KR101613005B1

KR101613005B1 - 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101613005B1
Application number: KR1020140036032A
Authority: KR
Inventors: 김원; 박성광; 강경표; 정유진
Original assignee: 전북대학교산학협력단; 전북대학교병원
Priority date: 2014-03-27
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2016-04-18
Also published as: KR20150113272A

Abstract

본 발명은 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명에 따른 SIRT2억제제는 시스플라틴과 함께 투여하였을 때 세포사멸 및 염증관련인자의 발현을 억제시킴으로써 시스플라틴의 부작용인 신장 독성은 감소시키면서 항암 효능은 증진시키는 효과가 있으므로, 암 질환의 예방 및 치료를 위한 의약품 및 암 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품으로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of the nephrotoxicity induced by anticancer agent}

본 발명은 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명에 따른 SIRT2유전자 억제제는 시스플라틴과 함께 투여하였을 때 시스플라틴의 부작용인 신장 독성은 감소시키면서 항암 효능은 증진시키는 효과가 있으므로, 암 질환의 예방 및 치료를 위한 의약품 및 암 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품을 제공하는 것이다.

암(cancer)은 전 세계적으로 연간 약 700만 명의 사망 원인이 되는 질병이며, 특히 우리나라에서는 지난 통계청의 『2000년 사망원인 통계연보』(2000년 사망 자료 분석 결과)에 의하면, 암으로 인한 사망은 23.5%로 전체 사망원인 중 1위를 차지하고 있어 국가차원의 암관리 대책이 요구되고 있다. 현재 암을 치료하는 방법으로 수술, 방사선 치료, 유전자 치료 등 여러 방법이 사용되고 있으나, 가장 많이 사용되고 있는 치료방법 중의 하나가 항암제를 투여하는 화학요법(chemotherapy)이다.

항암 화학요법은 전신 치료로, 대부분 주사나 경구로 항암제를 투여하면 혈류를 따라 전신에 퍼진다. 그러므로 국소적인 효과보다는 전신에 퍼져있는 미세전이(micometastasis)에 작용하는 치료이다. 따라서 전신적인 부작용이 많으며 수술이나 방사선치료에 비해서 그 정도가 매우 심한 편이다. 정상세포와 암세포 간의 약물에 대한 감수성 차를 이용하여 항암제가 암세포에 대해 선택적으로 작용하도록 하는 것이 화학요법이나 대부분의 항암제가 정상세포와 암세포를 구별하지 못하여 용량 제한적 특성(dose-limiting toxicity)을 나타내는데 그 문제점이 있다.

상술한 문제점으로 인해, 표적항암제에 대한 연구가 활발하다. 상기 표적항암제에 대한 종래 기술로 공개특허 10-2013-0058631(공개일자: 2013년06월04일)에는 인테그린 β3 중화항체, 인테그린 β3 siRNA, Src 억제제 및 Src siRNA로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 표적 항암제 내성 억제용 약학적 조성물, 항암 보조제 등에 관해 기재하고 있다.

그러나, 표적항암제는 암세포를 죽이지는 못하는 문제점이 있으며, 대신 암세포가 자라는데 필요한 요소를 저해하여 암세포의 증식과 성장을 방해하는 약물이 통상적이다.

한편, 대표적인 항암제인 시스플라틴(cis-diammine-dichloroplatinum [II])은 난소암, 방광암, 폐암, 두경부암, 고환암 등의 치료를 위한 화학요법제로 임상에서 널리 사용되고 있다(Rosenberg B., Cancer, 55: pp2303-2315, 1985). 시스플라틴은 활성산소종을 생성하여 암세포를 공격하고, 암세포에서 DNA의 인터-인트라스트랜드 교차결합(inter-intrastrand cross-linking), DNA 부가체 형성을 유도하여 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 치료과정 중 약물의 제한된 함량 이상에서는 청각의 상실, 신경 독성, 신장 독성과 같은 부작용이 나타나며(Mollman et al., 1998; Screnci and McKeage, 1999), 고농도의 시스플라틴의 투여 시에는 간 독성 및 신장 독성 또한 빈번하게 관찰되는 것으로 알려져 있다(Cerosimo R. J., Ann. Pharm., 27: pp438-441, 1993; Cavalli F.et al., Cancer Treat. Rep., 62: pp2125-2126, 1978; Pollera C. F. et al., J. Clin. Oncol., 5: pp318-319, 1987). 시스플라틴에 의한 이러한 부작용은 시스플라틴에 의해 생성된 활성산소종으로 인한 지질 과산화의 증가(Matsushima H. et al., J. Lab. Clin. Med., 131: pp518-526, 1998; Koc A. et al., Mol. Cell Biochem., 278(1-2): pp79-84, 2005), 조직에 존재하는 항산화 효소 활성의 억제(Sadzuka Y. et al., Biochem. Pharmacol., 43: pp1873-1875, 1992), 글루타시온(glutathione)의 고갈(Zhang J. G. and Lindup W. E., Biochem. Pharmcol., 45: pp2215-2222, 1993) 및 세포내 칼슘 항상성의 붕괴(Zhang J.G. and Lindup W.E., Toxicology in Vitro, 10: pp205209, 1996)와 밀접한 관련이 있다.

