WO2020226165A1 - α－シヌクレイン凝集抑制用組成物およびα－シヌクレイン凝集体の伝播抑制用組成物 - Google Patents

α－シヌクレイン凝集抑制用組成物およびα－シヌクレイン凝集体の伝播抑制用組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、糖転移ヘスペリジンを有効成分として含有するα－シヌクレイン凝集体の伝播抑制用組成物、糖転移ヘスペリジンを有効成分として含有するα－シヌクレイノパチーの進行防止用組成物、糖転移ヘスペリジンを有効成分として含有するα－シヌクレイン凝集抑制用組成物、ならびに、糖転移ヘスペリジンを有効成分として含有するα－シヌクレイノパチーの予防および／または改善用組成物を提供する。

Description

α－シヌクレイン凝集抑制用組成物およびα－シヌクレイン凝集体の伝播抑制用組成物
　本発明は、α－シヌクレイン凝集抑制用組成物およびα－シヌクレイン凝集体の伝播抑制用組成物に関するものである。
　パーキンソン病は病理学的にはα－シヌクレイン凝集体を主体とするLEWY小体の形成と中脳黒質のドーパミン神経細胞の変性、細胞死を主体とする進行性の神経変性疾患で、臨床的には筋強剛、振戦、寡動、歩行障害等の運動障害を主体とする疾患である。パーキンソン病は、神経変性疾患の中でアルツハイマー病に次いで多く、有病率は10万人に120～130人といわれ、日本では約14万人の患者がいると推定されている。加齢が最大の危険因子であり、超高齢化社会を迎える日本では、今後もパーキンソン病患者の増加が予想される。現状ではパーキンソン病に対する根治療法は存在しておらず、その進行に伴いADL（Activities of Daily Living、日常生活動作）が低下していき、いわゆる「寝たきり状態」を強いられることも多い。そのサポートには多くの医療資源、介護資源を必要とし、社会的負担は非常に大きく早急な解決が望まれている。
　α－シヌクレインは主に成熟神経細胞のシナプス前終末に局在する14～19kDaのタンパク質であり、凝集により神経毒性を発揮するアミロイドの一種とされる。他のアミロイドと同様に、成長不溶性フィブリル繊維より、オリゴマーと呼ばれる可溶性の低分子凝集体が、神経毒性および凝集伝播能が高いことが知られているが、オリゴマー形成を特異的に抑制する化合物は未だ薬剤として開発されていない。現在のパーキンソン病治療は、ドーパミン等の神経伝達物質の補充による対症療法が主でありα－シヌクレインの凝集、伝播を抑制する根本治療剤の開発が、医療、製薬業界で強く待ち望まれている。
　フラボノイド類は、試験管内におけるα－シヌクレインの凝集抑制作用が報告されているが、未だパーキンソン病の治療薬として実用化されていない。例えば、柑橘フラボノイドの一種であるヘスペリジンやそのアグリコンであるヘスペレチンは、そのままの形態では水溶性が著しく低いため、利用法が限定されていた。また、ヘスペリジンおよびヘスペレチンは、経口摂取した場合にも、その血中移行性の低さや、血漿蛋白結合率が高さから、試験管内でα－シヌクレイン凝集に対する抑制作用が得られたとしても脳での作用を発揮することが可能な剤形の設計は困難であった。他のフラボノイド類（バイカリン、ルチン）などにおいても生体中の蛋白質との結合性が一般的に高く、生体内における選択性および特異性について十分に解明されていないうえ、その有効性を示す作用量に関しても不明であった。
　また、シアニン色素の中には、これまでにアルツハイマー病の病因とされるβ－アミロイドやタウの凝集を抑制するものが報告されているが、パーキンソン病に代表されるα－シヌクレイノパチーの病因とされるα－シヌクレインに特異的に結合し、その凝集および伝播を抑制する化合物はこれまでに報告されておらず、さらに、フラボノイド類との併用効果に関しても不明であった。
　このような状況下、アミロイドと呼ばれる各種病変を惹起しうる種々の凝集蛋白質の中でも特にα－シヌクレインに選択的・特異的に結合し、その凝集および伝播を抑制する化合物が見出されれば、α－シヌクレイノパチーの抑制に対して効果を発揮する可能性が考えられる。
　特許文献１には、糖転移ヘスペリジンまたは糖転移ルチンを含有する神経機能調節剤が記載されている。特許文献２には、糖化ヘスペリジン、ヘスペリジンおよびヘスペレチンから選択される1種以上を有効成分とするNADH/NADPHオキシダーゼ抑制剤が記載されている。特許文献３には、糖化ヘスペリジン、ヘスペリジンおよびヘスペレチンからなる群より選ばれる1種以上を有効成分とすることを特徴とする転写因子Nrf2活性化剤が記載されている。特許文献４には、フラバノン配糖体であるヘスペリジンを有効成分として含有する経口摂取した際に生体内でアグリコンの形態に代謝される脳機能改善剤およびそれを含有する脳機能改善組成物が記載されている。特許文献５には、ヘスペリジンを有効成分として含有する視神経細胞保護用組成物、小胞体ストレス抑制の機能を有するヘスペリジン含有組成物が記載されている。特許文献６には、α－グルコシルヘスペリジンは、細胞のオートファジー亢進剤として有用であり、ハンチントン病に代表される神経変性疾患の治療に応用することが開示されている。
特開平11-255655 特開2009-7256 特開2011-256126 特開2007-230878 WO2017/010520 WO2013/018779
　本発明は、α－シヌクレイン凝集体の細胞間伝播抑制に有用な医薬組成物および食品組成物を提供することを課題とする。また、本発明は、α－シヌクレインの凝集抑制に有用な医薬組成物および食品組成物を提供することを課題とする。
　本発明は、上記の課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］糖転移ヘスペリジンを有効成分として含有するα－シヌクレイン凝集体の伝播抑制用組成物。
［２］さらにフラボノイド、フラボノイド配糖体、糖転移フラボノイド配糖体および糖類から選択される少なくとも一種を含有する前記［１］に記載の組成物。
［３］前記フラボノイドがヘスペレチン、バイカレインまたはケルセチンであり、前記フラボノイド配糖体がヘスペリジン、バイカリンまたはルチンであり、前記糖転移フラボノイド配糖体が糖転移バイカリンまたは糖転移ルチンであり、前記糖類がトレハロース、イソマルトデキストリンまたはイソサイクロマルトペンタオース（以下、「ICG-5」という。）である前記［２］に記載の組成物。
［４］さらにNK-4、NK-196、NK-359、NK-617、NK-736およびNK-3422から選択される少なくとも一種のシアニン色素を含有する前記［１］～［３］のいずれかに記載の組成物。
［５］トレハロースを含有する組成物を組み合わせて使用する前記［１］～［４］のいずれかに記載の組成物。
［６］糖転移ヘスペリジンを有効成分として含有するα－シヌクレイノパチーの進行防止用組成物。
［７］さらにフラボノイド、フラボノイド配糖体、糖転移フラボノイド配糖体および糖類から選択される少なくとも一種を含有する前記［６］に記載の組成物。
［８］前記フラボノイドがヘスペレチン、バイカレインまたはケルセチンであり、前記フラボノイド配糖体がヘスペリジン、バイカリンまたはルチンであり、前記糖転移フラボノイド配糖体が糖転移バイカリンまたは糖転移ルチンであり、前記糖類がトレハロース、イソマルトデキストリンまたはICG-5である前記［７］に記載の組成物。
［９］さらにNK-4、NK-196、NK-359、NK-617、NK-736およびNK-3422から選択される少なくとも一種のシアニン色素を含有する前記［６］～［８］のいずれかに記載の組成物。
［１０］トレハロースを含有する組成物を組み合わせて使用する前記［６］～［９］のいずれかに記載の組成物。
［１１］糖転移ヘスペリジンを有効成分として含有するα－シヌクレイン凝集抑制用組成物。
［１２］さらにフラボノイド、フラボノイド配糖体、糖転移フラボノイド配糖体および糖類から選択される少なくとも一種を含有する前記［１１］に記載の組成物。
［１３］前記フラボノイドがヘスペレチン、バイカレインまたはケルセチンであり、前記フラボノイド配糖体がヘスペリジン、バイカリンまたはルチンであり、前記糖転移フラボノイド配糖体が糖転移バイカリンまたは糖転移ルチンであり、前記糖類がトレハロース、イソマルトデキストリンまたはICG-5である前記［１２］に記載の組成物。
［１４］さらにNK-4、NK-196、NK-359、NK-617、NK-736およびNK-3422から選択される少なくとも一種のシアニン色素を含有する前記［１１］～［１３］のいずれかに記載の組成物。
［１５］トレハロースを含有する組成物を組み合わせて使用する前記［１１］～［１４］のいずれかに記載の組成物。
［１６］糖転移ヘスペリジンを有効成分として含有するα－シヌクレイノパチーの予防および／または改善用組成物。
［１７］さらにフラボノイド、フラボノイド配糖体、糖転移フラボノイド配糖体および糖類から選択される少なくとも一種を含有する前記［１６］に記載の組成物。
［１８］前記フラボノイドがヘスペレチン、バイカレインまたはケルセチンであり、前記フラボノイド配糖体がヘスペリジン、バイカリンまたはルチンであり、前記糖転移フラボノイド配糖体が糖転移バイカリンまたは糖転移ルチンであり、前記糖類がトレハロース、イソマルトデキストリンまたはICG-5である前記［１７］に記載の組成物。
［１９］さらにNK-4、NK-196、NK-359、NK-617、NK-736およびNK-3422から選択される少なくとも一種のシアニン色素を含有する前記［１６］～［１８］のいずれかに記載の組成物。
［２０］トレハロースを含有する組成物を組み合わせて使用する前記［１６］～［１９］のいずれかに記載の組成物。
　本発明により、α－シヌクレイン凝集体の細胞間伝播抑制に有用な医薬組成物および食品組成物、ならびに、α－シヌクレインの凝集抑制に有用な医薬組成物および食品組成物を提供することができる。α－シヌクレイン凝集体の細胞間伝播抑制に有用な医薬組成物および食品組成物は、パーキンソン病に代表されるα－シヌクレイノパチーの進行防止に有効である。α－シヌクレインの凝集抑制に有用な医薬組成物および食品組成物は、α－シヌクレイノパチーの予防および／または改善に有効である。
α－シヌクレイン凝集抑制を指標とした試験サンプルの三次スクリーニングの結果を示す図である。 三次スクリーニングで選択した試験サンプルの24時間目におけるα－シヌクレイン凝集抑制作用を評価した結果を示す図であり、（A）がシアニン色素の結果、（B）が糖類の結果である。 三次スクリーニングで選択した3種類の糖転移フラボノイド配糖体のα－シヌクレイン凝集抑制作用を、各対応するフラボノイド配糖体およびフラボノイド（アグリコン）のα－シヌクレイン凝集抑制作用と比較した結果を示す図であり、（A）がG-ヘスペリジン、ヘスペリジン、ヘスペレチンの結果、（B）がG-バイカリン、バイカリン、バイカレインの結果、（C）がG-ルチン、ルチン、ケルセチンの結果である。 三次スクリーニングで選択した試験サンプルのα－シヌクレイン凝集体崩壊作用を評価した結果を示す図であり、（A）がシアニン色素の結果、（B）が糖類の結果である。 ヒトα－シヌクレイン過剰発現細胞を用いたin vitro・パーキンソン病モデルを用いて、三次スクリーニングで選択した試験サンプルの細胞間伝播抑制作用を評価した結果を示す図である。 G-ヘスペリジン、ヘスペリジンまたはヘスペレチンを飲水または経口投与したマウスにMPTPを腹腔内投与後、行動試験（Grid test）を行った結果を示す図であり、（A）がMPTP投与1日目の結果、（B）がMPTP投与2日目の結果である。 G-ヘスペリジン、ヘスペリジンまたはヘスペレチンを飲水または経口投与したマウスにMPTPを腹腔内投与し、投与7日目に採取した脳のホモジネート中の脂質過酸化物量を、多価不飽和脂肪酸脂質過酸化物の分解物であるMDAの量として測定した結果を示す図である。 G-ヘスペリジン、ヘスペリジンまたはヘスペレチンを飲水または経口投与したマウスにMPTPを腹腔内投与し、投与7日目の脳黒質におけるTH陽性細胞領域を測定した結果を示す図である。 G-ヘスペリジン、ヘスペリジンまたはヘスペレチンを飲水または経口投与したマウスにMPTPを腹腔内投与し、投与7日目の脳黒質における単位領域当たりのIba1陽性細胞数を計数した結果を示す図である。 試験管内α－シヌクレイン凝集試験系を用いて、G-ヘスペリジンとNK-3422またはトレハロースの組み合わせによるα－シヌクレイン凝集抑制効果を評価した結果を示す図であり、（A）がG-ヘスペリジンとNK-3422との組み合わせの結果、（B）がG-ヘスペリジンとトレハロースとの組み合わせの結果である。 細胞内α－シヌクレイン凝集試験系を用いて、G-ヘスペリジンとNK-3422またはトレハロースの組み合わせによるα－シヌクレイン凝集抑制効果を評価した結果を示す図であり、（A）がG-ヘスペリジンとNK-3422との組み合わせの結果、（B）がG-ヘスペリジンとトレハロースとの組み合わせの結果である。 パーキンソン病モデルマウス（α－シヌクレイン伝播モデル）を用いて、G-ヘスペリジン飲水投与による脳黒質のリン酸化α－シヌクレイン凝集体形成抑制作用を評価した結果を示す図である。 パーキンソン病モデルマウス（α－シヌクレイン伝播モデル）を用いて、G-ヘスペリジン飲水投与による運動機能に対する作用を評価した結果を示す図である。
