JP4983258B2 - イソサイクロマルトオリゴ糖及びイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素とそれらの製造方法並びに用途 - Google Patents

Description

本発明は、一般式１で表される構造を有するイソサイクロマルトオリゴ糖及びイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素とそれらの製造方法並びに用途に関し、詳細には、一般式１で表される構造を有するイソサイクロマルトオリゴ糖及びイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素とその製造方法、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を産生する微生物、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡと形質転換体、当該酵素を用いたイソサイクロマルトオリゴ糖の生成方法及び製造方法、並びにイソサイクロマルトオリゴ糖を含んでなる組成物に関する。

一般式１：

グルコースを構成糖とする糖質としては、例えば、澱粉を原料として製造される澱粉部分分解物であるアミロース、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖などが知られている。これらの糖質は、通常、分子の一端に非還元性末端を、他端に還元性末端を有し、還元性を示すことが知られている。一般に、澱粉部分分解物は、その固形物当りの還元力の大きさをデキストロース・エクイバレント（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ、ＤＥ）として表される。この値の大きいものは、通常、分子が小さく低粘度で、甘味が強いものの、反応性が強く、アミノ酸や蛋白質などのアミノ基を持つ物質とアミノカルボニル反応を起こし易く、褐変し、悪臭を発生して、品質を劣化し易い性質のあることが知られている。

斯かる欠点を改善するために、その還元力を低減、若しくは消滅させる簡便な方法が古くから望まれていた。例えば、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）」、米国、１９４９年、第７１巻、３５３乃至３５８頁で開示されているように、澱粉にマセランス アミラーゼ（ｍａｃｅｒａｎｓ ａｍｙｌａｓｅ）を作用させることにより、６乃至８分子のグルコースがα−１，４グルコシド結合で環状構造を形成したα−、β−又はγ−サイクロデキストリンを生成させる方法が知られている。現在では、澱粉からこれらサイクロデキストリンが工業的規模で生産され、これらサイクロデキストリンは、それらが有する、非還元性で、無味であり、包接能を有するなどの特性を生かした用途に利用されている。また、先に、本出願人が、特開平７−１４３８７６号公報、特開平７−２１３２８３号公報などで開示したように、マルトオリゴ糖など澱粉部分分解物に非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を作用させることにより、２分子のグルコースがα，α−１，１結合したトレハロースを生成させる方法も知られている。現在では、澱粉からトレハロースが工業的規模で生産され、その非還元性や温和で高品質な甘味特性などを生かした用途に利用されている。さらに、先に、本出願人が、国際公開 ＷＯ ０１／９０３３８ Ａ１号明細書、国際公開 ＷＯ ０２／０５５７０８ Ａ１号明細書、国際公開 ＷＯ ０２／４０６５９ Ａ１号明細書などで開示したように、澱粉又はその部分分解物にα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素を作用させることにより、４分子のグルコースがα−１，３グルコシド結合及びα−１，６グルコシド結合で交互に結合した構造、すなわち、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成させる方法も知られている。また、さらに、先に、本出願人が、特開２００５−９５１４８号公報で開示したように、澱粉又はその部分分解物に環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させることにより、４分子のグルコースがα−１，４グルコシド結合及びα−１，６グルコシド結合で交互に結合した構造、すなわち、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖（別名、環状マルトシルマルトース）を生成させる方法も知られている。これら環状四糖は、環状構造を有することから包接能を有し、揮発性有機物を安定化する作用を示すとともに、非還元性の糖質であるため、アミノカルボニル反応を起こさず、褐変、劣化を懸念することなく利用、加工できることが期待される。

このように、グルコースを構成糖とする非還元性糖質として、グルコース重合度が６乃至８のα−、β−、γ−サイクロデキストリン、グルコース重合度が２のα，α−トレハロース、グルコース重合度が４のサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖及びサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖（別名、環状マルトシルマルトース）は、それぞれの特性を生かして種々の分野に利用され又は利用が期待されているものの、これら糖質以外にもグルコースを構成糖とする非還元性糖質が提供されれば非還元性糖質の選択の幅が広がり、更に多様な用途への利用が期待される。

本発明の課題は、グルコースを構成糖とする新規な非還元性糖質を提供し、非還元性糖質の選択の幅を広げるとともに当該非還元性糖質を生成する新規酵素と、それらの生成方法及び製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡ、これを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体、並びに当該非還元性糖質を含んでなる組成物を提供することにある。

本発明者等は、上記課題を解決するために、澱粉部分分解物から新規な非還元性糖質を生成する全く新しい酵素に期待を込めて、このような酵素を産生する微生物を広く検索してきた。その結果、岡山県岡山市の土壌から、新たに分離したバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する新規微生物ＡＭ７株が新規な酵素を産生し、この新規酵素の作用により、澱粉又はその部分分解物などのα−１，４グルカンから一般式１で表される構造を有する新規なイソサイクロマルトオリゴ糖が著量生成することを見出した。また、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の諸性質を明らかにするとともに、その製造方法を確立し、また、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体を確立し、さらに、本酵素によるイソサイクロマルトオリゴ糖の生成方法、及び本酵素を用いたイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれらを含む糖組成物の製造方法並びに用途を確立して、本発明を完成した。

一般式１：

すなわち、本発明は、一般式１で表される構造を有する新規なイソサイクロマルトオリゴ糖とそれらを生成する新規なイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素と、それらの生成方法及び製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体、さらには、イソサイクロマルトオリゴ糖又はこれを含む糖組成物を含んでなる飲食物、化粧品及び医薬品組成物を提供することによって上記課題を解決するものである。

本発明によれば、グルコースを構成糖とする非還元性糖質の選択の幅が広がる上に、従来未知であった新規環状糖質、イソサイクロマルトオリゴ糖が大量に供給できることとなり、飲食物、化粧品、医薬品をはじめとする様々な分野における利用が可能となる。

図１は、糖質I標品のＨＰＬＣ溶出パターンを示す図である。 図２は、糖質II標品のＨＰＬＣ溶出パターンを示す図である。 図３は、糖質I標品の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。 図４は、糖質I標品の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。 図５は、本発明のイソサイクロマルトペンタオースの構造を示す図である。 図６は、糖質II標品の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。 図７は、糖質II標品の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。 図８は、本発明のイソサイクロマルトヘキサオースの構造を示す図である。 図９は、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の至適温度を示す図である。 図１０は、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の至適ｐＨを示す図である。 図１１は、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の温度安定性を示す図である。 図１２は、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。 図１３は、組換えＤＮＡ、ｐＢＡＭＨ１を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、バチルス・サーキュランス ＡＭ７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１１１）由来の本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素をコードするＤＮＡである。 図１４は、組換えイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素発現用の組換えＤＮＡ、ｐＥＴＡＭ１を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、バチルス・サーキュランス ＡＭ７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１１１）由来の本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素をコードするＤＮＡである。

符号の説明

ａ：１位がα−１，４グルコシド結合しているグルコース残基
ｂ：１位がα−１，６グルコシド結合しているグルコース残基

本発明でいうイソサイクロマルトオリゴ糖とは、下記の一般式１で表される構造を有する環状糖質を意味する。

一般式１：

イソサイクロマルトオリゴ糖としては、上記一般式１において、ｎが４のイソサイクロマルトオリゴ糖、すなわち、マルトペンタオース分子の還元末端グルコースの１位と非還元末端グルコースの６位水酸基がα−１，６グルコシド結合して環状構造を形成した五糖（本明細書では、イソサイクロマルトペンタオースと呼称する）、及び、上記一般式１において、ｎが５のイソサイクロマルトオリゴ糖、すなわち、マルトヘキサオース分子の還元末端グルコースの１位と非還元末端グルコースの６位水酸基がα−１，６グルコシド結合し環状構造を形成した六糖（本明細書では、イソサイクロマルトヘキサオースと呼称する）が存在する。これらの糖質は、土壌より得た微生物の培養液中に本発明者らが初めて見出した従来未知の新規糖質であり、グルコースを構成糖とする環状の五糖又は六糖は上記構造を有しているかぎり、その給源、形態、純度、製造方法を問わず本発明に包含される。

本発明でいうイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素とは、グルコース重合度３以上のα−１，４グルカンに作用し、分子間転移反応でα−１，４グルカンの非還元末端グルコースの４位にα−１，４転移することにより種々のグルコース重合度のα−１，４グルカンを生成する不均化反応を触媒する一方、グルコース重合度７のα−１，４グルカン（マルトヘプタオース）に作用した場合には、マルトペンタオース単位で切断し、このマルトペンタオースの還元末端グルコースの１位を同一分子の非還元末端グルコースの６位水酸基にα−１，６転移する分子内転移反応で環化することによりイソサイクロマルトペンタオースを生成する反応を触媒し、グルコース重合度８以上のα−１，４グルカンに作用した場合には、マルトペンタオース又はマルトヘキサオース単位で切断し、このマルトペンタオース又はマルトヘキサオースの還元末端グルコースの１位を同一分子の非還元末端グルコースの６位水酸基にα−１，６転移する分子内転移反応で環化することによりイソサイクロマルトペンタオース及びイソサイクロマルトヘキサオースを生成する反応を触媒する酵素全般を意味する。上記の反応を触媒する酵素はその給源、形態、粗酵素又は精製酵素の区別なく本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素に包含される。

本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の酵素活性は、次のようにして測定することができる。アミロースを濃度１．２５ｗ／ｖ％となるよう１ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．８ｍｌに酵素液０．２ｍｌ加えて、３０℃で３０分間酵素反応し、その反応液を１０分間、約１００℃で加熱して反応を停止させた後、α−グルコシダーゼを固形物１グラム当り４０００単位及びグルコアミラーゼを固形物１グラム当り２５０単位添加して５０℃、１時間処理することにより残存可溶性澱粉や夾雑オリゴ糖を分解し、その処理液中のイソサイクロマルトペンタオース量を、後述する実験１に記載のＨＰＬＣで定量する。イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのイソサイクロマルトペンタオースを生成する酵素量と定義する。

本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の具体例としては、例えば、下記の理化学的性質を有するイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素が挙げられる。
（１）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において、１０６，０００±２０，０００ダルトン。
（２）等電点
アンフォライン含有等電点電気泳動法において、ｐＩ７．５±０．５。
（３）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５０℃乃至５５℃。
（４）至適ｐＨ
３０℃、３０分間反応の条件下で、ｐＨ４．５乃至８．０。
（５）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で、３５℃まで安定。
１ｍＭカルシウムイオン存在下では、４０℃まで安定。
（６）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下で、ｐＨ４．５乃至９．０で安定。

