０．５であった。
【００５７】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を図９（温度の影響）、図１０（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約４５℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１１（温度安定性）、図１２（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃までで、ｐＨ安定性は約４．０乃至９．０であった。
【００５８】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表４に示す。
【００５９】
【表４】
【００６０】
表４の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋で著しく阻害され、Ｃｕ２＋で阻害された。また、Ｃａ２＋で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないこともわかった。
【００６１】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列のイソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリン−アスパラギン−グリシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。
【００６２】
【実験６】
＜バチルス グロビスポルス Ｃ１１からのα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の生産＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス グロビスポルス Ｃ１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００６３】
容量３０ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中の本酵素活性は約０．５５単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．８単位／ｍｌで、環状四糖生成活性は約１．１単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は約０．５１単位／ｍｌの活性（総活性約９、１８０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素は約１．７単位／ｍｌの活性（総活性約３０，４００単位）で、環状四糖生成活性は約１．１単位／ｍｌ（総活性約１９，４００単位）であった。
【００６４】
【実験７】
＜バチルス グロビスポルス Ｃ１１由来酵素の調製＞
【実験７−１】
＜バチルス グロビスポルス Ｃ１１由来酵素の精製＞
実験６で得られた培養上清約１８ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４１６ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を８，４４０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を約２８，０００単位、環状四糖生成活性を約１７，７００単位有することが判明した。この粗酵素液を、実験４−１に記載の『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィーに供した。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性、α−イソマルトシル転移酵素活性、環状四糖生成活性のいずれも、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この酵素液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエント、更に続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭのリニアグラジエントで溶出させたところ、α‐イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は分離して溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性は硫安のリニアグラジエントでその濃度が約０．３Ｍ付近で溶出し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジエントでその濃度が約３０ｍＭ付近で溶出した。そこで、α−イソマルトシル転移酵素活性画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とを別々に集め回収した。実験４に記載のＣ９株の場合と同様に、環状四糖生成活性は本カラムクロマトグラフィーのいずれの画分にも認められないことがわかり、また、得られたα−イソマルトシル転移酵素画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とを混合した酵素液は環状四糖生成活性を示すこともわかり、澱粉部分分解物から環状四糖を生成する活性はα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との両酵素活性の共同作用によって発揮されることが判明した。
【００６５】
以下、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを別々に精製する方法について述べる。
【００６６】
【実験７−２】
＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製＞
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチルートヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表５に示す。
【００６７】
【表５】
【００６８】
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
【００６９】
【実験７−３】
＜α−イソマルトシル転移酵素の精製＞
実験７−１に記載のアフィニティークロマトグラフィーによってα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分と分離したα−イソマルトシル転移酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表６に示す。
【００７０】
【表６】
【００７１】
【実験８】
＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素の性質＞
【実験８−１】
＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質＞
実験７−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１３７，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００７２】
精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．２±０．５であった。
【００７３】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。なお、温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を図１３（温度の影響）、図１４（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で約４５℃（Ｃａ２＋非存在）、約５０℃（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）、至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）をＣａ２＋非存在下または１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１５（温度安定性）、図１６（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃まで（Ｃａ２＋非存在）、約４５℃まで（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）で、ｐＨ安定性は約５．０乃至１０．０であった。
【００７４】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表７に示す。
【００７５】
【表７】
【００７６】
表７の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、ＥＤＴＡで著しく阻害され、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋で阻害された。Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋で活性化されることも判明した。
【００７７】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列Ｎ末端チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。
【００７８】
このＮ末端アミノ酸配列結果を実験５−１のバチルス・グロビシポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のＮ末端配列と比較すると同一であることが判明し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の共通するＮ末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシンのＮ末端アミノ酸配列であることが判明した。
【００７９】
【実験８−２】
＜α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験７−３の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１０２，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００８０】
精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．６±０．５であった。
【００８１】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を図１７（温度の影響）、図１８（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約５０℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約５．５乃至６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１９（温度安定性）、図２０（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃までで、ｐＨ安定性は約４．５乃至９．０であった。
【００８２】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表８に示す。
【００８３】
【表８】
【００８４】
表８の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋で著しく阻害され、Ｃｕ２＋で阻害された。また、Ｃａ２＋で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないこともわかった。
【００８５】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列のイソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリン−チロシン−グリシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。このＮ末端アミノ酸配列結果を実験５−２のバチルス グロビスポルス Ｃ９由来のα−イソマルトシル転移酵素のＮ末端配列と比較して、α−イソマルトシル転移酵素の共通するＮ末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列のイソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリンのＮ末端アミノ酸配列であることが判明した。
【００８６】
【実験９】
＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のアミノ酸配列＞
【実験９−１】
＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の内部部分アミノ酸配列＞
実験７−２の方法で得られた精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのトリプシン（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。マイクロボンダパックＣ１８カラム（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ社製）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４０％アセトニトリル溶液の１２０分間のリニアグラジエントの条件で行なった。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した３ペプチド［Ｐ６４（保持時間約６４分）、Ｐ８８（保持時間約８８分）、Ｐ９９（保持時間約９９分）］を分取し、それぞれを真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した。それらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ８残基までアミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号５乃至７に示すアミノ酸配列が得られた。得られた内部部分アミノ酸配列を表９に示す。
【００８７】
【表９】
【００８８】
【実験９−２】
＜α−イソマルトシル転移酵素の内部部分アミノ酸配列＞
実験７−３の方法で得られた精製α−イソマルトシル転移酵素標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのリジルエンドぺプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。マイクロボンダパックＣ１８カラム（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ社製）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４０％アセトニトリル溶液の１２０分間のリニアグラジエントの条件で行なった。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した３ペプチド［Ｐ２２（保持時間約２２分）、Ｐ６３（保持時間約６３分）、Ｐ７１（保持時間約７１分）］を分取し、それぞれを真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した。それらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ８残基までアミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号８乃至１０に示すアミノ酸配列が得られた。得られた内部部分アミノ酸配列を表１０に示す。
【００８９】
【表１０】
【００９０】
【実験１０】
＜各種糖質への作用＞
各種糖質を用いて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の基質になりうるかどうかの試験をした。マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース、イソパノース、α，α−トレハロース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、マルトトリイトール、ラクトース、スクロース、エルロース、セラギノース、マルトシルグルコシド、イソマルトシルグルコシドを含む溶液を調製した。
【００９１】
これらの溶液に、実験４−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品、または実験７−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を基質固形物１グラム当たりそれぞれ２単位ずつ加え、基質濃度を２ｗ／ｖ％になるように調整し、これを３０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させた。酵素反応前後の反応液を、実験１記載のＴＬＣ法で分析し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無を確認した。結果を表１１に示す。
【００９２】
【表１１】
【００９３】
表１１の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、試験した多種の糖質のうち、グルコース重合度３以上で、非還元末端にマルトース構造を有する糖質によく作用することが判明した。また、グルコース重合度が２の糖質では、マルトース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、マルトトリイトール、エルロースにも僅かに作用することが判明した。
【００９４】
【実験１１】
＜マルトオリゴ糖からの生成物＞
【実験１１−１】
＜生成物の調製＞
濃度１％のマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースのそれぞれ水溶液に実験７−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を、それぞれ固形物１グラム当たり２単位（マルトースおよびマルトトリオース）、０．２単位（マルトテトラオース）、０．１単位（マルトペンタオース）加え、３５℃、ｐＨ６．０で８時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成を、ＨＰＬＣ法を用いて測定した。ＨＰＬＣは、『ＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ３０３』カラム（株式会社ワイ・エム・シー製造）を用いカラム温度４０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ水の条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー株式会社製造）を用いて行なった。その結果を表１２に示す。
【００９５】
【表１２】
【００９６】
表１２の結果から明らかなように、本酵素の作用の結果、基質マルトースからは、主にグルコースとα−イソマルトシルグルコース（別名、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース、パノース）とが生成し、基質マルトトリオースからは、主にマルトースとα−イソマルトシルグルコース（別名、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース）とが生成し、少量ながらグルコース、マルトテトラオース、α−イソマルトシルグルコース（別名、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース、パノース）、生成物Ｘが生成することが判明した。基質マルトテトラオースからは、主にマルトトリオースと生成物Ｘとが生成し、少量ながらマルトース、マルトペンタオース、α−イソマルトシルグルコース（別名、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース）、生成物Ｙが生成することが判明した。基質マルトペンタオースからは、主にマルトテトラオースと生成物Ｙとが生成し、少量ながらマルトトリオース、マルトヘキサオース、生成物Ｘ、生成物Ｚが生成することが判明した。
【００９７】
基質マルトテトラオースからの主生成物である生成物Ｘ、並びに基質マルトペンタオースからの主生成物である生成物Ｙの単離・精製を行った。分取用ＨＰＬＣカラム『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ Ｒ３５５−１５Ｓ−１５ １２Ａ』（株式会社ワイエムシイ製）を用いて精製し、上記のマルトテトラオースからの反応物、マルトペンタオースからの反応物それぞれから、純度９９．９％以上の生成物Ｘ標品を固形物収率約８．３％で、純度９９．９％以上の生成物Ｙを固形物収率約１１．５％で単離した。
【００９８】
【実験１１−２】
＜生成物の構造解析＞
実験１１−１の方法で得た生成物Ｘ標品および生成物Ｙ標品を用いて、常法に従ってメチル化分析とＮＭＲ分析を行なった。メチル化分析の結果は表１３にまとめた。ＮＭＲ分析の結果については、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２１（生成物Ｘ）、図２２（生成物Ｙ）に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルおよび帰属を図２３（生成物Ｘ）、図２４（生成物Ｙ）、表１４にまとめた。
【００９９】
【表１３】
【０１００】
これらの結果から、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素によるマルトテトラオースからの生成物Ｘは、マルトテトラオースの非還元末端グルコースの６位水酸基にグルコース基がα結合した５糖で、構造式１で表わされるα−イソマルトシルマルトトリオース（別名、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース）であることが判明した。
【０１０１】
構造式１：
αＤ−Ｇｌｃｐ（１→６）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）Ｄ−Ｇｌｃｐ
【０１０２】
また、マルトペンタオースからの生成物Ｙは、マルトペンタオースの非還元末端グルコースの６位水酸基にグルコシル基がα結合した６糖で、構造式２で表わされるα−イソマルトシルマルトテトラオース（別名、６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオース）であることが判明した。
【０１０３】
構造式２：
αＤ−Ｇｌｃｐ（１→６）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）Ｄ−Ｇｌｃｐ
【０１０４】
【表１４】
【０１０５】
以上のことから、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のマルトオリゴ糖に対する作用は以下のように判断された。
【０１０６】
（１） 本酵素は、基質として、α−１，４結合からなるグルコース重合度が２以上のマルトオリゴ糖に作用し、その非還元性末端のグルコシル残基を他の分子の非還元性末端のグルコシル残基の６位に転移する作用を有する分子間の６−グルコシル転移を触媒して、非還元末端に６−Ｏ−α−グルコシル基を有するグルコース重合度が１増加したα−イソマルトシルグルコ糖質（別名、６−Ｏ−α−グルコシルマルトオリゴ糖）と、グルコース重合度が１減じたマルトオリゴ糖とを生成する。
（２） 本酵素は、４−グルコシル転移も僅かに触媒し、マルトオリゴ糖から、グルコース重合度が１増加したマルトオリゴ糖と、グルコース重合度が１減じたマルトオリゴ糖とを僅かに生成する。
【０１０７】
【実験１２】
＜還元力生成試験＞
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素が還元力生成能を有するかどうかを調べるため、以下の試験を行った。濃度１％のマルトテトラオース水溶液に実験４−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素および実験７−２の方法で得たバチルス グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を、基質固形物１グラム当たり０．２５単位加え、３５℃、ｐＨ６．０で作用させ、その反応液の一部を経時的に採り、１００℃で１０分間保持して反応を停止し、反応液の還元力を測定した。即ち、その酵素反応前後の溶液の還元糖量をソモギ−・ネルソン法で測定し、また、同時にその酵素反応前後の溶液の全糖量をアントロン硫酸法で測定し、還元力生成率（％）は以下の計算式を用いて算出した。
【０１０８】
【数１】
計算式：
【０１０９】
結果を表１５に示す。
【０１１０】
【表１５】
【０１１１】
表１５の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、マルトテトラオースを基質として作用させると、反応物の還元力を実質的に増加しないこと、即ち、当該α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は加水分解作用を示さないか若しくは検出できないほど僅かなものであることが判明した。
【０１１２】
【実験１３】
＜デキストラン生成試験＞
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素がデキストラン生成作用を有するかどうかを調べるため、『バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第５６巻、１６９乃至１７３（１９９２年）に記載の方法に準じて試験を行った。濃度１％のマルトテトラオース水溶液に実験４−２の方法で得たＣ９株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素および実験７−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を、基質固形物１グラム当たり０．２５単位加え、３５℃、ｐＨ６．０で４時間および８時間作用させた後、１００℃で１５分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の５０μｌを遠心管に入れ、それに３倍量のエタノールを加え十分に攪拌した後、４℃で３０分間静置した。次いで、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分間）し、その上清を除去した後、１ｍｌの７５ｗ／ｗ％のエタノールを加え攪拌して洗浄した。再度、遠心分離してその上清を除き、真空乾燥した後、１ｍｌの脱イオン水を加え十分に攪拌した。その液中の全糖量（グルコース換算）をフェノール硫酸法で測定し、試験の全糖量とした。反応のブランクとして、１００℃で１０分間熱処理し失活させたバチルス グロビスポルス Ｃ９由来またはバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を用いて同様に行い、ブランクの全糖量とした。デキストラン生成量は以下の計算式で計算した。