　本発明は、糖転移ヘスペリジンを有効成分として含有するα－シヌクレイン凝集体の伝播抑制用組成物を提供する。パーキンソン病に代表されるα－シヌクレイノパチーでは、α－シヌクレイン凝集体が細胞間を伝播し、伝播した先の細胞内で凝集体形成のシードとして機能することで異常病変が拡大し、病状が進行する。それゆえ、α－シヌクレイン凝集体の細胞間伝播を抑制することができれば、α－シヌクレイノパチーの進行を防止することができると考えられる。したがって、本発明のα－シヌクレイン凝集体の伝播抑制用組成物は、α－シヌクレイノパチーの進行防止用組成物と称してもよい。様々な凝集形態のα－シヌクレインの内、繊維状、リボン状の大きな凝集体の伝播能は低く、小さい凝集体であるオリゴマーは高い伝播性を有することが知られている。このオリゴマーが伝播することで、神経細胞の機能低下が誘導され、その後大きな結晶を核としてシヌクレインが蓄積することでレビー小体が形成され、神経変性の進行が生じる。従って、様々な形態のα－シヌクレインの中でも特に伝播能の高い形態であるオリゴマー形成を抑制する化合物は、α－シヌクレイノパチーの進行防止用組成物として機能しうることが推察される。
　また、本発明は、糖転移ヘスペリジンを有効成分として含有するα－シヌクレイン凝集抑制用組成物を提供する。α－シヌクレイノパチーでは、細胞内にα－シヌクレイン凝集体が蓄積するという病理学的特徴を有している。それゆえ、α－シヌクレインの凝集を抑制することができれば、α－シヌクレイノパチーを予防および／または改善することができると考えられる。したがって、本発明のα－シヌクレイン凝集抑制用組成物は、α－シヌクレイノパチーの予防および／または改善用組成物と称してもよい。あるいは、本発明のα－シヌクレイン凝集抑制用組成物は、α－シヌクレイノパチーの予防および／または治療用組成物と称してもよい。
　以下、本発明のα－シヌクレイン凝集体の伝播抑制用組成物、α－シヌクレイノパチーの進行防止用組成物、α－シヌクレイン凝集抑制用組成物およびα－シヌクレイノパチーの予防および／または改善用組成物を合せて「本発明の組成物」と称する。
　本発明の組成物は、糖転移ヘスペリジンを有効成分として含有するものであればよい。糖転移ヘスペリジンはグルコシルヘスペリジン（G-ヘスペリジン）とも称される。本発明において、糖転移ヘスペリジンはモノグルコシルヘスペリジンであってもよい。
　ヘスペリジンに糖転移酵素でグルコースを付加したG-ヘスペリジンは、ヘスペリジンおよびヘスペレチンに比較して水溶性が飛躍的に向上した配糖体であり、食品原料としての使用実績もあることから、様々な剤形で容易に経口摂取することができる。また、摂取後はG-ヘスペリジンの形態でα－シヌクレインのオリゴマー形成を抑制することが可能であり、体内でαグルコシダーゼにより代謝されても、ヘスペリジンもしくはヘスペレチンとしてより効果的に血中および脳に送達され、引き続きα－シヌクレイン凝集抑制能を発揮することができる。
　本発明の組成物は、糖転移ヘスペリジン以外の有効成分を含むものであってもよい。糖転移ヘスペリジン以外の有効成分は、α－シヌクレイン凝集体の伝播抑制作用およびα－シヌクレインの凝集抑制作用の少なくともいずれかの作用を有するものであれば限定されない。糖転移ヘスペリジン以外の有効成分は、糖転移フラボノイド配糖体であってもよく、フラボノイド配糖体であってもよく、フラボノイド（アグリコン）であってもよく、糖類であってもよく、シアニン色素であってよく、これらの組み合わせであってもよい。
　糖転移フラボノイド配糖体としては、糖転移バイカリン（グルコシルバイカリン（G-バイカリン））、糖転移ルチン（グルコシルルチン（G-ルチン））等が挙げられる。フラボノイド配糖体としては、例えば、ヘスペリジン、バイカリン、ルチン等が挙げられる。フラボノイド（アグリコン）としては、例えば、ヘスペレチン、バイカレイン、ケルセチン、セサモール等が挙げられる。
　糖類としては、α－グルコース１－リン酸（αG1P）、β－グルコース１－リン酸（βG1P）、マンニトール、マンノース、トレハロース、ラクチュロース、ラクチトール、マルトース、ラクトスクロース、マルトテトライトール、マルトトリオシルグルコシド、マルトテトラオース、環状ニゲロシルニゲロース（CNN）、イソサイクロマルトペンタオース（ICG-5）、α－サイクロデキストリン（α-CD）、β－サイクロデキストリン（β-CD）、γ－サイクロデキストリン（γ-CD）、イソマルトデキストリン、メチル－β－サイクロデキストリンなどが挙げられる。G-ヘスペリジンと組み合わせる糖類は、トレハロース、CNN、ICG-5、γ-CDおよびイソマルトデキストリンから選択されるものであってもよく、トレハロース、ICG-5およびイソマルトデキストリンから選択されるものであってもよい。
　本明細書でいうイソマルトデキストリンとは、具体的には、特許第6457009号などに記載の、グルコースを構成糖とする分岐α－グルカンの混合物であって、全体としてメチル化分析において以下の（１）～（４）の特徴を有し、かつ、高速液体クロマトグラフ法（酵素-HPLC法）により求めた水溶性食物繊維含量が70質量％以上であるとともに、ゲル濾過高速液体クロマトグラムに基づく分子量分布分析による重量平均分子量（Mw）が2,600ダルトン以上25,700ダルトン以下であって、重量平均分子量（Mw）を数平均分子量（Mn）で除した値（Mw/Mn）が4未満であることを特徴とする、水溶性食物繊維として有用な分岐α－グルカン混合物を意味する。
（１）2,3,6-トリメチル-1,4,5-トリアセチルグルシトールと、2,3,4-トリメチル-1,5,6-トリアセチルグルシトールの比が1:0.6～1:4の範囲にある、
（２）2,3,6-トリメチル-1,4,5-トリアセチルグルシトールと、2,3,4-トリメチル-1,5,6-トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの60％以上を占める、
（３）2,4,6-トリメチル-1,3,5-トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの0.5％以上10％未満である、および
（４）2,4-ジメチル-1,3,5,6-テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの0.5％以上である。
　本明細書で言う環状ニゲロシルニゲロース（CNN）とは、国際公開WO02/10361号明細書などに記載のサイクロ｛→6)-α-D-グルコピラノシル-(1→3)-α-D-グルコピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシル-(1→3)-α-D-グルコピラノシル-(1→｝の構造を有する環状四糖を意味する。
　本明細書で言うイソサイクロマルトペンタオース（ICG-5）とは、国際公開WO2006/035725号明細書などに記載のサイクロ｛→6)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)4-α-D-グルコピラノシル-(1→｝の構造を有する環状糖で、マルトペンタオース分子の還元末端グルコースの1位と非還元末端グルコースの6位水酸基がα-1,6グルコシド結合して環状構造を形成したものを意味する。
　シアニン色素としては、NK-4、NK-9、NK-26、NK-150、NK-235、NK-3422、NK-5、NK-131、NK-44、NK-67、NK-68、NK-94、NK-103、NK-104、NK-132、NK-135、NK-138、NK-140、NK-142、NK-168、NK-193、NK-196、NK-342、NK-352、NK-359、NK-364、NK-463、NK-533、NK-537、NK-564、NK-565、NK-593、NK-617、NK-734、NK-736、NK-737、NK-9352、NK-1476などが挙げられる。G-ヘスペリジンと組み合わせるシアニン色素は、NK-4、NK-150、NK-3422、NK-193、NK-196、NK-359、NK-463、NK-533、NK-593、NK-617、NK-736およびNK-737から選択されるものであってもよく、NK-4、NK-3422、NK-196、NK-359、NK-617およびNK-736から選択されるものであってもよい。
　なお、本明細書中のNKで始まる化合物番号に対応する化合物の構造は、例えば『感光色素表』感光色素研究所発行（1969年）や、『ケミカルアブストラクトインデックスガイド（CHEMICAL ABSTRACT INDEX GUIDE）(N-Z)』1531G～1536G（1994年）などにも記載されている。
　本発明の組成物は、糖転移ヘスペリジンのみを有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンと他の糖転移フラボノイド配糖体を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンとフラボノイド配糖体を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンとフラボノイド（アグリコン）を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンと糖類を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンとシアニン色素を有効成分として含むものであってもよい。
　また、本発明の組成物は、糖転移ヘスペリジンと他の糖転移フラボノイド配糖体とフラボノイド配糖体を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンと他の糖転移フラボノイド配糖体とフラボノイド（アグリコン）を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンと他の糖転移フラボノイド配糖体と糖類を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンと他の糖転移フラボノイド配糖体とシアニン色素を有効成分として含むものであってもよい。
　また、本発明の組成物は、糖転移ヘスペリジンとフラボノイド配糖体とフラボノイド（アグリコン）を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンとフラボノイド配糖体と糖類を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンとフラボノイド配糖体とシアニン色素を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンとフラボノイド（アグリコン）と糖類を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンとフラボノイド（アグリコン）とシアニン色素を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンと糖類とシアニン色素を有効成分として含むものであってもよい。
　また、本発明の組成物は、糖転移ヘスペリジンと他の糖転移フラボノイド配糖体とフラボノイド配糖体とフラボノイド（アグリコン）を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンと他の糖転移フラボノイド配糖体とフラボノイド配糖体と糖類を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンと他の糖転移フラボノイド配糖体とフラボノイド配糖体とシアニン色素を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンとフラボノイド配糖体とフラボノイド（アグリコン）と糖類を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンとフラボノイド配糖体とフラボノイド（アグリコン）とシアニン色素を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンとフラボノイド（アグリコン）と糖類とシアニン色素を有効成分として含むものであってもよい。