また、上記理化学的性質を有する本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の一つは、上記理化学的性質のみならず、そのＮ末端配列として、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列を有している場合がある。

本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素は、通常、所定のアミノ酸配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体酵素としては、グルコース重合度３以上のα−１，４グルカンに作用し、一般式１で表されるイソサイクロマルトオリゴ糖を生成するという酵素活性を保持する範囲で、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有するものが挙げられ、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対し、通常、６０％以上、望ましくは、７０％以上、さらに望ましくは、８０％以上、よりさらに望ましくは、９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものが好適である。

しかしながら、上記理化学的性質又はアミノ酸配列を有するイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素はあくまで一例であって、上記と異なる理化学的性質又はＮ末端アミノ酸配列を有する酵素も、イソサイクロマルトオリゴ糖を生成するかぎり本発明に包含されることはいうまでもない。

本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素はその給源によって制限されないものの、好ましい給源として、微生物が挙げられ、とりわけ本発明者らが土壌より単離した微生物ＡＭ７株又はその変異株が好適に用いられる。以下、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素産生能を有する微生物ＡＭ７株の同定試験結果を示す。なお、同定試験は、『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版センター、１９８５年）に準じて行った。

＜Ａ：細胞形態＞
（１）肉汁寒天培養、２７℃
通常０．５×２乃至０.７×５μｍの桿菌。グラム陽性。運動性あり。楕円形の胞子あり。菌体の端に膨れた胞子嚢を形成する。

＜Ｂ：培養性質＞
（１）肉汁寒天平板培養、２７℃
形状： 円形 大きさは３日間で１乃至２ｍｍ。
周縁： 全縁
隆起： 扁平状
光沢： 鈍光
表面： ラフ
色調： 不透明、白色
（２）肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育： 中程度
形状： 糸状

＜Ｃ：生理学的性質＞
（１） ＶＰ試験： 陰性
（２） カタラーゼ： 陽性
（３） 澱粉の加水分解： 陽性
（４） チロシンの分解： 陰性
（５） フェニルアラニン脱アミノ化： 陰性
（６） 硝酸の還元： 陽性
（７） Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトールから酸を生成する
（８） 生育の範囲： ｐＨ５.７乃至９.８、温度１０乃至３７℃、ＮａＣｌ濃度
０乃至２％
（９） 酸素に対する態度： 通性嫌気性
（１０） ＤＮＡのＧＣ含量： ５０.７％

以上の菌学的性質に基づいて、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第２巻（１９８６年）を参考にして、公知菌との異同を検討した。その結果、本菌は、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）に属する微生物であることが判明した。これらの結果より本発明者等は、本菌を新規微生物バチルス・サーキュランス ＡＭ７と命名し、平成１６年８月２５日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１１１として受託された。

本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素産生能を有する微生物には、上記菌はもとより、その変異株、更には、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素産生能を有する他の微生物、及び、それらの変異株なども包含される。

本発明のＤＮＡとは、上記イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素をコードするもの全般を意味する。本発明のＤＮＡは、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素をコードするものである限り、それが天然由来のものであっても、人為的に合成されたものであってもよい。天然の給源としては、例えば、バチルス・サーキュランス ＡＭ７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１１１）を含むバチルス属の微生物が挙げられ、これらの菌体から本発明のＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを得ることができる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で約１乃至３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを菌体外に溶出させる。このとき、プロテアーゼなどの蛋白質分解酵素を併用したり、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈殿、遠心分離、リボヌクレアーゼ処理などの常法を適用すれば目的の遺伝子ＤＮＡが得られる。本発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列に基づいて化学合成すればよい。また、当該ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを鋳型として、適当なプライマーとなる化学合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ合成することも有利に実施できる。

本発明のＤＮＡは、通常、所定の塩基配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号３で示される塩基配列又はそれに相同的な塩基配列が挙げられる。配列表における配列番号３で示される塩基配列に相同的な塩基配列を有する変異体ＤＮＡとしては、コードする酵素の活性を保持する範囲で、配列番号３で示される塩基配列において１個又は２個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列を有するものが挙げられ、配列番号３で示される塩基配列に対し、通常、６０％以上、望ましくは、７０％以上、さらに望ましくは、８０％以上、よりさらに望ましくは、９０％以上の相同性を有する塩基配列を有するものが好適である。また、遺伝子コードの縮重に基づき、そのコードする酵素のアミノ酸配列を変えることなく塩基の１個又は２個以上を他の塩基に置換したものも当然、本発明のＤＮＡに包含される。

本発明のＤＮＡを、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとすることも有利に実施できる。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなり、ＤＮＡが入手できれば、常法の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。この内、本発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるには、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、まず、ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子ＤＮＡ及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ ３ＡＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結するのが容易である。必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。

このようにして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母をはじめとする適宜の宿主微生物に導入することができる。形質転換体を取得するには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、グルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンを含む栄養培地で培養し、該糖質よりイソサイクロマルトオリゴ糖を生成するものを選択すればよい。

本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素産生能を有する形質転換体も含めた微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が生育に利用できる物であればよく、例えば、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、これらの部分分解物やグルコース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択できる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を適宜用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などの塩類を適宜用いることができる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いることができる。

培養は、通常、温度１５乃至３７℃でｐＨ５．５乃至１０の範囲、好ましくは温度２０乃至３４℃でｐＨ５．５乃至８．５の範囲から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は当該微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１０時間乃至１５０時間である。また、培養条件における培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、攪拌したりするなどの手段を適宜採用する。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよい。

このようにして微生物を培養した後、本発明の酵素を含む培養物を回収する。イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素活性は、主に培養物の除菌液に認められ、除菌液を粗酵素液として採取することも、培養物全体を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を除去するには公知の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。除菌液をそのまま粗酵素液として用いることができるものの、一般的には、濃縮して用いられる。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空膜などを用いた膜濃縮法などを採用することができる。

更に、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素活性を有する除菌液及びその濃縮液を用いて、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を公知の方法により固定化することもできる。例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合法・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを適宜採用できる。

上記のように本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素は、粗酵素液をそのまま又は濃縮して用いることができるものの、必要に応じて、公知の方法によって、さらに分離・精製して利用することもできる。例えば、培養液の処理物を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を透析後、『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｓ』樹脂を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』樹脂を用いた疎水クロマトグラフィーを用いて精製することにより、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を電気泳動的に単一な酵素として得ることができる。

イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素が組換え型酵素である場合には、宿主の種類によっては菌体内に酵素が蓄積することがある。このような場合には、菌体又は培養物をそのまま使用することも可能であるものの、通常は使用に先立ち、必要に応じて、浸透圧ショックや界面活性剤により菌体から抽出した後、又は、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより組換え型酵素を菌体又は菌体破砕物から分離して用いることも有利に実施できる。

このようにして得られる本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素は、具体的には、下記の理化学的性質を有する場合がある。
（１）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において、１０６，０００±２０，０００ダルトン。
（２）等電点
アンフォライン含有等電点電気泳動法において、ｐＩ７．５±０．５。
（３）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５０℃乃至５５℃。
（４）至適ｐＨ
３０℃、３０分間反応の条件下で、ｐＨ４．５乃至８．０。
（５）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で、３５℃まで安定。
１ｍＭカルシウムイオン存在下では、４０℃まで安定。
（６）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下で、ｐＨ４．５乃至９．０で安定。
（７）Ｎ末端アミノ酸配列
配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列、すなわち、アラニン―セリン−イソロイシン−グリシン−スレオニン−バリン−スレオニン−グルタミン酸−アスパラギン−アスパラギン酸−スレオニン−イソロイシン−チロシン−グルタミン−イソロイシン−メチオニン−バリン−アスパラギン酸−アルギニン−フェニルアラニンのアミノ酸配列を有する。

本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の基質となるグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンとしては、澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどや、それらをアミラーゼまたは酸などによって部分的に加水分解して得られるアミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖などの部分分解物が挙げられる。アミラーゼで分解した部分分解物としては、例えば、『ハンドブック・オブ・アミレーシズ・アンド・リレイテッド・エンザイム（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｍｙｌａｓｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）（１９８８年）パーガモン・プレス社（東京）に記載されている、α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）、マルトテトラオース生成アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６０）、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．９８）などのアミラーゼを用いて澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどを分解して得られる部分分解物を用いることができる。更には、部分分解物を調製する際、プルラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４１）、イソアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６８）などの澱粉枝切酵素を作用させることも随意である。

基質としての澱粉は、例えば、とうもろこし、小麦、米など由来の地上澱粉であっても、また、馬鈴薯、さつまいも、タピオカなど由来の地下澱粉であってもよく、好ましくは、澱粉を糊化及び／又は液化した溶液として用いられる。その澱粉の部分分解の程度は低い程、イソサイクロマルトオリゴ糖生成率が高くなることから、ＤＥ約２０以下、望ましくは約１２以下、更に望ましくは約５以下の部分分解物が好適である。なお、本明細書でいうイソサイクロマルトオリゴ糖生成率とは、式、イソサイクロマルトオリゴ糖生成率（％）＝｛（生成したイソサイクロマルトオリゴ糖類の質量）／（反応液中の全糖質の質量）｝×１００で算出される値を意味する。

本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を基質に作用させるに際し、その基質濃度は特に限定されず、例えば、基質濃度０．１％（ｗ／ｖ）の比較的低濃度の溶液を用いた場合でも、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の反応は進行してイソサイクロマルトオリゴ糖を生成する。工業的には、基質濃度１％（ｗ／ｖ）以上が好適であり、この条件下で、イソサイクロマルトオリゴ糖を有利に生成できる。反応温度は反応が進行する温度、即ち５５℃付近までで行えばよい。好ましくは３０乃至４５℃付近の温度を用いる。反応ｐＨは、通常、４．５乃至８．０の範囲、好ましくはｐＨ５．０乃至７．５の範囲に調整するのがよい。酵素の使用量と反応時間とは密接に関係しており、目的とする酵素反応の進行により適宜選択すればよい。