최근 시스플라틴과 글루타시온 에스테르(glutathione ester)를 같이 투여하였을 때 시스플라틴으로 인한 신장 독성이 효과적으로 억제된다는 것을 관찰하였으며(Babu E. et al., Mol. Cell Biochem., 144: pp7-11, 1995) 식이를 통해 항산화물질을 섭취함으로써 시스플라틴으로 인한 독성을 억제하는데 많은 관심이 집중되고 있다(Appenroth D. et al., Arch. Toxicol., 71: pp677-683, 1997; Bogin E. et al., Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 32: pp843-851, 1994; Rao M. et al., J. Biochem., 125: pp383-390, 1999).

한편, SIRT2(Sirtuin 2)는 써투인(sirtuin) 단백질 패밀리 중 하나이며, 어떤 조건 하에서 중요한 세포 생존 기능을 수행한다. 그렇지만, 염증 및 산화 스트레스와 관련한 SIRT2 단백질의 생물학적 기능은 명확하지 않다.

써투인(sirtuin)으로 알려진 SIRT2 (silent information regulator 2)는 수명, 노화, 암발생, 신경퇴화 및 물질대사 질환과 같은 생물학적 과정에서 NAD+-의존적 디아세틸레이즈 조절자이다 [Michan, S.; Sinclair, D. Biochem. J. 404: 1-13; 2007, Finkel, T. et al. Nature 460: 587-591; 2009, Donmez, Z.; Guarente, L. Aging Cell 9: 285-290; 20101-3]. SIRT2 유전자 패밀리는 세균에서 진핵생물까지 잘 보존되어 있다. 인간에서는 일곱 개 타입의 SIRT가 밝혀졌다 [Frye, R. A. Biochem. Biophys. Res. Comm. 272: 793-798; 2000]. 인간의 일곱 가지 SIRT 중 대부분의 연구는 SIRT1에 촛점을 맞추었다. SIRT1의 과다발현은 DNA 손상 및 산화 스트레스하에서 세포의 생존율을 증가시킨다 [Oberdoerffer, P. et al. Cell 135: 907-918; 2008.]. 또, SIRT1의 신경보호 역할은 알츠하이머 병과 근위축성 측색경화증 (amyotrophic lateral sclerosis)에서 잘 정립되어 있다[Chen, J. et al. J. Biol. Chem. 280: 40364-40374; 2005, Kim, D. et al. EMBO J. 26: 3169-3179; 2007]. 그렇지만, 염증 및 산화 스트레스에서 SIRT2의 생물학적 기능과 메카니즘은 잘 알려지지 않았다.

한편, 시스플라틴을 비롯한 많은 화학요법제들이 활성 산소종을 생성하여 암세포를 공격하는 것으로 알려져 있고, 생성된 활성 산소종들은 정상세포에도 작용하여 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다. 따라서 항산화효과를 가지는 물질들은 화학요법제에 의해 유발된 독성을 감소시킬 가능성이 크다. 또한 활성산소종이나 라디칼을 생성하는 외부 유해물질에 의한 간 독성 및 신장 독성도 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 생각되지만, 이에 대한 연구가 부족하다는 문제점이 있었다.

나아가, 상기한 바와 같이, 염증 및 산화 스트레스에서 SIRT2의 생물학적 기능과 메카니즘에 대한 연구가 부족한 문제점이 있으며, 대표적인 항암제인 시스플라틴에 의해 유발되는 신장 독성 질환과 SIRT2의 세포내 상호작용 및 신호전달과 조절기작에 연관된 분자적 기전에 대한 연구가 매우 부족하여 항암제에 의해 유발되는 신장 독성질환의 예방 및 치료를 할 수 있는 방법이 매우 부족하다는 문제점이 있었다.

본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫 번째 해결하려는 과제는 항암제 투여 시 항암 효능을 증진시키면서 항암제에 의한 신장 독성을 억제하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 해결하려는 과제는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성에 대한 억제 활성을 갖는 항암보조제를 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 해결하려는 과제는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 첫번째 과제를 달성하기 위하여, SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 항암제는 시스플라틴(cisplatin)일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 SIRT2억제제는 상기 SIRT2유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 앱타머 또는 항체일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 SIRT2억제제는 AGK2 또는 AK-1일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 세포사멸(apoptosis) 및 염증반응과 관련된 분자 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 억제함으로써 신장 손상을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 두번째 과제를 달성하기 위하여, 항암제에 의해 유발되는 신장 독성에 대한 억제 활성을 갖는 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다.