　また、本発明の組成物は、糖転移ヘスペリジンと他の糖転移フラボノイド配糖体とフラボノイド配糖体とフラボノイド（アグリコン）と糖類を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンと他の糖転移フラボノイド配糖体とフラボノイド配糖体とフラボノイド（アグリコン）とシアニン色素を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンと他の糖転移フラボノイド配糖体とフラボノイド配糖体と糖類とシアニン色素を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンと他の糖転移フラボノイド配糖体とフラボノイド（アグリコン）と糖類とシアニン色素を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンとフラボノイド配糖体とフラボノイド（アグリコン）と糖類とシアニン色素を有効成分として含むものであってもよく、糖転移ヘスペリジンと他の糖転移フラボノイド配糖体とフラボノイド配糖体とフラボノイド（アグリコン）と糖類とシアニン色素を有効成分として含むものであってもよい。
　本発明の組成物中の有効成分の含量は特に限定されず、0.01～99％（w/w）であってもよく、0.1～95％（w/w）であってもよい。本発明の組成物中に複数の有効成分を含む場合は、各有効成分の含有割合は特に限定されず、具体的な有効成分に応じて適宜適切な割合を選択することができる。
　本発明の組成物は、α－シヌクレイン凝集体の伝播抑制作用および／またはα－シヌクレイン凝集抑制作用を有する他の物質と組み合わせて使用することができる。α－シヌクレイン凝集体の伝播抑制作用および／またはα－シヌクレイン凝集抑制作用を有する他の物質は、公知の物質でもよく、将来その作用が見出される物質でもよい。
　α－シヌクレイン凝集体の伝播抑制作用および／またはα－シヌクレイン凝集抑制作用を有する他の物質は、トレハロースまたはトレハロースを含有する組成物であってもよい。本発明者らは、本発明の組成物の有効成分である糖転移ヘスペリジンとトレハロースを組み合わせることにより、α－シヌクレイン凝集抑制作用に関して相乗効果を奏することを確認している。トレハロースを含有する組成物に含まれるトレハロース以外の成分は特に限定されない。トレハロースを含有する組成物は、上記に例示した糖転移フラボノイド配糖体、フラボノイド配糖体、フラボノイド（アグリコン）、糖類、シアニン色素等を含むものであってもよい。
　本発明の組成物とトレハロースまたはトレハロースを含有する組成物を組み合わせて使用するとは、糖転移ヘスペリジンとトレハロースの両者を含有する組成物を使用する形態であってもよく、本発明の組成物とトレハロースを含有する組成物を併用する形態であってもよい。本明細書において、「組み合わせて使用」と「併用」は同義である。
　本発明の組成物とトレハロースを含有する組成物とを組み合わせて使用（併用）する場合、これらを対象者（例えば、α－シヌクレイノパチー患者）に対して同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。本明細書において「組み合わせて使用（併用）する」とは、２以上の組成物の適用時期が重複していることを意味し、同時に投与することを要するものではない。
　本発明の組成物は、医薬として実施することができる。本発明の組成物を医薬として実施する場合、本発明の組成物に、薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤、経腸栄養剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
　錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は通常の製剤手順（例えば有効成分を注射用水、天然植物油等の溶媒に溶解または懸濁させる等）に従って調製することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ－５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
　本発明の組成物は、飲食品として実施することができる。飲食品には、健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、栄養強化食品、サプリメント等が含まれる。飲食品の形態は特に限定されない。例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、ドリンク剤等の形態；茶飲料、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料；飴、キャンディー、ガム、チョコレート、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子およびパン類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂および油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；カレー、シチュー、丼、お粥、雑炊等のレトルトパウチ食品；アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の冷菓などを挙げることができる。
　本発明の組成物を医薬として実施する場合、通常、G-ヘスペリジンの用量は、0.1g～50g/日、好ましくは0.5g～25g/日、より好ましくは1g～10g/日で配合されうる。シアニン色素を配合する場合は、通常、シアニン色素の乾燥重量として1mg～100mg/日、好ましくは10mg～50mg/日で配合されうる。トレハロースを配合する場合は、通常、乾燥重量として0.5g～50g/日、好ましくは1g～10g/日で配合されうる。なおG-ヘスペリジンをα－シヌクレイノパチーの発症予防の目的で飲食品として実施する場合は、治療剤としての用量の1/5～1/10用量が目安であるが、これに限定されるものではない。
　本発明には、以下の各発明が含まれる。
（A1）哺乳動物に対して糖転移ヘスペリジンを投与することを特徴とするα－シヌクレイン凝集体の伝播抑制方法。
（A2）哺乳動物に対して糖転移ヘスペリジンを投与することを特徴とするα－シヌクレイノパチーの進行防止方法。
（A3）哺乳動物に対して糖転移ヘスペリジンを投与することを特徴とするα－シヌクレイン凝集抑制方法。
（A4）哺乳動物に対して糖転移ヘスペリジンを投与することを特徴とするα－シヌクレイノパチーの予防および／または改善方法。
（A5）さらにフラボノイド、フラボノイド配糖体、糖転移フラボノイド配糖体および糖類から選択される少なくとも一種を投与する（A1）～（A4）のいずれかに記載の方法。
（A6）前記フラボノイドがヘスペレチン、バイカレインまたはケルセチンであり、前記フラボノイド配糖体がヘスペリジン、バイカリンまたはルチンであり、前記糖転移フラボノイド配糖体が糖転移バイカリンまたは糖転移ルチンであり、前記糖類がトレハロース、イソマルトデキストリンまたはICG-5である（A5）に記載の方法。
（A7）さらにNK-4、NK-196、NK-359、NK-617、NK-736およびNK-3422から選択される少なくとも一種のシアニン色素を投与する（A1）～（A6）のいずれかに記載の方法。
（A8）トレハロースを組み合わせて投与する（A1）～（A7）のいずれかに記載の方法。
（B1）α－シヌクレイン凝集体の伝播抑制のための糖転移ヘスペリジンの使用。
（B2）α－シヌクレイノパチーの進行防止のための糖転移ヘスペリジンの使用。
（B3）α－シヌクレイン凝集抑制に用いるための糖転移ヘスペリジンの使用。
（B4）α－シヌクレイノパチーの予防および／または改善に用いるための糖転移ヘスペリジンの使用。
（B5）さらにフラボノイド、フラボノイド配糖体、糖転移フラボノイド配糖体および糖類から選択される少なくとも一種を糖転移ヘスペリジンと組み合わせる（B1）～（B4）のいずれかに記載の使用。
（B6）前記フラボノイドがヘスペレチン、バイカレインまたはケルセチンであり、前記フラボノイド配糖体がヘスペリジン、バイカリンまたはルチンであり、前記糖転移フラボノイド配糖体が糖転移バイカリンまたは糖転移ルチンであり、前記糖類がトレハロース、イソマルトデキストリンまたはICG-5である（B5）に記載の使用。
（B7）さらにNK-4、NK-196、NK-359、NK-617、NK-736およびNK-3422から選択される少なくとも一種のシアニン色素を組み合わせる（B1）～（B6）のいずれかに記載の使用。
（B8）トレハロースを組み合わせる（B1）～（B7）のいずれかに記載の使用。
（C1）α－シヌクレイン凝集体の伝播抑制用組成物を製造するための糖転移ヘスペリジンの使用。
（C2）α－シヌクレイノパチーの進行防止用組成物を製造するための糖転移ヘスペリジンの使用。
（C3）α－シヌクレイン凝集抑制用組成物を製造するための糖転移ヘスペリジンの使用。
（C4）α－シヌクレイノパチーの予防および／または改善用組成物を製造するための糖転移ヘスペリジンの使用。
（C5）さらにフラボノイド、フラボノイド配糖体、糖転移フラボノイド配糖体および糖類から選択される少なくとも一種を糖転移ヘスペリジンと組み合わせる（C1）～（C4）のいずれかに記載の使用。
（C6）前記フラボノイドがヘスペレチン、バイカレインまたはケルセチンであり、前記フラボノイド配糖体がヘスペリジン、バイカリンまたはルチンであり、前記糖転移フラボノイド配糖体が糖転移バイカリンまたは糖転移ルチンであり、前記糖類がトレハロース、イソマルトデキストリンまたはICG-5である（C5）に記載の使用。
（C7）さらにNK-4、NK-196、NK-359、NK-617、NK-736およびNK-3422から選択される少なくとも一種のシアニン色素を組み合わせる（C1）～（C6）のいずれかに記載の使用。
（C8）トレハロースを組み合わせる（C1）～（C7）のいずれかに記載の使用。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：α－シヌクレイン凝集抑制を指標とした候補薬のスクリーニング〕
１－１　一次スクリーニング
（１）試験サンプル
　133種のシアニン色素ならびに66種の糖類（単糖、二糖、三糖、四糖、五糖、オリゴ糖、多糖、環状糖、糖転移フラボノイド配糖体、フラボノイド配糖体、フラボノイド（アグリコン）を含む）を一次スクリーニングに供した。シアニン色素は10 mMのジメチルスルホキシド（DMSO）溶液を調製した後、所定の終濃度になるように10 mM Tris-HCl（pH 8.0、0.1 M NaCl）で希釈して使用した。糖類は10 mMの水溶液を調製した後、所定の終濃度になるように10 mM Tris-HCl（pH 8.0、0.1 M NaCl）で希釈して使用した。
（２）実験方法
　当分野で通常用いられる方法に従い、大腸菌にヒトα－シヌクレイン発現ベクターを導入して発現させ、LB培地(10 L)にて37℃でオーバーナイト培養後、菌体を遠心回収し、4 ml/gの滅菌水を添加し、筆で懸濁した後、氷上で10分間インキュベートした後、12000 rpm、4℃、15分遠心し、上清をペリプラズムとして回収した。透析チューブに入れ（スペクトラポア、6000-8000 Da）、100倍量の20 mM Tris-HCl（pH 8.0）に対して4℃でオーバーナイト透析した後、DEAE-TOYOPEARLおよびSuperdex 200による分画を行い、α－シヌクレイン約300 mg（SDS-PAGE 純度92.7%）を得た。精製した組換えヒトα－シヌクレイン（0.4 mg/ml）を直径3 mmのガラスビーズを入れた96ウェルプレートに150 μl/ウェル添加した後、試験サンプル溶液を5 μl添加し、37℃48時間プレートシェーカーで振盪(180rpm)した。反応溶液20 μlを180 μlのチオフラビンT（ThT;終濃度20 μM）/10 mM Tris-HCl（pH 8.0、0.1M NaCl）溶液と混合し、蛍光マイクロプレートリーダー（FlexStation3、Molecular Devices）で450 nmの励起波長を用い、480 nmの蛍光強度を測定した（以下、「Ex 450 nm/Em 480 nmの蛍光を測定した」と略記する）。なお、ThTは凝集構造に結合して蛍光を発するため使用した。ブランクには、200 μlのThT溶液を用いた。コントロールは、試験サンプルの代わりに10 mM Tris-HClまたはDMSOを5 μl添加し、37℃で48時間振盪した後、上記ThT溶液を添加して蛍光を測定した。試験サンプルの代わりに10 mM Tris-HCl を5 μl添加し、4℃で48時間静置した後、上記ThT溶液を添加して蛍光を測定したものをα－シヌクレイン非凝集コントロールとした。
（３）結果