【０１１３】
計算式：
デキストラン生成量（ｍｇ／ｍｌ）＝［（試験の全糖量）−（ブランクの全糖量）］×２０
【０１１４】
結果を表１６に示す。
【０１１５】
【表１６】
【０１１６】
表１６の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素をマルトテトラオースに作用させてもデキストランを生成しないこと、つまり、当該α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、デキストラン生成作用を実質的に有さないか、その生成量は検出限界以下であることが判明した。
【０１１７】
【実験１４】
＜転移受容体特異性＞
各種糖質を用いて、本酵素の転移受容体になりうるかどうかの試験をした。Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−フコース、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ラムノース、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、ソルビトール、α，α−トレハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、ラクトース、スクロース、α−サイクロデキストリン、β−サイクロデキストリン、γ−サイクロデキストリンの溶液を調製した。
【０１１８】
これらの受容体溶液（濃度１．６％）に、糖供与体として澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』（濃度４％）を加え、実験４−２の方法で得たバチルスグロビスポルス Ｃ９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品または実験７−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を糖供与体固形物１グラム当たりそれぞれ１単位ずつ加え、これを３０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させた。酵素反応後の反応液を、受容体が単糖または二糖の場合はガスクロマトグラフィー法（以下、「ＧＬＣ法」と略する。）で、受容体が三糖以上の場合はＨＰＬＣ法で分析し、それぞれの糖質が本酵素の転移受容体になるかを確認した。なお、ＧＬＣに於いて、ＧＬＣ装置は『ＧＣ−１６Ａ』（株式会社島津製作所製）、カラムはジー・エル・サイエンス株式会社製『２％シリコンＯＶ−１７／クロモゾルブＷ』を充填したステンレス製カラム（３ｍｍφ×２ｍ）、キャリアーガスは窒素ガスを流量４０ｍｌ／分で１６０℃から３２０℃まで７．５℃／分の速度で昇温し、検出は水素炎イオン検出器で分析した。ＨＰＬＣでは、ＨＰＬＣの装置は東ソー株式会社製『ＣＣＰＤ』、カラムは『ＯＤＳ−ＡＱ−３０３』（株式会社ワイエムシィー社製）、溶離液は水を流速０．５ｍｌ／分で、検出は示差屈折形で分析した。結果を表１７に示す。
【０１１９】
【表１７】
【０１２０】
表１７の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、転移受容体として種々の糖質が利用でき、特に、Ｄ−／Ｌ−キシロース、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、α，α−トレハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、ラクトースおよびスクロースによく転移し、次いで、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−フコース、Ｌ−ソルボ−スおよびＮ−アセチルグルコサミンに転移し、更には、Ｄ−アラビノースにも転移することが判明した。
【０１２１】
以上に述べたα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質について、先に報告されている６−グルコシル転移作用を有する酵素、『バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第５６巻、第１６９乃至１７３頁（１９９２年）に記載のデキストリン・デキストラナ−ゼおよび『日本農芸化学会誌』、第３７巻、第６６８乃至６７２頁（１９６３年）に記載のトランスグルコシダーゼと比較した。その結果を表１８にまとめた。
【０１２２】
【表１８】
【０１２３】
表１８から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、既知のデキストリン・デキストラナーゼやトランスグルコシダーゼとは全く異なる新規な理化学的性質を有することが判明した。
【０１２４】
【実験１５】
＜環状四糖の生成＞
各種糖質を用いて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素の作用による環状四糖生成試験を行った。マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、アミロース、可溶性澱粉、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社製）またはグリコーゲン（カキ由来、和光純薬株式会社販売）の溶液を調製した。
【０１２５】
これらの水溶液（濃度０．５％）に、実験７−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り１０単位とを加え、これらを３０℃、ｐＨ６．０で作用させた。作用条件は、以下の４つの系で行った。
【０１２６】
（１） α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を２４時間作用させた後、酵素を熱失活し、続いて、α−イソマルトシル転移酵素を２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（２） α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを同時に２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（３） α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のみを２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（４） α−イソマルトシル転移酵素のみを２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
【０１２７】
これら熱失活させた反応液中の環状四糖の生成量を調べるために、実験１と同様のα−グルコシダーゼ・グルコアミラーゼ処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表１９に示す。
【０１２８】
【表１９】
【０１２９】
表１９の結果から明らかなように、試験したいずれの糖質も、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のみの作用およびα−イソマルトシル転移酵素のみの作用では、環状四糖は全く生成しなかったのに対して、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素を同時併用することにより環状四糖が生成した。その生成量は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させた後にα−イソマルトシル転移酵素を作用させた場合には、約１１％以下と比較的に低いのに対して、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを同時に作用させると、いずれの糖質でも環状四糖の生成量は向上し、特に、グリコーゲンでは約８７％に増加し、澱粉部分分解物では約６４％に増加することが判明した。
【０１３０】
このα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との同時併用における環状四糖の生成メカニズムは、両酵素の反応特性から以下のように推察される。
【０１３１】
（１） α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、グリコーゲンや澱粉部分分解物などのα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース基に作用し、そのグルコース基を他のα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース基の６位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にα−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖が生成する。
（２） α−イソマルトシル転移酵素は、非還元末端にイソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖に作用し、そのイソマルトシル基を、他の非還元末端にイソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース基の３位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖が生成する。
（３） 続いて、α−イソマルトシル転移酵素は、その非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖に作用し、分子内転移作用によってイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基をα−１，４グルカン鎖から切り離し、環状化して環状四糖が生成する。
（４） 切り離されたα−１，４グルカン鎖は、再度、（１）から（３）の反応を受けることによって、更に、環状四糖が生成する。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との同時併用で、上記のように両酵素が繰り返し作用し、環状四糖の生成量が増加すると推察された。
【０１３２】
【実験１６】
＜澱粉液化程度の影響＞
とうもろこし澱粉を濃度１５％澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを０．１％加えてｐＨ６．０に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』（ノボ社製）を澱粉１グラム当り０．２乃至２．０％を加え、９５℃で１０分間反応させ、次いで、１２０℃で２０分間オートクレーブし、約３５℃に急冷して、ＤＥ３．２乃至２０．５の液化溶液を得、これに、実験７−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり２単位と、実験７−３の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り２０単位とを加え、３５℃で２４時間反応させた。１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験１と同様にα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表２０に示す。
【０１３３】
【表２０】
【０１３４】
表２０の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とによる環状四糖の生成は、澱粉の液化の程度で影響を受け、液化の程度が低いほど、即ち、ＤＥが低値であるほど、澱粉からの環状四糖の生成率は高く、逆に、液化の程度が高いほど、即ち、ＤＥが高値であるほど、澱粉からの環状四糖の生成率が低いことが判明した。澱粉からの環状四糖の生成率を高めるには、澱粉の部分分解の程度はＤＥ約２０以下、望ましくは、ＤＥ約１２以下、更に望ましくは、ＤＥ約５以下が適していることが判明した。
【０１３５】
【実験１７】
＜澱粉部分分解物濃度の影響＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』（ＤＥ約２乃至５）の最終濃度０．５乃至４０％の水溶液を調製し、それぞれに、実験７−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り１０単位加え、両酵素を同時併用して３０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験１と同様にα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表２１に示す。
【０１３６】
【表２１】
【０１３７】
表２１の結果から明らかなように、澱粉部分分解物の濃度が０．５％の低濃度では、環状四糖の生成量は約６４％であるのに対し、濃度４０％の高濃度では、環状四糖の生成量は約４０％と、基質である澱粉部分分解物の濃度に依存して環状四糖の生成量が変化することが判明した。この結果から、環状四糖の生成量は、澱粉部分分解物が低濃度であるほど高まる傾向にあることが判明した。
【０１３８】
【実験１８】
＜シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ添加効果＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』水溶液（濃度１５％）を調製し、実験７−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得たＣ１１株由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り１０単位と、バチルス・ステアロサーモフィルス由来シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を固形物１グラム当り０乃至０．５単位加え、両酵素を同時併用して３０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験１と同様にα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表２２に示す。
【０１３９】
【表２２】
【０１４０】
表２２の結果から明らかなように、ＣＧＴａｓｅを添加することによって、環状四糖の生成量が増加することが判明した。
【０１４１】
【実験１９】
＜環状四糖の調製＞
トウモロコシ由来フィトグリコーゲン（キューピー株式会社製）の水溶液（約１００ｌ）を濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨ６．０、温度３０℃に調整した後、実験７−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り１０単位加え、４８時間作用させた後、１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた。この反応液の一部を採り、ＨＰＬＣで環状四糖生成量を調べたところ、糖組成として約８４％であった。この反応液をｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、実験１と同様にα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖などを加水分解し、さらに、水酸化ナトリウムでｐＨを５．８に調整し温度９０℃で１時間保持して、酵素を失活させ、不溶物を濾過して除去した。この濾液を逆浸透膜を用いて固形分濃度約１６％まで濃縮した後、常法に従って脱色、脱塩、濾過、濃縮したところ、固形分約３，７００ｇを含む糖液約６．２ｋｇを得た。
【０１４２】
得られた糖液を、オルガノ製イオン交換樹脂『アンバーライトＣＲ−１３１０（Ｎａ型）』を充填したカラム（ゲル量約２２５ｌ）に供し、カラム温度６０℃で流速約４５ｌ／ｈの条件でクロマト分離を行なった。溶出液の糖組成を実験１に記載のＨＰＬＣ法でモニターし、環状四糖の純度が９８％以上の画分を回収し、常法に従って脱塩、脱色、濾過、濃縮したところ、固形分約２，５００ｇを含む糖液約７．５ｋｇを得た。得られた糖液の糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、環状四糖の純度は約９９．５％であった。
【０１４３】
【実験２０】
＜環状四糖の水溶液からの結晶化＞
実験１９の方法で得られた純度約９８％以上の環状四糖画分をエバポレーターで固形物濃度約５０％に濃縮した後、この濃縮糖液約５ｋｇを円筒状のプラスチック容器に入れ、緩やかに回転させながら約２０時間で温度を６５℃から２０℃まで降下させることにより晶析させたところ、白色の結晶状粉末が得られた。その顕微鏡写真の１例を図２５に示す。続いて、遠心濾過器を用いて分蜜し結晶状物を湿重量として１，３６０ｇを回収した。さらに、６０℃で３時間乾燥して環状四糖結晶状粉末を１，１７０ｇ得た。得られた結晶粉末の糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、環状四糖の純度は９９．９％以上と極めて高純度であった。
【０１４４】
この環状四糖の結晶状粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したところ、図２６に示すように、主な回折角（２θ）として１０．１°、１５．２°、２０．３°および２５．５°を特徴とする回折スペクトルが得られた。また、この結晶状粉末の水分をカール・フィッシャー法で測定したところ、水分は１３．０％であることがわかり、環状四糖１分子当たり５乃至６分子の水を含む結晶であることが判明した。
【０１４５】
さらに、この環状四糖の結晶粉末を熱重量測定したところ、図２７に示す熱重量曲線が得られ、その重量変化と温度との関係から、温度１５０℃までの上昇で４乃至５分子の水に相当する重量減少が認められ、続いて、温度２５０℃付近で１分子の水に相当する重量減少が認められ、さらに、温度２８０℃付近から環状四糖自体の熱分解と考えられる重量減少が観察された。これらのことから、本発明の環状四糖５乃至６含水結晶は、常圧において、温度を１５０℃まで上昇させることにより結晶分子当たり４乃至５分子の水が離脱して１分子の水を含む結晶になり、さらに温度２５０℃までに１分子の水が結晶から離脱して無水結晶になることが判明した。
【０１４６】
【実験２１】
＜環状四糖１含水結晶への変換＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶粉末をガラス容器に入れ、予め温度１４０℃に保温したオイルバス中にそのガラス容器を３０分間保持した。得られた環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したところ、熱処理前の５乃至６含水結晶の粉末Ｘ線回折とは全く異なり、図２８に示すように、主な回折角（２θ）として、８．３°、１６．６°、１７．０°および１８．２°を特徴とする回折スペクトルが得られた。また、この結晶状粉末の水分をカール・フィッシャー法で測定したところ、水分が約２．７％であることがわかり、環状四糖１分子当たり１分子の水を含むことが判明した。さらに、この結晶粉末を熱重量測定したところ、図２９に示す熱重量曲線が得られ、その重量変化と温度との関係から、温度２７０℃付近で１分子の水に相当する重量減少が認められ、さらに、温度２９０℃付近から環状四糖自体の熱分解と考えられる重量減少が観察された。これらのことから、本発明の環状四糖結晶状物は１含水結晶であることが判明した。
【０１４７】
【実験２２】
＜無水結晶への変換＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶粉末を温度４０℃乃至１２０℃でそれぞれ１６時間真空乾燥した。得られた環状四糖粉末の水分をカール・フィッシャー法で測定したところ、真空乾燥温度４０℃の場合は水分が約４．２％であり、真空乾燥温度１２０℃の場合は水分が約０．２％で、実質的に無水であることが判明した。これら真空乾燥した環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したところ、真空乾燥前の５乃至６含水結晶の粉末Ｘ線回折および１含水結晶のものとは全く異なり、図３０（真空乾燥温度４０℃）、図３１（真空乾燥温度１２０℃）に示すように、主な回折角（２θ）として、１０．８°、１４．７°、１５．０°、１５．７°および２１．５°を特徴とする回折スペクトルが得られた。両回折スペクトル間でのピ−ク強度の強弱は認められるものの、基本的にピ−クの回折角度は同一で、結晶学的に同一無水結晶と推察された。また、回折スペクトルのベースラインは山状を呈し、真空乾燥前の環状四糖５乃至６含水結晶のものおよび１含水結晶のものと比べ結晶化度が低下しており、非結晶状態（アモルファス）の環状四糖が存在していることが判明した。このことから、真空乾燥４０℃の場合の水分を約４．２％含む環状四糖粉末は、その水分を含む環状四糖アモルファスと、環状四糖無水結晶とが混在する粉末と推察された。以上のことから、環状四糖５乃至６含水結晶粉末を真空乾燥することにより、５乃至６含水結晶は水分子を失い、非結晶状態のアモルファスと無水結晶に変換することがわかった。なお、水分０．２％の無水環状四糖粉末について、実験２０と同様に熱重量分析したところ、図３２に示すように、温度２７０℃付近から環状四糖の熱分解と考えられる重量減少のみが観察された。
【０１４８】
【実験２３】
＜環状四糖の水に対する飽和濃度＞
温度１０乃至９０℃での水に対する環状四糖の飽和濃度を調べるため、密栓付きガラス製容器に水１０ｍｌを入れ、それに実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を、各温度で完全に溶解する量以上の量を加えた後、ガラス容器を密封し、飽和に達するまで温度１０乃至９０℃で保温しながら２日間攪拌した。それぞれの温度の環状四糖飽和溶液を精密濾過して溶けていない環状四糖を除いた後、その濾液の水分を乾燥減量法で調べ、各温度での飽和濃度を求めた。結果を表２３に示す。
【０１４９】
【表２３】
【０１５０】
【実験２４】
＜熱安定性＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を水に溶解し濃度１０ｗ／ｖ％の環状四糖水溶液を調製し、その溶液８ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。放冷後、それら溶液の着色度の測定と、ＨＰＬＣ法による純度測定を行った。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度により評価した。結果は表２４に示す。
【０１５１】
【表２４】
【０１５２】
表２４の結果から明らかなように、環状四糖水溶液は１２０℃の高温加熱でも着色はなく、糖組成の純度の低下もなく、環状四糖は熱に対して安定な糖質であることが判明した。
【０１５３】
【実験２５】
＜ｐＨ安定性＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を各種の緩衝液（２０ｍＭ）に溶解し、環状四糖を濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨを２乃至１０に調整した環状四糖溶液を調製した。それぞれの溶液８ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１００℃で２４時間加熱した。放冷後、それら溶液の着色度の測定と、ＨＰＬＣ法による純度測定を行った。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度により評価した。結果は表２５に示す。
【０１５４】
【表２５】
【０１５５】
表２５の結果から明らかなように、環状四糖水溶液は１２０℃の高温で２４時間加熱しても、ｐＨ２乃至１０の広範囲で着色はなく、ｐＨ２において糖組成の純度は僅かに低下するものの、ｐＨ３乃至１０の範囲では全く糖組成の純度は低下せず、環状四糖は広いｐＨ範囲、換言すれば、ｐＨ３乃至５の酸性側、ｐＨ６乃至８の中性側、ｐＨ９乃至１０のアルカリ側で煮沸しても極めて安定な糖質であることが判明した。
【０１５６】
【実験２６】
＜アミノカルボニル反応＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を水に溶解し、さらに、それに市販試薬特級のグリシンとリン酸緩衝液を加え、５０ｍＭリン酸緩衝液でｐH７．０に調整した１ｗ／ｖ％グリシンを含む１０ｗ／ｖ％環状四糖溶液を調製した。その溶液４ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１００℃で３０乃至９０分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しアミノカルボニル反応性を調べた。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度により評価した。結果を表２６に示す。
【０１５７】
【表２６】
【０１５８】
表２６の結果から明らかなように、環状四糖は、グリシン共存下で加熱しても着色はなく、グリシンとの褐変を引き起こさないこと、換言すれば、アミノカルボニル反応（メイラード反応とも言う）を起こしにくい安定な糖質であることが判明した。
【０１５９】
【実験２７】
＜アミノカルボニル反応＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶と市販ポリペプトン（日本製薬製）とを脱イオン水に溶かし、５ｗ／ｖ％ポリペプトンを含む１０ｗ／ｖ％環状四糖溶液を調製した。その溶液４ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しアミノカルボニル反応性を調べた。同時に、ポリペプトンのみを含む溶液をブランクとして同様に加熱した。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度からブランクの吸光度を差し引いた値に基づいて評価した。結果を表２７に示す。
【０１６０】
【表２７】
【０１６１】
表２７の結果から明らかなように、環状四糖は、ポリペプトン共存下で加熱して、ポリペプトンとの褐変を引き起こさないこと、換言すれば、アミノカルボニル反応を起こしにくい安定な糖質であることが判明した。
【０１６２】
【実験２８】
＜包接作用＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を脱イオン水に溶かし、２０％水溶液を調製した。その水溶液１００ｇ当たり、メタノールは２ｇ、エタノールは３ｇ、酢酸は４．６ｇを加えて包接を行なった。その後、それぞれを濾過し濾液を凍結乾燥し、未包接物を除去した。対照として、包接能を有することが知られている分枝シクロデキストリン（商品名『イソエリートＰ』、マルハ株式会社販売）を用いて同様に行なった。
【０１６３】
凍結乾燥粉末中の包接物量を測定するために、それぞれの凍結乾燥粉末１ｇを５ｍｌの水に溶かし、それに５ｍｌのジエチルエ−テルを加えて抽出を行ない、再度、抽出を繰り返した後、ジエチルエーテル中の抽出物をガスクロマトグラフィー法で定量した。結果を表２８に示す。
【０１６４】
【表２８】
【０１６５】
表２８の結果から明らかなように、環状四糖は包接能を有しており、その包接能は、分枝サイクロデキストリンと比べ、重量当たり約２倍も高いことが判明した。
【０１６６】
【実験２９】