본 발명은 상기 세번째 과제를 달성하기 위하여, SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명은 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 SIRT2억제제는 세포사멸(apoptosis)을 억제하고, 염증반응 관련 인자인 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 조절함으로써, 항암제인 시스플라틴에 의한 신장손상을 억제하고 신장독성을 감소시키면서 항암 효능을 증진시키는 우수한 효과가 있고, 항암제와 병용하였을 경우 항암제의 항암효능을 증진시킴을 확인함으로써, 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물 또는 건강기능식품으로서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 SIRT2유전자-결여된 마우스에서의 시스플라틴에 의한 신장의 기능을 확인하기 위하여 BUN을 측정한 그래프이다.
도 2는 SIRT2유전자-결여된 마우스에서의 시스플라틴에 의한 신장의 기능을 확인하기 위하여 크레아티닌(creatinine)을 측정한 그래프이다
도 3은 시스플라틴 투여로 인한 신장의 조직학적인 손상을 PAS 염색을 통해 확인한 사진이다.
도 4는 시스플라틴 투여로 인한 생존율을 확인한 그래프이다.
도 5는 SIRT2유전자 발현에 의한 세포사멸(apoptosis) 조절 효과를 caspase-3 발현 양상을 통해 확인한 웨스턴블랏의 결과이다. 도 5에 나타낸 WT은 SIRT2가 존재하는 대조군을 의미하고 KO은 SIRT2가 결여된 대조군을 의미한다. 첫 번째 레인은 SIRT2가 존재하는 마우스에 vehicle을 두 번째 레인은 SIRT2가 결여된 마우스에 vehicle을 처리하였고 세 번째에서 여섯 번째 레인은 SIRT2가 존재하는 마우스에 cisplatin을 일곱 번째에서 열 번째 레인은 SIRT2가 결여된 마우스에 cisplatin을 처리하였다. vehicle만 처리한 대조군에서는 발현하지 않았던 caspase-3의 active한 form이 SIRT2가 존재하는 마우스에 cisplatin을 처리하였을 때 증가 발현하였고, SIRT2가 결여된 마우스에서는 의의있게 감소됨을 확인하였다.
도 6은 SIRT2유전자 발현에 의한 세포사멸(apoptosis) 조절 효과를 p53 발현 양상을 통해 확인한 웨스턴블랏의 결과이다. SIRT2가 존재하는 마우스에 cisplatin을 처리하였을 때 증가한 p53의 acetylation이 SIRT2가 결여된 마우스에서는 감소함을 확인하였다.
도 7은 SIRT2유전자 발현에 의한 염증분자 조절 효과를 ICAM-1 및 VCAM-1 발현 양상을 통해 확인한 웨스턴블랏의 결과이다. 첫 번째와 두 번째 레인은 SIRT2 유무에 관계없이 vehicle을 처리하였을 때 ICAM-1과 VCAM-1이 발현하지 않았다. 세 번째에서 다섯 번째 레인은 SIRT2가 존재하는 마우스에 cisplatin을 처리하였을 때 ICAM-1과 VCAM-1이 증가발현 하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 SIRT2가 결여된 마우스 대조군인 여섯 번째에서 여덟 번째 레인은 cisplatin을 처리하였을 때 ICAM-1과 VCAM-1이 SIRT2가 존재하는 마우스 대조군에 비해 감소발현 하는 것을 확인 할 수 있었다.
도 8은 SIRT2억제제가 시스플라틴에 의한 세포 손상 억제 효과를 확인한 세포 사진이다.
도 9는 상기 도 8의 결과를 정량화한 그래프이다.
도 10은 세포 증식 검사를 통해 SIRT2억제제의 세포 증식 효과를 XTT를 수행하여 확인한 결과 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이 염증 및 산화 스트레스에서 SIRT2의 생물학적 기능과 메카니즘에 대한 연구가 부족한 문제점이 있으며, 대표적인 항암제인 시스플라틴에 의해 유발되는 신장 독성 질환과 SIRT2의 세포내 상호작용 및 신호전달과 조절기작에 연관된 분자적 기전에 대한 연구가 매우 부족하여 항암제에 의해 유발되는 신장 독성질환의 예방 및 치료를 할 수 있는 방법이 매우 부족하다는 문제점이 있었다.

이에 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다.