　サンプル未添加のコントロール（Tris-HCl添加）では、顕著な蛍光強度の上昇が認められた。一方、４℃にて静置保存したウェルの蛍光強度は、コントロールの0.7%であった。コントロールの蛍光強度を100%とした際に3%以下の蛍光強度を示す試験サンプルを、凝集抑制活性を有する試験サンプルとして選択した。その結果、シアニン色素37種および糖類21種に凝集抑制活性が認められた。
１－２　二次スクリーニング
（１）試験サンプル
　一次スクリーニングで選択した58種の試験サンプルを二次スクリーニングに供した。
（２）スクリーニング方法
　一次スクリーニングと同じ方法で行った。シアニン色素は一次スクリーニングと同じ濃度（1 μM）とした。糖類は一次スクリーニングの1/5の濃度（100 μM）とした。
（３）結果
　サンプル未添加のコントロール（Tris-HCl添加）の蛍光強度の3%以下の蛍光強度を示す試験サンプルを選択した。その結果、シアニン色素11種および糖類7種に強い凝集抑制活性が認められた。二次スクリーニングで選択された試験サンプルは以下のとおりである。
シアニン色素：NK-4、NK-150、NK-193、NK-359、NK-463、NK-533、NK-593、NK-617、NK-736、NK-737およびNK-3422。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
糖類：CNN、ICG-5、トレハロース、γ－サイクロデキストリン（γ-CD）、イソマルトデキストリン、G-バイカリンおよびセサモール。なお、イソマルトデキストリンは分岐α－グルカンの混合物であるため構造式を示していない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
１－３　三次スクリーニング
（１）試験サンプル
　二次スクリーニングで選択した18サンプルに加え、二次スクリーニングで凝集抑制活性の認められたシアニン色素と構造が類似しているNK-9、NK-142、NK-196およびNK-564、ならびにトレハロースの異性体であるイソトレハロースを試験サンプルに加えた。さらに、G-バイカリンの構造類縁体として、ヘスペリジンとルチンの各糖転移体である糖転移ヘスペリジン（G-ヘスペリジン）および糖転移ルチン（G-ルチン）を試験サンプルに加えた。
（２）スクリーニング方法
　一次スクリーニングと同じ方法で行った。シアニン色素の濃度は0.2 μM、糖類の濃度は20 μMとした。
（３）結果
　結果を図1に示した。ブランクの値を差し引いた後の蛍光強度が、サンプル未添加のコントロールの蛍光強度を100%とした際に3％以下となる試験サンプルを選択した。その結果、6種類のシアニン色素（NK-4、NK-196、NK-359、NK-617、NK-736およびNK-3422）ならびに6種類の糖類（G-ヘスペリジン、G-バイカリン、G-ルチン、トレハロース、イソマルトデキストリン、ICG-5）の合計12種類の試験サンプルに、強い凝集抑制活性が認められた。NK-196、G-ヘスペリジン、G-ルチンの構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
〔実施例２：スクリーニングで選択した物質のα－シヌクレイン凝集抑制作用〕
（１）試験サンプル
　三次スクリーニングで選択した12種類の物質を試験サンプルとした。シアニン色素は10 mMのDMSO溶液を調製した後、所定の終濃度になるように10 mM Tris-HCl（pH 8.0、0.1 M NaCl）で希釈して使用した。糖類は10 mMの水溶液を調製した後、所定の終濃度になるように10 mM Tris-HCl（pH 8.0、0.1 M NaCl）で希釈して使用した。シアニン色素の終濃度は、0、0.0078125、0.015625、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2（μM）とした。糖類の終濃度は、0、0.78125、3.125、12.5、50、200、800（μM）とした。
（２）実験方法
　α－シヌクレインと試験サンプルとの反応時間を24時間に変更した以外は、実施例１の１－１（２）に記載の実験方法と同じ方法で行った。
（３）結果
　結果を図2に示した。（A）がシアニン色素の結果、（B）が糖類の結果である。シアニン色素はいずれも用量依存的にα－シヌクレイン凝集抑制作用が認められ、0.5～2 μMではほぼ完全にα－シヌクレインの凝集が阻害された。半数阻害濃度(IC50)で比較すると、NK-736＞NK-4、NK-359＞NK-617、NK-3422＞NK-196の順であった。糖類は、いずれもシアニン色素に比較してIC50が高く、高濃度において凝集抑制作用を示した（ICG-5、トレハロース、G-ルチン、G-バイカリン、G-ヘスペリジン＞イソマルトデキストリン）。
〔実施例３：フラボノイド（アグリコン）、フラボノイド配糖体および糖転移フラボノイド配糖体の比較〕
　三次スクリーニングで選択された3種類の糖転移フラボノイド配糖体（G-ヘスペリジン、G-バイカリン、G-ルチン）のα－シヌクレイン凝集抑制作用について、各フラボノイド配糖体およびフラボノイド（アグリコン）と比較した。
（１）試験サンプル
　G-ヘスペリジンとの比較対照としてヘスペリジン、ヘスペレチンを、G-バイカリンの比較対象としてバイカリン、バイカレインを、G-ルチンの比較対象としてルチン、ケルセチンを使用した。いずれの試験サンプルも、10 mMの水溶液を調製した後、終濃度が400 μMになるように10 mM Tris-HCl（pH 8.0、0.1 M NaCl）で希釈した。
（２）実験方法
　実施例１の１－１（２）に記載の実験方法により、α－シヌクレインと試験サンプルとの反応時間を24時間、48時間、72時間および168時間とした。各反応時間経過時点で、反応溶液20 μlを分取し、180 μlのThT溶液と混合し、蛍光マイクロプレートリーダーでEx 450 nm/ Em 480 nmの蛍光を測定した。なお、ブランクおよび陽性コントロールについては、実施例１の１－１（２）に記載のように蛍光を測定した。
（３）結果
　結果を図3に示した。（A）がG-ヘスペリジン、ヘスペリジン、ヘスペレチンの結果、（B）がG-バイカリン、バイカリン、バイカレインの結果、（C）がG-ルチン、ルチン、ケルセチンの結果である。（A）より、ヘスペリジンおよびヘスペレチンは、G-ヘスペリジンと同等のα－シヌクレイン凝集抑制作用を有していた。（B）より、バイカリンおよびバイカレインはG-バイカリンと同等のα－シヌクレイン凝集抑制作用を有していた。（C）より、アグリコンのケルセチンが最も強いα－シヌクレイン凝集抑制作用を有しており、ルチンはG-ルチンと同等のα－シヌクレイン凝集抑制作用を有していた。この結果から、実験に供した糖転移フラボノイド配糖体は、必ずしも最も強いα－シヌクレイン凝集抑制作用を有しているわけではないが、フラボノイド配糖体およびフラボノイド（アグリコン）が水に不溶または難溶であり、その利用が著しく制限されることを考慮すれば、α－シヌクレイン凝集抑制作用を有し、フラボノイドやその配糖体よりもさらに水溶性が高い糖転移フラボノイド配糖体は、製剤上のハンドリングの向上はもとより、用途拡大の点において非常に有用であると考えられる。以下にアグリコンであるバイカレイン、ケルセチンおよびヘスペレチンに対応する配糖体（バイカリン、ルチン、ヘスペリジン）と各糖転移体（G-バイカリン、G-ルチン、G-ヘスペリジン）の構造を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
〔実施例４：α－シヌクレイン凝集体崩壊作用の検討〕
（１）試験サンプル
　三次スクリーニングで選択した12種類の物質を試験サンプルとした。シアニン色素は10 mM のDMSO溶液を調製した後、終濃度が2 μMになるように10 mM Tris-HCl（pH 8.0、0.1 M NaCl）で希釈した。糖類は10 mMの水溶液を調製した後、終濃度が200 μMになるように10 mM Tris-HCl（pH 8.0、0.1 M NaCl）で希釈した。
（２）実験方法
　実施例１で用いたものと同じα－シヌクレイン（0.4 mg/ml、10 mM phosphate buffered saline（以下、「PBS」という）、pH 7.4）を直径3 mmのガラスビーズを入れた96ウェルプレートに150 μl/ウェル添加した後、37℃3日間プレートシェーカーで振盪し、凝集させた。試験サンプル溶液を5 μl添加し、60分後、240分後、1200分後に反応溶液20μlを分取し、180 μlのThT溶液と混合し、蛍光マイクロプレートリーダーでEx 450 nm/ Em 480 nmの蛍光を測定した（各n=3）。なお、ブランクおよび陰性コントロールは、実施例１の１－１（２）に記載のように蛍光を測定した。
（３）結果
　結果を図4に示した。（A）がシアニン色素の結果、（B）が糖類の結果である。シアニン色素では、NK-736＞NK-3422＞NK-196＞NK-359、NK-617、NK-4の順に凝集体崩壊作用が認められた。その活性は、60分後から240分後をピークとし、1200分後には再度ThT蛍光が上昇した。1200分後に蛍光が上昇したのは、シアニン色素は水溶液中で安定性が低いことが原因であると考えられた。糖類では、G-ヘスペリジン、G-バイカリン、G-ルチンに添加から60分で強い凝集体崩壊作用が認められ、その作用は1200分(20時間)まで継続した。なかでもG-バイカリンに最も高い凝集体崩壊作用が認められ、G-ヘスペリジン、G-ルチンの順に凝集体崩壊作用が弱くなった。トレハロースに弱い凝集体崩壊作用が認められたが、イソマルトデキストリンおよびICG-5には作用が認められなかった。
〔実施例５：ヒトα－シヌクレイン過剰発現細胞を用いたin vitro・パーキンソン病モデルによる検討（１）〕
（１）試験サンプル
　4種類のシアニン色素（NK-4、NK-359、NK-617、NK-3422）および6種類の糖類（G-バイカリン、G-ヘスペリジン、G-ルチン、トレハロース、ICG-5、イソマルトデキストリン）を使用した。シアニン色素は、10 mM のDMSO溶液を調製した後、所定の終濃度になるように、試験系に用いたバッファーで希釈して使用した。糖類は、10 mMの水溶液を調製した後、所定の終濃度になるように、試験系に用いたバッファーで希釈して使用した。
（２）実験方法
　『Molecular and Cellular Neuroscience』、71巻、92頁（2016）に記載の大阪大学神経内科学教室で樹立したヒトα－シヌクレインを過剰発現するSH-SY5Y細胞株（以下「SH-SY5Y/α-synuclein」と記す）を用いた。SH-SY5Y/α-synucleinをコラーゲンコートした12ウェルプレートに1×105cells/ウェル/1 ml D-MEM培地（10% ウシ胎児血清（FBS）添加）で蒔き、37℃5%CO2インキュベーターにて一夜前培養した後、レチノイン酸（終濃度10 μM）を添加し、さらに4日間培養した。マルチフェクタム（コスモバイオ）6 μl/ウェルおよびヒトα－シヌクレインフィブリル（コスモバイオ）0.2 μg/100 μl 20 mM Tris-HCl（pH 7.4）/ウェルを添加し、4時間培養した。上清を除去し、試験サンプルを含む新しい培地に交換して所定時間培養し、以下の各試験を実施した。
　所定時間培養後、上清を除去し、SH-SY5Y/α-synuclein をPBS 500 μlで洗浄した後、SDS-PAGEサンプルバッファー100 μlを添加し、ピペッティングにより細胞を回収した。ソニケーターで細胞を破砕し、破砕液20 μl を定法に従い、電気泳動（30 mA/ゲル、1時間）した後、泳動分離したタンパク質をニトロセルロース膜に転写し（100 V、1時間）、オリゴマー量、α－シヌクレイン量、リン酸化α－シヌクレイン量、β－アクチン量をウエスタンブロッティング法で解析した。フィブリル量はドットブロットにて解析した。どちらの場合も、非特異的なシグナルを減じるためのブロッキング処理をした後、1次抗体を1000倍希釈し、細胞内タンパク質が転写されたニトロセルロース膜と反応させた後（4℃、一夜）、ペルオキシターゼ（HRP）標識した2次抗体（2000倍希釈）と反応させ（室温、1時間）、ECL prime Western Blotting Detection Reagents（GEヘルスケア）を用いて目的タンパク質を検出した。得られたバンド強度の定量解析にはImage J（NIH, ver 1.51）を用いた。なお、オリゴマーは、SDS非解離性の30 kDa以上のものを定量した。フィブリルをトランスフェクションして、試験サンプルを添加してないSH-SY5Y/α-synucleinを陽性コントロールとし、フィブリルをトランスフェクションせず、試験サンプルを添加してないSH-SY5Y/α-synucleinを陰性コントロールとした。使用した抗体を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