＜甘味度＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を脱イオン水に溶かし、固形物濃度１０％水溶液を調製し、この環状四糖１０％水溶液を基準とし、蔗糖（市販グラニュ−糖）の濃度を変え、パネラ−５名で官能試験を行なった。その結果、環状四糖の甘味度は、蔗糖の約２０％であった。
【０１６７】
【実験３０】
＜消化性試験＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を用いて、『日本栄養食糧学会誌』、第４３巻、第２３乃至２９頁（１９９０年）に記載の岡田等の方法に準じて、試験管内での唾液アミラーゼ、合成胃液、膵液アミラーゼ、小腸粘膜酵素による環状四糖の消化性を調べた。対照として、難消化性糖質として知られているマルチトールを用いて行なった。結果を表２９に示す。
【０１６８】
【表２９】
【０１６９】
表２９の結果から明らかなように、環状四糖は、唾液アミラーゼ、合成胃液、膵液アミラーゼで全く消化されず、小腸粘膜酵素によって僅かに消化されたが、その程度は０．７４％と低値であり、対照の難消化性糖質マルチトールの値と比較すると１／５以下であり、環状四糖が極めて消化されにくい糖質であることが判明した。
【０１７０】
【実験３１】
＜醗酵性試験＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至含水結晶を用いて、『ジャ−ナル・オブ・ニュートリショナル・サイエンス・アンド・ビタミノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｉｔａｍｉｎｏｌｏｇｙ）』、第３７巻、第５２９乃至５４４頁（１９９１年）に記載のＯｋｕ等の方法に準じて、ラット盲腸内容物による環状四糖の発酵性を調べた。盲腸内容物は、ウィスター系雄ラットをエーテル麻酔下で屠殺し嫌気的に採取し、４倍量の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に懸濁したものを用いた。環状四糖は盲腸内容物重量当たり約７％を添加し、添加直後および１２時間後に残存する環状四糖量はガスクロマトグラフィー法で定量した。その結果、添加直後の環状四糖濃度は盲腸内容物ｇ当たり６８．０ｍｇ、１２時間後の環状四糖濃度は盲腸内容物ｇ当たり６３．０ｍｇであり、９３％が醗酵されず残存していることがわかり、環状四糖は極めて醗酵されにくい糖質であることが判明した。
【０１７１】
【実験３２】
＜資化性試験＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を用いて、『腸内フローラと食物因子』、光岡知足編、学会出版センター（１９８４年）に記載の方法に準じて、各種腸内細菌の資化性を調べた。即ち、予め培養しておいた新鮮な菌を、環状四糖を０．５％添加したＰＹＦ培地５ｍｌに約１０７ＣＦＵ接種し、嫌気条件下で３７℃、４日間培養した。対照として、資化されやすい糖質グルコースを用いて行なった。資化性の判定は、培養後の培養液のｐＨが、６．０以上の場合、資化されない（−）とし、６．０未満の場合、資化される（＋）とした。さらに、培養液中に残存する糖質をアンスロン法で測定し糖質の減少量を調べ、資化性の判定を確認した。結果を表３０に示す。
【０１７２】
【表３０】
【０１７３】
表３０の結果から明らかなように、環状四糖は、試験した腸内細菌株のいずれにも資化されなく、対照のグルコースはいずれにも資化されることがわかり、環状四糖が腸内細菌に極めて資化されにくい糖質であることが判明した。
【０１７４】
【実験３３】
＜急性毒性試験＞
マウスを使用して、実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を経口投与して急性毒性試験を行なった。その結果、環状四糖は低毒性の物質で、投与可能な最大投与量においても死亡例は認められなかった。従って、正確な値とはいえないが、そのＬＤ５０値は、５０ｇ／ｋｇマウス体重以上であった。
【０１７５】
以上の実験３０乃至３３の結果から、環状四糖は、経口摂取しても、消化、吸収されにくく、無カロリー乃至低カロリーの可食素材として、ダイエット甘味料、高甘味度甘味料の賦形剤、ダイエット飲食物の増粘剤、増量剤、賦形剤、更には、食物繊維、脂肪代替食品材料などとしての利用が期待できる。
【０１７６】
以下、本発明の環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物の製造方法を実施例Ａで、環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物を含有させた組成物を実施例Ｂで示す。
【０１７７】
【実施例Ａ−１】
バチルス グロビスポルス Ｃ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）を実験３の方法に準じて、ファーメンターで４８時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌濾過し、約１８ｌの培養濾液を回収し、更に、その濾液をＵＦ膜濃縮し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を８．８単位／ｍｌとα−イソマルトシル転移酵素を２６．７単位／ｍｌとを含む濃縮酵素液約１ｌを回収した。
【０１７８】
馬鈴薯澱粉乳を濃度約２％澱粉乳とし、これに最終濃度１ｍＭとなるように塩化カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整し、９５℃に約２０分間加熱して糊化を行い、次いで約３５℃に冷却し、これに前記方法で調製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮酵素液を澱粉固形物１グラム当り０．２５ｍｌの割合になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過し、以後、常法にしたがって精製（脱色、脱塩）し、濃縮して濃度５０％の環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約９０％で得た。本シラップをオートクレーブに入れ、ラネーニッケル６％を添加し、攪拌しながら温度を９０乃至１２０℃に上げ、水素圧を２０乃至１２０ｋｇ／ｃｍ2に上げて水素添加を完了させた後、ラネーニッケルを除去し、次いで、常法に従って、脱色、脱塩して精製し、濃縮して、濃度７０％のシラップを原料澱粉固形物当たり約８０％の収率で得た。
【０１７９】
本シラップは、環状四糖とともに糖アルコールを含有するＤＥ０．５未満の糖質混合物で、固形物当たり、環状四糖６２．１％、ソルビトール０．７％、イソマルチトール１．４％、マルチトール１１．１％およびその他の糖アルコールを２４．７％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、低カロリー甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１８０】
【実施例Ａ−２】
馬鈴薯澱粉を濃度約６％澱粉乳とし、これに濃度０．１％となるように炭酸カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整し、これにα−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉固形物グラム当り０．２％になるように加え、９５℃で１０分間反応させ、次いで１２０℃で２０分間オートクレーブし、更に約３５℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実施例Ａ−１の方法で調製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮液を澱粉固形物１グラム当り０．２５ｍｌの割合になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過して環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約９０％で得た。本シラップを実施例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精製し、濃縮し、以後、常法にしたがって精製（脱色、脱塩）し、濃縮して濃度７０％のシラップを原料澱粉固形物当たり約８０％の収率で得た。本シラップは、環状四糖とともに糖アルコールを含有するＤＥ０．５未満の糖質混合物で、固形物当たり、環状四糖６０．１％、ソルビトール０．９％、イソマルチトール１．５％、マルチトール１１．３％およびその他の糖アルコールを２６．２％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、低カロリー甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１８１】
【実施例Ａ−３】
バチルス グロビスポルス Ｃ１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）を実験６の方法に準じて、ファーメンターで４８時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌濾過し、約１８ｌの培養濾液を回収し、更に、その濾液をＵＦ膜濃縮し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を９．０単位／ｍｌとα−イソマルトシル転移酵素を３０．２単位／ｍｌとを含む濃縮酵素液約１ｌを回収した。タピオカ澱粉を濃度約２５％澱粉乳とし、これにα−アミラーゼ（商品名『ネオスピターゼ』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉固形物グラム当り０．２％加え、８５乃至９０℃で約２０分間反応させ、次いで１２０℃で２０分間オートクレーブし、更に約３５℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに上記の方法で調製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮酵素液を澱粉固形物１グラム当り０．２５ｍｌの割合になるように加え、更にシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラ−ゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉固形物１グラム当り１０単位になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（商品名『トランスグルコシダーゼ Ｌ「アマノ」』、天野製薬株式会社製）を固形物１グラム当たり３００単位加え、２４時間反応させ、更にグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物１グラム当たり３０単位加え、１７時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過し、以後、常法にしたがって精製（脱色、脱塩）し、濃縮して濃度５０％の環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約９０％で得た。本シラップを実施例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精製し、濃縮して、濃度７７％のシラップとし、これを助晶缶にとり、種晶として環状四糖５乃至６含水結晶及びソルビトール含水結晶をそれぞれ約２％ずつ加えて徐冷し、マスキットとし、これを乾燥搭上のノズルより１５０ｋｇ／ｃｍ２の高圧にて噴霧した。これと同時に８５℃の熱風を乾燥搭の上部より送風し、底部に設けた移送用金網コンベア上に結晶粉末を捕集し、コンベアの下より４５℃の温風を送りつつ、該粉末を乾燥搭外に徐々に移動させて、取り出した。この結晶粉末を熟成搭に充填して温風を送りつつ、１０時間熟成させ、結晶化と乾燥を完了し、環状四糖５乃至６含水結晶及びソルビトール含水結晶を含有する粉末を得た。本品は、環状四糖とともに糖アルコールを含有するＤＥ０．５未満の糖質混合物で、固形物当たり（無水物換算）、環状四糖５８．１％、ソルビトール３８．４％及びその他の糖アルコールを３．５％含有しており、温和な甘味、保湿性、包接性を有し、低カロリー甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１８２】
【実施例Ａ−４】
とうもろこし澱粉を濃度約２０％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム０．１％加え、ｐＨ６．５に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉固形物グラム当たり０．３％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約３５℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実施例Ａ−３の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮酵素液を澱粉固形物１グラム当り０．２５ｍｌの割合になるように加え、更にシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉固形物１グラム当り１０単位になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５で４８時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（商品名『トランスグルコシダーゼ Ｌ「アマノ』、天野製薬株式会社製造）を固形物１グラム当たり３００単位加え、２４時間反応させ、更にグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物１グラム当たり３０単位加え、１７時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過し、以後、常法にしたがって精製（脱色、脱塩）し、濃縮して濃度５０％の環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約９０％で得た。本シラップを実施例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精製し濃縮して、濃度８５％のシラップとし、これを助晶缶にとり、種晶として、環状四糖５乃至６含水結晶を約２％加え、攪拌しつつ徐冷して助晶し、これをプラスチック製バットに取り出し、室温で２日間放置し、晶出熟成させてブロックを調製した。次いで、本ブロックを切削機にて粉砕して環状四糖５乃至６含水結晶を含有する粉末を得た。本品は、環状四糖とともに澱粉糖アルコールを含有するＤＥ０．５未満の糖質混合物で、固形物当たり（無水物換算）、環状四糖６２．７％、ソルビトール３４．２％及びその他の糖アルコールを３．１％含有しており、温和な甘味、保湿性、包接性を有し、低カロリー甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１８３】
【実施例Ｂ−１】
＜甘味料＞
実施例Ａ−３の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末１重量部に、α−グリコシルステビオシド、東洋精糖株式会社販売『αＧスイート』０．０１重量部及びＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、味の素株式会社販売『アスパルテーム』０．０１重量部を均一に混合し、顆粒成型機にかけて、顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の約２倍の甘味度を有し、実質的に低カロリーである。本甘味料は、それに配合した高甘味度甘味物の分解もなく、安定性に優れており、低カロリー甘味料として、カロリー摂取を制限している肥満者、糖尿病者などのための低カロリー飲食物などに対する甘味付けに好適である。また、本甘味料は、虫歯誘発菌による酸の生成が少なく、不溶性グルカンの生成も少ないことより、虫歯を抑制する飲食物などに対する甘味付けにも好適である。
【０１８４】
【実施例Ｂ−２】
＜ハードキャンディー＞
濃度５５％蔗糖溶液１００重量部に実施例Ａ−１の方法で得た環状四糖とともに糖アルコールを含有するシラップ３０重量部を加熱混合し、次いで減圧下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン酸１重量部及び適量のレモン香料と着色料とを混和し、常法に従って成型し、製品を得た。本品は、歯切れ、呈味良好で、蔗糖の晶出、変形も起こらない高品質のハードキャンディーである。また、本品は、低カロリー、低う蝕性のハードキャンディーとしても好適である。
【０１８５】
【実施例Ｂ−３】
＜チョコレート＞
カカオペースト４０重量部、カカオバター１０重量部、蔗糖３０重量部、実施例Ａ−４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末２０重量部を混合してレファイナーに通して粒度を下げた後、コンチェに入れて５０℃で２昼夜練り上げた。この間に、レシチン０．５重量部を加え充分に混和分散させた。次いで、温度調節器で３１℃に調節し、バターの固まる直前に型に流し込み、振動機でアワ抜きを行い、１０℃の冷却トンネルを２０分間くぐらせて固化させた。これを型抜きして包装し製品を得た。本品は、吸湿性がなく、色、光沢共によく、内部組織も良好で、口中でなめらかに溶け、上品な甘味とまろやかな風味を有する。
【０１８６】
【実施例Ｂ−４】
＜チューインガム＞
ガムベース３重量部を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに蔗糖４重量部及び実施例Ａ−３の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末３重量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成形、包装して製品を得た。本品は、テクスチャー、風味とも良好なチューインガムである。また、本品は、低カロリー、低う蝕性のチューインガムとしても好適である。
【０１８７】
【実施例Ｂ−５】
＜加糖練乳＞
原乳１００重量部に実施例Ａ−２の方法で得た環状四糖とともに糖アルコールを含有するシラップ３重量部及び蔗糖１重量部を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して製品を得た。本品は、温和な甘味で、風味もよく、乳幼児食品、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に有利に利用できる。
【０１８８】
【実施例Ｂ−６】
＜乳酸菌飲料＞
脱脂粉乳１７５重量部、実施例Ａ−３の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末８０重量部及び特開平４−２８１７９５号公報で開示されているラクトスクロース高含有粉末５０重量部を水１，２００重量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスターターを３０重量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好な低カロリー乳酸菌飲料である。また、本品は、オリゴ糖を含有し、乳酸菌を安定に保持するだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用をも有する。
【０１８９】
【実施例Ｂ−７】
＜粉末ジュース＞
噴霧乾燥により製造したオレンジ果汁粉末３３重量部に対して、実施例Ａ−４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末５０重量部、蔗糖１０重量部、無水クエン酸０．６５重量部、リンゴ酸０．１重量部、Ｌ−アスコルビン酸０．１重量部、クエン酸ソーダ０．１重量部、プルラン０．５重量部、粉末香料適量をよく混合撹拌し、粉砕し微粉末にしてこれを流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃とし、これに、実施例Ａ−２の方法で得た環状四糖とともに糖アルコールを含有するシラップをバインダーとしてスプレーし、３０分間造粒し、計量、包装して製品を得た。本品は、果汁含有率約３０％の低カロリー粉末ジュースである。また、本品は異味、異臭がなく、長期に安定であった。
【０１９０】
【実施例Ｂ−８】
＜カスタードクリーム＞
コーンスターチ１００重量部、実施例Ａ−１の方法で得た環状四糖とともに糖アルコールを含有するシラップ１００重量部、マルトース８０重量部、蔗糖２０重量部及び食塩１重量部を充分に混合し、鶏卵２８０重量部を加えて撹拌し、これに沸騰した牛乳１，０００重量部を徐々に加え、更に、これを火にかけて撹拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、なめらかな光沢を有し、温和な甘味で美味である。
【０１９１】
【実施例Ｂ−９】
＜ういろうの素＞
米粉９０重量部に、コーンスターチ２０重量部、蔗糖４０重量部、実施例Ａ−３の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末８０重量部及びプルラン４重量部を均一に混合してういろうの素を製造した。ういろうの素と適量の抹茶と水とを混練し、これを容器に入れて６０分間蒸し上げて抹茶ういろうを製造した。本品は、照り、口当りも良好で、風味も良く、低カロリーである。また、澱粉の老化も抑制され、日持ちも良い。
【０１９２】
【実施例Ｂ−１０】
＜あん＞
原料あずき１０重量部に、常法に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きして、水溶性夾雑物を除去して、あずきつぶあん約２１重量部を得た。この生あんに、蔗糖１４重量部、実施例Ａ−２の方法で得た環状四糖とともに糖アルコールを含有するシラップ５重量部及び水４重量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダオイルを加えてつぶあんをこわさないように練り上げ、製品のあんを約３５重量部得た。本品は、色焼けもなく、舌ざわりもよく、風味良好で、あんパン、まんじゅう、だんご、もなか、氷菓などのあん材料として好適である。
【０１９３】
【実施例Ｂ−１１】
＜パン＞
小麦粉１００重量部、イースト２重量部、砂糖５重量部、実施例Ａ−４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末１重量部及び無機フード０．１重量部を、常法にしたがって、水でこね、中種を２６℃で２時間発酵させ、その後３０分間熟成し、焼き上げた。本品は、色相、すだちともに良好で適度な弾力、温和な甘味を有する高品質のパンである。
【０１９４】
【実施例Ｂ−１２】
＜ハム＞
豚もも肉１，０００重量部に食塩１５重量部及び硝酸カリウム３重量部を均一にすり込んで、冷室に１昼夜堆積する。これを水５００重量部、食塩１００重量部、硝酸カリウム３重量部、実施例Ａ−３の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末４０重量部及び香辛料からなる塩漬液に冷室で７日間漬け込み、次いで、常法に従い、冷水で洗浄し、ひもで巻き締め、燻煙し、クッキングし、冷却包装して製品を得た。本品は、色合いもよく、風味良好な高品質のハムである。
【０１９５】
【実施例Ｂ−１３】
＜粉末ペプチド＞
濃度４０％食品用大豆ペプチド溶液、不二製油株式会社製『ハイニュートＳ』１重量部に、実施例Ａ−４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末２重量部を混合し、プラスチック製バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを得た。本品は、風味良好で、プレミックス、冷菓などの製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管流動食などの離乳食、治療用栄養剤などとしても有利に利用できる。
【０１９６】
【実施例Ｂ−１４】
＜化粧用クリーム＞
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２重量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５重量部、実施例Ａ−３の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末２重量部、α−グリコシルルチン１重量部、流動パラフィン１重量部、トリオクタン酸グリセリル１０重量部及び防腐剤の適量を、常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２重量部、１，３−ブチレングリコール５重量部及び精製水６６重量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて撹拌混合しクリームを製造した。本品は、抗酸化性を有し、安定性が高く、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
【０１９７】
【実施例Ｂ−１５】
＜固体製剤＞
ヒト天然型インターフェロン−α標品（株式会社林原生物化学研究所製）を、常法に従って、固定化抗ヒトインターフェロン−α抗体カラムにかけ、該標品に含まれるヒト天然型インターフェロン−αを吸着させ、安定剤であるウシ血清アルブミンを素通りさせて除去し、次いで、ｐＨを変化させて、ヒト天然型インターフェロン−αを実施例Ａ−４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末を５％含有する生理食塩水を用いて溶出した。本液を精密濾過し、約２０倍量の株式会社林原商事販売無水結晶マルトース粉末『ファイントース』に加えて脱水、粉末化し、これを打錠機にて打錠し、１錠（約２００ｍｇ）当たりヒト天然型インターフェロン−αを約１５０単位含有する錠剤を得た。本品は、舌下錠などとして、一日当たり、大人１乃至１０錠程度が経口的に投与され、ウイルス性疾患、アレルギー性疾患、リューマチ、糖尿病、悪性腫瘍などの治療に有利に利用できる。とりわけ、近年、患者数の急増しているエイズ、肝炎などの治療剤として有利に利用できる。本品は、本発明の非還元性糖質と無水結晶マルトースが共に安定剤として作用し、室温で放置してもその活性を長期間よく維持する。
【０１９８】
【実施例Ｂ−１６】
＜糖衣錠＞
重量１５０ｍｇの素錠を芯剤とし、これに実施例Ａ−３の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末４０重量部、プルラン（平均分子量２０万）２重量部、水３０重量部、タルク２５重量部及び酸化チタン３重量部からなる下掛け液を用いて錠剤重量が約２３０ｍｇになるまで糖衣し、次いで、同じ環状四糖５乃至６含水結晶粉末６５重量部、プルラン１重量部及び水３４重量部からなる上掛け液を用いて、糖衣し、更に、ロウ液で艶出しして光沢の在る外観の優れた糖衣錠を得た。本品は、耐衝撃性にも優れており、高品質を長期間維持する。
【０１９９】
【実施例Ｂ−１７】
＜練歯磨＞
第２リン酸カルシウム４５．０重量部、プルラン２．９５重量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５重量部、グリセリン２０．０重量部、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート０．５重量部、防腐剤０．０５重量部、実施例Ａ−３の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末１２．０重量部、マルチトール５．０重量部及び水１３．０重量部を常法にしたがって混合し、練歯磨を得た。本品は、適度の甘味を有しており、特に子供用練歯磨として好適である。