例えば、基質濃度１％（ｗ／ｖ）の澱粉又はその部分分解物やアミロースの水溶液に本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を作用させることにより、澱粉又はその部分分解物からは約２０％以上、アミロースからは約３０％の高いイソサイクロマルトオリゴ糖生成率で本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖を得ることができる。このイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素によるイソサイクロマルトオリゴ糖類の生成メカニズムは、以下のように推察される。
（１）本酵素は、基質としてグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、分子間転移反応でα−１，４グルカンの非還元末端グルコースの４位水酸基にα−１，４転移することによる不均化反応により種々のグルコース重合度のα−１，４グルカンを生成する。
（２）本酵素は、グルコース重合度７のα−１，４グルカン（マルトヘプタオース）に作用した場合には、マルトペンタオース単位で切断し、このマルトペンタオースの還元末端グルコースの１位を同一分子の非還元末端グルコースの６位水酸基にα−１，６転移する分子内転移反応により環化し、イソサイクロマルトペンタオースとマルトースとを生成する。
（３）本酵素は、グルコース重合度８以上のα−１，４グルカンに作用した場合には、マルトペンタオース又はマルトヘキサオース単位で切断し、このマルトペンタオース又はマルトヘキサオースの還元末端グルコースの１位を同一分子の非還元末端グルコースの６位水酸基にα−１，６転移する分子内転移反応により環化し、イソサイクロマルトペンタオース及びイソサイクロマルトヘキサオースとグルコース重合度が５又は６減じたα−１，４グルカンとを生成する。
（４）（２）及び（３）で新たに生じたマルトース及びα−１，４グルカンは、再度、（１）乃至（３）の反応を受けることによって、イソサイクロマルトオリゴ糖を生成する。

また、このイソサイクロマルトオリゴ糖生成反応の際、他の酵素を併用して、イソサイクロマルトオリゴ糖生成率を向上させることも有利に実施できる。例えば、澱粉に、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素とイソアミラーゼやプルラナーゼなどの澱粉枝切酵素を併用して作用させることにより、イソサイクロマルトオリゴ糖の生成率をさらに向上させることも有利に実施できる。

上記の反応によって得られた反応液は、そのままイソサイクロマルトオリゴ糖含有糖液として用いることもできる。また、必要に応じて、イソサイクロマルトオリゴ糖含有糖液に、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びα−グルコシダーゼから選ばれる１種又は２種以上を作用させて、夾雑するオリゴ糖を加水分解したイソサイクロマルトオリゴ糖含有糖液として用いることもできる。また、水素添加して反応液中に残存する還元性糖質を糖アルコールに変換して還元力を消滅せしめるなどの更なる加工処理を施すことも随意である。一般的には、イソサイクロマルトオリゴ糖含有糖液はさらに精製して用いられる。精製方法としては、糖の精製に用いられる通常の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコールおよびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離、更には、イソサイクロマルトオリゴ糖を利用せず夾雑糖質を資化、分解する微生物、例えば酵母などによる発酵処理や、アルカリ処理などにより残存している還元性糖質を分解除去するなどの１種または２種以上の精製方法が適宜採用できる。

とりわけ、工業的大量生産方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーの採用が好適であり、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより夾雑糖類を除去し、目的物の含量を向上させたイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれを含む糖質を有利に製造することができる。この際、固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。

このようにして得られたイソサイクロマルトオリゴ糖を含む水溶液、又はその含量を向上させた糖質水溶液は、通常、イソサイクロマルトオリゴ糖を、固形物当たり、１０質量％以上、望ましくは４０質量％以上含有する糖質水溶液で、通常、これを濃縮し、シラップ状製品とする。このシラップ状製品は、更に、乾燥して非晶質固状物製品又は非晶質粉末製品にすることも随意である。

また、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖は包接能を有しており、包接した香気成分、有効成分などの揮散、品質劣化を防止することから、香気成分、有効成分の安定化・保持に極めて優れている。この際、必要に応じて、サイクロデキストリン類、分岐サイクロデキストリン類、グルコース４分子がα−１，３及びα−１，６結合で交互に結合した環状四糖、分岐環状四糖類、グルコース４分子がα−１，４及びα−１，６結合で交互に結合した環状マルトシルマルトース、サイクロデキストラン類、サイクロフラクタン類など他の環状糖質を併用することで、包接による安定化を強化することも有利に実施できる。サイクロデキストリン類など環状糖質としては、高純度のものに限る必要はなく、低純度の環状糖質、例えば、多量のマルトデキストリンとともに各種の環状糖質を含有した澱粉部分分解物なども有利に利用できる。

さらに、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖はα−アミラーゼやα−グルコシダーゼによって実質的に分解されないことから、経口摂取しても消化吸収されない、難消化性の糖質であって、無毒、無害の新規な糖質である。

従って、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれを含む糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。

本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれを含む糖質は、そのまま甘味付のための調味料として使用できる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、トレハロース、蜂蜜、メープルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、スクラロース、Ｌ−アスパラチルフェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料と、また、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。

また、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれを含む糖質の粉末状製品は、そのままで、または必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成形して使用することも随意である。

また、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれを含む糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種の物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。

例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料への甘味料、更には、呈味改良剤、品質改良剤などとして使用することも有利に実施できる。また、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、ふぐのみりん干し、タラ、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、増醸酒、清酒、果実酒、発泡酒、ビールなどの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付に、呈味改良に、品質改良などに有利に実施できる。

また、家畜、家禽、その他は蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料など嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種の固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、または呈味改良剤、矯味剤として、さらに品質改良剤、安定剤などとして有利に利用できる。

品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性など失い易い各種生理活性物質またはこれを含む健康食品、機能性食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、インターフェロン−α、−β、−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有液、ＥＰＡ、ＤＨＡ、アラキドン酸、などの高度不飽和脂肪酸又はそのエステル誘導体、リパーゼ、エステラーゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペースト、ローヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペースト状または固状の健康食品、機能性食品や医薬品などを容易に製造できることとなる。

以上述べたような各種組成物に、イソサイクロマルトオリゴ糖又はこれを含む糖質を含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常０．１質量％以上、望ましくは１質量％以上含有せしめるのが好適である。

以下、実験により本発明を詳細に説明する。

＜実験１：非還元性糖質の調製＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社製造）１．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社製造）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『酵母エキスＳ』、日本製薬株式会社製造）０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．３ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコ１０本に３０ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却した。次いで、バチルス・サーキュランス ＡＭ７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１１１）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで１２０時間回転振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清（約０．３Ｌ）を得た。得られた培養上清の０．２５Ｌを酵素液として用いて、これを２ｗ／ｖ％アミロース及び２ｍＭ塩化カルシウムを含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．２５Ｌに添加し、４８時間、４０℃で反応させた後、約１００℃で１０分間、熱処理することによって反応を停止した。

続いて、夾雑する還元糖をグルコースまで加水分解するため、上述の反応物を塩酸でｐＨ５．０に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野エンザイム株式会社製造）を固形物１グラム当り４００単位及びグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）を固形物１グラム当り２５単位添加して５０℃、２４時間反応させた。反応後、約１００℃で１０分間、熱処理して反応を停止させた。得られた反応液中の糖質を分析用の高速液体クロマトグラフィー（以下、分析ＨＰＬＣと略称する。）で分析したところ、溶出時間５７.３分のグルコース、溶出時間４３．７分の糖質（以下、糖質Ｉと略称する。）、及び、溶出時間３７．１分の糖質（以下、糖質ＩＩと略称する。）が検出さた。それぞれの組成は、グルコースが７３．３％で、糖質Ｉが２４．２％で、糖質ＩＩが２．５％であった。
なお、分析ＨＰＬＣは、、カラムに『ＭＣＩｇｅｌ ＣＫ０４ＳＳ』（三菱化学株式会社製造）の２本を直列につなぎ、溶離液に水を用いて、カラム温度８０℃、流速０．４ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩＤ−１０Ａ（株式会社島津製作所製造）を用いて行った。

続いて、上述の反応液中の不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』と『ダイヤイオンＷＡ３０』及びオルガノ製イオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』を用いて脱色、脱塩し、濃縮し、精密濾過した後、調製用ＨＰＬＣで分画したところ、グルコースは溶出時間２９分から４０分に溶出し、糖質Ｉは溶出時間５７分から７５分に溶出し、糖質ＩＩは溶出時間１２０分から１８０分に溶出した。糖質Ｉと糖質ＩＩの画分を別々に回収し、精密濾過した後、真空乾燥して、糖質Ｉを固形物として約８５０ｍｇ、糖質ＩＩを固形物として約１００ｍｇを得た。なお、調製用ＨＰＬＣは、『ＯＤＳ−ＡＱ Ｒ−３５５−１５ＡＱ』カラム（ＹＭＣ株式会社製造）を用い、溶離液に７．５％（ｖ／ｖ）メタノールを用いて、カラム温度２５℃、流速２０ｍｌ／分の条件で行った。

得られた糖質Ｉ及び糖質ＩＩ標品の糖組成を分析ＨＰＬＣで調べたところ、図１及び図２に示すように、糖質Ｉ及び糖質ＩＩの含量はいずれも９７％以上であり、極めて高純度であることが判明した。

また、糖質Ｉ及び糖質ＩＩ標品の還元力をソモギー・ネルソン法で測定したところ、両標品とも還元力は検出限界以下であり、糖質Ｉ及び糖質ＩＩは実質的に非還元性であると判断された。

＜実験２：糖質Ｉの構造解析＞

＜実験２−１：質量分析＞
実験１の方法で得られた糖質Ｉ標品について、質量分析装置『ＬＣＱ−Ａｄｖａｎｔａｇｅ』（サーモエレクトロン社製）を用いて質量分析したところ、質量数８３３のナトリウム付加分子イオンが顕著に検出され、糖質Ｉの質量数は８１０であることが判明した。

＜実験２−２：構成糖分析＞
実験１の方法で得られた糖質Ｉ標品について、常法に従って、硫酸を用いて単糖にまで加水分解し、ガスクロマトグラフィーで構成糖を調べたところ、Ｄ−グルコースのみが検出され、糖質ＩはＤ−グルコースのみを構成糖とすることが判明した。上述の質量数を考慮すると、糖質ＩはＤ−グルコース５分子からなる環状糖質であることがわかった。

＜実験２−３：メチル化分析＞
実験１の方法で得られた糖質Ｉ標品について、常法に従って、メチル化分析を行いガスクロマトグラフィーでメチル化物を調べた。結果を表１にまとめた。

表１の結果から明らかなように、２，３，４−トリメチル化物と２，３，６−トリメチル化物の比率がほぼ１：４であることから、糖質Ｉを構成するＤ−グルコース５分子のうち、１分子は１位と６位でグルコシド結合しており、また、他の４分子は1位と４位でグルコシド結合していることが判明した。