５－１　α－シヌクレインオリゴマー形成に対する作用
　α－シヌクレインのとりうる形態の中で最も細胞毒性が高く、パーキンソン病の発症原因物質とされるα－シヌクレインオリゴマーの細胞内形成に対する候補物質の作用を比較検討した。
　フィブリルトランスフェクション後、試験サンプルを含む培地に交換して3日間培養し、回収した細胞中のオリゴマー量（β－アクチンに対するオリゴマーの割合）を測定した。3日目の結果をフィブリルトランスフェクションしたSH-SY5Y/α-synucleinのオリゴマー量を100%とした相対百分率で表し、表2に示した。フィブリルトランスフェクション後3日目では、ICG-5（100、500 μM)、トレハロース（100 μM）、G-ルチン（100、500 μM）、G-ヘスペリジン（100、500 μM）、G-バイカリン（100、500 μM）、NK-4(1 μM）、NK-359（1、5 μM）およびNK-617（1 μM）で陽性コントロールの50%以下となるオリゴマー形成抑制作用が認められた。なお、α－シヌクレインオリゴマーの細胞内形成に対する作用の有無は、50%以下を作用ありと評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　上記試験と同様にフィブリルトランスフェクション後、試験サンプルを含む培地に交換して3日間培養した。3日目に試験サンプルを含む新しい培地に交換してさらに2日間培養し（5日目）、回収した細胞中のα－シヌクレインオリゴマーを測定した。データは示していないが、添加5日目では、NK-3422が低濃度において顕著なα－シヌクレインオリゴマー形成抑制作用を示した。
　これらの結果から、試験管内でα－シヌクレイン凝集抑制作用を示した物質は、細胞内におけるα－シヌクレインの凝集・伝播に対しても有効であることが示された。
５－２　α－シヌクレインのフィブリル形成に対する作用
　フィブリルトランスフェクション後、試験サンプルを含む培地に交換して5日間培養し、回収したSH-SY5Y/α-synuclein中のα－シヌクレインのフィブリルを測定した。試験サンプルは、添加2日後に新しいサンプルを含む培地に交換した。各試験サンプルのフィブリル抑制作用は、陽性コントロールのフィブリル量を100%とした相対百分率で表した時の値(x)を元に、次の様に評価した。－:x＞100%、±: 80%＜x≦100%、＋:60%＜x≦80%、＋＋：40%＜x≦60%、＋＋＋：x≦40%。この時の結果を表3に示した。イソマルトデキストリン（100 μM）、トレハロース（100 、500 μM）、G-ヘスぺリジン(100 μM)、G-ルチン(100、500 μM)、G-バイカリン（100 μM）に＋＋となる高いα－シヌクレインのフィブリル形成抑制作用が認められ、NK-4（1、5 μM）、NK-3422（1 μM）、ICG-5（500 μM）、G-バイカリン(500 μM)に＋となる弱いα－シヌクレインのフィブリル形成抑制作用が認められた。フィブリル形成に関しては、シアニン色素に比較して糖の抑制作用が高かった。以上の結果より、α－シヌクレインオリゴマーおよびフィブリルの両方に高い作用の認められたイソマルトデキストリン、トレハロース、G-ヘスぺリジン、G-ルチン、G-バイカリンはα－シヌクレインの凝集・伝播に対し抑制作用を発揮する可能性が示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
５－３　α－シヌクレインのリン酸化に対する作用
　α－シヌクレインの凝集プロセスにおいて、リン酸化α－シヌクレインは、最も初期の凝集パラメーターとして注目されている。フィブリルトランスフェクション後、試験サンプルを含む培地に交換して3日間培養し、回収したSH-SY5Y/α-synuclein中のリン酸化α－シヌクレイン量を測定した。各試験サンプルのα－シヌクレインリン酸化抑制作用は、陽性コントロールのリン酸化α－シヌクレイン量を100%として相対百分率で表した時の値(x)を元に、次の様に評価した。－:x＞90%、±:70%＜x≦90%、＋:50%＜x≦70%、＋＋：30%＜x≦50%、＋＋＋x≦30%。結果を表4に示した。陽性コントロールでは、陰性コントロールの約2.5倍のリン酸化α－シヌクレインが検出された。この系において、NK-3422（1 μM）、トレハロース（100 μM）、イソマルトデキストリン（20、100、500 μM）、ICG-5（20 μM）、 G-ヘスペリジン（20、100、500 μM）、G-バイカリン（20、100、500 μM）に＋＋＋となる非常に高いリン酸化α－シヌクレイン形成抑制作用が認められた。
　この結果から、試験に供したシアニン色素によるα－シヌクレイン量に対するリン酸化α－シヌクレイン量の割合の抑制、すなわちリン酸化α－シヌクレイン形成抑制作用は、NK-3422＞NK-4＞NK-617＞NK-359であり、試験に供した糖類によるリン酸化α－シヌクレイン形成抑制作用は、イソマルトデキストリン、G-バイカリン＞トレハロース、ICG-5、G-ヘスペリジン＞G-ルチンであると評価した。イソマルトデキストリン、トレハロース、G-ヘスぺリジン、G-バイカリンの４種の化合物は、リン酸化α－シヌクレイン、オリゴマー、フィブリルのどの凝集体の形成も抑制したことからα－シヌクレインの凝集を抑制する化合物候補として有力であると判断した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
〔実施例６：SH-SY5Y細胞を用いたα－シヌクレイン細胞間伝播抑制の検討〕
　SH-SY5Y細胞（ヒトα－シヌクレインを過剰発現しない）をD-MEM/HamF12 1:1 培地（日水製薬株式会社；10% FBS添加）で24ウェルプレートに1×105個播種して3日間培養した後、レチノイン酸（終濃度10μM）を加えて7日間分化誘導した。試験サンプル（シアニン色素は1μM、糖類は100μM）を含む培地に交換して5日間培養した後、α－シヌクレインを内包するエクソソーム（SH-SY5Y/α-synucleinの培養上清よりハンサバイオ社Exo-Prepを用いて精製したもの）を等量添加して4時間培養し、細胞に取り込ませた。その後、試験サンプル含む培地に交換してさらに4日間培養し、SH-SY5Y細胞を回収し、Western blottingにより単位タンパク質当たりのα－シヌクレインオリゴマー量を定量した。
　結果を図5に示した。グラフは、エクソソームを添加した陽性コントロール（Fibril transfection）の細胞のα－シヌクレインオリゴマー量を100%とした相対百分率で示した。NK-4、NK-359、NK-617、NK-3422、ICG-5、G-バイカリン、G-ヘスペリジン、G-ルチンにα－シヌクレインの細胞間伝播抑制作用が認められた。試験に供したシアニン色素のα－シヌクレインの細胞間伝播抑制作用は、NK-4、NK-359＞NK-617＞NK-3422であり、試験に供した糖類のα－シヌクレインの細胞間伝播抑制作用は、G-ヘスペリジン＞G-バイカリン、G-ルチン＞ICG-5であると評価した。以上の結果より、G-ヘスぺリジンおよびG-バイカリンではα－シヌクレインの凝集だけでなく伝播も抑制することから、α－シヌクレインの凝集・伝播の抑制物質候補として有用であることが示唆された。
〔実施例７：α－シヌクレイン以外のタンパク質凝集に対する作用の検討〕
　6種類のシアニン色素（NK-4、NK-196、NK-359、NK-617、NK-736、NK-3422）および6種類の糖類（G-バイカリン、G-ヘスペリジン、G-ルチン、トレハロース、ICG-5、イソマルトデキストリン）を試験サンプルとして、α－シヌクレイン以外のタンパク質凝集に対する作用を検討した。
７－１　β－アミロイド凝集に対する抑制作用
　β-amyloid25-35（Anaspec、以下「Aβ」と記す）は、DMSOを用いて濃度8 mMに溶解し、試験時まで-80℃で保存した。使用直前に、10 mMリン酸バッファー（pH 7.4）を用いて200 μMに希釈した。試験サンプルを10 mMリン酸バッファー（pH7.4）で溶解し、終濃度の2倍濃度に調整した。96ウェルプレートに、Aβ（200 μM）25 μl/ウェルおよび試験サンプル25 μl/ウェルを入れて混合した。37℃のインキュベーター内で72時間反応させた後、ThT緩衝液（40 μM/10 mMリン酸バッファー）を150 μl添加し、常温で30分間反応させた。蛍光マイクロプレートリーダーで凝集Aβに起因するEx 450 nm/ Em 480 nmの蛍光を測定した。ブランクには200 μlのThT緩衝液(ThT終濃度30 μM)を用いた。
　試験サンプルを添加しない対照の蛍光強度を100%とした際の各試験サンプルの相対百分率を表5および表6に示した。シアニン色素ではNK-617、糖類ではG-ルチン、G-バイカリンのAβ凝集抑制作用が最も高く、NK-736、NK-3422、NK-4、NK-196、G-ヘスペリジン、イソマルトデキストリン、ICG-5でも中程度のAβ凝集抑制作用が認められた。一方、NK-359、トレハロースではほとんどAβ凝集抑制作用は認められなかった。これらの結果から、G-ヘスペリジンは、他のフラボノイド配糖体に比較してAβ凝集抑制作用が低く、α－シヌクレインに対する選択性が高いと考えられた。また、トレハロースはAβ凝集抑制作用が非常に低く、α－シヌクレインに対する指向性が高いと考えられた。統計解析にはstudent's t-testを用い、サンプル非添加のコントロールの値と比較した場合のp値がp<0.05のとき、統計学的に有意な差があると判断し、**p<0.01、*p<0.05で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
７－２　アミリン凝集に対する抑制作用
　Amylin8-37（KareBay Biochem）は、hexafluoro-2-propanol（HFIP）（Sigma）を用いて濃度1mMに溶解し、水浴中で2分間超音波処理した。このAmylin8-37/HFIP溶液は10 mM酢酸ナトリウムバッファー（pH 6.4）を用いて20 μMに希釈した。試験サンプルを10 mM酢酸ナトリウムバッファーで溶解し、終濃度の4倍濃度に調整した。96ウェルプレートに、20 μMアミリン溶液を50 μl/ウェル添加した。次にThT（160 μM/10 mM酢酸ナトリウムバッファー）を25 μl/ウェル添加した。次に試験サンプルを25 μl/ウェル添加し、混合した。37℃のインキュベーター内で24時間反応させた後に、蛍光マイクロプレートリーダーでアミリン凝集体に起因するEx 450 nm/ Em 480 nmの蛍光を測定した。試験サンプルを添加しないコントロールには100 μlのThT緩衝液(ThT終濃度20 μM)を用いた。
　試験サンプルを添加しない対照の蛍光強度を100%とした際の各試験サンプルの相対百分率を表7および表8に示した。シアニン色素では、NK-196、NK-359、NK-3422に高いアミリン凝集抑制作用が認められた。糖類では、G-バイカリンおよびイソマルトデキストリンに比較的高いアミリン凝集抑制作用が認められたが、100μMでも完全に凝集を抑制することはできなかった。これらの結果から、G-ヘスペリジンおよびトレハロースはα－シヌクレインに対する特異性が高いと考えられた。統計解析にはstudent's t-testを用い、試験サンプルを添加しないコントロールの値と比較した場合のp値がp<0.05の時、統計学的に有意差があると判断し、**p<0.01, *p<0.05で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
７－３　タウ凝集に対する抑制作用
　Tau306-336（Anaspec）は、超純水を用いて5 mg/mlの濃度に溶解し、試験時まで-80℃で保存した。使用直前に、10 mM HEPESバッファー（pH 7.4; 100 mM NaCl、60 μg/ml heparin）で40 μMに希釈した。試験サンプルを10 mM HEPESバッファーで溶解し、終濃度の2倍濃度に調整した。96ウェルプレートに、40 μMタウ溶液を50 μl/ウェル添加した。次にThT（40 μM/10 mM HEPESバッファー）を50 μl/ウェル添加した。次に、試験サンプルを50 μl/ウェル添加し、混合した。37℃のインキュベーター内で24時間反応させた後に蛍光マイクロプレートリーダーでタウ凝集体に起因するEx 450 nm/ Em 480 nmの蛍光を測定した。試験サンプルを添加しないコントロールには200 μlの10 μM ThT/10 mM HEPESバッファーを用いた。