이를 통해 종래의 항암제인 시스플라틴에 의한 신장손상을 억제하고 신장독성을 감소시키면서 항암 효능을 증진시키는 우수한 효과가 있고, 항암제와 병용하였을 경우 항암제의 항암효능을 증진시킴을 확인함으로써, 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물로써 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명은 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 "SIRT2"는 써투인(sirtuin) 단백질 패밀리 중 하나이며, 어떤 조건 하에서 중요한 세포 생존 기능을 수행한다. 그렇지만, 염증 및 산화 스트레스와 관련한 SIRT2 단백질의 생물학적 기능은 명확하지 않다.

또한, 본 발명의 상기 항암제는 시스플라틴일 수 있다.

대표적인 항암제인 시스플라틴(cis-diammine-dichloroplatinum [II])은 난소암, 방광암, 폐암, 두경부암, 고환암 등의 치료를 위한 화학요법제로 임상에서 널리 사용되고 있다(Rosenberg B., Cancer, 55: pp2303-2315, 1985). 시스플라틴은 활성산소종을 생성하여 암세포를 공격하고, 암세포에서 DNA의 인터-인트라스트랜드 교차결합(inter-intrastrand cross-linking), DNA 부가체 형성을 유도하여 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 치료과정 중 약물의 제한된 함량 이상에서는 청각의 상실, 신경 독성, 신장 독성과 같은 부작용이 나타나며(Mollman et al., 1998; Screnci and McKeage, 1999), 고농도의 시스플라틴의 투여 시에는 간 독성 및 신장 독성 또한 빈번하게 관찰되는 것으로 알려져 있다.

따라서 본 발명은 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환과 SIRT2의 세포내 상호작용 및 신호전달과 조절기작에 연관된 분자적 기전을 규명함으로써 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

구체적으로, 실시예 2에서 알 수 있듯이, SIRT2유전자 발현이 시스플라틴에 의한 신장독성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 SIRT2유전자-결여된 마우스에 시스플라틴을 투여하여 신장 기능 및 손상도를 확인한 결과, 마우스에 시스플라틴을 투여하면 신장 손상을 초래하여 신손상도 측정 기준인 BUN 및 크레아티닌이 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, SIRT2유전자-결여된 마우스에서는 시스플라틴에 의해 증가한 BUN 및 크레아티닌이 현저히 감소됨을 확인하였다(도 1 및 도 2 참조). 또한, 시스플라틴 투여로 인한 신장의 조직학적인 손상을 확인하기 위하여 PAS염색을 수행한 결과, 도 3에서 알 수 있듯이, SIRT2유전자 WT(SIRT2 +/+) 마우스에 시스플라틴을 투여한 대조군의 신장에서는 상피세포의 박리, 브러쉬보더의 손실, tubular cast 형성 등의 조직 손상이 관찰 되지만, SIRT2유전자-결여된(SIRT2 -/-) 마우스에서는 이러한 신장 손상이 현저히 감소됨을 확인하였다. 뿐만 아니라, 생존율 역시 증가함을 알 수 있었다(도 4 참조).

이를 통해 SIRT2유전자가 결여되었을 때 시스플라틴에 의한 신장 손상을 억제함을 확인할 수 있었다.

본 발명에서 상기 치료란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화하거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본 발명에서 사용된 상기 치료라는 용어는 치료하는 이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.

따라서 본 발명에 따른 SIRT2억제제는 p53 acetylation 경로 조절을 통한 세포사멸(apoptosis)을 억제하고, 시스플라틴에 의해 증가한 염증반응 관련 인자인 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현 감소시킴으로써, 항암제인 시스플라틴에 의한 신장손상을 억제하고 신장독성을 감소시키면서 항암 효능을 증진시키는 우수한 효과가 있고, 항암제와 병용하였을 경우 항암제의 항암효능을 증진시킴을 확인함으로써, 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

구체적으로, 실시예 3에서 알 수 있듯이, 일반적으로 시스플라틴에 의한 신장의 손상은 세포사멸의 영향을 받기 때문에, SIRT2유전자가 결여되었을 때, 시스플라틴에 의한 세포사멸 조절에 미치는 영향을 확인 하고자 caspase-3 및 p53의 acetylation을 웨스턴 블랏을 수행하여 확인 하였다. 그 결과, WT 마우스에 시스플라틴을 투여한 그룹에서 증가한 cleaved caspase-3가 SIRT2유전자-결여된 마우스에서는 현저히 감소함을 확인 할 수 있었고, acetyl p53의 발현 또한 감소함을 확인할 수 있었다(도 5 및 도 6 참조).

이를 통해 SIRT2유전자-결여된 마우스 신장 조직에서 세포사멸을 감소시킴을 의미하며, 이는 p53 acetylation 경로를 통해 조절됨을 확인 하였다.