＜実験２−４：核磁気共鳴分析＞
実験１の方法で得られた糖質Ｉ標品を用い、常法に従って、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析を行った。^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３に、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図４に示した。^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける約５．０７ｐｐｍのシグナル、約５．００ｐｐｍのシグナル、約４．９９ｐｐｍのシグナル、約４．９８ｐｐｍのシグナル、及び、約４．８７ｐｐｍのシグナルはＤ−グルコース残基の１位プロトンに帰属され、そのスピン−スピン結合定数を求めたところ、約３．４９Ｈｚ（約５．０７ｐｐｍのシグナル）、約３．８６Ｈｚ（約５．００ｐｐｍのシグナル）、約２．３９Ｈｚ（約４．９９ｐｐｍのシグナル）、約２．９４Ｈｚ（約４．９８ｐｐｍのシグナル）、及び、約３．３１Ｈｚ（約４．８７ｐｐｍのシグナル）であったことから、１，４グルコシド結合しているＤ−グルコース残基の１位のアノマー型及び１，６グルコシド結合しているＤ−グルコース残基の１位のアノマー型は両方ともα型であることが判明した。

以上の結果から、糖質Ｉは、図５に示すサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状グルコ五糖、すなわち、イソサイクロマルトペンタオースであることが判明した。この構造を有する糖質は従来全く知られておらず、本発明のイソサイクロマルトペンタオースは新規な環状糖質である。

＜実験３：糖質ＩＩの構造解析＞

＜実験３−１：質量分析＞
実験１の方法で得られた糖質ＩＩ標品について、質量分析装置『ＬＣＱ−Ａｄｖａｎｔａｇｅ』を用いて質量分析したところ、質量数９９５のナトリウム付加分子イオンが顕著に検出され、糖質ＩＩの質量数は９７２であることが判明した。

＜実験３−２：構成糖分析＞
実験１の方法で得られた糖質ＩＩ標品について、常法に従って、硫酸を用いて単糖にまで加水分解し、ガスクロマトグラフィーで構成糖を調べたところ、Ｄ−グルコースのみが検出され、糖質ＩＩはＤ−グルコースのみを構成糖とすることが判明した。上述の質量数を考慮すると、糖質ＩＩはＤ−グルコース６分子からなる環状糖質であることがわかった。

＜実験３−３：メチル化分析＞
実験１の方法で得られた糖質ＩＩ標品について、常法に従って、メチル化分析を行いガスクロマトグラフィーでメチル化物を調べた。結果を表２にまとめた。

表２の結果から明らかなように、２，３，４−トリメチル化物と２，３，６−トリメチル化物の比率がほぼ１：５であることから、糖質ＩＩを構成するＤ−グルコース６分子のうち、１分子は１位と６位でグルコシド結合しており、また、他の５分子は1位と４位でグルコシド結合していることが判明した。

＜実験３−４：核磁気共鳴分析＞
実験１の方法で得られた糖質ＩＩ標品を用いて、常法に従って、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析を行った。^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図６に、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図７に示した。^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける約５．２０ｐｐｍのシグナル、約５．００ｐｐｍのシグナル、約４．９９ｐｐｍのシグナル、約４．９７ｐｐｍのシグナル、約４．９６ｐｐｍのシグナル、及び、約４．８６ｐｐｍのシグナルはＤ−グルコース残基の１位プロトンに帰属され、そのスピン−スピン結合定数を求めたところ、約３．４９Ｈｚ（約５．２０ｐｐｍのシグナル）、約２．５７Ｈｚ（約５．００ｐｐｍのシグナル）、約３．１３Ｈｚ（約４．９９ｐｐｍのシグナル）、約４．０４Ｈｚ（約４．９７ｐｐｍのシグナル）、約３．８６Ｈｚ（約４．９６ｐｐｍのシグナル）、及び、約３．８６Ｈｚ（約４．８６ｐｐｍのシグナル）であったことから、１，４グルコシド結合しているＤ−グルコース残基の１位のアノマー型及び１，６グルコシド結合しているＤ−グルコース残基の１位のアノマー型は両方ともα型であることが判明した。

以上の結果から、糖質ＩＩは、図８に示すサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状グルコ六糖、すなわち、イソサイクロマルトヘキサオースであることが判明した。この構造を有する糖質は従来全く知られておらず、本発明のイソサイクロマルトヘキサオースは新規な環状糖質である。

＜実験４：イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の生産＞
実験１に記載の液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコ２本に１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス・サーキュランス ＡＭ７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１１１）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。

容量３０Ｌのファーメンターに種培養と同じ組成の液体培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約２００ｍｌを接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、９６時間通気攪拌培養した。培養後、ファーメンターから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清約１８Ｌを得た。培養液及び培養上清について、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素活性を測定したところ、培養液中には該酵素活性を約０．０２７単位／ｍｌ含み、上清中には該酵素活性を約０．０２５単位／ｍｌ含むことがわかり、バチルス・サーキュランス ＡＭ７によって生産されるイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素はその大部分が菌体外に存在することが判明した。

＜実験５：イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の精製＞
実験４で得た培養上清のうち、約１０Ｌ（総活性約２５０単位）に、最終濃度８０％飽和となるように硫安を添加し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。生成した塩析沈殿物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、粗酵素液として約２４０ｍｌを得た。粗酵素液中のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素活性は約０．９６単位／ｍｌであった（総活性約２３０単位）。この粗酵素液を東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ） ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量１２０ｍｌ）に供した。イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素活性のある画分は、１０ｍＭ酢酸（ｐＨ６．０）で平衡化した『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出した。この活性画分を回収し、終濃度１Ｍとなるように硫安を添加して４℃、２４時間放置した後、遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ） ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル容量６０ｍｌ）に供した。イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素のある画分は、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した『ブチル−トヨパール ６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安濃度１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．１Ｍ付近に溶出した。この精製の各ステップにおけるイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の活性、比活性及び収率を表３に示す。

精製したイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。

＜実験６：イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の性質＞

＜実験６−１：分子量＞
実験５の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の分子量は１０６，０００±２０，０００ダルトンであることが判明した。

＜実験６−２：等電点＞
実験５の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を２．２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・バイオサイエンス社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、同時に泳動した等電点マーカー（アマシャム・バイオサイエンス社製）と比較して等電点を求めたところ、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の等電点はｐＩ７．５±０．５であることが判明した。

＜実験６−３：酵素反応の至適温度及び至適ｐＨ＞
実験５の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図９（至適温度）、図１０（至適ｐＨ）に示した。イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５０乃至５５℃であり、至適ｐＨは、３０℃、３０分間反応の条件下で４．５乃至８．０であることが判明した。

＜実験６−４：酵素の温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験５の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を用いて、本酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を塩化カルシウム非存在下または１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ１００ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図１１（温度安定性）、図１２（ｐＨ安定性）に示した。図１１から明らかなように、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の温度安定性は、塩化カルシウム非存在下で３５℃まで、塩化カルシウム１ｍＭ存在下で４０℃までであることが判明し、カルシウムイオンによって本酵素の温度安定性が向上することがわかった。また、図１２から明らかなように、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素のｐＨ安定性はｐＨ４．５乃至９．０の範囲であることが判明した。

＜実験６−５：酵素活性に及ぼす金属塩の影響＞
実験５の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を用いて、酵素活性に及ぼす金属塩の影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表４に示す。

表４の結果から明らかなように、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素活性は、ＨｇＣｌ_２で４５％阻害され、ＦｅＣｌ_３及びＣｕＣｌ_２で約２０％阻害されることが判明した。また、金属イオンのキレート剤であるＥＤＴＡによっても弱く阻害された。

＜実験６−６：Ｎ末端アミノ酸配列＞
実験５の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を用いて、本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー モデル４９２ＨＴ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列、すなわち、アラニン―セリン−イソロイシン−グリシン−スレオニン−バリン−スレオニン−グルタミン酸−アスパラギン−アスパラギン酸−スレオニン−イソロイシン−チロシン−グルタミン−イソロイシン−メチオニン−バリン−アスパラギン酸−アルギニン−フェニルアラニン を有していることが判明した。

＜実験６−７：部分アミノ酸配列＞
実験５の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を適量とり、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析した後、同緩衝液を加えて蛋白濃度約１ｍｇ／ｍｌとした。この溶液を約１ｍｌとり、リジルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）２０μｇを加えて、３０℃、２０時間保持して酵素蛋白を加水分解した。加水分解物を予め１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で平衡化させておいたＨＰＬＣ用カラム（商品名『マイクロボンダスフェアーＣ１８』、直径３．９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）に注入し、流速０．９ｍｌ／分、室温の条件下、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸−１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液から０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸−５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液の１００分間のリニアグラジエントで通液し、ペプチド断片を分画した。カラムから溶出したペプチド断片は波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。通液開始から約１４分、約１８分、約３０分、約３５分、約３８分、約６１分、約６４分、約６７分及び約８２分に溶出した９種のペプチド断片のアミノ酸配列を、それぞれ実験６−６と同じ方法で分析したところ、それぞれ配列表における配列番号４乃至１２に示されるアミノ酸配列を有していた。

＜実験７：イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素をコードするＤＮＡのクローニング及びこれを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製＞
イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素をコードするＤＮＡをバチルス・サーキュランス ＡＭ７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１１１）からクローニングし、自律複製可能な組換えＤＮＡの作製、酵素をコードするＤＮＡの塩基配列の決定、及び形質転換体の調製を行った。

＜実験７−１：染色体ＤＮＡの調製＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社製造）０．２５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『粉末酵母エキスＳ』、日本製薬株式会社販売）０．２ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社販売）１．０ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス・サーキュランス ＡＭ７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１１１）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで５日間回転振盪培養した。

遠心分離により培養物から採取した菌体をＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加え、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷水中で冷却しながら１０分間激しく振盪した後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈殿した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテイナーゼをそれぞれ７．５μｇと１２５μｇ加え、３７℃で１時間保持して反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈殿を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０℃で凍結した。

＜実験７−２：ＰＣＲによる部分ＤＮＡ断片のクローニング＞
イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素をコードするＤＮＡのクローニングを行うに先立ち、まず、その部分ＤＮＡ断片のＰＣＲ−クローニングを行った。イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素のＮ末端アミノ酸配列である配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列における第１０乃至第１５番目及び第１３乃至第１８番目のアミノ酸配列に基づき、配列表における配列番号１３及び１４で示される２種のセンスプライマーＦ１及びＦ２を合成した。また、当該酵素の内部アミノ酸配列である配列表における配列番号４で示されるアミノ酸配列における第４乃至第８番目及び第１乃至第５番目のアミノ酸配列に基づき、配列表における配列番号１５及び１６で示される２種のアンチセンスプライマーＲ１及びＲ２を合成した。センスプライマーＦ１とアンチセンスプライマーＲ１の組合せで、実験７−１で得た染色体ＤＮＡを鋳型として１回めのＰＣＲを常法に従い行った。次いで、得られたＰＣＲ産物を鋳型としてセンスプライマーＦ２とアンチセンスプライマーＲ２の組合せで２回目のＰＣＲを行ったところ、約２００塩基対と約３００塩基対の２種のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片が認められた。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片は、プラスミド（商品名「ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）」、ストラタジーン社販売）の制限酵素Ｓｒｆ Ｉ部位に挿入した後、通常のコンピテントセル法によりコンピテントセル（商品名『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』、ストラタジーン・クローニング・システム製）を形質転換した。得られた形質転換体から通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出し、目的とする約３００塩基対の挿入ＤＮＡ断片を有する組換えＤＮＡを保持する形質転換体を選択した。次いで、この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、配列表における配列番号１７で示される鎖長２５１塩基対の塩基配列を有するＤＮＡを含んでいた。