　試験サンプルを添加しないコントロール（濃度0μM）の蛍光強度を100%とした際の各試験サンプルの相対百分率を表9および表10に示した。シアニン色素では、NK-196およびNK-3422に高いタウ凝集抑制作用が認められ、次いでNK-4、NK-359に比較的高いタウ凝集抑制作用が認められた。糖類では、G-バイカリンに高いタウ凝集抑制作用が認められたが、他の物質にはほとんどタウ凝集抑制作用が認められなかった。これらの結果から、G-ヘスペリジンはタウ凝集にほとんど作用せず、α－シヌクレインに対する選択性が高いと考えられた。トレハロースはタウ凝集に対する作用が低く、比較的α－シヌクレイン指向性が高いと考えられた。統計解析にはstudent's t-testを用い、試験サンプルを添加しないコントロールの値と比較した場合のp値がp<0.05の時、統計学的に有意差があると判断し、**p<0.01, *p<0.05で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　以上の結果より、G-バイカリンはα－シヌクレインのみでなく、Aβ、アミリンおよびタウといった他のアミロイド蛋白質の凝集についても高い抑制作用を示すことが示された。一方、G-ヘスぺリジンに関しては、α－シヌクレイン凝集抑制作用は高いものの、アミリンおよびタウといった他のアミロイド蛋白質の凝集についてはほとんど作用せず、α－シヌクレイン選択性が高いことが示された。
〔実施例８：ヒトα－シヌクレイン過剰発現細胞を用いたin vitro・パーキンソン病モデルによる検討（２）〕
　実施例５で使用したSH-SY5Y/α-synuclein（ヒトα－シヌクレインを過剰発現するSH-SY5Y細胞株）を用い、トランスフェクションするフィブリルを、野生型ヒトα－シヌクレインフィブリルに代えて変異型ヒトα－シヌクレイン（G51D）フィブリルを用いて、G-ヘスペリジンのα－シヌクレインオリゴマー形成抑制作用およびα－シヌクレイン凝集抑制作用を検討した。
　変異型ヒトα－シヌクレイン（G51D）のアミノ酸配列は、野生型ヒトα－シヌクレインのアミノ酸配列（配列番号1：NCBI ACCESSION No. CAG46454）の51番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されている。この変異型ヒトα－シヌクレイン（G51D）は、2013年にイギリスで最初に報告され、2014年に日本でも報告された変異型ヒトα－シヌクレインであり（Acta Neuropathol. 2013 May;125(5):753-769、Parkinsonism Relat Disord. 2014 Feb;20(2):262-264）、この変異を有するパーキンソン病患者は若年発症であり、孤発性のパーキンソン病では認められない精神症状や錐体路症状を呈する特徴がある。なお、変異型ヒトα－シヌクレイン（G51D）は、試験管内凝集系（例えば、実施例１のスクリーニング方法で用いたマイクロプレート凝集系）では凝集しないことが本発明者らにより確認されている。
　SH-SY5Y/α-synuclein培養し、ヒトα－シヌクレインフィブリルとしては、変異型ヒトα－シヌクレイン（G51D）フィブリル（超音波法により凝集させたG51Dα－シヌクレインタンパク質）を用いた以外は、実施例５で行ったと同様にα－シヌクレインのオリゴマー生成量を分析した。またα－シヌクレイン凝集体を検出する1次抗体としては、抗α－シヌクレイン抗体（alpha Synuclein Antibody(Syn211)、ThermoFisher scientific #MA5-12272）を用いた。変異型ヒトα－シヌクレイン（G51D）フィブリルをトランスフェクションし、G-ヘスペリジンを添加してないSH-SY5Y/α-synucleinを陽性コントロールとし、変異型ヒトα－シヌクレイン（G51D）フィブリルをトランスフェクションせず、G-ヘスペリジンを添加してないSH-SY5Y/α-synucleinを陰性コントロールとした。
　結果はコントロールのα－シヌクレインオリゴマー量を100%として相対百分率で表11に示した。α－シヌクレインオリゴマーについては、陽性コントロールは陰性コントロールと比較して顕著にα－シヌクレインオリゴマー量が増加していた。G-ヘスペリジンは、用量依存的にα－シヌクレインオリゴマーの形成を抑制した。また、G-ヘスペリジンは、高分子量（30kDa）の凝集体形成を抑制した。以上の結果より、G-ヘスペリジンは、脳における変異型α－シヌクレイン（G51D）を核とした凝集体形成においても抑制作用を発揮する可能性が示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
〔実施例９：G-ヘスペリジンおよびその代謝物の血液脳関門（BBB）透過性の検討〕
　G-ヘスペリジンは、細胞内で野生型α－シヌクレイン凝集伝播に対して抑制作用を示したが、生体の脳内で期待する作用を発揮するには血液脳関門（BBB）の透過性が重要な要素であるとされる。そこで、G-ヘスペリジンおよびその代謝物であるヘスペリジンおよびヘスペレチンについて、in vitro BBB再構築キットを用いて脳移行性を評価した。
（１）実験材料
　BBBキット（RBT-24H、ファーマコセル株式会社）
　BBBキット培養液（ファーマコセル株式会社）
　DPBS-Hアッセイバッファー（10 mM HEPES 50 ml、0.9 mM CaCl2・2H2O、MgCl2・12H2O、D-PBS 4.9g/ 500 mL）
　G-ヘスペリジン（林原ヘスペリジン（登録商標）S、Lot 7B011；モノグルコシルヘスペリジン 75.9%含有）
　ヘスペリジン（富士フィルム和光純薬、Lot 086-07342）
　ヘスペレチン（富士フィルム和光純薬、Lot 326-03843）
　DMSO（ナカライ、19659-14）
　CAPCELL PAK C18 UG120カラム（資生堂、5 μm、φ4.6×250 mm、Cat No. 6150）
　×Bridge C8 カラム（BEH Technology 5 μm、φ4.6×250 mm、Lot 0109301671）
（２）実験方法
　BBBキットは、脳毛細血管内皮細胞、ペリサイトおよびアストロサイトの3種類の細胞とインサート膜で構成された血液脳関門再構築モデルである。使用開始時に37℃に温めたBBBキット培養液をインサートの外側（脳側）に1000 μl、インサートの内側（血管側）に200 μl添加し、37℃の5%CO2インキュベーターで2時間培養後、培地を全量回収・廃棄し、新鮮な同培養液をインサートの外側（脳側）に1200 μl、インサートの内側（血管側）に300 μl添加した。さらに22時間後に同様の方法で培地交換し、3日間培養した後に経内皮電気抵抗を測定した。このとき、適正に細胞間のタイトジャンクションが形成されていれば電気抵抗値が上昇し、150 Ωcm2 以上の数値となることがメーカーにより保証されている。この条件をクリアしたインサートを選択し、900 μlのDPBS-Hアッセイバッファーを添加した新しいウェルにインサートを配置した。インサートの内側（血管側）に、DPBS-Hアッセイバッファーで200 μM に調整したG-ヘスペリジン、ヘスペリジン、ヘスペレチンを600 μl添加し、プレートシェーカーで穏やかに振とうしながら、37℃、5%CO2インキュベーターで培養した。30分後、60分後、24時間後にインサート外液（脳側）に滲出したサンプルを、よくピペッティングした後、200μlずつ回収した。サンプル回収後、インサートを新しい900 μlのDPBS-Hアッセイバッファーを添加したウェルに配置し、さらに30分培養後にサンプルを回収した後、同様の手順で24時間後のサンプルを回収した。なお、24時間後にはインサート内液中のサンプルも同様に回収した。回収したサンプルにアセトニトリルまたはメタノールを移動相と等しい割合で混合し、0.45 μmのフィルターでろ過した後、HPLC分析に供した。
　HPLCの操作条件を以下に示す。
(i) G-ヘスペリジン、ヘスペリジンの定量
　カラム：CAPCELL PAK C18 UG120
　移動相：水/アセトニトリル/酢酸=80/20/0.01
　流量：0.7 mL/min
　カラム温度：40℃
　液体クロマトグラフ：SHIMADZU UFLC prominence LC-20AD
　検出器：紫外分光光度検出器（測定波長：280 nm）
　試料注入量：10 μL
(ii) ヘスペレチンの定量
　カラム：×Bridge C8
　移動相：水/メタノール/酢酸=58/40/2
　流量：0.7 mL/min
　カラム温度：40℃
　液体クロマトグラフ：SHIMADZU UFLC prominence LC-20AD
　検出器：紫外分光光度検出器（測定波長：280 nm）
　試料注入量：10 μL
　透過計数（Papp）は、メーカーのインストラクションに従い、以下の計算式で算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000016
　PaPP：細胞、インサートメンブレンおよび細胞外基質の合計の透過係数
　VA：インサートの内側(血管側)の液量
　Δ[C] Abluminal：インサートの内側(血管側)の試験物質濃度
　A：膜表面積
　[C]Luminal：インサートの外側(脳側)の試験物質濃度
　Δt：測定時間 PSe：細胞と細胞外基質のバリア機能
　PSmem：インサート膜のバリア機能
　PStotal：細胞、インサートメンブレンおよび細胞外基質のバリア機能の合計
　Pe：細胞と細胞外基質の透過係数
（３）結果
　結果を表12に示した。G-ヘスペリジンとヘスペリジンに関しては、透過係数は24時間（1440分）後まで増加傾向にあり、それぞれ24時間後の2.9×10-6 cm/sおよび3.4×10-6 cm/sが最大となった。表13に示したキット販売元の指標と照らし合わせると、G-ヘスペリジンとヘスペリジンはBBBを極僅かではあるものの透過すると判断された。G-ヘスペリジンでは、添加24時間後のインサート外液中から代謝物のヘスペリジンのピークが検出されており（3.9 nmol）、一部はBBB透過時に細胞膜表面の酵素によりヘスペリジンに分解され、インサート外液に移行したと推察されたが、今回の透過係数はG-ヘスペリジンとして外液中から検出されたもののみの値に基づいて算出した。
　ヘスペレチンに関しては、60分後まで非常に高い透過係数を示し、その値は60分後に最大値となる61.8×10-6 cm/sに達したが、24時間後では10.0×10-6 cm/sまで低下した。ヘスペレチンはアンチピリン等の脳移行性の薬剤と同等以上の非常に高いBBB透過性を有していることが明らかとなり（表13参照）、受動拡散で容易に脳に移行することが示唆された。ヘスペレチンの24時間（1440分）後の回収率は44.9%と低かったが、培養器材への吸着は認められなかったことから、細胞内への移行や代謝による可能性が考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
〔実施例１０：MPTP誘導性パーキンソン病モデルマウスに対するG-ヘスペリジンの効果の検討〕
　MPTP（1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン塩酸塩）は、神経毒として知られる化合物であり、アストロサイトやミクログリア細胞のミトコンドリア外膜にあるモノアミン酸化酵素B型により酸化されてMPP+となりドーパミントランスポーターにより、ドーパミン神経に特異的に取り込まれラジカルとして作用する。これによりミトコンドリア呼吸鎖阻害、膜電位消失、各種酵素の活性化などが生起し、ドーパミンニューロンの変性を引き起こすとともに、生じる活性酸素によりα－シヌクレインの凝集が誘導される。そこで、パーキンソン病動物モデルとして汎用される、MPTP誘導性パーキンソン病マウスにおけるG-ヘスペリジンの作用を検討した。
（１）実験材料
　動物：C57BL/6Jマウス、雄、6週齢（日本チャールス・リバー、10匹/群）
　1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン塩酸塩（MPTP、シグマアルドリッチ、M0896）
　G-ヘスペリジン（林原ヘスペリジン（登録商標）S、Lot 7B011；モノグルコシルヘスペリジン 75.9%含有）
　ヘスペリジン（富士フィルム和光純薬、Lot 086-07342）
　ヘスペレチン（富士フィルム和光純薬、Lot 326-03843）
　カルボキシメチルセルロースナトリウム（CMC、富士フィルム和光純薬、039-01335）
　RIPAバッファー（富士フィルム和光純薬、188-02453）
　プロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク、25955-11）
（２）実験方法
（2-1）マウスパーキンソン病モデル作製