【０２００】
【実施例Ｂ−１８】
＜流動食用固体製剤＞
実施例Ａ−４の方法で製造した環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末１００重量部、マルトース１含水結晶２００重量部、α，α−トレハロース２含水結晶２００重量部、粉末卵黄２７０重量部、脱脂粉乳２０９重量部、塩化ナトリウム４．４重量部、塩化カリウム１．８重量部、硫酸マグネシウム４重量部、チアミン０．０１重量部、アスコルビン酸ナトリウム０．１重量部、ビタミンＥアセテート０．６重量部及びニコチン酸アミド０．０４重量部からなる配合物を調製し、この配合物２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、１袋分を約１５０乃至３００ｍｌの水に溶解して流動食とし、経口的、又は鼻腔、胃、腸などへ経管的使用方法により利用され、生体への栄養補給用に有利に利用できる。
【０２０１】
【実施例Ｂ−１９】
＜外傷治療用膏薬＞
実施例Ａ−３の方法で製造した環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末２００重量部及びマルトース３００重量部に、ヨウ素３重量部を溶解したメタノール５０重量部を加え混合し、更に１０ｗ／ｖ％プルラン水溶液２００重量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、ヨウ素による殺菌作用によって治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。
【０２０２】
【発明の効果】
上記から明らかなように、本発明の環状四糖とともに澱粉糖アルコールを含有してなる糖質混合物は、実質的に非還元性で安定性に優れ、良質で上品な甘味を有している。したがって、本発明の糖質混合物は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。また、本発明の糖質混合物の製造に用いる原料用還元性糖質としては、パノースなどのα−イソマルトシルグルコ糖質含有溶液にα−イソマルトシル転移酵素を作用させるか、又は、澱粉を液化した溶液に、α−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとともに作用させることにより、環状四糖とともに還元性糖質を含有する糖質を得て、これを水素添加し、環状四糖を単離することなく、還元性糖質を対応する糖アルコールに変換させて還元性を低減させ、次いで精製することにより、比較的低分子、低粘度で取扱い容易なＤＥ０．５未満の実質的に非還元性糖質混合物を得る。このようにして得ることのできる本発明の糖質混合物は、例えば、低カロリー甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして広範囲な用途に利用できる。
【０２０３】
本発明の環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物とその製造方法の確立並びにその用途の提供は、安価で無限の資源である澱粉を原料として製造される、従来望むべくして容易に得られなかった環状四糖とともに還元性糖質を含有する糖質から工業的に大量かつ安価に提供できる全く新しい道を拓くこととなり、本発明の工業実施を極めて容易にする。したがって、本発明が与える影響は、食品、化粧品、医薬品業界は言うに及ばず、農水畜産業、化学工業にも及びこれら産業界に与える工業的意義は計り知れないものがある。
【０２０４】
【配列表】
【０２０５】
【図面の簡単な説明】
【図１】α−イソマルトシル転移酵素反応により得られた糖質を高速液体クロマトグラフィーにかけたときの溶出パタ−ンを示す図である。
【図２】α−イソマルトシル転移酵素反応により得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲスペクトル）を示す図である。
【図３】α−イソマルトシル転移酵素反応により得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル）を示す図である。
【図４】環状四糖の構造が、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝であることを示す図である。
【図５】バチルス グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図６】バチルス グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図７】バチルス グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図８】バチルス グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図９】バチルス グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１０】バチルス グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１１】バチルス グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
【図１２】バチルス グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１３】バチルス グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１４】バチルス グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１５】バチルス グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図１６】バチルス グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１７】バチルス グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１８】バチルス グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１９】バチルス グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
【図２０】バチルス グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図２１】α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトトリオースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２２】α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトテトラオースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２３】α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトトリオースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２４】α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトテトラオースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２５】５乃至６含水結晶環状四糖の顕微鏡写真をディスプレ−上に表示した中間調画像を示す図である。
【図２６】５乃至６含水結晶環状四糖状粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
【図２７】５乃至６含水結晶環状四糖状粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。
【図２８】本発明の１含水結晶環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
【図２９】本発明の１含水結晶環状四糖粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。
【図３０】５乃至６含水結晶環状四糖粉末を４０℃で真空乾燥して得られる無水結晶環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
【図３１】５乃至６含水結晶環状四糖粉末を１２０℃で真空乾燥して得られる無水結晶環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
【図３２】本発明の無水結晶環状四糖粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖質混合物とその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質（当該糖質を、その構造にちなんで、本明細書では、以後、環状四糖と称することもある。）とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物とその製造方法並びに用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルコースを構成糖とする非還元性糖質として、近年、新たな四糖類が報告された。即ち、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第２２６巻、６４１乃至６４８頁（１９９４年）には、主として４つのグルコース残基がα−１、３結合とα−１，６結合で交互に連なっているアルテルナン（ａｌｔｅｒｎａｎ）に加水分解酵素アルテルナナーゼ（ａｌｔｅｒｎａｎａｓｅ）を作用させることにより、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖が生成し、これを有機溶媒の一種であるメタノール共存下で晶出させることが示されている。
【０００３】
環状四糖は、環状構造を有することから、各種化合物を包接する能力を有するとともに、非還元性故に、アミノカルボニル反応を起こさず、褐変、劣化を懸念することなく各種用途に加工、利用できることが期待される。しかしながら、環状四糖の製造原料としてのアルテルナンや、環状四糖の製造に必要な酵素であるアルテルナナーゼの入手が困難である上、それらを産生する微生物も容易に入手できる状態になかった。
【０００４】
斯かる状況下、本発明者等は、先に特願２０００−２２９５５７号明細書で開示したように、パノースなどのα−イソマルトシルグルコ糖質から環状四糖を生成する新規な酵素であるα−イソマルトシル転移酵素を発見し、この新規酵素を利用して、澱粉原料から製造されるパノースなどのα−イソマルトシルグルコ糖質からの環状四糖の製造方法を確立した。さらに、本発明者等は、先に特願２０００−２３４９３７号明細書で開示したように、澱粉原料にα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素と前記α−イソマルトシル転移酵素を組み合わせて作用させることにより、安価な澱粉原料から、直接、環状四糖を効率よく製造する方法を確立した。
【０００５】
しかしながら、上記した環状四糖の製造方法では、澱粉原料を用いるため、環状四糖とともに、副生するグルコース、マルトース、イソマルトース、パノースなどの還元性糖質を含有する糖質となる。製造された環状四糖を含有する糖質は、環状四糖自体は非還元性であっても、共存する還元性糖質のために還元性を示す。このため、環状四糖を含有する製品を非還元性とするためには、幾多の精製工程を経て還元性糖質を除去し、高純度の環状四糖製品とする必要がある。
【０００６】
澱粉を原料として製造される澱粉部分分解物、例えば、澱粉液化物、各種デキストリン、各種マルトオリゴ糖などは、通常、その分子の末端に還元基を有し還元性を示す糖質（以下、本明細書では、本還元性糖質を還元性澱粉糖と称することもある。）であることが知られている。一般に、還元性澱粉糖は、固形物当りの還元力の大きさをデキストロース・エクイバレント（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ，ＤＥ）として表している。この値の大きいものは、例えば、加工食品などに用いた場合、通常、分子が小さく低粘度で、甘味が強いものの、反応性が強く、アミノ酸や蛋白質などのアミノ基を持つ物質とアミノカルボニル反応を起こし易く、褐変し、悪臭を発生して、品質を劣化し易い性質のあることが知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、環状四糖と還元性糖質とを含有してなる糖質の欠点を解消するためのものであって、環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる還元性を低減させた糖質混合物、及び、その製造方法を確立し、併せて、この還元性を低減させた糖質混合物の用途を提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、前記課題を解決するために、環状四糖とともに還元性糖質を含有する糖質の還元性を低減させる方法に着目し、種々研究を続けてきた。その結果、該糖質を水素添加して還元性を低減させることにより、非還元性糖質である環状四糖に悪影響を与えること無く、還元性糖質が対応する糖アルコールに変換され、環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物となり、その後の精製工程も容易であって前記課題を解決できることを見いだし、本発明を完成した。
【０００９】
【発明の実施の形態】
まず、本発明で用いる環状四糖生成酵素としては、パノース若しくはイソマルトシルマルトースのようなα−イソマルトシルグルコ糖質から環状四糖を生成する酵素であるα−イソマルトシル転移酵素、及び澱粉からα−イソマルトシルグルコ糖質を生成する酵素であるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素があげられる。これら酵素としては、例えば、特願２０００−２２９５５７号明細書および特願２０００−２３４９３７号明細書で開示されるバチルス グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）、バチルス グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）など由来のα−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素が好適に用いられる。
【００１０】
本発明で使用される澱粉は、とうもろこし澱粉、米澱粉、小麦澱粉などの地上澱粉であっても、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、タピオカ澱粉などの地下澱粉であってもよい。澱粉を液化するには、通常、澱粉を水に懸濁した澱粉乳、望ましくは濃度１０ｗ／ｗ％（以下、本明細書では、特にことわらない限り、ｗ／ｗ％を％と略称する。）以上、更に望ましくは約２０乃至５０％とし、これを加熱して機械的に液化しても、酸又は酵素で液化してもよい。液化の程度は、比較的低いＤＥ２０未満のものが適しており、望ましくはＤＥ１５未満、更に望ましくはＤＥ１０未満のものが好適である。酸で液化する場合には、例えば、塩酸、燐酸、蓚酸などで液化し、その後、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、炭酸ナトリウムなどで必要ｐＨに中和して利用すればよい。酵素で液化する場合には、α−アミラーゼ、とりわけ、耐熱性の液化型α−アミラーゼの使用が適している。
【００１１】
このようにして得られる澱粉を液化した溶液に、α−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとともに作用させるには、これら酵素が作用しうるｐＨ、温度で行えばよく、通常、ｐＨ４乃至１０、好ましくは、ｐＨ５乃至８、温度約１０乃至８０℃、好ましくは、約３０乃至７０℃で行われる。また、澱粉を液化した溶液にこれら酵素を加える順序は問わず、いずれかの酵素を先に加え、他の酵素をその後に加えて作用させることも、また、これら酵素を同時に加えて作用させることも随意である。
【００１２】
酵素の使用量は、作用条件、反応時間によって適宜選べばよく、通常、基質である液化澱粉に対して、固形物グラム当たり、α−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の場合、それぞれ約０．０１乃至１００単位から選ばれ、また、澱粉枝切酵素の場合、約１乃至１０，０００単位から選ばれ、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの場合、約０．０５乃至５００単位から選ばれる。このようにして得られる非還元性の環状四糖とともに還元性を示すグルコース、マルトース、イソマルトース、パノースなどの澱粉糖を含む還元性糖質は、本発明の原料用還元性糖質として有利に利用できる。
【００１３】
反応液は、常法により、濾過、遠心分離などして不溶物を除去した後、活性炭で脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂で脱塩して精製し、濃縮し、シラップ状製品とする。更に、乾燥して粉末状製品にすることも随意である。必要ならば、更に、精製、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコール及びアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離などの方法を１種又は２種以上組み合わせて精製することにより、非還元性の環状四糖含量を高め、かつ残存する還元性澱粉糖含量を低減させた糖質混合物も、また、逆に、還元性澱粉糖含量を高め、かつ残存する非還元性の環状四糖を低減させた糖質も、何れも本発明の原料用還元性糖質として有利に利用できる。
【００１４】
とりわけ、工業的大量生産方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーの採用が好適であり、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより夾雑糖類を除去して、原料用還元性糖質を製造することも有利に実施できる。この際、固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。このようにして得られる原料用還元性糖質は、環状四糖と還元性糖質との重量比で、通常、１：９９乃至９９：１、望ましくは１０：９０乃至９０：１０の範囲にある。
【００１５】
このようにして得られる環状四糖とともに還元性糖質を含む糖質を水素添加するには、環状四糖を分解することなく、これに含まれる還元性糖質が対応する糖アルコールに還元されればよく、例えば、原料の糖質の濃度を約３０乃至７０％水溶液にし、オートクレーブに入れ、触媒として、糖質固形物当り、ラネーニッケルを約４乃至１０％を添加し、攪拌しながら温度を９０乃至１５０℃に上げて水素添加を完了、望ましくは、実質的に非還元性となるＤＥを０．５未満に低減させるまで水素添加を行い、次いでラネーニッケルを除去し、更に、常法に従って、活性炭による脱色、イオン交換樹脂による脱塩などの精製工程を経た後、濃縮し、シラップ状製品にすることも、また、シラップを乾燥させて非晶質粉末状製品にすることも、更に、シラップを晶出させマスキットとし、これを粉末化して結晶含有粉末製品にすることも随意である。このようにして製造される還元性を低減させた糖質混合物は、環状四糖に加えて、ソルビトール、マルチトール、イソマルチトール及びパニトールから選ばれる１種又は２種以上の糖アルコールを含有している。本発明の環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物は、その特徴をさらに引き出すために、環状四糖と糖アルコールとの重量比で、望ましくは１：９９乃至９９：１、更に望ましくは１０：９０乃至９０：１０の範囲が好適である。
【００１６】
本発明の環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物（以下、本明細書では、当該混合物を本発明の糖質混合物と称することもある。）は、ＤＥ０．５未満と還元性が極めて低く安定であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸を有する物質と混合しても、褐変することも、異臭を発生することもなく、混合した他の素材を損なうことも少ない。また、還元力が低いにもかかわらず低粘度であり、良質で上品な甘味を有している。また、経口摂取により、主成分の環状四糖のみならずマルチトール、イソマルチトール及びパニトールなどのオリゴ糖アルコールは比較的消化吸収されにくく低カロリー甘味料として利用される。また、本発明の糖質混合物は虫歯誘発菌などによって、醗酵されにくく、虫歯を起こしにくい甘味料としても利用できる。
【００１７】
また、本発明の糖質混合物は、安定な甘味料であることにより、結晶高含有製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤の糖衣剤として利用することも有利に実施できる。また、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、他の糖の晶出防止性、難醗酵性、糊化澱粉の老化防止性などの性質を具備している。
【００１８】
また、本発明の糖質混合物は、甘味料、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、飲食物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
【００１９】
また、本発明の糖質混合物は、そのまま甘味付けのための調味料として使用することができる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、マルトース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メープルシュガー、イソマルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ラクトスクロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、パラチニット、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、レバウディオシド、α−グリコシルレバウディオシド、グリチルリチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、スクラロース、アセスルファムＫ、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料の１種又は２種以上の適量と混合して使用してもよく、また必要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。
【００２０】
また、本発明の環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物、とりわけ、粉末状製品は、そのままで、又は必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成型して使用することも随意である。
【００２１】
また、本発明の環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付け、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【００２２】
例えば、アミノ酸、ペプチド類、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、核酸系調味料、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調味料として有利に使用できる。
【００２３】
また、例えば、せんべい、あられ、おこし、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、キャンディーなどの洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプレッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素類、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しなどの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻などの惣菜食品、ヨーグルト、チーズなどの乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、清酒、合成酒、リキュール、洋酒などの酒類、コーヒー、紅茶、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付けに、呈味改良に、また、品質改良などに有利に利用できる。
【００２４】
また、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のために飼料、餌料などの嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、又は呈味改良剤、矯味剤として、さらには品質改良剤、安定剤などとして有利に利用できる。
【００２５】
品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性などを失い易い各種生理活性物質又はこれを含む健康食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、ツモア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌、ローヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペースト状又は固状の健康食品や医薬品などに容易に製造できることとなる。
【００２６】
以上述べたような各種組成物に本発明の環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物を含有させる方法は、その製品が完成するまでの工程に含有させればよく、例えば、混和、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶出、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常０．１％以上、望ましくは１％以上含有させるのが好適である。
【００２７】
次に実験により本発明をさらに具体的に説明する。
【００２８】
【実験１】
＜培養物からの環状四糖の調製＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１』、松谷化学株式会社製造）５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』、アサヒビール株式会社製造）１．５ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地１００ｍｌを、５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス グロビスポルス Ｃ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養した後、遠心分離して菌体を除き培養上清を得た。さらに、その培養上清をオートクレーブ（１２０℃、１５分間）し、放冷した後、不溶物を遠心分離して除き上清を回収した。