配列表における配列番号１７に併記されたアミノ酸配列の第３７乃至第４６番目及び第４７乃至６０番目のアミノ酸配列は、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の部分アミノ酸配列である配列表における配列番号６及び１０で示されるアミノ酸配列と完全に一致したことから、上記ＤＮＡ断片は、バチルス・サーキュランス ＡＭ７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１１１）に由来するイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の一部をコードするＤＮＡ断片であることが判明した。

＜実験７−３：コロニーハイブリダイゼーション法によるイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素をコードするＤＮＡのクローニング＞
実験７−１で調製した精製染色体ＤＮＡ溶液を０．１ｍｌとり、これに制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩを約１００単位加え、３７℃で１時間反応させて染色体ＤＮＡを加水分解した後、アガロース電気泳動法により約５，０００乃至９，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、プラスミドベクター（ストラタジーン・クローニング・システム製、登録商標『ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）』）を常法により制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩを作用させ完全に切断した後、その切断されたプラスミドベクター０．５μｇと先に得たＤＮＡ断片約５μｇとを市販のキット（宝酒造製、商品名『ＤＮＡライゲーション・キット』）を用いて、添付の説明書に従って操作し、連結した。得られた組換えＤＮＡを用いて、通常のコンピテントセル法によりコンピテントセル（商品名『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』、ストラタジーン・クローニング・システム製）を形質転換してＨｉｎｄ ＩＩＩ染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。

このようにして得た形質転換体を、常法により調製した、１０ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、１００ｍｇ／ｌアンピシリンナトリウム塩、５０ｍｇ／ｌ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間培養後、培地上で形成されたコロニー約６５５個をナイロン膜（商品名『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』、アマシャム製）上に固定した。別途、実験７−２で調製した組換えＤＮＡを制限酵素Ｎｏｔ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで消化した後、常法のアガロースゲル電気泳動法により目的とする約３００塩基対のＤＮＡ断片を採取し、ＤＮＡ標識キット（商品名「ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社販売）を用いて標識し、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）標識プローブとした。前記した、ナイロン膜上に固定したコロニー６５５株に対して、ＤＩＧ標識プローブを用いて通常のコロニーハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンとして１種類の形質転換体を得た。この形質転換体を『ＢＡＭＨ１』と命名した。

＜実験７−４：イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素をコードするＤＮＡの塩基配列の決定＞
形質転換体ＢＡＭＨ１を、常法に従い１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム塩を含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、バチルス・サーキュランス ＡＭ７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１１１）に由来する、配列表における配列番号１８で示される鎖長２，９８５塩基対の塩基配列を有するＤＮＡを含んでいた。図１３に示すように、この組換えＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡは、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩによる認識部位の下流に連結されていた。一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号１８で示される塩基配列に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験６−６の方法で確認された本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素のＮ末端アミノ酸配列及び実験６−７の方法で明らかにされた部分アミノ酸配列である、配列表における配列番号１及び配列番号４乃至１２で示されるアミノ酸配列と比較したところ、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列は、配列表における配列番号１８に併記したアミノ酸配列における第３６乃至５５番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２に示されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列表における配列番号１８で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列における第１２６乃至１３５番目、第１４０乃至１４９番目、第８４乃至９３番目、第１５２乃至１６３番目、第８０６乃至８１６番目、第９２５乃至９３９番目、第９４乃至１０７番目、第１８５乃至１９７番目、及び第２７２乃至２８６番目のアミノ酸配列と完全に一致した。以上のことは、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素が、配列表における配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むものであり、当該酵素はバチルス・サーキュランス ＡＭ７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１１１）においては、配列表における配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。また、配列表における配列番号１８に併記したアミノ酸配列における第１乃至３５番目のアミノ酸配列は、当該酵素の分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該酵素の分泌前の前駆体は、配列表における配列番号１８に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号１８に示す塩基配列にコードされていることが判明した。以上のようにして調製し、塩基配列を確認した組換えＤＮＡを『ｐＢＡＭＨ１』と命名した。

＜実験８：発現用組換えＤＮＡｐＥＴＡＭ１の作製とその形質転換体ＥＴＡＭ１による組換え型イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の産生＞
組換えＤＮＡ『ｐＢＡＭＨ１』中のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素遺伝子を発現用ベクターに挿入し、組換え型イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の大腸菌における発現を検討した。

＜実験８−１：発現用組換えＤＮＡ、ｐＥＴＡＭ１の作製及び形質転換体ＥＴＡＭ１の調製＞
ｐＢＡＭＨ１中のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素遺伝子を発現用ベクターに組込むに際し、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の構造遺伝子の上流に制限酵素Ｎｄｅ Ｉ認識部位を導入し、当該構造遺伝子内部に存在するＮｄｅ Ｉ認識部位を削除する目的でＰＣＲによる変異を導入した。ｐＢＡＭＨ１を鋳型として用い、ｐＢＡＭＨ１のベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）におけるイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の構造遺伝子の上流に位置する塩基配列に基づき合成した配列表における配列番号１９で示される塩基配列を有するセンスプライマーと構造遺伝子内部のＮｄｅ Ｉ認識部位の塩基配列に基づき合成した配列表における配列番号２２で示される塩基配列を有するアンチセンスプライマーの組合せ、及び、構造遺伝子内部のＮｄｅ Ｉ認識部位の塩基配列に基づき合成した配列表における配列番号２１で示される塩基配列を有するセンスプライマーと構造遺伝子の下流に位置する制限酵素Ｂａｍ ＨＩ認識部位の塩基配列に基づき合成した配列表における配列番号２３で示される塩基配列を有するアンチセンスプライマーの組合せで１次ＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡ断片を得た。次いで、この得られた増幅ＤＮＡ断片を鋳型とし、構造遺伝子の上流にＮｄｅ Ｉ認識部位を導入するために合成した配列表における配列番号２０で示される塩基配列を有するセンスプライマーと構造遺伝子の下流に位置する制限酵素Ｂａｍ ＨＩ認識部位の塩基配列に基づき合成した配列表における配列番号２３で示される塩基配列を有するアンチセンスプライマーの組合せで２次ＰＣＲを行い、目的とするＮｄｅ Ｉ認識部位を構造遺伝子の上流に有し、構造遺伝子内部のＮｄｅ Ｉ認識部位が削除されたイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素遺伝子を増幅した。常法により、制限酵素Ｎｄｅ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで消化した発現用ベクターｐＥＴ−３８ｂ（＋）（ノバジェン社製）に、上記で増幅したＤＮＡを組込んで得られた組換えＤＮＡを『ｐＥＴＡＭ１』と命名した。ｐＥＴＡＭ１を図１４に示す。ｐＥＴＡＭ１を用いて大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡株式会社販売）を形質転換し、得られた形質転換体からｐＥＴＡＭ１を調製し、発現用宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換して形質転換体『ＥＴＡＭ１』を調製した。

＜実験８−２：形質転換体ＥＴＡＭ１による組換え型イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の産生＞
１０ｇ／ｌトリプトン（商品名『Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ』、Ｄｉｆｃｏ社販売）、５ｇ／ｌ酵母エキス（商品名『Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ』、Ｄｉｆｃｏ社販売）及び１０ｇ／ｌ食塩及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、無菌的にｐＨ７．５に調整した後、カナマイシン２ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験８−１の方法で得た形質転換体ＥＴＡＭ１を接種し、２７℃で回転振盪培養して濁度が約０．６に達した時点でイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．４ｍＭになるように添加してイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素遺伝子の発現を誘導し、さらに３時間培養した。得られた培養物を、常法に従い、遠心分離して培養上清と菌体とに分離して回収した。菌体については、超音波破砕法により細胞からの全抽出物を調製した。超音波破砕法は、菌体を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザー（モデルＵＨ−６００、株式会社エスエムテー製）で細胞破砕することによって行い、その破砕物を全細胞抽出物とした。

このようにして調製した培養上清と全細胞抽出物とについて、それぞれのイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素活性を測定し、それぞれの活性値を培養物１ｍｌ当りに換算した。なお、対照としてプラスミドｐＥＴ−３８ｂ（＋）を保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を上述の形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と全細胞抽出物を調製し、同様にイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素活性を測定した。これらの結果を表５に示す。

表５の結果から明らかなように、形質転換体ＥＴＡＭ１は、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を細胞内に産生することが判明した。宿主である対照の大腸菌では培養上清、全細胞抽出物のいずれにも当該酵素活性は全く認められなかった。

この実験８の方法で得た全細胞抽出物を、さらに実験５に示した方法に準じて、塩析、透析し、ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓゲル、ブチル−トヨパール ６５０Ｍゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、さらにこの精製酵素標品を実験６に示した方法に準じて分析した。その結果、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は約１０６，０００±２０，０００ダルトン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点は約７．５±０．５、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素活性の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で約５０乃至５５℃、至適ｐＨは３０℃、３０分間反応の条件下で約４．５乃至８．０、温度安定性は、各温度に６０分間保持する条件下で、塩化カルシウム非存在下で３５℃まで、１ｍＭ塩化カルシウム存在下で約４０℃まで安定であり、ｐＨ安定性は、各ｐＨに４℃で２４時間保持する条件下で約４．５乃至９．０の範囲で安定であった。これらの理化学的性質は、実験５に示された方法で調製された当該酵素のそれと実質的に同一であった。以上の結果は、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素は、組換えＤＮＡ技術によって良好に製造できることを示している。

＜実験９：各種糖質への作用＞
各種糖質を用いて、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の基質特異性を調べた。マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、ネオトレハロース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース、イソパノース、マルチトール、マルトトリイトール、α−、β−又はγ−サイクロデキストリン、アミロース、可溶性澱粉、グリコーゲン、プルラン又はデキストランを含む水溶液を調製した。これらの基質溶液に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験５の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を基質固形物１グラム当たりそれぞれ１単位ずつ加え、基質濃度を２ｗ／ｖ％になるように調整し、これを４０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させた。酵素反応前後の反応液中の糖質を調べるため、展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）を、また、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル６０』（アルミプレート、１０×２０ｃｍ）を用い、２回展開するシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略す）を行い、糖質を分離した。硫酸−メタノール法にて発色させ、分離した糖質を検出し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無又は強さの程度を確認した。結果を表６に示す。