나아가, 실시예 4에서 알 수 있듯이, 시스플라틴에 의한 염증반응과 관련된 분자인 ICAM-1 및 VCAM-1유전자의 발현이 SIRT2유전자에 의해 조절되는지 확인한 결과, WT 마우스에 시스플라틴을 투여하였을 때 증가한 ICAM-1 및 VCAM-1유전자의 발현이 SIRT2유전자-결여된 마우스에 시스플라틴을 투여하였을 때 감소함을 확인하였다(도 7 참조).

본 발명에 따른 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양의 SIRT2억제제를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

상기에서 약학적으로 유효한 양이란 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 SIRT2억제제의 약학적으로 유효한 양은 0.5 내지 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 내지 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 신장 독성 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 SIRT2억제제는 상기 SIRT2에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, siRNA, shRNA, 앱타머, 항체, 단일사슬 가변영역 단편, 저분자량의 화합물 또는 천연추출물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 AGK2 또는 AK-1일 수 있다.

상기 AK-1은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.

상기 AGK2는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물일 수 있다.

또한, 상기 AK-1 및/또는 AGK2는 benzylsulfonamide의 세포 투과를 통해 SIRT2 nicotinamide binding site를 타겟하여 SIRT2 activity를 억제할 수 있다.

본 발명의 SIRT2억제제는 항암제인 시스플라틴에 의한 세포 손상 억제 효과 및 세포증식 효과를 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 실시예 5에 나타난 바와 같이, SIRT2억제제가 시스플라틴에 의한 세포 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 마우스 근위세뇨관세포에 시스플라틴을 처리 하였을 때 SIRT2억제제인 AGK2 및 AK-1의 효과를 확인한 결과, 시스플라틴을 투여한 세포에서는 부착된 세포들이 감소하였음을 확인할 수 있으나, SIRT2억제제를 사용한 대조군에서는 부착된 세포들이 유의성 있게 증가해 있음을 확인할 수 있었다(도 8 및 도 9 참조).

게다가, 세포 증식 검사를 통해 SIRT2억제제의 세포 증식 효과를 확인한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, XTT검사를 수행한 결과, 시스플라틴을 처리 하였을 때 감소한 세포 증식이 SIRT2억제제인 AGK2 및 AK-1을 함께 처리하였을 때, 유의성 있게 증가함을 확인하였다.

이를 통해 SIRT2유전자가 결여되었을 때 시스플라틴에 의한 신장 손상을 억제하여 신장 보호 효과가 있음을 확인할 수 있었고, 이를 통해 SIRT2유전자 발현의 조절이 급성 신장 손상 치료에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 상기 유전자의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합 할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, 상기 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.

더불어, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제 5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 "RNAi"는 RNA Interference를 지칭하는 말로, 우리말로 풀이하면 RNA 간섭이라는 뜻을 지니고 있다. RNA 간섭은 대부분의 생물체 사이에서 잘 보존되어 있는 특이적 유전자억제 현상이다. 바이러스 감염에 대한 방어나 트랜스포손을 억제하기 위하여 혹은 비정상적 mRNA를 제거하기 위하여 세포가 사용하는 유전자 감시기작의 일종으로 생각되고 있다. 특히, small RNA에 의한 유전자 억제현상을 넓은 의미에서 RNA간섭이라 하고, 좁은 의미의 RNA 간섭은 siRNA에 의한 mRNA 분해 현상을 뜻한다. 또한 RNA간섭은 siRNA를 이용한 유전자 억제 실험 기술을 뜻하기도 한다.

본 발명에서 "siRNA"라는 용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(상기 마커 유전자의 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(상기 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 상기 마커 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자 내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

본 발명의 siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.

본 발명에서의 "앱타머(aptamer)"라는 용어는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 올리고뉴클레오타이드 분자를 말한다. 앱타머는, 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.

본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 본 발명의 앱타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상 15 내지 200 뉴클레오타이드일 수 있지만, 예컨대 15 ~ 100 뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 18 ~ 80 뉴클레오타이드이며, 보다 바람직하게는 20 ~ 60 뉴클레오타이드이고, 가장 바람직하게는 22 ~ 45 뉴클레오타이드일 수 있다. 총 뉴클레오타이드 개수가 적으면 화학합성, 화학수식 및 대량 생산이 보다 용이하고, 경제적이며, 생체내 안정성은 높으면서 독성은 낮아 유리하다.

또한 본 발명의 SIRT2억제제로는 SIRT2 단백질 활성 억제제를 포함하며, 이러한 단백질 활성 억제제로서 바람직하게는 SIRT2에 특이적으로 결합하는 항체, 단일사슬 가변영역 단편, 펩타이드, 저분자량의 화합물 또는 천연추출물을 예시할 수 있다.