【００２９】
得られた上清中の糖質を調べるため、展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル６０』（アルミプレート、２０×２０ｃｍ）を用い２回展開するシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」と略す。）を行ない、上清中の糖質を分離した。検出法として、分離した全糖質を硫酸−メタノール法で発色し、また、還元糖質をジフェニルアミン−アニリン法で発色して調べたところ、Ｒｆ値が約０．３１の位置に硫酸−メタノール法で陽性、かつ、ジフェニルアミン−アニリン法で陰性の非還元性糖質が検出された。
【００３０】
先に得た上清約９０ｍｌをｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野製薬株式会社製造）を固形物１グラム当り１，５００単位とグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）を固形物１グラム当り７５単位添加して２４時間処理し、続いて、水酸化ナトリウムでｐＨを１２に調整し２時間煮沸して、残存する還元糖を分解した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤアイオンＰＫ２１８』と『ダイヤイオンＷＡ３０』を用いて脱色、脱塩し、さらに、三菱化学製カチオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』とオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』で再度脱塩し、活性炭で脱色し、精密濾過した後、エバポレータで濃縮し凍結真空乾燥して固形物として約０．６ｇの糖質粉末を得た。
【００３１】
得られた糖質の組成を高速液体クロマトグラフィー法（以下、ＨＰＬＣと略称する。）で調べたところ、図１に示すように、溶出時間１０．８４分に単一ピークのみが検出され、純度は９９．９％以上で極めて高純度であることが判明した。なお、ＨＰＬＣは、『ショウデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）ＫＳ−８０１カラム』（昭和電工株式会社製造）を用いカラム温度６０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ水の条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー株式会社製造）を用いて行なった。
【００３２】
また、還元力をソモギ−・ネルソン法で測定したところ、その還元力は検出限界以下であり、本標品は実質的に非還元性糖質であると判断される。
【００３３】
【実験２】
＜非還元性糖質の構造解析＞
実験１の方法で得られた非還元性糖質について、高速原子衝撃法による質量分析（通称「ＦＡＢ−ＭＳ」）したところ、質量数６４９のプロトン付加分子イオンが顕著に検出され、本糖質の質量数が６４８であることが判明した。
【００３４】
また、常法に従って、硫酸を用い加水分解し、ガスクロマトグラフィー法で構成糖を調べたところ、Ｄ−グルコースのみが検出され、本糖質の構成糖はＤ−グルコースであることも判明し、質量数を考慮すると、本糖質はＤ−グルコース４分子からなる環状糖質であることがわかった。
【００３５】
さらに、本糖質を用いて核磁気共鳴法（通称ＮＭＲ）を行ったところ、図２に示す１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと、図３に示す１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが得られ、これらスペクトルを既知糖質のものと異同を比較したところ、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、６４１乃至６４８頁（１９９４年）に記載されている非還元性環状糖質サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝のスペクトルと一致し、本糖質の構造が図４に示す環状四糖、即ち、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝であることが判明した。
【００３６】
【実験３】
＜バチルス グロビスポルス Ｃ９からのα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の生産＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学株式会社製造）４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』（アサヒビール株式会社製造）１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス グロビスポルス Ｃ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００３７】
容量３０ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．４５単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．５単位／ｍｌで、環状四糖生成活性は約０．９５単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は約０．４５単位／ｍｌの活性（総活性約８，１１０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素は約１．５単位／ｍｌの活性（総活性約２６，９００単位）で、環状四糖生成活性は約０．９５単位／ｍｌ（総活性約１７，１００単位）であった。
【００３８】
なお、酵素活性は次のようにして測定した。即ち、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性の測定は、マルトトリオースを濃度２ｗ／ｖ％となるよう１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で６０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に主に生成するイソマルトシルマルトースとマルトースのうち、このマルトース量を、実験１に記載のＨＰＬＣ法で定量することによって行った。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのマルトースを生成する酵素量とした。
【００３９】
また、α−イソマルトシル転移酵素活性の測定は、パノースを濃度２ｗ／ｖ％となるよう１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で３０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に主に生成する環状四糖とグルコースのうち、このグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量することによって行った。α−イソマルトシル転移酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのグルコースを生成する酵素量とした。
【００４０】
環状四糖生成活性の測定は、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社製造）を濃度２ｗ／ｖ％となるよう５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で６０分間酵素反応し、その反応液を１００℃で１０分間熱処理して反応を停止させた後、更に、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野製薬製造）７０単位／ｍｌとグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）２７単位／ｍｌとを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１ｍｌを加えて、５０℃で６０分間処理し、その液を１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた後、環状四糖量を実験１に記載のＨＰＬＣ法で定量することによって行った。環状四糖生成活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルの環状四糖を生成する酵素量とした。
【００４１】
【実験４】
＜バチルス グロビスポルス Ｃ９由来酵素の調製＞
【実験４−１】
＜バチルス グロビスポルス Ｃ９由来酵素の精製＞
実験３で得られた培養上清約１８ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４００ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を８，１１０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を２４，７００単位、環状四糖生成活性を約１５，６００単位有していた。この粗酵素液を三菱化学株式会社製『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量１，０００ｍｌ）に供した。この際、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性、α−イソマルトシル転移酵素活性および環状四糖生成活性のいずれも、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この酵素液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不純物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエント、更に続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とは分離して溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性は硫安のリニアグラジエントでその濃度が約０Ｍ付近に溶出し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジエントでその濃度が約３０ｍＭ付近に溶出した。そこで、α−イソマルトシル転移酵素活性画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分とを別々に集め回収した。また、環状四糖生成活性は本カラムクロマトグラフィーのいずれの画分にも認められないことがわかり、また、得られたα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とα−イソマルトシル転移酵素画分とを混合した酵素液は環状四糖生成活性を示すこともわかり、澱粉部分分解物から環状四糖を生成する活性はα−イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素との両酵素活性の共同作用によって発揮されることが判明した。
【００４２】
以下、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを別々に精製する方法について述べる。
【００４３】
【実験４−２】
＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製＞
実験４−１で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表１に示す。
【００４４】
【表１】
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
【００４６】
【実験４−３】
＜α−イソマルトシル転移酵素の精製＞
実験４−１に記載のアフィニティークロマトグラフィーによってα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分と分離したα−イソマルトシル転移酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表２に示す。
【００４７】
【表２】
【実験５】
＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素の性質＞
【実験５−１】
＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質＞
実験４−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１４０，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００４９】
精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．２±０．５であった。
【００５０】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。なお、温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を図５（温度の影響）、図６（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で約４０℃（Ｃａ２＋非存在）、約４５℃（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）、至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０乃至６．５であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）をＣａ２＋非存在下または１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図７（温度安定性）、図８（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約３５℃まで（Ｃａ２＋非存在）、約４０℃まで（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）で、ｐＨ安定性は約４．５乃至９．０であった。
【００５１】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表３に示す。
【００５２】
【表３】
表３の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、ＥＤＴＡで著しく阻害され、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋で阻害された。Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋で活性化されることも判明した。
【００５４】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー モデル４７３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。
【００５５】
【実験５−２】
＜α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験４−３の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１１２，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００５６】
精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．５±０．５であった。
【００５７】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を図９（温度の影響）、図１０（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約４５℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１１（温度安定性）、図１２（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃までで、ｐＨ安定性は約４．０乃至９．０であった。
【００５８】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表４に示す。
【００５９】
【表４】
表４の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋で著しく阻害され、Ｃｕ２＋で阻害された。また、Ｃａ２＋で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないこともわかった。
【００６１】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列のイソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリン−アスパラギン−グリシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。
【００６２】
【実験６】
＜バチルス グロビスポルス Ｃ１１からのα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の生産＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス グロビスポルス Ｃ１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００６３】
容量３０ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中の本酵素活性は約０．５５単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．８単位／ｍｌで、環状四糖生成活性は約１．１単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は約０．５１単位／ｍｌの活性（総活性約９、１８０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素は約１．７単位／ｍｌの活性（総活性約３０，４００単位）で、環状四糖生成活性は約１．１単位／ｍｌ（総活性約１９，４００単位）であった。
【００６４】
【実験７】
＜バチルス グロビスポルス Ｃ１１由来酵素の調製＞
【実験７−１】
＜バチルス グロビスポルス Ｃ１１由来酵素の精製＞
実験６で得られた培養上清約１８ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４１６ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を８，４４０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を約２８，０００単位、環状四糖生成活性を約１７，７００単位有することが判明した。この粗酵素液を、実験４−１に記載の『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィーに供した。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性、α−イソマルトシル転移酵素活性、環状四糖生成活性のいずれも、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この酵素液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエント、更に続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭのリニアグラジエントで溶出させたところ、α‐イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は分離して溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性は硫安のリニアグラジエントでその濃度が約０．３Ｍ付近で溶出し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジエントでその濃度が約３０ｍＭ付近で溶出した。そこで、α−イソマルトシル転移酵素活性画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とを別々に集め回収した。実験４に記載のＣ９株の場合と同様に、環状四糖生成活性は本カラムクロマトグラフィーのいずれの画分にも認められないことがわかり、また、得られたα−イソマルトシル転移酵素画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分とを混合した酵素液は環状四糖生成活性を示すこともわかり、澱粉部分分解物から環状四糖を生成する活性はα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との両酵素活性の共同作用によって発揮されることが判明した。
【００６５】
以下、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを別々に精製する方法について述べる。
【００６６】
【実験７−２】
＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製＞
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチルートヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表５に示す。
【００６７】
【表５】
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
【００６９】
【実験７−３】
＜α−イソマルトシル転移酵素の精製＞
実験７−１に記載のアフィニティークロマトグラフィーによってα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素画分と分離したα−イソマルトシル転移酵素画分を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表６に示す。
【００７０】
【表６】
【実験８】
＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素の性質＞
【実験８−１】
＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質＞
実験７−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１３７，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００７２】
精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．２±０．５であった。
【００７３】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。なお、温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を図１３（温度の影響）、図１４（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で約４５℃（Ｃａ２＋非存在）、約５０℃（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）、至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）をＣａ２＋非存在下または１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１５（温度安定性）、図１６（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃まで（Ｃａ２＋非存在）、約４５℃まで（Ｃａ２＋１ｍＭ存在）で、ｐＨ安定性は約５．０乃至１０．０であった。
【００７４】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表７に示す。
【００７５】
【表７】
表７の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、ＥＤＴＡで著しく阻害され、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋で阻害された。Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋で活性化されることも判明した。
【００７７】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列Ｎ末端チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。
【００７８】
このＮ末端アミノ酸配列結果を実験５−１のバチルス・グロビシポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のＮ末端配列と比較すると同一であることが判明し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の共通するＮ末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシンのＮ末端アミノ酸配列であることが判明した。
【００７９】
【実験８−２】
＜α−イソマルトシル転移酵素の性質＞
実験７−３の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約１０２，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００８０】
精製α−イソマルトシル転移酵素標品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約５．６±０．５であった。
【００８１】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を図１７（温度の影響）、図１８（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で約５０℃、至適ｐＨは、３５℃、３０分間反応で約５．５乃至６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１９（温度安定性）、図２０（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約４０℃までで、ｐＨ安定性は約４．５乃至９．０であった。
【００８２】
本酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表８に示す。
【００８３】
【表８】
表８の結果から明らかなように、本酵素活性は、Ｈｇ２＋で著しく阻害され、Ｃｕ２＋で阻害された。また、Ｃａ２＋で活性化されないことも、ＥＤＴＡで阻害されないこともわかった。
【００８５】
本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列のイソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリン−チロシン−グリシンのＮ末端アミノ酸配列を有していることがわかった。このＮ末端アミノ酸配列結果を実験５−２のバチルス グロビスポルス Ｃ９由来のα−イソマルトシル転移酵素のＮ末端配列と比較して、α−イソマルトシル転移酵素の共通するＮ末端アミノ酸配列は、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列のイソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−バリン−チロシン−ヒスチジン−アラニン−プロリンのＮ末端アミノ酸配列であることが判明した。
【００８６】
【実験９】
＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のアミノ酸配列＞
【実験９−１】
＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の内部部分アミノ酸配列＞
実験７−２の方法で得られた精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのトリプシン（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。マイクロボンダパックＣ１８カラム（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ社製）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４０％アセトニトリル溶液の１２０分間のリニアグラジエントの条件で行なった。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した３ペプチド［Ｐ６４（保持時間約６４分）、Ｐ８８（保持時間約８８分）、Ｐ９９（保持時間約９９分）］を分取し、それぞれを真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した。それらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ８残基までアミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号５乃至７に示すアミノ酸配列が得られた。得られた内部部分アミノ酸配列を表９に示す。
【００８７】
【表９】
【実験９−２】
＜α−イソマルトシル転移酵素の内部部分アミノ酸配列＞
実験７−３の方法で得られた精製α−イソマルトシル転移酵素標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのリジルエンドぺプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。マイクロボンダパックＣ１８カラム（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ社製）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４０％アセトニトリル溶液の１２０分間のリニアグラジエントの条件で行なった。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した３ペプチド［Ｐ２２（保持時間約２２分）、Ｐ６３（保持時間約６３分）、Ｐ７１（保持時間約７１分）］を分取し、それぞれを真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した。それらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ８残基までアミノ酸配列を分析したところ、配列表における配列番号８乃至１０に示すアミノ酸配列が得られた。得られた内部部分アミノ酸配列を表１０に示す。
【００８９】
【表１０】
【実験１０】
＜各種糖質への作用＞
各種糖質を用いて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の基質になりうるかどうかの試験をした。マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース、イソパノース、α，α−トレハロース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、マルトトリイトール、ラクトース、スクロース、エルロース、セラギノース、マルトシルグルコシド、イソマルトシルグルコシドを含む溶液を調製した。
【００９１】
これらの溶液に、実験４−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品、または実験７−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を基質固形物１グラム当たりそれぞれ２単位ずつ加え、基質濃度を２ｗ／ｖ％になるように調整し、これを３０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させた。酵素反応前後の反応液を、実験１記載のＴＬＣ法で分析し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無を確認した。結果を表１１に示す。
【００９２】
【表１１】
表１１の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、試験した多種の糖質のうち、グルコース重合度３以上で、非還元末端にマルトース構造を有する糖質によく作用することが判明した。また、グルコース重合度が２の糖質では、マルトース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、マルトトリイトール、エルロースにも僅かに作用することが判明した。
【００９４】
【実験１１】
＜マルトオリゴ糖からの生成物＞
【実験１１−１】
＜生成物の調製＞
濃度１％のマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースのそれぞれ水溶液に実験７−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を、それぞれ固形物１グラム当たり２単位（マルトースおよびマルトトリオース）、０．２単位（マルトテトラオース）、０．１単位（マルトペンタオース）加え、３５℃、ｐＨ６．０で８時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成を、ＨＰＬＣ法を用いて測定した。ＨＰＬＣは、『ＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ３０３』カラム（株式会社ワイ・エム・シー製造）を用いカラム温度４０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ水の条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー株式会社製造）を用いて行なった。その結果を表１２に示す。
【００９５】
【表１２】
表１２の結果から明らかなように、本酵素の作用の結果、基質マルトースからは、主にグルコースとα−イソマルトシルグルコース（別名、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース、パノース）とが生成し、基質マルトトリオースからは、主にマルトースとα−イソマルトシルグルコース（別名、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース）とが生成し、少量ながらグルコース、マルトテトラオース、α−イソマルトシルグルコース（別名、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース、パノース）、生成物Ｘが生成することが判明した。基質マルトテトラオースからは、主にマルトトリオースと生成物Ｘとが生成し、少量ながらマルトース、マルトペンタオース、α−イソマルトシルグルコース（別名、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース）、生成物Ｙが生成することが判明した。基質マルトペンタオースからは、主にマルトテトラオースと生成物Ｙとが生成し、少量ながらマルトトリオース、マルトヘキサオース、生成物Ｘ、生成物Ｚが生成することが判明した。
【００９７】
基質マルトテトラオースからの主生成物である生成物Ｘ、並びに基質マルトペンタオースからの主生成物である生成物Ｙの単離・精製を行った。分取用ＨＰＬＣカラム『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ Ｒ３５５−１５Ｓ−１５ １２Ａ』（株式会社ワイエムシイ製）を用いて精製し、上記のマルトテトラオースからの反応物、マルトペンタオースからの反応物それぞれから、純度９９．９％以上の生成物Ｘ標品を固形物収率約８．３％で、純度９９．９％以上の生成物Ｙを固形物収率約１１．５％で単離した。
【００９８】
【実験１１−２】
＜生成物の構造解析＞
実験１１−１の方法で得た生成物Ｘ標品および生成物Ｙ標品を用いて、常法に従ってメチル化分析とＮＭＲ分析を行なった。メチル化分析の結果は表１３にまとめた。ＮＭＲ分析の結果については、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２１（生成物Ｘ）、図２２（生成物Ｙ）に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルおよび帰属を図２３（生成物Ｘ）、図２４（生成物Ｙ）、表１４にまとめた。
【００９９】
【表１３】
これらの結果から、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素によるマルトテトラオースからの生成物Ｘは、マルトテトラオースの非還元末端グルコースの６位水酸基にグルコース基がα結合した５糖で、構造式１で表わされるα−イソマルトシルマルトトリオース（別名、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース）であることが判明した。
【０１０１】
構造式１：
αＤ−Ｇｌｃｐ（１→６）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）Ｄ−Ｇｌｃｐ
【０１０２】
また、マルトペンタオースからの生成物Ｙは、マルトペンタオースの非還元末端グルコースの６位水酸基にグルコシル基がα結合した６糖で、構造式２で表わされるα−イソマルトシルマルトテトラオース（別名、６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオース）であることが判明した。
【０１０３】
構造式２：
αＤ−Ｇｌｃｐ（１→６）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）αＤ−Ｇｌｃｐ（１→４）Ｄ−Ｇｌｃｐ
【０１０４】
【表１４】
以上のことから、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のマルトオリゴ糖に対する作用は以下のように判断された。
【０１０６】
（１） 本酵素は、基質として、α−１，４結合からなるグルコース重合度が２以上のマルトオリゴ糖に作用し、その非還元性末端のグルコシル残基を他の分子の非還元性末端のグルコシル残基の６位に転移する作用を有する分子間の６−グルコシル転移を触媒して、非還元末端に６−Ｏ−α−グルコシル基を有するグルコース重合度が１増加したα−イソマルトシルグルコ糖質（別名、６−Ｏ−α−グルコシルマルトオリゴ糖）と、グルコース重合度が１減じたマルトオリゴ糖とを生成する。
（２） 本酵素は、４−グルコシル転移も僅かに触媒し、マルトオリゴ糖から、グルコース重合度が１増加したマルトオリゴ糖と、グルコース重合度が１減じたマルトオリゴ糖とを僅かに生成する。
【０１０７】
【実験１２】
＜還元力生成試験＞
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素が還元力生成能を有するかどうかを調べるため、以下の試験を行った。濃度１％のマルトテトラオース水溶液に実験４−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素および実験７−２の方法で得たバチルス グロビスポルスＣ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を、基質固形物１グラム当たり０．２５単位加え、３５℃、ｐＨ６．０で作用させ、その反応液の一部を経時的に採り、１００℃で１０分間保持して反応を停止し、反応液の還元力を測定した。即ち、その酵素反応前後の溶液の還元糖量をソモギ−・ネルソン法で測定し、また、同時にその酵素反応前後の溶液の全糖量をアントロン硫酸法で測定し、還元力生成率（％）は以下の計算式を用いて算出した。
【０１０８】
【数１】
計算式：
結果を表１５に示す。
【０１１０】
【表１５】
表１５の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、マルトテトラオースを基質として作用させると、反応物の還元力を実質的に増加しないこと、即ち、当該α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は加水分解作用を示さないか若しくは検出できないほど僅かなものであることが判明した。
【０１１２】
【実験１３】
＜デキストラン生成試験＞
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素がデキストラン生成作用を有するかどうかを調べるため、『バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第５６巻、１６９乃至１７３（１９９２年）に記載の方法に準じて試験を行った。濃度１％のマルトテトラオース水溶液に実験４−２の方法で得たＣ９株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素および実験７−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を、基質固形物１グラム当たり０．２５単位加え、３５℃、ｐＨ６．０で４時間および８時間作用させた後、１００℃で１５分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の５０μｌを遠心管に入れ、それに３倍量のエタノールを加え十分に攪拌した後、４℃で３０分間静置した。次いで、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分間）し、その上清を除去した後、１ｍｌの７５ｗ／ｗ％のエタノールを加え攪拌して洗浄した。再度、遠心分離してその上清を除き、真空乾燥した後、１ｍｌの脱イオン水を加え十分に攪拌した。その液中の全糖量（グルコース換算）をフェノール硫酸法で測定し、試験の全糖量とした。反応のブランクとして、１００℃で１０分間熱処理し失活させたバチルス グロビスポルス Ｃ９由来またはバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を用いて同様に行い、ブランクの全糖量とした。デキストラン生成量は以下の計算式で計算した。
【０１１３】
計算式：
デキストラン生成量（ｍｇ／ｍｌ）＝［（試験の全糖量）−（ブランクの全糖量）］×２０
【０１１４】
結果を表１６に示す。
【０１１５】
【表１６】
表１６の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素をマルトテトラオースに作用させてもデキストランを生成しないこと、つまり、当該α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、デキストラン生成作用を実質的に有さないか、その生成量は検出限界以下であることが判明した。
【０１１７】
【実験１４】
＜転移受容体特異性＞
各種糖質を用いて、本酵素の転移受容体になりうるかどうかの試験をした。Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−フコース、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ラムノース、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、ソルビトール、α，α−トレハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、ラクトース、スクロース、α−サイクロデキストリン、β−サイクロデキストリン、γ−サイクロデキストリンの溶液を調製した。
【０１１８】
これらの受容体溶液（濃度１．６％）に、糖供与体として澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』（濃度４％）を加え、実験４−２の方法で得たバチルスグロビスポルス Ｃ９由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品または実験７−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を糖供与体固形物１グラム当たりそれぞれ１単位ずつ加え、これを３０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させた。酵素反応後の反応液を、受容体が単糖または二糖の場合はガスクロマトグラフィー法（以下、「ＧＬＣ法」と略する。）で、受容体が三糖以上の場合はＨＰＬＣ法で分析し、それぞれの糖質が本酵素の転移受容体になるかを確認した。なお、ＧＬＣに於いて、ＧＬＣ装置は『ＧＣ−１６Ａ』（株式会社島津製作所製）、カラムはジー・エル・サイエンス株式会社製『２％シリコンＯＶ−１７／クロモゾルブＷ』を充填したステンレス製カラム（３ｍｍφ×２ｍ）、キャリアーガスは窒素ガスを流量４０ｍｌ／分で１６０℃から３２０℃まで７．５℃／分の速度で昇温し、検出は水素炎イオン検出器で分析した。ＨＰＬＣでは、ＨＰＬＣの装置は東ソー株式会社製『ＣＣＰＤ』、カラムは『ＯＤＳ−ＡＱ−３０３』（株式会社ワイエムシィー社製）、溶離液は水を流速０．５ｍｌ／分で、検出は示差屈折形で分析した。結果を表１７に示す。
【０１１９】
【表１７】
表１７の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、転移受容体として種々の糖質が利用でき、特に、Ｄ−／Ｌ−キシロース、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、α，α−トレハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、ラクトースおよびスクロースによく転移し、次いで、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−フコース、Ｌ−ソルボ−スおよびＮ−アセチルグルコサミンに転移し、更には、Ｄ−アラビノースにも転移することが判明した。
【０１２１】
以上に述べたα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の性質について、先に報告されている６−グルコシル転移作用を有する酵素、『バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第５６巻、第１６９乃至１７３頁（１９９２年）に記載のデキストリン・デキストラナ−ゼおよび『日本農芸化学会誌』、第３７巻、第６６８乃至６７２頁（１９６３年）に記載のトランスグルコシダーゼと比較した。その結果を表１８にまとめた。
【０１２２】
【表１８】
表１８から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、既知のデキストリン・デキストラナーゼやトランスグルコシダーゼとは全く異なる新規な理化学的性質を有することが判明した。
【０１２４】
【実験１５】
＜環状四糖の生成＞
各種糖質を用いて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素およびα−イソマルトシル転移酵素の作用による環状四糖生成試験を行った。マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、アミロース、可溶性澱粉、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社製）またはグリコーゲン（カキ由来、和光純薬株式会社販売）の溶液を調製した。
【０１２５】
これらの水溶液（濃度０．５％）に、実験７−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り１０単位とを加え、これらを３０℃、ｐＨ６．０で作用させた。作用条件は、以下の４つの系で行った。
【０１２６】
（１） α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を２４時間作用させた後、酵素を熱失活し、続いて、α−イソマルトシル転移酵素を２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（２） α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを同時に２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（３） α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のみを２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
（４） α−イソマルトシル転移酵素のみを２４時間作用させた後、酵素を熱失活させた。
【０１２７】
これら熱失活させた反応液中の環状四糖の生成量を調べるために、実験１と同様のα−グルコシダーゼ・グルコアミラーゼ処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表１９に示す。
【０１２８】
【表１９】
表１９の結果から明らかなように、試験したいずれの糖質も、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のみの作用およびα−イソマルトシル転移酵素のみの作用では、環状四糖は全く生成しなかったのに対して、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素を同時併用することにより環状四糖が生成した。その生成量は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させた後にα−イソマルトシル転移酵素を作用させた場合には、約１１％以下と比較的に低いのに対して、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを同時に作用させると、いずれの糖質でも環状四糖の生成量は向上し、特に、グリコーゲンでは約８７％に増加し、澱粉部分分解物では約６４％に増加することが判明した。
【０１３０】
このα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との同時併用における環状四糖の生成メカニズムは、両酵素の反応特性から以下のように推察される。
【０１３１】
（１） α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、グリコーゲンや澱粉部分分解物などのα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース基に作用し、そのグルコース基を他のα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース基の６位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にα−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖が生成する。
（２） α−イソマルトシル転移酵素は、非還元末端にイソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖に作用し、そのイソマルトシル基を、他の非還元末端にイソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース基の３位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖が生成する。
（３） 続いて、α−イソマルトシル転移酵素は、その非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカン鎖に作用し、分子内転移作用によってイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基をα−１，４グルカン鎖から切り離し、環状化して環状四糖が生成する。
（４） 切り離されたα−１，４グルカン鎖は、再度、（１）から（３）の反応を受けることによって、更に、環状四糖が生成する。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素との同時併用で、上記のように両酵素が繰り返し作用し、環状四糖の生成量が増加すると推察された。
【０１３２】
【実験１６】
＜澱粉液化程度の影響＞
とうもろこし澱粉を濃度１５％澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを０．１％加えてｐＨ６．０に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』（ノボ社製）を澱粉１グラム当り０．２乃至２．０％を加え、９５℃で１０分間反応させ、次いで、１２０℃で２０分間オートクレーブし、約３５℃に急冷して、ＤＥ３．２乃至２０．５の液化溶液を得、これに、実験７−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり２単位と、実験７−３の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り２０単位とを加え、３５℃で２４時間反応させた。１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験１と同様にα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表２０に示す。
【０１３３】
【表２０】
表２０の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とによる環状四糖の生成は、澱粉の液化の程度で影響を受け、液化の程度が低いほど、即ち、ＤＥが低値であるほど、澱粉からの環状四糖の生成率は高く、逆に、液化の程度が高いほど、即ち、ＤＥが高値であるほど、澱粉からの環状四糖の生成率が低いことが判明した。澱粉からの環状四糖の生成率を高めるには、澱粉の部分分解の程度はＤＥ約２０以下、望ましくは、ＤＥ約１２以下、更に望ましくは、ＤＥ約５以下が適していることが判明した。
