KR101898207B1 - 알로인을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알로인을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알로인을 유효성분으로 포함하는 HMGB1에 의해 매개되는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 알로인은 패혈증의 주요 매개인자인 HMGB1(High mobility group box 1)의 분비를 억제하고 상기 HMGB1과 관련된 전염증성 시그날링(proinflammatory signaling)을 억제하는 효과를 지니며, 실제로 CLP-유도된 in vivo 패혈증 동물 모델에서 패혈증의 치료효과가 현저하다.

Description

알로인을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크 예방 또는 치료용 조성물{Composition for prevention or treatment of sepsis or septic shock comprising aloin}

본 발명은 알로인을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알로인을 유효성분으로 포함하는 HMGB1에 의해 매개되는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

HMGB1(High-mobility group box 1 protein)은 뉴클레오솜(nucleosome)의 구조 및 안정성 유지와 전사 인자들이 그들의 동족 DNA 서열에 결합하는 것을 가능하게 하는 것에 의하여 유전자 발현의 조절에 기여하는 핵 염색체 단백질로서 처음 규명되었다. 최근, 실험 및 임상 연구로부터의 많은 데이터들이, 패혈증과 같은 여러 염증성 질환의 발병에 대한 세포외 HMGB1(extracellular HMGB1)의 기여를 강조하였다(Andersson and Tracey, 2011; Diener et al., 2013). 패혈증 동안, HMGB1은 감염에 기인하는 세포죽음에 따라 급속히 수동적으로 분비될 수 있고, 전-염증성 사이토카인들 및 PAMP(pathogen-associated molecular patterns)들에 대한 반응으로 면역 세포에서 능동적으로 분비될 수 있다. PAMP 및 내생적으로 유래된 염증 매개자(예를들어 TNF-α, IL-1b, NF-κB 및 ERK1/2)에 노출되었을 때, 세포외 산물과 원형질막 수용체의 상호작용에 의하여 촉발되는 세포적 신호 변환(cellular signaling transduction)을 통하여 내피세포는 HMGB1을 능동적으로 분비한다. 세포외 환경(extracellular milieu)으로 분비된 HMGB1은 전-염증성 사이토카인의 생성을 위하여 선천 면역 세포들을 자극하는 케모카인 또는 사이토카인으로서 역할을 한다. HMGB1 상호작용에 참여하는 세포 표면 수용체들은 RAGE(receptor for advanced glycation end products), TLR(toll like receptor)-2, 및 TLR-4를 포함한다. HMGB1이 세포외 공간으로 분비되는 방식은 두가지가 있는데, 하나는 대식세포 및 호중구와 같은 면역세포들이 관련되어 염증을 촉발하는 능동적 프로세스이고, 다른 하나는 괴사성 세포 및 선천 면역 시스템에 의해 채택된 매커니즘에 의하여 촉발되며 손상되거나 괴사된 세포를 인식하는 수동적 프로세스이다(Ulloa and Tracey, 2005). HMGB1으로 내피를 자극하는 것은 ICAM(intercellular adhesion molecule), VCAM(vascular cell-adhesion molecule), 및 E-Selectin과 같은 CMA(cell adhesion molecule)들의 발현을 증가시키며, 이는 백혈구의 소집(recruitment)을 통하여 염증을 촉진한다(Bae and Rezaie, 2011). 패혈증 또는 패혈성 쇼크 진단 후 1주일까지 대부분의 환자에서 측정 가능하며, 상기 HMGB1의 수준은 장기 기능이상(organ dysfunction) 정도와 연관되어 있다(Gibot et al., 2007; Sunden-Cullberg et al., 2005).