본 발명에서 이용될 수 있는 SIRT2 단백질에 특이적으로 결합하여 활성을 억제하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이다. SIRT2 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler et al., European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al.,J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 문헌[Harlow, E. et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991]에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 예를 들어, 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 SIRT2 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명에서 항체는 단일사슬 가변영역 단편(scFv)을 포함할 수 있다. 상기 단일사슬 가변영역 단편은 "경사슬의 가변성 부위(VL)-링커-중사슬의 가변성 부위(VH)"로 구성될 수 있다. 상기 링커는 중사슬 및 경사슬의 가변성 부위를 인위적으로 연결하는 작용을 하는 일정 길이의 아미노산 서열을 의미한다.

본 발명의 바람직한 다른 구현예에 따르면, 항암제에 의해 유발되는 신장 독성에 대한 억제 활성을 갖는 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다.

본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다.

본 발명은 SIRT2억제제 및 식품학적으로 허용 가능한 식품첨가제를 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 SIRT2억제제를 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

본 발명에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

나아가, 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.

예를 들어, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 그대로 또는 부형제, 결합제, 붕해제 또는 다른 첨가제를 넣어 고르게 섞은 것을 적당한 방법으로 과립상으로 한 다음 활택제 등을 넣어 압축 성형하여 조제하거나 정제 형태의 건강기능식품을 그대로 또는 부형제, 결합제, 붕해제 또는 다른 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 것을 직접 압축 성형하여 만들거나 또는 미리 만든 과립에 건강기능식품을 그대로 혹은 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 다음 압축 성형하여 조제하거나 건강기능식품에 부형제, 결합제 또는 다른 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 분말을 용매로 습윤시키고, 습윤된 분말을 저압으로 틀에 넣어서 성형한 후, 적당한 방법으로 건조하여 조제한다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품에 필요에 따라 교미제 등을 넣을 수 있으며, 적당한 제피제로 제피가능하다.

상기 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 보통 캅셀에 건강기능식품 또는 건강기능식품에 적당한 부형제 등을 고르게 섞은 것 또는 적당한 방법으로 입상으로 한 것 또는 입상으로 한 것에 적당한 제피제로 제피한 것을 그대로 또는 가볍게 성형하여 충전하여 조제하며, 연질 캅셀제는 보통 캅셀에 건강기능식품 또는 건강기능식품에 적당한 부형제 등을 넣은 것을 젤라틴 등 적당한 캅셀기제에 글리세린 또는 소르비톨 등을 넣어 소성을 높인 캅셀기제로 피포하여 일정한 형상으로 성형하여 조제하며, 필요에 따라 상기 캅셀기제에 착색료 보존료 등을 첨가할 수 있다.

환형태의 건강기능식품은 보통 건강기능식품에 부형제, 결합제, 붕해제 등을 고르게 섞은 다음 적당한 방법으로 구상으로 성형하여 조제하며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.

과립형태의 건강기능식품은 보통 건강기능식품을 그대로 또는 건강기능식품에 부형제, 결합제, 붕해제 등을 넣어 고르게 섞은 다음 적당한 방법으로 입상으로 만들고 될 수 있는 대로 입자를 고르게 한 것이며, 필요에 따라 착향료, 교미제 등을 넣을 수 있다. 과립형태의 건강기능식품은 12호 (1680 ㎛), 14호 (1410 ㎛) 및 45호 (350㎛) 체를 써서 다음 입도시험을 할 때에 12호체를 전량 통과하고 14호체에 남는 것은 전체량의 5.0 %이하 이고 또 45호체를 통과하는 것은 전체량의 15.0 %이하이어야 한다.

본 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향료 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다 (대한약전 해설편, 문성사, 한국 약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 SIRT2억제제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 SIRT2억제제는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

결국, 본 발명에 따른 SIRT2억제제는 시스플라틴과 병용 투여하였을 때 시스플라틴의 부작용인 신장 독성은 감소시키면서 항암 효능은 증진시키는 효과가 있으므로 암 질환의 예방 및 치료를 위한 의약품 및 암 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품으로 이용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 실험동물의 준비

본 발명에 사용된 실험동물은 8 내지 10 주령의 수컷 SIRT2 단백이 결여된 마우스인 SIRT2-/- mice(Jackson laboratory, 미국)와 SIRT2 단백이 존재하는 마우스인 SIRT2 +/+ mice(C57BL/6, 오리엔트, 한국)로, 상기 실험동물에 대해 표준 실험실 사료와 물을 임의대로 제공하였고, 전북대학교 동물실험윤리위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 유지하였다.

1-1. 실험동물 준비

상기 실험동물은 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 4개 군으로 나누어 실험을 수행하였다.