【０１３５】
【実験１７】
＜澱粉部分分解物濃度の影響＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』（ＤＥ約２乃至５）の最終濃度０．５乃至４０％の水溶液を調製し、それぞれに、実験７−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り１０単位加え、両酵素を同時併用して３０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験１と同様にα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表２１に示す。
【０１３６】
【表２１】
表２１の結果から明らかなように、澱粉部分分解物の濃度が０．５％の低濃度では、環状四糖の生成量は約６４％であるのに対し、濃度４０％の高濃度では、環状四糖の生成量は約４０％と、基質である澱粉部分分解物の濃度に依存して環状四糖の生成量が変化することが判明した。この結果から、環状四糖の生成量は、澱粉部分分解物が低濃度であるほど高まる傾向にあることが判明した。
【０１３８】
【実験１８】
＜シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ添加効果＞
澱粉部分分解物『パインデックス＃１００』水溶液（濃度１５％）を調製し、実験７−２の方法で得たバチルス グロビスポルス Ｃ１１由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得たＣ１１株由来の精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り１０単位と、バチルス・ステアロサーモフィルス由来シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を固形物１グラム当り０乃至０．５単位加え、両酵素を同時併用して３０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、１００℃で１５分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、実験１と同様にα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖を加水分解し、ＨＰＬＣ法で環状四糖を定量した。それらの結果を表２２に示す。
【０１３９】
【表２２】
表２２の結果から明らかなように、ＣＧＴａｓｅを添加することによって、環状四糖の生成量が増加することが判明した。
【０１４１】
【実験１９】
＜環状四糖の調製＞
トウモロコシ由来フィトグリコーゲン（キューピー株式会社製）の水溶液（約１００ｌ）を濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨ６．０、温度３０℃に調整した後、実験７−２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、実験７−３の方法で得た精製α−イソマルトシル転移酵素標品を固形物１グラム当り１０単位加え、４８時間作用させた後、１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた。この反応液の一部を採り、ＨＰＬＣで環状四糖生成量を調べたところ、糖組成として約８４％であった。この反応液をｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、実験１と同様にα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを用いて処理し、残存する還元性オリゴ糖などを加水分解し、さらに、水酸化ナトリウムでｐＨを５．８に調整し温度９０℃で１時間保持して、酵素を失活させ、不溶物を濾過して除去した。この濾液を逆浸透膜を用いて固形分濃度約１６％まで濃縮した後、常法に従って脱色、脱塩、濾過、濃縮したところ、固形分約３，７００ｇを含む糖液約６．２ｋｇを得た。
【０１４２】
得られた糖液を、オルガノ製イオン交換樹脂『アンバーライトＣＲ−１３１０（Ｎａ型）』を充填したカラム（ゲル量約２２５ｌ）に供し、カラム温度６０℃で流速約４５ｌ／ｈの条件でクロマト分離を行なった。溶出液の糖組成を実験１に記載のＨＰＬＣ法でモニターし、環状四糖の純度が９８％以上の画分を回収し、常法に従って脱塩、脱色、濾過、濃縮したところ、固形分約２，５００ｇを含む糖液約７．５ｋｇを得た。得られた糖液の糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、環状四糖の純度は約９９．５％であった。
【０１４３】
【実験２０】
＜環状四糖の水溶液からの結晶化＞
実験１９の方法で得られた純度約９８％以上の環状四糖画分をエバポレーターで固形物濃度約５０％に濃縮した後、この濃縮糖液約５ｋｇを円筒状のプラスチック容器に入れ、緩やかに回転させながら約２０時間で温度を６５℃から２０℃まで降下させることにより晶析させたところ、白色の結晶状粉末が得られた。その顕微鏡写真の１例を図２５に示す。続いて、遠心濾過器を用いて分蜜し結晶状物を湿重量として１，３６０ｇを回収した。さらに、６０℃で３時間乾燥して環状四糖結晶状粉末を１，１７０ｇ得た。得られた結晶粉末の糖組成をＨＰＬＣ法で測定したところ、環状四糖の純度は９９．９％以上と極めて高純度であった。
【０１４４】
この環状四糖の結晶状粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したところ、図２６に示すように、主な回折角（２θ）として１０．１°、１５．２°、２０．３°および２５．５°を特徴とする回折スペクトルが得られた。また、この結晶状粉末の水分をカール・フィッシャー法で測定したところ、水分は１３．０％であることがわかり、環状四糖１分子当たり５乃至６分子の水を含む結晶であることが判明した。
【０１４５】
さらに、この環状四糖の結晶粉末を熱重量測定したところ、図２７に示す熱重量曲線が得られ、その重量変化と温度との関係から、温度１５０℃までの上昇で４乃至５分子の水に相当する重量減少が認められ、続いて、温度２５０℃付近で１分子の水に相当する重量減少が認められ、さらに、温度２８０℃付近から環状四糖自体の熱分解と考えられる重量減少が観察された。これらのことから、本発明の環状四糖５乃至６含水結晶は、常圧において、温度を１５０℃まで上昇させることにより結晶分子当たり４乃至５分子の水が離脱して１分子の水を含む結晶になり、さらに温度２５０℃までに１分子の水が結晶から離脱して無水結晶になることが判明した。
【０１４６】
【実験２１】
＜環状四糖１含水結晶への変換＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶粉末をガラス容器に入れ、予め温度１４０℃に保温したオイルバス中にそのガラス容器を３０分間保持した。得られた環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したところ、熱処理前の５乃至６含水結晶の粉末Ｘ線回折とは全く異なり、図２８に示すように、主な回折角（２θ）として、８．３°、１６．６°、１７．０°および１８．２°を特徴とする回折スペクトルが得られた。また、この結晶状粉末の水分をカール・フィッシャー法で測定したところ、水分が約２．７％であることがわかり、環状四糖１分子当たり１分子の水を含むことが判明した。さらに、この結晶粉末を熱重量測定したところ、図２９に示す熱重量曲線が得られ、その重量変化と温度との関係から、温度２７０℃付近で１分子の水に相当する重量減少が認められ、さらに、温度２９０℃付近から環状四糖自体の熱分解と考えられる重量減少が観察された。これらのことから、本発明の環状四糖結晶状物は１含水結晶であることが判明した。
【０１４７】
【実験２２】
＜無水結晶への変換＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶粉末を温度４０℃乃至１２０℃でそれぞれ１６時間真空乾燥した。得られた環状四糖粉末の水分をカール・フィッシャー法で測定したところ、真空乾燥温度４０℃の場合は水分が約４．２％であり、真空乾燥温度１２０℃の場合は水分が約０．２％で、実質的に無水であることが判明した。これら真空乾燥した環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したところ、真空乾燥前の５乃至６含水結晶の粉末Ｘ線回折および１含水結晶のものとは全く異なり、図３０（真空乾燥温度４０℃）、図３１（真空乾燥温度１２０℃）に示すように、主な回折角（２θ）として、１０．８°、１４．７°、１５．０°、１５．７°および２１．５°を特徴とする回折スペクトルが得られた。両回折スペクトル間でのピ−ク強度の強弱は認められるものの、基本的にピ−クの回折角度は同一で、結晶学的に同一無水結晶と推察された。また、回折スペクトルのベースラインは山状を呈し、真空乾燥前の環状四糖５乃至６含水結晶のものおよび１含水結晶のものと比べ結晶化度が低下しており、非結晶状態（アモルファス）の環状四糖が存在していることが判明した。このことから、真空乾燥４０℃の場合の水分を約４．２％含む環状四糖粉末は、その水分を含む環状四糖アモルファスと、環状四糖無水結晶とが混在する粉末と推察された。以上のことから、環状四糖５乃至６含水結晶粉末を真空乾燥することにより、５乃至６含水結晶は水分子を失い、非結晶状態のアモルファスと無水結晶に変換することがわかった。なお、水分０．２％の無水環状四糖粉末について、実験２０と同様に熱重量分析したところ、図３２に示すように、温度２７０℃付近から環状四糖の熱分解と考えられる重量減少のみが観察された。
【０１４８】
【実験２３】
＜環状四糖の水に対する飽和濃度＞
温度１０乃至９０℃での水に対する環状四糖の飽和濃度を調べるため、密栓付きガラス製容器に水１０ｍｌを入れ、それに実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を、各温度で完全に溶解する量以上の量を加えた後、ガラス容器を密封し、飽和に達するまで温度１０乃至９０℃で保温しながら２日間攪拌した。それぞれの温度の環状四糖飽和溶液を精密濾過して溶けていない環状四糖を除いた後、その濾液の水分を乾燥減量法で調べ、各温度での飽和濃度を求めた。結果を表２３に示す。
【０１４９】
【表２３】
【実験２４】
＜熱安定性＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を水に溶解し濃度１０ｗ／ｖ％の環状四糖水溶液を調製し、その溶液８ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。放冷後、それら溶液の着色度の測定と、ＨＰＬＣ法による純度測定を行った。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度により評価した。結果は表２４に示す。
【０１５１】
【表２４】
表２４の結果から明らかなように、環状四糖水溶液は１２０℃の高温加熱でも着色はなく、糖組成の純度の低下もなく、環状四糖は熱に対して安定な糖質であることが判明した。
【０１５３】
【実験２５】
＜ｐＨ安定性＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を各種の緩衝液（２０ｍＭ）に溶解し、環状四糖を濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨを２乃至１０に調整した環状四糖溶液を調製した。それぞれの溶液８ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１００℃で２４時間加熱した。放冷後、それら溶液の着色度の測定と、ＨＰＬＣ法による純度測定を行った。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度により評価した。結果は表２５に示す。
【０１５４】
【表２５】
表２５の結果から明らかなように、環状四糖水溶液は１２０℃の高温で２４時間加熱しても、ｐＨ２乃至１０の広範囲で着色はなく、ｐＨ２において糖組成の純度は僅かに低下するものの、ｐＨ３乃至１０の範囲では全く糖組成の純度は低下せず、環状四糖は広いｐＨ範囲、換言すれば、ｐＨ３乃至５の酸性側、ｐＨ６乃至８の中性側、ｐＨ９乃至１０のアルカリ側で煮沸しても極めて安定な糖質であることが判明した。
【０１５６】
【実験２６】
＜アミノカルボニル反応＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を水に溶解し、さらに、それに市販試薬特級のグリシンとリン酸緩衝液を加え、５０ｍＭリン酸緩衝液でｐH７．０に調整した１ｗ／ｖ％グリシンを含む１０ｗ／ｖ％環状四糖溶液を調製した。その溶液４ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１００℃で３０乃至９０分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しアミノカルボニル反応性を調べた。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度により評価した。結果を表２６に示す。
【０１５７】
【表２６】
表２６の結果から明らかなように、環状四糖は、グリシン共存下で加熱しても着色はなく、グリシンとの褐変を引き起こさないこと、換言すれば、アミノカルボニル反応（メイラード反応とも言う）を起こしにくい安定な糖質であることが判明した。
【０１５９】
【実験２７】
＜アミノカルボニル反応＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶と市販ポリペプトン（日本製薬製）とを脱イオン水に溶かし、５ｗ／ｖ％ポリペプトンを含む１０ｗ／ｖ％環状四糖溶液を調製した。その溶液４ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しアミノカルボニル反応性を調べた。同時に、ポリペプトンのみを含む溶液をブランクとして同様に加熱した。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度からブランクの吸光度を差し引いた値に基づいて評価した。結果を表２７に示す。
【０１６０】
【表２７】
表２７の結果から明らかなように、環状四糖は、ポリペプトン共存下で加熱して、ポリペプトンとの褐変を引き起こさないこと、換言すれば、アミノカルボニル反応を起こしにくい安定な糖質であることが判明した。
【０１６２】
【実験２８】
＜包接作用＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を脱イオン水に溶かし、２０％水溶液を調製した。その水溶液１００ｇ当たり、メタノールは２ｇ、エタノールは３ｇ、酢酸は４．６ｇを加えて包接を行なった。その後、それぞれを濾過し濾液を凍結乾燥し、未包接物を除去した。対照として、包接能を有することが知られている分枝シクロデキストリン（商品名『イソエリートＰ』、マルハ株式会社販売）を用いて同様に行なった。
【０１６３】
凍結乾燥粉末中の包接物量を測定するために、それぞれの凍結乾燥粉末１ｇを５ｍｌの水に溶かし、それに５ｍｌのジエチルエ−テルを加えて抽出を行ない、再度、抽出を繰り返した後、ジエチルエーテル中の抽出物をガスクロマトグラフィー法で定量した。結果を表２８に示す。
【０１６４】
【表２８】
表２８の結果から明らかなように、環状四糖は包接能を有しており、その包接能は、分枝サイクロデキストリンと比べ、重量当たり約２倍も高いことが判明した。
【０１６６】
【実験２９】
＜甘味度＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を脱イオン水に溶かし、固形物濃度１０％水溶液を調製し、この環状四糖１０％水溶液を基準とし、蔗糖（市販グラニュ−糖）の濃度を変え、パネラ−５名で官能試験を行なった。その結果、環状四糖の甘味度は、蔗糖の約２０％であった。
【０１６７】
【実験３０】
＜消化性試験＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を用いて、『日本栄養食糧学会誌』、第４３巻、第２３乃至２９頁（１９９０年）に記載の岡田等の方法に準じて、試験管内での唾液アミラーゼ、合成胃液、膵液アミラーゼ、小腸粘膜酵素による環状四糖の消化性を調べた。対照として、難消化性糖質として知られているマルチトールを用いて行なった。結果を表２９に示す。
【０１６８】
【表２９】
表２９の結果から明らかなように、環状四糖は、唾液アミラーゼ、合成胃液、膵液アミラーゼで全く消化されず、小腸粘膜酵素によって僅かに消化されたが、その程度は０．７４％と低値であり、対照の難消化性糖質マルチトールの値と比較すると１／５以下であり、環状四糖が極めて消化されにくい糖質であることが判明した。
【０１７０】
【実験３１】
＜醗酵性試験＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至含水結晶を用いて、『ジャ−ナル・オブ・ニュートリショナル・サイエンス・アンド・ビタミノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｉｔａｍｉｎｏｌｏｇｙ）』、第３７巻、第５２９乃至５４４頁（１９９１年）に記載のＯｋｕ等の方法に準じて、ラット盲腸内容物による環状四糖の発酵性を調べた。盲腸内容物は、ウィスター系雄ラットをエーテル麻酔下で屠殺し嫌気的に採取し、４倍量の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に懸濁したものを用いた。環状四糖は盲腸内容物重量当たり約７％を添加し、添加直後および１２時間後に残存する環状四糖量はガスクロマトグラフィー法で定量した。その結果、添加直後の環状四糖濃度は盲腸内容物ｇ当たり６８．０ｍｇ、１２時間後の環状四糖濃度は盲腸内容物ｇ当たり６３．０ｍｇであり、９３％が醗酵されず残存していることがわかり、環状四糖は極めて醗酵されにくい糖質であることが判明した。
【０１７１】
【実験３２】
＜資化性試験＞
実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を用いて、『腸内フローラと食物因子』、光岡知足編、学会出版センター（１９８４年）に記載の方法に準じて、各種腸内細菌の資化性を調べた。即ち、予め培養しておいた新鮮な菌を、環状四糖を０．５％添加したＰＹＦ培地５ｍｌに約１０７ＣＦＵ接種し、嫌気条件下で３７℃、４日間培養した。対照として、資化されやすい糖質グルコースを用いて行なった。資化性の判定は、培養後の培養液のｐＨが、６．０以上の場合、資化されない（−）とし、６．０未満の場合、資化される（＋）とした。さらに、培養液中に残存する糖質をアンスロン法で測定し糖質の減少量を調べ、資化性の判定を確認した。結果を表３０に示す。
【０１７２】
【表３０】
表３０の結果から明らかなように、環状四糖は、試験した腸内細菌株のいずれにも資化されなく、対照のグルコースはいずれにも資化されることがわかり、環状四糖が腸内細菌に極めて資化されにくい糖質であることが判明した。
【０１７４】
【実験３３】
＜急性毒性試験＞
マウスを使用して、実験２０の方法で得られる環状四糖５乃至６含水結晶を経口投与して急性毒性試験を行なった。その結果、環状四糖は低毒性の物質で、投与可能な最大投与量においても死亡例は認められなかった。従って、正確な値とはいえないが、そのＬＤ５０値は、５０ｇ／ｋｇマウス体重以上であった。
【０１７５】
以上の実験３０乃至３３の結果から、環状四糖は、経口摂取しても、消化、吸収されにくく、無カロリー乃至低カロリーの可食素材として、ダイエット甘味料、高甘味度甘味料の賦形剤、ダイエット飲食物の増粘剤、増量剤、賦形剤、更には、食物繊維、脂肪代替食品材料などとしての利用が期待できる。
【０１７６】
以下、本発明の環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物の製造方法を実施例Ａで、環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物を含有させた組成物を実施例Ｂで示す。
【０１７７】
【実施例Ａ−１】
バチルス グロビスポルス Ｃ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）を実験３の方法に準じて、ファーメンターで４８時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌濾過し、約１８ｌの培養濾液を回収し、更に、その濾液をＵＦ膜濃縮し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を８．８単位／ｍｌとα−イソマルトシル転移酵素を２６．７単位／ｍｌとを含む濃縮酵素液約１ｌを回収した。
【０１７８】
馬鈴薯澱粉乳を濃度約２％澱粉乳とし、これに最終濃度１ｍＭとなるように塩化カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整し、９５℃に約２０分間加熱して糊化を行い、次いで約３５℃に冷却し、これに前記方法で調製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮酵素液を澱粉固形物１グラム当り０．２５ｍｌの割合になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過し、以後、常法にしたがって精製（脱色、脱塩）し、濃縮して濃度５０％の環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約９０％で得た。本シラップをオートクレーブに入れ、ラネーニッケル６％を添加し、攪拌しながら温度を９０乃至１２０℃に上げ、水素圧を２０乃至１２０ｋｇ／ｃｍ2に上げて水素添加を完了させた後、ラネーニッケルを除去し、次いで、常法に従って、脱色、脱塩して精製し、濃縮して、濃度７０％のシラップを原料澱粉固形物当たり約８０％の収率で得た。
【０１７９】
本シラップは、環状四糖とともに糖アルコールを含有するＤＥ０．５未満の糖質混合物で、固形物当たり、環状四糖６２．１％、ソルビトール０．７％、イソマルチトール１．４％、マルチトール１１．１％およびその他の糖アルコールを２４．７％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、低カロリー甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１８０】
【実施例Ａ−２】
馬鈴薯澱粉を濃度約６％澱粉乳とし、これに濃度０．１％となるように炭酸カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整し、これにα−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉固形物グラム当り０．２％になるように加え、９５℃で１０分間反応させ、次いで１２０℃で２０分間オートクレーブし、更に約３５℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実施例Ａ−１の方法で調製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮液を澱粉固形物１グラム当り０．２５ｍｌの割合になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過して環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約９０％で得た。本シラップを実施例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精製し、濃縮し、以後、常法にしたがって精製（脱色、脱塩）し、濃縮して濃度７０％のシラップを原料澱粉固形物当たり約８０％の収率で得た。本シラップは、環状四糖とともに糖アルコールを含有するＤＥ０．５未満の糖質混合物で、固形物当たり、環状四糖６０．１％、ソルビトール０．９％、イソマルチトール１．５％、マルチトール１１．３％およびその他の糖アルコールを２６．２％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、低カロリー甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１８１】
【実施例Ａ−３】
バチルス グロビスポルス Ｃ１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）を実験６の方法に準じて、ファーメンターで４８時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌濾過し、約１８ｌの培養濾液を回収し、更に、その濾液をＵＦ膜濃縮し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を９．０単位／ｍｌとα−イソマルトシル転移酵素を３０．２単位／ｍｌとを含む濃縮酵素液約１ｌを回収した。タピオカ澱粉を濃度約２５％澱粉乳とし、これにα−アミラーゼ（商品名『ネオスピターゼ』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉固形物グラム当り０．２％加え、８５乃至９０℃で約２０分間反応させ、次いで１２０℃で２０分間オートクレーブし、更に約３５℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに上記の方法で調製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮酵素液を澱粉固形物１グラム当り０．２５ｍｌの割合になるように加え、更にシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラ−ゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉固形物１グラム当り１０単位になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（商品名『トランスグルコシダーゼ Ｌ「アマノ」』、天野製薬株式会社製）を固形物１グラム当たり３００単位加え、２４時間反応させ、更にグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物１グラム当たり３０単位加え、１７時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過し、以後、常法にしたがって精製（脱色、脱塩）し、濃縮して濃度５０％の環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約９０％で得た。本シラップを実施例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精製し、濃縮して、濃度７７％のシラップとし、これを助晶缶にとり、種晶として環状四糖５乃至６含水結晶及びソルビトール含水結晶をそれぞれ約２％ずつ加えて徐冷し、マスキットとし、これを乾燥搭上のノズルより１５０ｋｇ／ｃｍ２の高圧にて噴霧した。これと同時に８５℃の熱風を乾燥搭の上部より送風し、底部に設けた移送用金網コンベア上に結晶粉末を捕集し、コンベアの下より４５℃の温風を送りつつ、該粉末を乾燥搭外に徐々に移動させて、取り出した。この結晶粉末を熟成搭に充填して温風を送りつつ、１０時間熟成させ、結晶化と乾燥を完了し、環状四糖５乃至６含水結晶及びソルビトール含水結晶を含有する粉末を得た。本品は、環状四糖とともに糖アルコールを含有するＤＥ０．５未満の糖質混合物で、固形物当たり（無水物換算）、環状四糖５８．１％、ソルビトール３８．４％及びその他の糖アルコールを３．５％含有しており、温和な甘味、保湿性、包接性を有し、低カロリー甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１８２】