한편, 패혈증(sepsis)은 감염된 미생물에 대항하는 신체의 비정상적인 방어작용에 의해 발생한다. 대식세포의 활성화와 이에 따른 염증관련 인자들의 과도한 생성이 연관되어 있는데, 이로 인해 전신에 심각한 염증 반응이 나타난다. 체온이 38℃ 이상으로 올라가는 발열 증상, 36℃ 이하로 내려가는 저체온증, 분당 24회 이상의 호흡수(빈호흡), 분당 90회 이상의 심박수(빈맥), 혈액 검사상 백혈구 수의 증가 또는 현저한 감소 중 두 가지 이상의 증상을 보이는 경우, 이를 전신성 염증반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome; SIRS)이라 하고, 이러한 전신성 염증반응 증후군이 미생물의 감염에 의한 것일 때 패혈증이라고 한다. 패혈증은 잠재적으로 패혈증성 쇼크(septic shock)를 유발할 수 있다. 패혈증이 심해지면 신체의 여러 기관(심장, 신장, 간, 뇌, 폐 등)의 기능이 나빠지고 더욱 심해지면 쇼크 상태가 되는 것이다. 다양한 종류의 병원체로 인해 패혈증이 발병할 수 있는데, 가장 발생률이 높은 것은 박테리아에 의한 것이지만 그 외에도 바이러스나 곰팡이에 의해서도 일어날 수 있다. 폐에 감염을 일으키는 폐렴, 방광과 신장에 감염을 일으키는 요도감염, 피부에 일어나는 봉소염, 복부에 일어나는 충수염 또는 뇌에 일어나는 뇌막염 등이 있으며, 예를 들면 폐렴을 앓고 있는 환자가 패혈증에 걸리게 되면 뇌, 심장, 간, 폐 또는 신장에 손상이 일어나며 중증으로 진전되는 경우 환자의 약 20 ~ 50%는 패혈증성 쇼크에 의해 사망한다. 또한, 수술 후 감염에 의해 패혈증이 발생하기도 한다. 감염 또는 수술 후 감염에 의한 초급성 염증반응으로서 패혈증에 걸리게 되면 40 ~ 90%가 사망에 이르게 된다.

상기 패혈증은 감염 원인균과 숙주의 면역, 염증 그리고 응고계통 사이의 복잡한 상호작용의 결과로 발생하는 것으로 이해되고 있다. 숙주의 반응 정도와 감염 원인균의 특성 모두 패혈증의 예후에 중대한 영향을 미친다. 패혈증에서 관찰되는 장기부전은 숙주의 감염 원인균에 대한 반응이 부적절한 경우에 발생하며, 만일 숙주의 감염 원인균에 대한 반응이 지나치게 증폭된다면 숙주 자체의 장기손상을 유발할 수 있다. 이러한 개념을 바탕으로 숙주의 염증 반응에 주도적인 역할을 수행하는 전염증 사이토카인(proinflammatory cytokines)인 TNF-α, IL-1β, IL-6등에 대한 길항 물질이 패혈증의 치료제로 시도되었으나 대부분 실패하였으며, 기계환기치료, 활성 단백질 C(activated protein C) 투여, 글루코코르티코이드 치료 등이 현재 시도되고 있으나 여러 가지 한계점이 지적되고 있다. 따라서, 높은 사망률을 보임에도 아직까지 뚜렷한 치료제가 개발되지 않은 패혈증 및 패혈증 쇼크를 예방 또는 치료하기 위한 새로운 치료제에 대한 필요성이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 천연물로부터 유래된 항-패혈증 효능 물질을 연구하던 중, 본 명세서에서 알로인(aloin)이 패혈증 주요 인자인 HMGB1의 분비를 억제하고 이와 관련된 세포 시그날링의 분자적 매커니즘을 효과적으로 조절하여 HMGB1에 의한 혈관염증성 반응을 억제할 뿐만 아니라, 실제로 in vivo 패혈증 동물모델에 대하여 현저한 치료효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 알로인 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

본 발명의 다른 목적은 알로인 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 알로인 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 알로인 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 알로인(aloin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 신규한 용도를 제공하는 것으로서, 알로인 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 항-패혈증 용도를 제공한다;

알로인의 항-패혈증 효과는 본 발명자에 의하여 처음으로 규명된 것으로서, 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나 있다.

본 발명의 실시예에서는, 알로인이 패혈증의 주요 매개자인 HMGB1을 억제함을 확인하였다.