表６の結果から明らかなように、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素は、試験した糖質のうち、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースによく作用し、また、マルトトリオースに僅かに作用した。さらに、アミロース、可溶性澱粉、グリコーゲンにも、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素はよく作用した。これらの結果より、本酵素はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用することが判明した。

＜実験１０：作用メカニズム＞

＜実験１０−１：マルトヘキサオースからの生成物＞
最終濃度１ｗ／ｖ％のマルトヘキサオース水溶液に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験５の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を、基質固形物１グラム当たり１単位加え、４５℃、ｐＨ６．０で作用させ、経時的にサンプリングを行い、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成を、ＨＰＬＣを用いて測定した。ＨＰＬＣは、、カラムに『ＭＣＩｇｅｌ ＣＫ０４ＳＳ』（三菱化学株式会社製造）の２本を直列につなぎ、溶離液に水を用いて、カラム温度８０℃、流速０．４ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩＤ−１０Ａ（株式会社島津製作所製造）を用いて行った。その結果を表７に示す。

表７の結果から明らかなように、本酵素の作用の結果、基質マルトヘキサオースから、マルトヘキサオースよりも重合度の低いマルトオリゴ糖、イソサイクロマルトペンタオース、イソサイクロマルトヘキサオースおよびマルトヘキサオースよりも重合度の高いマルトオリゴ糖を生成することが判明した。この結果から推察すると、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素はマルトヘキサオースに作用して、マルトースからマルトペンタオースまでの一連のマルトオリゴ糖を分子間でα−１,４転移して、グルコース重合度８以上のマルトオリゴ糖を含むグルコース重合度の種々異なるマルトオリゴ糖の生成（不均化反応）を触媒すると同時に、グルコース重合度が７のマルトオリゴ糖（マルトヘプタオース）から、マルトペンタオース単位で切断し分子内でα−１,６転移して、イソサイクロマルトペンタオースを生成し、またグルコース重合度が８以上のマルトオリゴ糖から、マルトペンタオース又はマルトヘキサオース単位で切断し分子内でα−１,６転移して、イソサイクロマルトペンタオース及びイソサイクロマルトヘキサオースを生成すると推定された。

以上のことから、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素によるイソサイクロマルトオリゴ糖の反応メカニズムは以下のように考えられた。本酵素は、基質としてグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、一連のマルトオリゴ糖を分子間でα−１,４転移して、重合度の異なるマルトオリゴ糖の生成（不均化反応）を触媒する。一方、グルコース重合度が７のα−１，４グルカン（マルトヘプタオース）に作用する場合には、その非還元性末端よりマルトペンタオース単位で切断し、マルトペンタオースの非還元末端グルコースの６位水酸基に還元末端グルコースの1位を分子内で転移する環化反応を触媒することにより、イソサイクロマルトペンタオースとマルトースとを生成する。また、グルコース重合度が８以上のα−１，４グルカンに作用する場合には、その非還元性末端よりマルトペンタオース又はマルトヘキサオース単位で切断し、マルトペンタオース又はマルトヘキサオースの非還元末端グルコースの６位水酸基に還元末端グルコースの1位を分子内で転移する環化反応を触媒することにより、イソサイクロマルトペンタオース及びイソサイクロマルトヘキサオースと、グルコース重合度が５又は６減じたα−１，４グルカンとを生成する。

＜実験１１：各種基質からのイソサイクロマルトオリゴ糖の生成＞
本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素用いて、各種糖質からのイソサイクロマルトオリゴ糖の生成を試験した。マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、アミロース、可溶性澱粉、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社製造）、グリコーゲン（トウモロコシ由来、キューピー株式会社製造）の各水溶液を調製した。

これらの水溶液（最終濃度１．０ｗ／ｖ％）に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験５の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位加え、これらを４５℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、その反応液を１００℃で１０分間加熱して反応を停止させた。実験１と同様にα−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼで処理した後、ＨＰＬＣでイソサイクロマルトオリゴ糖を定量し、イソサイクロマルトオリゴ糖の生成率を求めた。それらの結果を表８に示す。

表８の結果から明らかなように、試験したいずれの糖質からも、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の作用によってイソサイクロマルトペンタオース及びイソサイクロマルトヘキサオースが生成した。その生成率の合計は、基質がマルトヘキサオースの場合約１４％と低いのに対して、基質がアミロースの場合約２９％と最も高く、次いで可溶性澱粉、澱粉部分分解物の順であった。

＜実験１２：イソサイクロマルトオリゴ糖生成反応と反応産物の還元力＞
アミロース水溶液（最終濃度１．０ｗ／ｖ％）に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験５の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位加え、これらを４５℃、ｐＨ６．０で反応させ、酵素添加直後にサンプリングし、サンプリングしたものを直ちに約１００℃で１０分間加熱して反応を停止し、水冷し、反応０時間の反応液を得た。続いて、反応１、２、３、４時間、それぞれの時点でサンプリングし、直ちに約１００℃で１０分間加熱して反応を停止し、水冷し、反応１時間、反応２時間、反応３時間、反応４時間のそれぞれの反応液を得た。得られた反応液の還元糖量をソモギー・ネルソン法で、全糖量をアンスロン硫酸法で測定し、全糖量に占める還元糖量の割合を百分率（％）で表し、還元力とした。また、反応液を実験１と同様にα−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼで処理した後、ＨＰＬＣでイソサイクロマルトオリゴ糖を定量し、イソサイクロマルトオリゴ糖の生成率を求めた。これらの結果を表９にまとめた。

表９の結果から明らかなように、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を可溶性澱粉に作用させ、イソサイクロマルトオリゴ糖類を生成させたところ、イソサイクロマルトオリゴ糖の生成率が１０％以上の場合でも、還元力の増加は０．１％程度とごく僅かであることが判明した。このことは、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素が本質的に転移・環化反応を触媒する酵素であり、それら反応に際してはほとんど加水分解を伴わないことを意味している。澱粉やその分解物などに本酵素を作用させ、イソサイクロマルトオリゴ糖類を生成させる際、反応前の澱粉やその分解物の還元力、すなわち、ＤＥを低くしておけば、増加する還元力が僅かなため、還元力が低い生成物が得られることがわかった。

＜実験１３：イソサイクロマルトオリゴ糖の生成に及ぼすイソアミラーゼ及びプルラナーゼの添加効果＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社製）水溶液（最終濃度１ｗ／ｖ％）を調製し、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験５の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を固形物１グラム当りそれぞれ０、１２５、２５０、５００、１２５０又は２５００単位加え、４５℃、ｐＨ５．５で２４時間作用させた後、１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、反応液を実験１と同様にα−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼで処理した後、ＨＰＬＣでイソサイクロマルトオリゴ糖を定量し、イソサイクロマルトオリゴ糖生成率を求めた。また、イソアミラーゼに替えてプルラナーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を用い、固形物１グラム当りそれぞれ０、１．３、２．７、５．３、１３．３又は２６．７単位加えて同様の操作を行い、イソサイクロマルトオリゴ糖生成率を求めた。それらの結果を表１０及び表１１に示す。

表１０及び表１１の結果から明らかなように、イソアミラーゼ又はプルラナーゼを添加することによって、イソサイクロマルトオリゴ糖類の生成率が増加することが判明した。

＜実験１４：イソサイクロマルトオリゴ糖の生成に及ぼす液化澱粉ＤＥの影響＞
とうもろこし澱粉を濃度２質量％澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを０．１質量％加えてｐＨ６．０に調整し、α−アミラーゼ（ノボ社製造、商品名『ターマミール６０Ｌ』）を澱粉グラム当り０．２、０．４、０．６、１．０、１．５又は２．０質量％加え、それぞれ９５℃で１０分間反応させ、次いで、１２０℃でオートクレーブし、約４０℃に急冷して、ＤＥ３．１乃至２０．４の表１０に示す６種類の澱粉液化液を得た。これらの澱粉液化液（最終濃度１質量％）に、実験５の方法で得た精製イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位加え、４５℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた。これら熱失活させた反応液中のイソサイクロマルトオリゴ糖類の生成量を調べるために、実験１と同様にα−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼを添加し反応させた後、ＨＰＬＣでイソサイクロマルトオリゴ糖を定量し、イソサイクロマルトオリゴ糖生成率を求めた。それらの結果を表１２に示す。

表１２の結果から明らかなように、本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素によるイソサイクロマルトオリゴ糖類の生成率は、液化澱粉のＤＥによって影響され、ＤＥが低値であるほど、イソサイクロマルトオリゴ糖の生成率は高く、逆に、ＤＥが高値であるほど、イソサイクロマルトオリゴ糖の生成率が低いことが判明した。具体的には、液化澱粉のＤＥは約２０以下、望ましくは、ＤＥ約８以下、更に望ましくは、ＤＥ約５以下が適していることが判明した。

＜実験１５：イソサイクロマルトオリゴ糖の熱安定性＞
実験１１の方法で可溶性澱粉から調製し、実験１の方法で純度１００％まで精製して得たイソサイクロマルトペンタオースを脱イオン水に溶解し、濃度５ｗ／ｖ％のイソサイクロマルトペンタオース溶液を調製した。その溶液８ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。放冷後、それら溶液の着色度の測定と、ＨＰＬＣ法によるイソサイクロマルトペンタオースの純度測定を行った。着色度は４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度とした。結果を表１３に示した。

表１３の結果から明らかなように、イソサイクロマルトペンタオース水溶液は１２０℃の高温加熱においても着色せず、分解による純度低下も認められず、イソサイクロマルトペンタオースは熱に対して安定な糖質であることが判明した。

＜実験１６：イソサイクロマルトオリゴ糖のｐＨ安定性＞
実験１５で用いたイソサイクロマルトペンタオースを各種緩衝液に溶解し、イソサイクロマルトペンタオース濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨを２乃至１０に調整した９種類のイソサイクロマルトペンタオース溶液を調製した。それぞれの溶液８ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１００℃で２４時間加熱した。放冷後、実験１５と同様にそれら溶液の着色度の測定と、ＨＰＬＣ法によるイソサイクロマルトペンタオースの純度測定を行った。結果を表１４に示した。