　マウスを1週間予備飼育した後、体重を指標としてコントロール群、MPTP群、G-ヘスペリジン群、ヘスペリジン群およびヘスペレチン群に群分けし（10匹/群）、試験サンプルの投与を開始した。G-ヘスペリジン群には、G-ヘスペリジンを1％含有する蒸留水を飲水として自由に摂取させた（1％飲水投与）。ヘスペリジンおよびヘスペレチンは水に不溶であるため、ヘスペリジン群にはG-ヘスペリジン1％と等モル量である1.68 g/kgのヘスペリジンを、ヘスペレチン群にはG-ヘスペリジン1％と等モル量である0.78 g/kgのヘスペレチンを、それぞれ1％CMCに懸濁し、1日1回胃ゾンデを用いて強制経口投与した。投与量は予備検討により予め測定したマウスの一日当たりの飲水量から算出したG-ヘスペリジン摂取量に合わせて設定した。
　試験サンプルを2週間投与した後、MPTP（20 mg/kg）を2時間おきに4回腹腔内投与した。MPTP投与後も7日間試験サンプルの投与を継続した。MPTP投与後7日目に麻酔下で採血した。その後心灌流し、脳を摘出した。5個体は、ホルマリン固定後薄切し免疫染色に供した。残りの5個体は、ドライアイス凍結後、5倍量（w/v）のRIPAバッファー（プロテアーゼ阻害剤カクテル含有）を加えて全脳ホモジネートを調製し、以後の試験に供した。
（2-2）行動試験
　MPTP投与翌日から4日間、毎日行動試験（Grid test）を行い、感覚運動機能を評価した。8 mm間隔のステンレス網を用い、垂直方向の2方向のGrid testを実施した。垂直に設置したgrid上に、マウスの頭部を上向きに捕まらせ、方向転換して頭を水平より下向きに移動するまでの時間を測定した。なお、50秒間方向転換しなかった個体はデータ解析から除外した。
（2-3）脂質過酸化物定量
　上記の脳ホモジネートを100,000 gで1時間遠心分離（4℃）し、上清を採取した。脳中の脂質過酸化物量を、多価不飽和脂肪酸脂質過酸化物の分解物であるマロンジアルデヒド（MDA）の量として測定した。測定にはTBARS Microplate Assay Kit（Oxford Biomedical Research、FR45）を用い、キットのプロトコールに従って行った。また、ブラッドフォード法によりタンパク質定量を行い、単位タンパク質量あたりの脂質過酸化物量を算出した。
（2-4）脳黒質のTH（tyrosine hydroxylase）陽性細胞の免疫染色
　組織切片を脱パラフィン後再水和した後、クエン酸バッファー（pH 6.0）中で抗原の賦活化を行った（100℃、10 分間）。30分間冷却した後、内因性ペルオキシダーゼの不活化を行い（3%過酸化水素 10 分間）、常温で2時間ブロッキングした後（10% Goat serum、1% BSA、0.3% TritonX/TBS; 20mM Tris-HCl、0.9% NaCl(pH7.2)）、抗Tyrosine hydroxylase抗体（メルク、6A2907）を1次抗体希釈液（1% Goat Serum、1% BSA/TBS）で1000倍希釈し、4℃で一夜反応させた。TBSで洗浄後（5分間×3回）、2次抗体（HRP標識抗体）を常温で2時間反応させ、さらにTBSで洗浄（5分間×3回）した。HistoMark True Blue Peroxidase System（SeraCare Life Sciences, Inc.）で10分間発色させた後（常温）、水洗し、Contrast Redを用いて核を染色した。
（2-5）脳黒質のIba1（Ionized calcium-binding adapter molecule1）陽性細胞の免疫染色
　1次抗体として抗Iba1抗体（アブカム、ab107159）を用いた以外は、上記（2-4）と同じ手順で免疫染色を行った。
（３）結果
（3-1）行動試験
　結果を図6に示した（平均値±SEM（standard error of mean））。（A）がMPTP投与1日目の結果、（B）がMPTP投与2日目の結果である。MPTP群ではコントロール群に比較して1日目の方向転換に要する時間が2倍以上に増加しており（p<0.01 vs. control）、2日目も高値を示した。G-ヘスペリジン群では、1日目および2日目とも、MPTP群と比較して方向転換に要する時間について、統計学的に有意な短縮が認められた。一方、ヘスペリジン群およびヘスペレチン群では、MPTP群と比較して方向転換に要する時間の短縮傾向は認められたものの、G-ヘスペリジン群と比較してその効果は弱く、どちらも統計学的有意差は認められなかった。3日目以降はMPTP群とコントロール群との間に差が認められなくなったため、被検物質の効果判定は不可能であった。
（3-2）脂質過酸化物
　結果を図7に示した（平均値±SEM）。MPTP群ではコントロール群に比較して脂質過酸化物量の増加が認められた（p<0.01 vs. control）。G-ヘスペリジン群では脂質過酸化物量の増加がコントロール群と同程度にまで抑制され、MPTP群に比較して統計学的有意差が認められた（p<0.01 vs. MPTP）。ヘスペリジン群およびヘスペレチン群では、MPTP群と比較して脂質過酸化物量の抑制傾向は認められたものの、どちらもMPTP群と比較して統計学的有意差は認められなかった。
（3-3）脳黒質のTH陽性細胞の免疫染色
　TH（tyrosine hydroxylase）はドーパミンニューロンのマーカーである。
　結果を図8に示した（n=10、平均値±SEM）。MPTP群ではではコントロール群に比較してTH陽性領域の減少が認められた（p<0.05 vs. control）。G-ヘスペリジン群では、MPTP投与によるTH陽性領域の減少が顕著に抑制され（p<0.01 vs. MPTP）、G-ヘスペリジン群のTH陽性領域はコントロール群と同じレベルであった。ヘスペリジン群およびヘスペレチン群では、G-ヘスペリジン群と比較してTH陽性領域の減少抑制作用は弱かったが、どちらもMPTP群と比較して統計学的有意差が認められた（p<0.01 vs. MPTP）。
（3-4）脳黒質のIba1陽性細胞の免疫染色
　Iba1は、マクロファージとミクログリアに特異的に発現するカルシウム結合タンパク質であり、細胞の活性化に伴い発現が増加することが報告されている（Mol Brain Res. 1998 Jun 1;57(1):1-9）。また、パーキンソン病患者の脳では、活性化ミクログリアの惹起する神経炎症がトリガーとなりドーパミン神経細胞死が誘導されることが知られている。MPTP誘導性パーキンソン病モデルマウスでも、Iba1陽性ミクログリアの浸潤が確認されている。
　結果を図9に示した（n=10、平均値±SEM）。MPTP群ではコントロール群に比較してIba1陽性細胞数が約3倍増加した（p<0.05 vs. control）。G-ヘスペリジン群では、Iba1陽性細胞の顕著な増加抑制が認められ（p<0.01 vs. MPTP）、G-ヘスペリジン群のIba1陽性細胞数はコントロール群とほぼ同じレベルであった。ヘスペリジン群およびヘスペレチン群では、G-ヘスペリジン群と比較してIba1陽性細胞の増加抑制作用は弱かったが、どちらもMPTP群と比較して統計学的有意差が認められた（p<0.05 vs. MPTP）。以上の結果から、糖転移ヘスペリジンはパーキンソン病モデルマウスに対してα－シヌクレイノパチー予防および／または改善することが分かった。糖転移ヘスペリジンほど強い効果ではないものの、ヘスペレチンおよびヘスペリジンにも効果があることが分かった。また、実施例２乃至４の結果から推察すると、バイカレイン、バイカリン、糖転移バイカリン、ケルセチン、ルチンおよび糖転移ルチンも特異性は低くなるが、α－シヌクレイノパチー予防および／または改善する効果が期待できる。
〔実施例１１：G-ヘスペリジンとの組み合わせによるα－シヌクレイン凝集抑制効果の検討〕
　α－シヌクレイン凝集抑制効果に対するG-ヘスペリジンとNK-3422との組み合わせ、およびG-ヘスペリジンとトレハロースとの組み合わせについて検討した。
１１－１　試験管内試験による検討
（１）実験方法
　96ウェルプレートの各ウェルに直径3 mmのガラスビーズを入れた後、α－シヌクレイン（0.4 mg/ml）を145 μl/ウェル添加した。試験サンプル溶液を5 μl/ウェル添加し、37℃のインキュベーター中で72時間振盪した。反応溶液20 μlを、180 μlの20 μM ThT/Tris-HCl(pH 8.0、0.1M NaCl）と混合し、蛍光マイクロプレートリーダーでα－シヌクレイン凝集体に起因するEx 450 nm/ Em 480 nmの蛍光を測定した。
　結果を図10に示した。（A）がG-ヘスペリジンとNK-3422との組み合わせの結果、（B）がG-ヘスペリジンとトレハロースとの組み合わせの結果である。（A）より、G-ヘスペリジンのα－シヌクレイン凝集抑制作用に対してNK-3422は相加効果を示した。（B）より、G-ヘスペリジンのα－シヌクレイン凝集抑制作用に対してトレハロースは相乗効果を示した。統計解析にはstudent's t-testを用い、サンプル非添加のコントロールの値と比較した場合のp値がp<0.05のとき、統計学的に有意な差があると判断し、**P<0.01、*p<0.05で示した。
１１－２　細胞内試験による検討
　ヒトα－シヌクレインを過剰発現するSH-SY5Y/α-synucleinをコラーゲンコートした12ウェルプレートに1×105cells/ウェル/1 ml D-MEM培地（10% FBS）蒔き、37℃、5%CO2 インキュベーターにて一夜前培養した後、レチノイン酸（終濃度10 μM）を添加し、さらに4日間培養した。マルチフェクタム（コスモバイオ）6 μl/ウェルおよび野生型ヒトα－シヌクレインフィブリル0.2 μg/100 μl 20 mM Tris（pH 7.4）/ウェルを添加し、4時間培養した。上清を除去し、試験サンプルを含む新しい培地に交換した。3日後に試験サンプルを含む新しい培地に交換し、さらに２日間培養した。上清を除去し、PBS 500 μlで洗浄した後、SDS-PAGEサンプルバッファー100 μlを添加し、細胞を回収し、Western blotting法でα－シヌクレインオリゴマーを定量した。
　結果を図11に示した。（A）がG-ヘスペリジンとNK-3422との組み合わせの結果、（B）がG-ヘスペリジンとトレハロースとの組み合わせの結果である。（A）より、G-ヘスペリジンのα－シヌクレイン凝集抑制作用に対してNK-3422は相加効果を示した。（B）より、G-ヘスペリジンのα－シヌクレイン凝集抑制作用に対してトレハロースは相乗効果を示した。なお、併用効果に関してはCombination Index (CI)を用い、CI=1の場合：相加効果、CI<1の場合：相乗効果、CI>1の場合：相殺効果と判定した。ここで、CI=[H]/[H']+[X]/[X']であり、G-ヘスぺリジンと素材Xとの併用(G-ヘスぺリジンの用量を[H']、素材Xの用量を[X'])により生じる反応値と同じ大きさの反応値を示す各素材単独の用量(G-ヘスぺリジンの用量を[H]、素材Xの用量を[X]で示した。以上の結果から、糖転移ヘスペリジンとシアニン色素（NK-3422）あるいは糖類（トレハロース）との組合せにより試験管内でα－シヌクレインの凝集を相加的あるいは相乗的に抑制することが分かった。
〔実施例１２：パーキンソン病モデルマウス（α－シヌクレイン伝播モデル）を用いたG-ヘスペリジンのα－シヌクレイン凝集、伝播抑制効果の検討〕
　変異型α－シヌクレイン（G51D）は、家族性パーキンソン病の原因遺伝子であるが、このタイプの変異を有するパーキンソン病患者は、発症年齢が若齢であること、症状の進行が非常にドラスティックであることが特徴である。そこで、大阪大学神経内科にて確立した、変異型α－シヌクレイン（G51D）のフィブリルを核としたマウス脳内凝集伝播モデルにおけるG-ヘスペリジンの凝集伝播抑制作用の検討を行った。
（１）実験材料
　動物：C57BL/6Jマウス、雄、8週齢（日本チャールス・リバー、5-6匹/群）
　G-ヘスペリジン（林原ヘスペリジン（登録商標）S、Lot 7B011；モノグルコシルヘスペリジン 75.9%含有）
（２）実験方法
　C57BL/6Jマウスを1週間予備飼育した後、平均体重およびばらつきが均一になるように、コントロール群（n=5）およびG-ヘスペリジン群（n=6）に群分けした。群分け後から実験終了時まで、コントロール群には蒸留水を、G-ヘスペリジン群にはG-ヘスペリジンを1％含有する蒸留水を、飲水として自由に摂取させた（1％飲水投与）。飲水投与開始から2週間経過後に、変異型ヒトα－シヌクレイン（G51D）フィブリル（超音波法により凝集させたG51Dα－シヌクレインタンパク質）20μgを左脳黒質部に直接投与した。飲水投与開始から24週目に麻酔下で心灌流を行い、4％パラホルムアルデヒドで固定した後、脳を摘出した。冠状断で厚さ20 μmの切片を作製し、抗リン酸化α－シヌクレイン抗体（アブカム、ab51253、1000倍希釈）で染色を行い、左黒質におけるリン酸化α－シヌクレイン陽性凝集体の定量を行った。リン酸化α－シヌクレインの免疫染色について、左側の黒質でランダムに5切片/匹をカウントし、切片あたりの凝集体数を示した。