그룹	SIRT2 유전자	시스플라틴(20 ㎍/㎏)	Vehicle
1	+/+	-	+
2	+/+	+	-
3	-/-	-	+
4	-/-	+	-

상기 표 1과 같이, 1)정상 실험동물군(WT)에 Vehicle를 투여한 대조군, 2)정상 실험동물 (WT)에 시스플라틴(20 ㎍/㎏)를 투여한 대조군, 3)SIRT2 단백이 결여된 마우스(KO)에 vehicle를 투여한 대조군 및 4)SIRT2 단백이 결여된 마우스(KO)에 시스플라틴 (20 ㎍/㎏)을 투여한 대조군으로 구분하였다. 상기 control buffer와 시스틀라틴은 멸균한 생리식염수(0.9% NaCl 100 ㎕)에 희석하여 복강 내 주사하였다.

1-2. 샘플의 준비

상기 vehicle 또는 시스플라틴을 투여한 실험동물군은 투여 3일 후, 케타민(ketamine, 100 mg/kg)과 자일라진(xylazine, 10 mg/kg)으로 마취하여 혈액 및 신장 조직을 수집하였다.

보다 구체적으로, 상기 혈액 채취는 실험동물을 케타민(ketamine) 100㎎/㎏과 자이라진(xylazine) 10㎎/㎏으로 마취시킨 후, 심장 천자(cardiac puncture)에 의해 혈액을 채취하였다. 상기 신장 조직은 채취 후 4등분 하여 2등분은 4% 파라포름알데하이드에 넣어 고정시킨 후 Periodic acid-Schiff(PAS)를 확인하였다. 다른 2등분은 단백질을 추출하였다.

실시예 2: SIRT2 유전자-결여된 마우스에서의 시스플라틴에 의한 신장 손상 억제 효과

2-1. 신장 기능 확인

먼저, SIRT2유전자 발현이 시스플라틴에 의한 신장 독성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 SIRT2유전자-결여된 마우스에 시스플라틴을 투여하여 신장 기능 및 손상도를 확인하였다.

BUN과 크레아티닌(creatinine)은 상기 실시예 1-2에 나타난 바와 같이, 마우스에서 혈액을 채취하여 원심분리기를 이용해 혈청만을 분리 한 후, automatic analyzer(Hitachi 7180; Tokyo, 일본)을 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 마우스에 시스플라틴을 투여하면 신장 손상을 초래하여 BUN 및 크레아티닌이 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, SIRT2가 결여된 마우스에서는 시스플라틴에 의해 증가한 BUN 및 크레아티닌이 현저히 감소됨을 확인하였다.

2-2. 신장 손상도 확인

시스플라틴 투여로 인한 신장의 조직학적인 손상을 확인하기 위하여 PAS염색을 수행하였다.

상기 PAS염색을 통해 손상된 신장 조직을 Zeiss Z1 현미경을 이용하여 가시화하는 방법을 수행하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, SIRT2유전자 WT(SIRT2 +/+) 마우스에 시스플라틴을 투여한 대조군의 신장에서는 상피세포의 박리, 브러쉬보더의 손실, tubular cast 형성 등의 조직 손상이 관찰 되지만, SIRT2유전자-결여된(SIRT2 -/-) 마우스에서는 이러한 신장 손상이 현저히 감소됨을 확인하였다.

2-3. 생존율 확인

도 4에 나타난 바와 같이, 대조군에서는 시스플라틴을 투여하였을 때 6일 만에 모든 마우스가 사망하였으나, SIRT2유전자-결여된 마우스에 시스플라틴을 투여한 군에서는 8일째 사망하는 것을 확인함으로써 생존율 역시 증가함을 알 수 있었다.

실시예 3: SIRT2 유전자 발현에 의한 세포사멸( apoptosis ) 조절 효과

일반적으로 시스플라틴에 의한 신장의 손상은 세포사멸의 영향을 받는다. SIRT2유전자가 결여되었을 때, 시스플라틴에 의한 세포사멸 조절에 미치는 영향을 확인하고자 caspase-3 및 p53의 acetylation을 웨스턴 블랏을 수행하여 확인하였다.

상기 실시예 1-2의 방법으로 신장 조직을 얻은 후, 이를 균질화하여 단백질을 추출하고 caspase-3 및 acetyl p53 항체(Cell Signaling Technology, Denvers, MA. 미국)를 이용하여 caspase-3 및 acetylp53 단백질 발현 양상을 확인 하였다. 단백의 정량 확인을 위하여 같은 블랏을 박리하여 액틴(Actin)(Sigma Aldrich, St Louis, MO, 미국)과 p53(Cell Signaling Technology)을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, WT 마우스에 시스플라틴을 투여한 그룹에서 증가한 cleaved caspase-3가 SIRT2유전자-결여된 마우스에서는 현저히 감소함을 확인 할 수 있었고, acetyl p53의 발현 또한 감소함을 확인할 수 있었다.