表１４から明らかなように、イソサイクロマルトペンタオースは１００℃、２４時間の加熱において、ｐＨ５乃至１０の範囲で実質的に分解されず、弱酸性からアルカリ性の広い範囲で安定であることが分かった。しかしながら、ｐＨ４では僅かに、ｐＨ３では半分以上が分解され、ｐＨ２では完全に分解され消失した。

＜実験１７：アミノカルボニル反応＞
実験１５で用いたイソサイクロマルトペンタオースと市販試薬特級グリシンとを脱イオン水に溶解し、さらに、リン酸緩衝液でｐＨ７．０に調整した１ｗ／ｖ％グリシンを含む５ｗ／ｖイソサイクロマルトペンタオース溶液を調製した。対照として、イソサイクロマルトペンタオースの代わりにα−サイクロデキストリンを用いた以外は上記と同様にしてα−サイクロデキストリン含有溶液を調製した。それぞれの溶液４ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しアミノカルボニル反応性を調べた。同時にグリシンのみを含む溶液を同様に加熱しブランクとした。着色度は４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度とし、ブランクの値を差し引いた値とした。結果を表１５に示す。

表１５の結果から明らかなように、イソサイクロマルトペンタオースは着色度の上昇を示さず、対照のα−サイクロデキストリンと同様にグリシン共存下で加熱しても着色、褐変を起こしにくい、アミノカルボニル反応性の低い安定な糖質であることが分かった。

＜実験１８：アミノカルボニル反応＞
実験１５で用いたイソサイクロマルトペンタオースと市販ポリペプトン（日本製薬製）とを脱イオン水に溶解し、５ｗ／ｖ％ポリペプトンを含む５ｗ／ｖイソサイクロマルトペンタオース溶液を調製した。対照として、イソサイクロマルトペンタオースの代わりにα−サイクロデキストリンを用いた以外は上記と同様にしてα−サイクロデキストリン（α−ＣＤ）含有溶液を調製した。それぞれの溶液４ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しアミノカルボニル反応性を調べた。同時にポリペプトンのみを含む溶液を同様に加熱しブランクとした。着色度は４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度とし、ブランクの値を差し引いた値とした。結果を表１６に示す。

表１６の結果から明らかなように、イソサイクロマルトペンタオースの着色度はわずかであり、対照のα−サイクロデキストリンと同様に、ポリペプトン共存下で加熱しても着色、褐変を起こしにくい、アミノカルボニル反応性の低い安定な糖質であることが分かった。

＜実験１９：イソサイクロマルトオリゴ糖の包接作用＞
実験１５で用いたイソサイクロマルトペンタオースを脱イオン水に溶解し、２０質量％水溶液を調製した。その水溶液２０ｍｌ当たりに、香気成分の具体例として、メタノール、エタノール、プロパノール及びブタノールの４種短鎖アルコール、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸及びｎ−吉草酸の４種短鎖脂肪酸、及び、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、４−フェニル１−プロパノール及びｏ−クレゾールの４種芳香族化合物をそれぞれイソサイクロマルトペンタオースに対してモル換算で３倍量加えて均一に攪拌し包接させた。その後、それぞれを濾過し、濾液を凍結乾燥して未包接物を除去した。凍結乾燥物中の包接物量を測定するために、それぞれの凍結乾燥物について化合物をガスクロマトグラフィー法にて定量した。対照としてα−サイクロデキストリン（α−ＣＤ）を用い、同様に試験した。結果を表１７に示す。

表１７の結果から明らかなように、イソサイクロマルトペンタオースは、短鎖アルコール、短鎖脂肪酸及び芳香族化合物など各種化合物の包接能を有していることが分かった。メタノール、エタノール、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸の包接量に関しては、α−サイクロデキストリンよりもイソサイクロマルトペンタオースの方が多かった。イソサイクロマルトペンタオースは芳香族化合物の包接能も示したものの、その包接量は包接される化合物の種類によって大きく異なった。

＜実験２０：イソサイクロマルトオリゴ糖の消化性試験＞
実験１５で用いたイソサイクロマルトペンタオースについて、日本栄養食糧学会誌、第４３巻、第２３乃至２９頁（１９９０）に記載の岡田らの方法に準じて、試験管内での唾液アミラーゼ、人工胃液、膵液アミラーゼ、及び小腸粘膜酵素による消化性を調べた。対照として、同じく環状糖質であるα−、β−、及びγ−サイクロデキストリンを用い、同様に消化性を調べた。結果を表１８に示す。なお、表中の分解率（％）は、上記の各消化反応において、式、分解率（％）＝｛（反応液中の還元糖量）／（反応液中の全糖量）｝×１００で算出される値を意味する。

表１８の結果から明らかなように、イソサイクロマルトペンタオースは、α−及びβ−サイクロデキストリンと同様に、唾液アミラーゼ、人工胃液、膵液アミラーゼ、及び小腸粘膜酵素のいずれによっても実質的に消化されないことが判明した。一方、γ−サイクロデキストリンは膵液アミラーゼ及び小腸粘膜酵素により部分的に消化された。イソサイクロマルトペンタオースは難消化性の糖質であった。

＜実験２１：急性毒性試験＞
実験１５で用いたイソサイクロマルトペンタオースをマウスに経口投与して、急性毒性試験を行った。その結果、イソサイクロマルトペンタオースは低毒性の物質で、投与可能な最大投与量においても死亡例は認められず、そのＬＤ_５０値は、５ｇ／ｋｇ−マウス体重以上であった。

以下、実施例によりさらに詳細に本発明を説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

〈実施例１〉
バチルス・サーキュランス ＡＭ７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１１１）を実験１の方法に準じて、種培養した。続いて、容量３０Ｌのファーメンターに、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社製造）１．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社製造）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『酵母エキスＳ』、日本製薬株式会社製造）０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．３ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ５．５乃至８．０に保ちつつ、９６時間通気培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌濾過し、約１８Ｌの培養濾液を回収し、更に、その濾液をＵＦ膜濃縮し、０．４１単位／ｍｌの本発明のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を含む濃縮酵素液約１Ｌを回収した。

〈実施例２〉
馬鈴薯澱粉乳を濃度約１質量％澱粉乳とし、これに最終濃度１ｍＭとなるように塩化カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整し、９５℃に約２０分間加熱して糊化を行い、次いで約４０℃に冷却し、これに実施例１の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を含む濃縮酵素液を澱粉固形物１グラム当り２．４４ｍｌ（約１単位）の割合になるように加え、ｐＨ６．０、温度４０℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に、濃縮して濃度６５質量％のイソサイクロマルトオリゴ糖含有シラップを固形物当たり収率約９０％で得た。本品は、固形物当たり、イソサイクロマルトオリゴ糖類を２７．５質量％、その他の糖質を７２．５質量％含有しており、低還元性で、適度の粘度を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。

〈実施例３〉
タピオカ澱粉を濃度約１質量％澱粉乳とし、これに濃度０．１質量％となるように炭酸カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整し、これにα−アミラーゼ（ノボ社製造、商品名『ターマミール６０Ｌ』）を澱粉固形物グラム当り０．２質量％になるように加え、９５℃で１０分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約４０℃に急冷してＤＥ約３の液化溶液を得、これに実施例１の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を含む濃縮液を澱粉固形物１グラム当り２．４４ｍｌ（約１単位）とイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉固形物１グラム当り１０００単位の割合になるように加え、ｐＨ６．０、温度４０℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して、固形物当りイソサイクロマルトオリゴ糖類を３１．５％含む濃度６０質量％のシラップを得た。得られたシラップを糖液として、強酸性カチオン交換樹脂（アンバーライトＣＲ−１３１０、Ｎａ型、オルガノ株式会社製造）を用いたカラム分画を行なった。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ樹脂層全長２０ｍとした。カラム内温度６０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに６０℃の温水をＳＶ０．１３で流して分画し、溶出液の糖組成をＨＰＬＣ法でモニターし、イソサイクロマルトオリゴ糖含有画分を含む低分子画分を採取し、精製し、濃縮し、噴霧乾燥して、イソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末を固形物当たり収率約５４％で得た。本品は、固形物当たり、イソサイクロマルトオリゴ糖類を５１．５質量％、その他の糖質を４８．５質量％含有しており、低還元性で、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。

〈実施例４〉
トウモロコシ澱粉を濃度約１質量％澱粉乳とし、これに濃度０．１質量％となるように炭酸カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整し、これにα−アミラーゼ（商品名『ネオスピターゼ』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉固形物グラム当り０．２％になるように加え、８５乃至９０℃で２０分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約４０℃に急冷してＤＥ約３の液化溶液を得、これに実施例１の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を含む濃縮液を澱粉固形物１グラム当り２．４４ｍｌ（約１単位）とイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉固形物１グラム当り１０００単位の割合になるように加え、ｐＨ６．０、温度４０℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃にし、それにα−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野エンザイム株式会社製）を澱粉１グラム当り１０００単位及びグルコアミラーゼ（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉１グラム当り１００単位の割合になるように加え、ｐＨ５．０、温度５０℃で１６時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して、濃度６０質量％のイソサイクロマルトオリゴ糖含有シラップを固形物当たり収率約９５％で得た。本品は、固形物当たり、イソサイクロマルトオリゴ糖類３２．６質量％、グルコース６３．０質量％、及びその他の糖質を４．４質量％含有しており、低還元性で、適度の粘度を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。

〈実施例５〉
実施例４の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有シラップを、オートクレーブに入れ、触媒としてラネーニッケルを固形分に対し約９質量％添加し、攪拌しながら温度を１３０℃に上げ、水素圧を７５ｋｇ／ｃｍ^２に上げて水素添加して、イソサイクロマルトオリゴ糖含有シラップに含まれるグルコース及びその他の還元性糖質を、それらの糖アルコールに変換した。この反応液からラネーニッケルを除去し、常法により脱色、脱塩して精製し、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、イソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末を固形物当たり収率約９０％で得た。本品は、固形物当たり、イソサイクロマルトオリゴ糖３２．５質量％、ソルビトール６３．２質量％、及びその他の糖アルコールを４．３質量％含有しており、実質的に還元力を示さず、アミノカルボニル反応を起こしにくく、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。

＜実施例６：甘味料＞
実施例３の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末０．８質量部に、トレハロース含水結晶（株式会社林原商事販売、登録商標『トレハ』）０．２質量部、α−グリコシルステビオシド（東洋精糖株式会社販売、商品名『αＧスィート』）０．０１質量部、およびＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（商品名『アスパルテーム』）０．０１質量部を均一に混合し、顆粒成型機にかけて顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の約２倍の甘味度を有している。本品は、室温保存下、変質劣化の懸念も無く安定な甘味料として好適である。