（３）結果
（3-1）リン酸化α－シヌクレイン凝集体
　結果を図12に示した。黒質（投与側）においてG-ヘスペリジン群でリン酸化α－シヌクレイン陽性凝集体形成の抑制傾向を認めた（median：コントロール群57、G-ヘスペリジン群34、p=0.0579 t-test）。従って、G-ヘスペリジンは経口摂取によって、脳におけるα－シヌクレインの凝集伝播を抑制する可能性が示された。以上の結果より、糖転移ヘスペリジンはα－シヌクレイン（リン酸化α－シヌクレイン）特異的な凝集および伝播を抑制することが分かった。
〔実施例１３：のパーキンソン病モデルマウス（α－シヌクレイン伝播モデル）を用いたG-ヘスペリジンの運動機能改善効果の検討
（１）実験材料
　動物：C57BL/6Jマウス、雄、8週齢（日本チャールス・リバー、12匹/群）
　G-ヘスペリジン（林原ヘスペリジン（登録商標）S、Lot 7B011；モノグルコシルヘスペリジン 75.9%含有）
（２）実験方法
　C57BL/6Jマウスを1週間予備飼育した後、平均体重およびそのばらつきが均一になるように、コントロール群（n=12）およびG-ヘスペリジン群（n=12）に群分けした。群分け後から実験終了時まで、コントロール群には蒸留水を、G-ヘスペリジン群にはG-ヘスペリジンを1％含有する蒸留水を、飲水として自由に摂取させた（1％飲水投与）。飲水投与開始から2週間経過後に、変異型ヒトα－シヌクレイン（G51Dα）フィブリル（超音波法により凝集させたG51Dα－シヌクレインタンパク質）20μg（5μg/μl）を左脳黒質部に直接投与した。フィブリル投与後9週目に、アポモルフィンを用いた運動機能評価を行った。
　フィブリル投与後9週目に、アポモルフィン（0.5 mg/kg）をマウス腹腔内に投与し、直径20cmのホーロー製のボウルに入れ、5分間順化させた。5分後から360度の回転運動を20分間記録した。結果は、フィブリル投与側と反対方向に回転した回転数を示した。統計解析は、各群間でTukey-Kramer post hoc test を用いて行い、p<0.05の場合に統計学的有意差ありと判定した。
（３）結果
　結果を図13に示した。コントロール群において投与5分後から顕著な回転運動が認められ、20分間持続したが、G-ヘスペリジン群においては、統計学的に有意な回転数の減少が認められた（コントロール群3.5±1.0、G-ヘスペリジン群0.83±0.27、p<0.05)。従って、G-ヘスペリジンは経口摂取によってα－シヌクレインの黒質投与により生じる運動機能障害を抑制することが示された。
　パーキンソン病モデルマウス（α－シヌクレイン伝播モデル）を用いた実施例１２および１３の結果より、糖転移ヘスペリジンを継続的に経口摂取することで、脳内に生じるα－シヌクレイン（リン酸化α－シヌクレイン）特異的な凝集および伝播を抑制し、α－シヌクレイノパチーに特徴的な身体症状である運動機能障害を抑制しうることが分かった。このことは、糖転移ヘスペリジンを含んでなる組成物が、α－シヌクレイノパチーの予防および／または改善に有効であるばかりでなく、進行防止にも有効であることを示している。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (20)

  1. 　糖転移ヘスペリジンを有効成分として含有するα－シヌクレイン凝集体の伝播抑制用組成物。
  2. 　さらにフラボノイド、フラボノイド配糖体、糖転移フラボノイド配糖体および糖類から選択される少なくとも一種を含有する請求項１に記載の組成物。
  3. 　前記フラボノイドがヘスペレチン、バイカレインまたはケルセチンであり、前記フラボノイド配糖体がヘスペリジン、バイカリンまたはルチンであり、前記糖転移フラボノイド配糖体が糖転移バイカリンまたは糖転移ルチンであり、前記糖類がトレハロース、イソマルトデキストリンまたはイソサイクロマルトペンタオースである請求項２に記載の組成物。
  4. 　さらにNK-4、NK-196、NK-359、NK-617、NK-736およびNK-3422から選択される少なくとも一種のシアニン色素を含有する請求項１～３のいずれかに記載の組成物。
  5. 　トレハロースを含有する組成物を組み合わせて使用する請求項１～４のいずれかに記載の組成物。
  6. 　糖転移ヘスペリジンを有効成分として含有するα－シヌクレイノパチーの進行防止用組成物。
  7. 　さらにフラボノイド、フラボノイド配糖体、糖転移フラボノイド配糖体および糖類から選択される少なくとも一種を含有する請求項６に記載の組成物。
  8. 　前記フラボノイドがヘスペレチン、バイカレインまたはケルセチンであり、前記フラボノイド配糖体がヘスペリジン、バイカリンまたはルチンであり、前記糖転移フラボノイド配糖体が糖転移バイカリンまたは糖転移ルチンであり、前記糖類がトレハロース、イソマルトデキストリンまたはイソサイクロマルトペンタオースである請求項７に記載の組成物。
  9. 　さらにNK-4、NK-196、NK-359、NK-617、NK-736およびNK-3422から選択される少なくとも一種のシアニン色素を含有する請求項６～８のいずれかに記載の組成物。
  10. 　トレハロースを含有する組成物を組み合わせて使用する請求項６～９のいずれかに記載の組成物。
  11. 　糖転移ヘスペリジンを有効成分として含有するα－シヌクレイン凝集抑制用組成物。
  12. 　さらにフラボノイド、フラボノイド配糖体、糖転移フラボノイド配糖体および糖類から選択される少なくとも一種を含有する請求項１１に記載の組成物。
  13. 　前記フラボノイドがヘスペレチン、バイカレインまたはケルセチンであり、前記フラボノイド配糖体がヘスペリジン、バイカリンまたはルチンであり、前記糖転移フラボノイド配糖体が糖転移バイカリンまたは糖転移ルチンであり、前記糖類がトレハロース、イソマルトデキストリンまたはイソサイクロマルトペンタオースである請求項１２に記載の組成物。
  14. 　さらにNK-4、NK-196、NK-359、NK-617、NK-736およびNK-3422から選択される少なくとも一種のシアニン色素を含有する請求項１１～１３のいずれかに記載の組成物。
  15. 　トレハロースを含有する組成物を組み合わせて使用する請求項１１～１４のいずれかに記載の組成物。
  16. 　糖転移ヘスペリジンを有効成分として含有するα－シヌクレイノパチーの予防および／または改善用組成物。
  17. 　さらにフラボノイド、フラボノイド配糖体、糖転移フラボノイド配糖体および糖類から選択される少なくとも一種を含有する請求項１６に記載の組成物。
  18. 　前記フラボノイドがヘスペレチン、バイカレインまたはケルセチンであり、前記フラボノイド配糖体がヘスペリジン、バイカリンまたはルチンであり、前記糖転移フラボノイド配糖体が糖転移バイカリンまたは糖転移ルチンであり、前記糖類がトレハロース、イソマルトデキストリンまたはイソサイクロマルトペンタオースである請求項１７に記載の組成物。
  19. 　さらにNK-4、NK-196、NK-359、NK-617、NK-736およびNK-3422から選択される少なくとも一種のシアニン色素を含有する請求項１６～１８のいずれかに記載の組成物。
  20. 　トレハロースを含有する組成物を組み合わせて使用する請求項１６～１９のいずれかに記載の組成物。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11255655A (ja) * 1997-12-09 1999-09-21 Hayashibara Biochem Lab Inc 神経機能調節剤
WO2006035725A1 (ja) * 2004-09-27 2006-04-06 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo イソサイクロマルトオリゴ糖及びイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素とそれらの製造方法並びに用途
WO2010087313A1 (ja) * 2009-01-29 2010-08-05 株式会社林原生物化学研究所 神経突起伸展促進剤
WO2016136624A1 (ja) * 2015-02-25 2016-09-01 株式会社林原 免疫調節剤及びその用途
WO2018155150A1 (ja) * 2017-02-21 2018-08-30 サッポロホールディングス株式会社 血中尿酸値改善剤及び血中尿酸値改善用飲食品

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11255655A (ja) * 1997-12-09 1999-09-21 Hayashibara Biochem Lab Inc 神経機能調節剤
WO2006035725A1 (ja) * 2004-09-27 2006-04-06 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo イソサイクロマルトオリゴ糖及びイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素とそれらの製造方法並びに用途
WO2010087313A1 (ja) * 2009-01-29 2010-08-05 株式会社林原生物化学研究所 神経突起伸展促進剤
WO2016136624A1 (ja) * 2015-02-25 2016-09-01 株式会社林原 免疫調節剤及びその用途
WO2018155150A1 (ja) * 2017-02-21 2018-08-30 サッポロホールディングス株式会社 血中尿酸値改善剤及び血中尿酸値改善用飲食品

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTUNES, M. S. ET AL.: "Protective effect of hesperidin in a model of Parkinson's disease induced by 6-hydroxydopamine in aged mice", NUTRITION, vol. 30, 2014, pages 1415 - 1422, XP029049970, ISSN: 0899-9007, DOI: 10.1016/j.nut.2014.03.024 *
LAN, D. M. ET AL.: "Effect of Trehalose on PC12 Cells Overexpressing Wild-Type or A53T Mutant alpha- synuclein", NEUROCHEMICAL RESEARCH, vol. 37, 2012, pages 2025 - 2032, XP035092946, DOI: 10.1007/s11064-012-0823-0 *
MENG XIAOYUN, MUNISHKINA LARISSA A., FINK ANTHONY L., UVERSKY VLADIMIR N.: "Molecular Mechanisms Underlying the Flavonoid-Induced Inhibition of a-Synuclein Fibrillation", BIOCHEMISTRY, vol. 48, 2009, pages 8206 - 8224, XP055760246, ISSN: 1520-4995 *
YAMADA, M. ET AL.: "Bioavailability of Glucosyl Hesperidin in Rats", BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY , AND BIOCHEMISTRY, vol. 70, no. 6, 2006, pages 1386 - 1394, XP009136975, ISSN: 1347-6947 *
ZHU, M. ET AL.: "The Flavonoid Baicalein Inhibits Fibrillation of a-Synuclein and Disaggregates Existing Fibrils", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 279, no. 26, 2004, pages 26846 - 26857, XP003016009, ISSN: 1083-351X, DOI: 10.1074/jbc.M403129200 *

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