이를 통해 SIRT2유전자의 결여는 마우스 신장 조직에서 세포사멸을 감소시킴을 의미하며, 이는 p53 acetylation 경로를 통해 조절됨을 확인하였다.

실시예 4: SIRT2 유전자 발현에 의한 염증분자 조절 효과

시스플라틴을 투여한 실험군에서 염증반응과 관련된 분자인 ICAM-1 및 VCAM-1유전자의 발현이 SIRT2유전자에 의해 조절되는지 확인하였다.

상기 실시예 3과 동일한 방법으로, ICAM-1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 미국) 및 VCAM-1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 미국) 항체를 이용하여 웨스턴블랏을 수행하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, WT 마우스에 시스플라틴을 투여하였을 때 증가한 ICAM-1 및 VCAM-1유전자의 발현이 SIRT2유전자-결여된 마우스에 시스플라틴을 투여하였을 때 감소함을 확인하였다.

실시예 5: SIRT2 억제제에 의한 세포손상에 미치는 영향

SIRT2억제제가 시스플라틴에 의한 세포 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 마우스 근위세뇨관세포에 시스플라틴을 처리하였을 때 SIRT2억제제인 AGK2 및 AK-1의 효과를 확인하였다.

구체적으로, 마우스 근위세뇨관세포에 시스플라틴을 처리 30분 전 SIRT2억제제인 AGK2(10μM) 및 AK-1(10μM)을 처리한 후, 시스플라틴(20 ㎍/㎖)을 48시간 처리하여 세포를 Zeiss Z1 현미경을 통해 가시화 하였다. 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.

도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, 시스플라틴을 투여한 세포에서는 부착된 세포들이 감소되어 있음을 확인할 수 있으나, SIRT2억제제를 사용한 대조군에서는 부착된 세포들이 유의성 있게 증가해 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 세포 증식 검사를 통해 SIRT2억제제의 세포 증식 효과를 확인하였다.

세포 증식 검사는 마우스 근위세뇨관 세포를 트립신 처리 후, 96웰 플레이트에 각각 1×103개의 세포를 넣고, 24시간 동안 37 ℃에서 배양 후에 배양액을 제거하고, 1% FBS가 있는 배양액과 함께 AGK2, AK-1, 시스플라틴, 시스플라틴과 함께 AGK2 및 AK-1을 각각 처리하였다. 처리 24시간동안 37 ℃에서 배양 후, 세포증식키트 II(Cell proliferation Kit II, XTT, Roche, Mannheim, Germany)을 이용하여 세포의 증식 정도를 측정하였다. 세포가 증식될수록 세포 내 미토콘드리아의 발색물질의 증가로 흡광도가 증가하므로, 마우스 근위세뇨관 세포의 증식은 흡광도를 통해 측정하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타난 바와 같이, XTT검사를 수행한 결과, 시스플라틴을 처리하였을 때 감소한 세포 증식이 SIRT2억제제인 AGK2 및 AK-1을 함께 처리하였을 때, 유의성 있게 증가함을 확인하였다.

결국, SIRT2유전자가 결여되었을 때 시스플라틴에 의한 신장 손상을 억제하여 신장 보호 효과가 있음을 확인할 수 있었고, 이를 통해 SIRT2유전자 발현의 조절이 급성 신장 손상 치료에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

통계학적 분석

데이터를 평균±표준편차로 나타내었다. 아노바(ANOVA)를 이용한 유의차로 다중 비교하고 터키 사후검정을 이용한 개별 비교를 하였으며, 통계적 유의성은 p<0.05로 수행하였다.

따라서, 본 발명에 따른 SIRT2억제제는 세포사멸(apoptosis)을 억제하고, 염증반응 관련 인자인 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 조절함으로써, 항암제인 시스플라틴에 의한 신장손상을 억제하고 신장독성을 감소시키면서 항암 효능을 증진시키는 우수한 효과가 있고, 항암제와 병용하였을 경우 항암제의 항암효능을 증진시킴을 확인함으로써, 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물 또는 건강기능식품으로서 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

SIRT2유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 앱타머 및 항체로 이루어진 군 중 1종 이상의 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 항암제는 시스플라틴(cisplatin)인 것을 특징으로 하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 SIRT2억제제는 하기 화학식 1로 표시되는 AGK2 화합물 또는 하기 화학식 2로 표시되는 AK-1 화합물인 것을 특징으로 하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]

[화학식 2]
제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 세포사멸(apoptosis) 및 염증반응과 관련된 분자인 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 억제함으로써 신장 손상을 억제하는 것을 특징으로 하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
항암제에 의해 유발되는 신장 독성에 대한 억제 활성을 갖는 SIRT2유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 앱타머 및 항체로 이루어진 군 중 1종 이상의 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암보조제.
SIRT2유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 앱타머 및 항체로 이루어진 군 중 1종 이상의 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.