본 발명의 실시예에서는, 알로인이 SIRT1 단백질 발현을 유의하게 증가시켜 HMGB1의 분비를 억제함을 확인하였다.

본 발명의 실시예에서는, 패혈증의 주요 매개자인 HMGB1 및 이와 관련된 전염증성 시그날링 인자들에 대하여 알로인의 효과를 평가하였다.

알로인은 LPS- 또는 CLP(cecal ligation and puncture)-에 의해 매개된 HMGB1의 분비 및 HMGB1에 의해 매개된 장벽 붕괴를 억제하였다. 또한 알로인은 HMGB1에 의해 유도되는 nuclear factor-κB (NF-κB) 및 extracellular regulated kinases 1/2(ERK1/2)의 활성화와 IL-6, tumor necrosis factor-α(TNF-α)의 생산을 억제하였으며, HMGB1으로 자극시, NF-kB p65가 세포질에서 핵으로 전이되는 것을 억제하였다. 또한 상기 화합물들은 실제로 CLP-패혈증 동물모델에서 혈관 장벽의 보호효과를 나타내었으며, 사망률 감소면에서 현저한 효과를 나타내었으며, CLP 수술로 인한 간질 부종, 폐 손상 등에도 현저한 치료효과를 나타내었다.

본 명세서 실시예의 in vitro 및 in vivo 실험을 통하여 보인 바와 같이, 알로인은 HMGB1에 의해 매개되는 염증성 반응들을 억제하며, 이러한 HMGB1 signaling pathway의 억제를 통해 패혈증 및 패혈성 쇼크를 치료하는 효과가 있다.

따라서 본 발명은 알로인 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 패혈증(sepsis) 또는 패혈성 쇼크(septic shock)는 HMGB1에 의해 (High mobility group box 1)에 의해 매개되는 것이 특징으로, 상기“패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료”란, 폐혈증에 연관된 임상 증상 및 다기관 기능부전 증후군에 연관된 상태(예를 들어 다양한 정도의 열, 저독소혈증, 사성, 빈맥, 내피염, 심근경색증, 고도착란, 변화성 정신 상태, 혈관 허탈 및 기관 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 응고장애, 심부전증, 신부전증, 쇼크 및(또는) 혼수상태 등)의 전부 또는 일부 증상을 감소, 개선 또는 제거하는 것을 의미한다.

본 발명의 알로인은 알로에로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 알로인은 알로에로부터 추출될 수 있다. 상기 화합물은 알로에부터 유기용매 추출 및 크로마토그래피 등의 당업계에서 통상적으로 사용되는 공지의 방법에 의해 추출될 수 있다.

본 발명에 따른 알로인은 그 자체 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서 ‘약학적으로 허용되는’이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 부여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말하여, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한, 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 알로인을 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 및 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

아울러, 본 발명에 따른 상기 알로인 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 예방 또는 개선하기 위한 목적으로 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 알로인 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 및 개선효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 알로인 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물 중 상기 알로인 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만, 예를 들어, 최종적으로 제조된 식품 중 0.001 내지 30 중량% 일 수 있다. 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 20 중량%일 수 있다.

또한, 본 발명의 알로인 또는 이의 염을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 알로인은 패혈증의 주요 매개인자인 HMGB1(High mobility group box 1)의 분비를 억제하고 상기 HMGB1과 관련된 전염증성 시그날링(proinflammatory signaling)을 억제하는 효과를 지니며, 실제로 CLP-유도된 in vivo 패혈증 동물 모델에서 패혈증의 치료효과가 현저하다.