【実施例Ａ−４】
とうもろこし澱粉を濃度約２０％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム０．１％加え、ｐＨ６．５に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉固形物グラム当たり０．３％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約３５℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実施例Ａ−３の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを含む濃縮酵素液を澱粉固形物１グラム当り０．２５ｍｌの割合になるように加え、更にシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉固形物１グラム当り１０単位になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５で４８時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（商品名『トランスグルコシダーゼ Ｌ「アマノ』、天野製薬株式会社製造）を固形物１グラム当たり３００単位加え、２４時間反応させ、更にグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物１グラム当たり３０単位加え、１７時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過し、以後、常法にしたがって精製（脱色、脱塩）し、濃縮して濃度５０％の環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約９０％で得た。本シラップを実施例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精製し濃縮して、濃度８５％のシラップとし、これを助晶缶にとり、種晶として、環状四糖５乃至６含水結晶を約２％加え、攪拌しつつ徐冷して助晶し、これをプラスチック製バットに取り出し、室温で２日間放置し、晶出熟成させてブロックを調製した。次いで、本ブロックを切削機にて粉砕して環状四糖５乃至６含水結晶を含有する粉末を得た。本品は、環状四糖とともに澱粉糖アルコールを含有するＤＥ０．５未満の糖質混合物で、固形物当たり（無水物換算）、環状四糖６２．７％、ソルビトール３４．２％及びその他の糖アルコールを３．１％含有しており、温和な甘味、保湿性、包接性を有し、低カロリー甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１８３】
【実施例Ｂ−１】
＜甘味料＞
実施例Ａ−３の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末１重量部に、α−グリコシルステビオシド、東洋精糖株式会社販売『αＧスイート』０．０１重量部及びＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、味の素株式会社販売『アスパルテーム』０．０１重量部を均一に混合し、顆粒成型機にかけて、顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の約２倍の甘味度を有し、実質的に低カロリーである。本甘味料は、それに配合した高甘味度甘味物の分解もなく、安定性に優れており、低カロリー甘味料として、カロリー摂取を制限している肥満者、糖尿病者などのための低カロリー飲食物などに対する甘味付けに好適である。また、本甘味料は、虫歯誘発菌による酸の生成が少なく、不溶性グルカンの生成も少ないことより、虫歯を抑制する飲食物などに対する甘味付けにも好適である。
【０１８４】
【実施例Ｂ−２】
＜ハードキャンディー＞
濃度５５％蔗糖溶液１００重量部に実施例Ａ−１の方法で得た環状四糖とともに糖アルコールを含有するシラップ３０重量部を加熱混合し、次いで減圧下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン酸１重量部及び適量のレモン香料と着色料とを混和し、常法に従って成型し、製品を得た。本品は、歯切れ、呈味良好で、蔗糖の晶出、変形も起こらない高品質のハードキャンディーである。また、本品は、低カロリー、低う蝕性のハードキャンディーとしても好適である。
【０１８５】
【実施例Ｂ−３】
＜チョコレート＞
カカオペースト４０重量部、カカオバター１０重量部、蔗糖３０重量部、実施例Ａ−４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末２０重量部を混合してレファイナーに通して粒度を下げた後、コンチェに入れて５０℃で２昼夜練り上げた。この間に、レシチン０．５重量部を加え充分に混和分散させた。次いで、温度調節器で３１℃に調節し、バターの固まる直前に型に流し込み、振動機でアワ抜きを行い、１０℃の冷却トンネルを２０分間くぐらせて固化させた。これを型抜きして包装し製品を得た。本品は、吸湿性がなく、色、光沢共によく、内部組織も良好で、口中でなめらかに溶け、上品な甘味とまろやかな風味を有する。
【０１８６】
【実施例Ｂ−４】
＜チューインガム＞
ガムベース３重量部を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに蔗糖４重量部及び実施例Ａ−３の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末３重量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成形、包装して製品を得た。本品は、テクスチャー、風味とも良好なチューインガムである。また、本品は、低カロリー、低う蝕性のチューインガムとしても好適である。
【０１８７】
【実施例Ｂ−５】
＜加糖練乳＞
原乳１００重量部に実施例Ａ−２の方法で得た環状四糖とともに糖アルコールを含有するシラップ３重量部及び蔗糖１重量部を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して製品を得た。本品は、温和な甘味で、風味もよく、乳幼児食品、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に有利に利用できる。
【０１８８】
【実施例Ｂ−６】
＜乳酸菌飲料＞
脱脂粉乳１７５重量部、実施例Ａ−３の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末８０重量部及び特開平４−２８１７９５号公報で開示されているラクトスクロース高含有粉末５０重量部を水１，２００重量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスターターを３０重量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好な低カロリー乳酸菌飲料である。また、本品は、オリゴ糖を含有し、乳酸菌を安定に保持するだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用をも有する。
【０１８９】
【実施例Ｂ−７】
＜粉末ジュース＞
噴霧乾燥により製造したオレンジ果汁粉末３３重量部に対して、実施例Ａ−４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末５０重量部、蔗糖１０重量部、無水クエン酸０．６５重量部、リンゴ酸０．１重量部、Ｌ−アスコルビン酸０．１重量部、クエン酸ソーダ０．１重量部、プルラン０．５重量部、粉末香料適量をよく混合撹拌し、粉砕し微粉末にしてこれを流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃とし、これに、実施例Ａ−２の方法で得た環状四糖とともに糖アルコールを含有するシラップをバインダーとしてスプレーし、３０分間造粒し、計量、包装して製品を得た。本品は、果汁含有率約３０％の低カロリー粉末ジュースである。また、本品は異味、異臭がなく、長期に安定であった。
【０１９０】
【実施例Ｂ−８】
＜カスタードクリーム＞
コーンスターチ１００重量部、実施例Ａ−１の方法で得た環状四糖とともに糖アルコールを含有するシラップ１００重量部、マルトース８０重量部、蔗糖２０重量部及び食塩１重量部を充分に混合し、鶏卵２８０重量部を加えて撹拌し、これに沸騰した牛乳１，０００重量部を徐々に加え、更に、これを火にかけて撹拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、なめらかな光沢を有し、温和な甘味で美味である。
【０１９１】
【実施例Ｂ−９】
＜ういろうの素＞
米粉９０重量部に、コーンスターチ２０重量部、蔗糖４０重量部、実施例Ａ−３の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末８０重量部及びプルラン４重量部を均一に混合してういろうの素を製造した。ういろうの素と適量の抹茶と水とを混練し、これを容器に入れて６０分間蒸し上げて抹茶ういろうを製造した。本品は、照り、口当りも良好で、風味も良く、低カロリーである。また、澱粉の老化も抑制され、日持ちも良い。
【０１９２】
【実施例Ｂ−１０】
＜あん＞
原料あずき１０重量部に、常法に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きして、水溶性夾雑物を除去して、あずきつぶあん約２１重量部を得た。この生あんに、蔗糖１４重量部、実施例Ａ−２の方法で得た環状四糖とともに糖アルコールを含有するシラップ５重量部及び水４重量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダオイルを加えてつぶあんをこわさないように練り上げ、製品のあんを約３５重量部得た。本品は、色焼けもなく、舌ざわりもよく、風味良好で、あんパン、まんじゅう、だんご、もなか、氷菓などのあん材料として好適である。
【０１９３】
【実施例Ｂ−１１】
＜パン＞
小麦粉１００重量部、イースト２重量部、砂糖５重量部、実施例Ａ−４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末１重量部及び無機フード０．１重量部を、常法にしたがって、水でこね、中種を２６℃で２時間発酵させ、その後３０分間熟成し、焼き上げた。本品は、色相、すだちともに良好で適度な弾力、温和な甘味を有する高品質のパンである。
【０１９４】
【実施例Ｂ−１２】
＜ハム＞
豚もも肉１，０００重量部に食塩１５重量部及び硝酸カリウム３重量部を均一にすり込んで、冷室に１昼夜堆積する。これを水５００重量部、食塩１００重量部、硝酸カリウム３重量部、実施例Ａ−３の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末４０重量部及び香辛料からなる塩漬液に冷室で７日間漬け込み、次いで、常法に従い、冷水で洗浄し、ひもで巻き締め、燻煙し、クッキングし、冷却包装して製品を得た。本品は、色合いもよく、風味良好な高品質のハムである。
【０１９５】
【実施例Ｂ−１３】
＜粉末ペプチド＞
濃度４０％食品用大豆ペプチド溶液、不二製油株式会社製『ハイニュートＳ』１重量部に、実施例Ａ−４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末２重量部を混合し、プラスチック製バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを得た。本品は、風味良好で、プレミックス、冷菓などの製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管流動食などの離乳食、治療用栄養剤などとしても有利に利用できる。
【０１９６】
【実施例Ｂ−１４】
＜化粧用クリーム＞
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２重量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５重量部、実施例Ａ−３の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末２重量部、α−グリコシルルチン１重量部、流動パラフィン１重量部、トリオクタン酸グリセリル１０重量部及び防腐剤の適量を、常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２重量部、１，３−ブチレングリコール５重量部及び精製水６６重量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて撹拌混合しクリームを製造した。本品は、抗酸化性を有し、安定性が高く、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
【０１９７】
【実施例Ｂ−１５】
＜固体製剤＞
ヒト天然型インターフェロン−α標品（株式会社林原生物化学研究所製）を、常法に従って、固定化抗ヒトインターフェロン−α抗体カラムにかけ、該標品に含まれるヒト天然型インターフェロン−αを吸着させ、安定剤であるウシ血清アルブミンを素通りさせて除去し、次いで、ｐＨを変化させて、ヒト天然型インターフェロン−αを実施例Ａ−４の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末を５％含有する生理食塩水を用いて溶出した。本液を精密濾過し、約２０倍量の株式会社林原商事販売無水結晶マルトース粉末『ファイントース』に加えて脱水、粉末化し、これを打錠機にて打錠し、１錠（約２００ｍｇ）当たりヒト天然型インターフェロン−αを約１５０単位含有する錠剤を得た。本品は、舌下錠などとして、一日当たり、大人１乃至１０錠程度が経口的に投与され、ウイルス性疾患、アレルギー性疾患、リューマチ、糖尿病、悪性腫瘍などの治療に有利に利用できる。とりわけ、近年、患者数の急増しているエイズ、肝炎などの治療剤として有利に利用できる。本品は、本発明の非還元性糖質と無水結晶マルトースが共に安定剤として作用し、室温で放置してもその活性を長期間よく維持する。
【０１９８】
【実施例Ｂ−１６】
＜糖衣錠＞
重量１５０ｍｇの素錠を芯剤とし、これに実施例Ａ−３の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末４０重量部、プルラン（平均分子量２０万）２重量部、水３０重量部、タルク２５重量部及び酸化チタン３重量部からなる下掛け液を用いて錠剤重量が約２３０ｍｇになるまで糖衣し、次いで、同じ環状四糖５乃至６含水結晶粉末６５重量部、プルラン１重量部及び水３４重量部からなる上掛け液を用いて、糖衣し、更に、ロウ液で艶出しして光沢の在る外観の優れた糖衣錠を得た。本品は、耐衝撃性にも優れており、高品質を長期間維持する。
【０１９９】
【実施例Ｂ−１７】
＜練歯磨＞
第２リン酸カルシウム４５．０重量部、プルラン２．９５重量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５重量部、グリセリン２０．０重量部、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート０．５重量部、防腐剤０．０５重量部、実施例Ａ−３の方法で得た環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末１２．０重量部、マルチトール５．０重量部及び水１３．０重量部を常法にしたがって混合し、練歯磨を得た。本品は、適度の甘味を有しており、特に子供用練歯磨として好適である。
【０２００】
【実施例Ｂ−１８】
＜流動食用固体製剤＞
実施例Ａ−４の方法で製造した環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末１００重量部、マルトース１含水結晶２００重量部、α，α−トレハロース２含水結晶２００重量部、粉末卵黄２７０重量部、脱脂粉乳２０９重量部、塩化ナトリウム４．４重量部、塩化カリウム１．８重量部、硫酸マグネシウム４重量部、チアミン０．０１重量部、アスコルビン酸ナトリウム０．１重量部、ビタミンＥアセテート０．６重量部及びニコチン酸アミド０．０４重量部からなる配合物を調製し、この配合物２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、１袋分を約１５０乃至３００ｍｌの水に溶解して流動食とし、経口的、又は鼻腔、胃、腸などへ経管的使用方法により利用され、生体への栄養補給用に有利に利用できる。
【０２０１】
【実施例Ｂ−１９】
＜外傷治療用膏薬＞
実施例Ａ−３の方法で製造した環状四糖５乃至６含水結晶とともにソルビトール無水結晶を含有する粉末２００重量部及びマルトース３００重量部に、ヨウ素３重量部を溶解したメタノール５０重量部を加え混合し、更に１０ｗ／ｖ％プルラン水溶液２００重量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、ヨウ素による殺菌作用によって治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。
【０２０２】
【発明の効果】
上記から明らかなように、本発明の環状四糖とともに澱粉糖アルコールを含有してなる糖質混合物は、実質的に非還元性で安定性に優れ、良質で上品な甘味を有している。したがって、本発明の糖質混合物は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。また、本発明の糖質混合物の製造に用いる原料用還元性糖質としては、パノースなどのα−イソマルトシルグルコ糖質含有溶液にα−イソマルトシル転移酵素を作用させるか、又は、澱粉を液化した溶液に、α−イソマルトシル転移酵素及びα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとともに作用させることにより、環状四糖とともに還元性糖質を含有する糖質を得て、これを水素添加し、環状四糖を単離することなく、還元性糖質を対応する糖アルコールに変換させて還元性を低減させ、次いで精製することにより、比較的低分子、低粘度で取扱い容易なＤＥ０．５未満の実質的に非還元性糖質混合物を得る。このようにして得ることのできる本発明の糖質混合物は、例えば、低カロリー甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして広範囲な用途に利用できる。
【０２０３】
本発明の環状四糖とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物とその製造方法の確立並びにその用途の提供は、安価で無限の資源である澱粉を原料として製造される、従来望むべくして容易に得られなかった環状四糖とともに還元性糖質を含有する糖質から工業的に大量かつ安価に提供できる全く新しい道を拓くこととなり、本発明の工業実施を極めて容易にする。したがって、本発明が与える影響は、食品、化粧品、医薬品業界は言うに及ばず、農水畜産業、化学工業にも及びこれら産業界に与える工業的意義は計り知れないものがある。
【０２０４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】α−イソマルトシル転移酵素反応により得られた糖質を高速液体クロマトグラフィーにかけたときの溶出パタ−ンを示す図である。
【図２】α−イソマルトシル転移酵素反応により得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲスペクトル）を示す図である。
【図３】α−イソマルトシル転移酵素反応により得られた環状四糖の核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル）を示す図である。
【図４】環状四糖の構造が、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝であることを示す図である。
【図５】バチルス グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図６】バチルス グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図７】バチルス グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図８】バチルス グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図９】バチルス グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１０】バチルス グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１１】バチルス グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
【図１２】バチルス グロビスポルスＣ９由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１３】バチルス グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１４】バチルス グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１５】バチルス グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図１６】バチルス グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１７】バチルス グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１８】バチルス グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１９】バチルス グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
【図２０】バチルス グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図２１】α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトトリオースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２２】α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトテトラオースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２３】α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトトリオースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２４】α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素反応により得られたα−イソマルトシルマルトテトラオースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２５】５乃至６含水結晶環状四糖の顕微鏡写真をディスプレ−上に表示した中間調画像を示す図である。
【図２６】５乃至６含水結晶環状四糖状粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
【図２７】５乃至６含水結晶環状四糖状粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。
【図２８】本発明の１含水結晶環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
【図２９】本発明の１含水結晶環状四糖粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。
【図３０】５乃至６含水結晶環状四糖粉末を４０℃で真空乾燥して得られる無水結晶環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
【図３１】５乃至６含水結晶環状四糖粉末を１２０℃で真空乾燥して得られる無水結晶環状四糖粉末を粉末Ｘ線回折法で解析したときの回折スペクトルを示す図である。
【図３２】本発明の無水結晶環状四糖粉末を熱重量測定したときの熱重量曲線を示す図である。
Claims (3)
- 下記（１）乃至（４）の工程を含んでなる、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物の製造方法：
（１）ＤＥ２０以下の澱粉部分分解物に、α−１，４グルカンの非還元末端グルコース基に作用し、そのグルコース基を他のα−１，４グルカンの非還元末端グルコース基の６位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にα−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカンを生成する、バチルス・グロビスポルスＣ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）又はＣ１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させ、非還元末端にα−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカンを生成させる工程；
（２）生成した非還元末端にα−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカンに、非還元末端にα−イソマルトシル基を有するα−１，４グルカンに作用し、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質を生成する、バチルス・グロビスポルスＣ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）又はＣ１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）由来のα−イソマルトシル転移酵素を作用させて、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質を生成させる工程；
（３）得られるサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質と還元性糖質を含有してなる糖質混合物を水素添加して還元性を低減させる工程；
（４）得られるサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質とともに糖アルコールを含有してなる糖質混合物を採取する工程。 - 糖アルコールが、ソルビトール、マルチトール、イソマルチトール及びパニトールから選ばれる１種又は２種以上の糖アルコールである請求項１記載の糖質混合物の製造方法。
- 糖質混合物が、ＤＥ０．５未満であって、その形態がシラップ又は結晶含有粉末である請求項１又は２記載の糖質混合物の製造方法。
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