＜実施例７：ハードキャンディー＞
濃度５５％蔗糖溶液１００質量部に実施例４の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有シラップ５０質量部を加熱混合し、次いで減圧下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン酸０．６質量部および適量のレモン香料と着色料とを混和し、常法に従って成型し、製品を得た。本品は歯切れ、呈味、風味とも良好で、蔗糖の晶出も起こさず、吸湿性少なく、ダレも起こさない安定で高品質のハードキャンディーである。

＜実施例８：チューイングガム＞
ガムベース３質量部を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに無水マルチトール２質量部、キシリトール２質量部、実施例５の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末２質量部、およびトレハロース含水結晶１質量部を加え、更に適量の香料と着色料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成型、包装して製品を得た。本品は、テクスチャー、呈味、風味良好で、低う蝕性、低カロリーのチューイングガムとして好適である。

＜実施例９：加糖練乳＞
原乳１００質量部に実施例２の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有シラップ４質量部および蔗糖２重量を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して製品を得た。本品は、温和な甘味で風味も良く、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に有利に利用できる。

＜実施例１０：乳酸菌飲料＞
脱脂粉乳１７５質量部、実施例３の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末１００質量部およびラクトスクロース高含有粉末（株式会社林原商事販売、登録商標『乳果オリゴ』）を水１、５００質量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスターターを３０質量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好で、オリゴ糖、イソサイクロマルトオリゴ糖を含有し、乳酸菌を安定に保つだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用、整腸作用を有する乳酸菌飲料として好適である。

＜実施例１１：粉末ジュース＞
噴霧乾燥により製造したオレンジ果汁粉末３３質量部に対して、実施例５の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末５０質量部、無水結晶マルチトール１０質量部、無水クエン酸０．６５質量部、リンゴ酸０．１質量部、２−Ｏ−α−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸０．２質量部、クエン酸ソーダ０．１質量部、プルラン０．５質量部および粉末香料の適量をよく混合攪拌し、粉砕し微粉末にして、これを流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃とし、これに実施例２の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有シラップをバインダーとして適量スプレーし、３０分間造粒し、計量し、包装して製品を得た。本品は、果汁含有率約３０％の粉末ジュースである。又、本品は、異味、異臭がなく、高品質で、低カロリーのジュースとして商品価値の高いものである。

＜実施例１２：カスタードクリーム＞
コーンスターチ１００質量部、実施例２の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有シラップ１００質量部、トレハロース含水結晶６０質量部、蔗糖４０質量部、および食塩１質量部を充分に混合し、鶏卵２８０質量部を加えて攪拌し、これに沸騰した牛乳１、０００質量部を徐々に加え、更に火にかけて攪拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、なめらかな光沢を有し、風味良好で、澱粉の老化も抑制され、高品質のカスタードクリームである。

＜実施例１３：ハム＞
豚もも肉１、０００質量部に食塩１５質量部および硝酸カリウム３質量部を均一にすり込んで、冷室に１昼夜堆積する。これを水５００質量部、食塩１００質量部、硝酸カリウム３質量部、実施例５の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末４０質量部および香辛料からなる塩漬液に冷室で７日間漬け込み、次いで、常法に従い、冷水で洗浄し、ひもで巻き締め、薫煙し、クッキングし、冷却、包装して製品を得た。本品は、色合いもよく、風味良好な高品質のハムである。

＜実施例１４：粉末ペプチド＞
４０％食品用大豆ペプチド溶液（不二製油株式会社販売、商品名『ハイニュートＳ』）１質量部に、実施例３の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末２質量部を混合し、プラスチック製バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを得た。本品は風味良好で、プレミックス、冷菓などの低カロリー製菓材料として有用であるのみならず、経口流動食、経管流動食のための難消化性の食物繊維、整腸剤量としても有用である。

＜実施例１５：化粧用クリーム＞
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２質量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５質量部、実施例５の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末２質量部、α−グルコシル ルチン（株式会社林原販売、商品名αＧルチン）１質量部、流動パラフィン１質量部、トリオクタン酸グリセリン１０質量部および防腐剤の適量を常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２質量部、１、３−ブチレングリコール５質量部および精製水６６質量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて攪拌混合し、化粧用クリームを製造した。本品は、抗酸化性を有し、安定性は高く、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。

＜実施例１６：練歯磨＞
第二リン酸カルシウム４５質量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５質量部、グリセリン２５質量部、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート０．５質量部、実施例３の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末１０質量部、サッカリン０．０２質量部を水１８質量部と混合して練歯磨を得た。本品は、界面活性剤の洗浄力を落とすことなく、嫌味を改良し、使用後感も良好である。

＜実施例１７：流動食用固体製剤＞
実施例２の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有シラップ１００質量部、トレハロース含水結晶２００質量部、マルトテトラオース高含有粉末２００質量部、粉末卵黄２７０質量部、脱脂粉乳２０９質量部、塩化ナトリウム４．４質量部、塩化カリウム１．８質量部、硫酸マグネシウム４質量部、チアミン０．０１質量部、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム０．１質量部、ビタミンＥアセテート０．６質量部およびニコチン酸アミド０．０４質量部からなる配合物を調製し、この配合物２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、流動食として経口的、または鼻腔、胃、腸などへ経管的使用方法により利用され、生体へのエネルギー補給用に有利に利用できる。

＜実施例１８：外傷治療用膏薬＞
実施例５の方法で得たイソサイクロマルトオリゴ糖含有粉末１００質量部およびマルトース３００質量部に、ヨウ素３質量部を溶解したメタノール５０質量部を加え混合し、更に１０ｗ／ｖ％プルラン水溶液２００質量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、経時変化が少ない商品価値の高い膏薬である。又、本品は、ヨウ素による殺菌作用のみならず、マルトースによる細胞へのエネルギー補給剤としても作用することから治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。

本発明によれば、従来未知であった下記の一般式１で表される構造を有する新規なイソサイクロマルトオリゴ糖を、イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を用いて大量に製造し、提供することが可能となる。全く新規なイソサイクロマルトオリゴ糖の提供を可能とする本発明は、飲食物、化粧品、医薬品など種々の利用分野に貢献することとなり、その産業的意義はきわめて大きい。

一般式１：

Claims (23)

1. 一般式１で表される構造を有するイソサイクロマルトオリゴ糖。
   一般式１：
   

   
2. 請求項１記載のイソサイクロマルトオリゴ糖とともに他の糖質を含んでなるイソサイクロマルトオリゴ糖含有糖質。
3. 形態が、シラップ、粉末又は固状物のいずれかであることを特徴とする請求項２記載のイソサイクロマルトオリゴ糖含有糖質。
4. 請求項１記載のイソサイクロマルトオリゴ糖、又は、請求項２又は３記載のイソサイクロマルトオリゴ糖含有糖質を含有せしめてなる飲食物、化粧品又は医薬品。
5. グルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、一般式１で表される構造を有するイソサイクロマルトオリゴ糖を生成する作用を有し、且つ、下記の理化学的性質を有するイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素：
   （１）分子量
   ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において、１０６，０００±２０，０００ダルトン；
   （２）等電点
   アンフォライン含有等電点電気泳動法において、ｐＩ７．５±０．５；
   （３）至適温度
   ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５０乃至５５℃；
   （４）至適ｐＨ
   ３０℃、３０分間反応の条件下で、ｐＨ４．５乃至８．０；
   （５）温度安定性
   ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で、３５℃まで安定；
   １ｍＭカルシウムイオン存在下では、４０℃まで安定；
   （６）ｐＨ安定性
   ４℃、２４時間保持の条件下で、ｐＨ４．５乃至９．０で安定。
   一般式１：
   

   
6. 配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列をＮ末端アミノ酸配列として有する請求項５記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素。
7. 配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列か、又は配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列において、その酵素活性を保持する範囲で１個以上１０個未満のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する請求項５又は６記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素。
8. グルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンが、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、アミロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉及びグリコーゲンから選ばれる１種又は２種以上の糖質である請求項５乃至７のいずれかに記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素。
9. イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素が、バチルス属に属する微生物由来の酵素である請求項５乃至８のいずれかに記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素。
10. バチルス属に属する微生物が、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＡＭ７（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１１１）又はそのイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素産生能を有する変異株である請求項９記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素。
11. バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＡＭ７（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１１１）又はそのイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素産生能を有する変異株である請求項５乃至１０のいずれかに記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素産生能を有する微生物。
12. 請求項７記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素をコードするＤＮＡ。
13. 配列表における配列番号３で示される塩基配列か、又は配列表における配列番号３で示される塩基配列において、コードする酵素の活性を保持する範囲で１個以上３０個未満の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列、又はそれらに相補的な塩基配列を有するＤＮＡ。
14. 遺伝子コードの縮重に基づき、コードするアミノ酸配列を変えることなく、配列表における配列番号３で示される塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換した請求項１２又は１３記載のＤＮＡ。
15. 請求項１２乃至１４のいずれかに記載のＤＮＡと、自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ。
16. 請求項１５記載の組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入してなる形質転換体。
17. 請求項５乃至１０のいずれかに記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の産生能を有する微生物を栄養培地で培養して得られる培養物から、請求項５乃至１０のいずれかに記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を採取することを特徴とするイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の製造方法。
18. 請求項１６記載の形質転換体を培養し、培養物から組換え型イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素を採取することを特徴とする組換え型イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素の製造方法。
19. グルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンを含有する溶液に、請求項５乃至１０のいずれかに記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素か、又は請求項１１記載のイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素産生能を有する微生物を作用させることを特徴とする一般式１で表される構造を有するイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれらを含む糖組成物の製造方法。
    一般式１：
    

    
20. グルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンが、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、アミロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉及びグリコーゲンから選ばれる１種又は２種以上の糖質である請求項１９記載のイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれらを含む糖組成物の製造方法。
21. 液化澱粉が、ＤＥ２０以下の液化澱粉溶液である請求項２０記載のイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれらを含む糖組成物の製造方法。
22. イソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素とともにイソアミラーゼ又はプルラナーゼを作用させ、必要に応じて、更にα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、サイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼから選ばれる１種又は２種以上の酵素を作用させることを特徴とする請求項１９乃至２１のいずれかに記載のイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれらを含む糖組成物の製造方法。
23. さらに、カラムクロマトグラフィーによる分画、膜による分離、微生物による発酵処理及びアルカリ処理による分解除去から選ばれる１種又は２種以上の精製方法を用いることを特徴とする請求項１９乃至２２のいずれかに記載のイソサイクロマルトオリゴ糖又はこれらを含む糖組成物の製造方法。

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