도 1은 알로인이 LPS-자극된 HUVEC 및 CLP-유도된 패혈증 동물모델에서 SIRT1 신호를 활성화함으로써 HMGB1의 방출을 저해하는 것을 확인한 결과들이다(모든 실험은 3회의 반복실험을 통해 평균 및 표준편차로 나타내었으며, *p < 0.05 versus LPS alone (a) or CLP alone (b)).
도 1a는 도면에 표시된 각 농도의 알로인을 LPS에 의해 자극된 HUVEC에 처리한 후 HMGB1의 분비량을 ELISA로 분석한 결과이다(D: 0.2% DMSO 처리군).
도 1b는 CLP-유도된 패혈증 동물모델에 알로인을 처리한 후 혈청에서 HMGB1의 양을 ELISA로 분석한 결과이다(D: 0.2% DMSO 처리군).
도 1c는 도면에 표시된 각 농도의 알로인을 HUVEC에 처리한 후 세포 생존율을 MTT assay로 분석한 결과이다(D: 0.2% DMSO 처리군).
도 1d는 HUVEC에 알로인 400uM을 도면에 표시된 시간동안 처리한 후 세포에서 SIRT1의 발현량을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.
도 1e는 HUVEC에서 알로인이 HMGB1의 아세틸화 및 SIRT1 발현에 미치는 영향을 평가한 결과이다. 세포를 LPS(100ng/mL)로 처리하고, 알로인(400 μM)을 함께 처리하거나 처리하지 않았다. 또는, 알로인 처리 전에 1시간 동안 SIRT1 억제제(sirtinol, Srtnl, 10 mM)로 세포를 처리하였다. 16시간 동안 배양한 후, 세포를 면역침전을 위해 용해시켰다. 세포 용해물을 항-HMGB1 항체를 이용하여 면역침전 시킨 후, HMGB1 아세틸화 및 총 HMGB1 단백질 수준을 항-아세틸-리신 (anti-acetyl-lysine, K) 및 항-HMGB1를 이용한 면역블롯 분석으로 분석하였다 (1행 및 2행). 16시간 동안 배양한 후, 동일한 부피의 배지를 수집하고 방출된 HMGB1을 웨스턴 블롯으로 검출하였다(3행)(IP: 면역침전, WB: 웨스턴 블롯).
도 2는 알로인이 Nrf2-의존적인 HO-1 유도 및 PI3K 경로를 통해 LPS에 의해 활성화된 HUVEC에서 HMGB1의 분비를 저해하는 것을 확인한 결과이다(모든 실험은 3회의 반복실험을 통해 평균 및 표준편차로 나타내었으며, *p < 0.05 versus D (A), 0 (B), aloin (C, E), or LPS (F). #p < 0.05 versus LPS + aloin (F)).
도 2a는 도면에 표시된 각 농도의 알로인을 HUVEC에 12시간 동안 처리한 후 세포에서 추출한 단백질에서 HO-1의 발현량을 ELISA를 통해 분석한 결과이다.
도 2b는 400uM의 알로인을 도면에 표시된 각 시간 동안 HUVEC에 처리한 후 세포에서 추출한 단백질에서 HO-1의 발현량을 ELISA를 통해 분석한 결과이다.
도 2c는 HUVEC을 HO-1 siRNA 또는 대조 siRNA로(Ctrl siRNA) 형질감염 시킨 후, 400uM의 알로인으로 16시간 동안 처리하고 단백질을 추출하여 HO-1의 발현량을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 2d는 HUVEC을 50~400uM의 알로인으로 16시간 동안 처리한 후, 세포질 분획 또는 핵 분획에서 단백질을 추출하여 Nrf2의 발현량을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.
도 2e는 HUVEC을 Nrf2 siRNA 또는 대조 siRNA로 형질감염 시키거나, PI3K 저해제인 LY29400(10uM)를 알로인 처리 1시간 전에 전처리한 후, 상기 각 HUVEC을 알로인(400uM)으로 16시간 동안 처리한 후 단백질을 추출하여 HO-1의 발현량을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 2f는 HUVEC을 ZnPPIX, Nrf2-siRNA, 대조 siRNA 또는 LY294002로 전처리한 것을 제외하고는 도 1a와 동일한 실험의 결과를 나타낸 결과이다.
도 3은 알로인이 HMGB1에 의해 매개되는 혈관 장벽 붕괴를 저해하는 효과를 확인한 결과이다(모든 실험은 3회의 반복실험을 통해 평균 및 표준편차로 나타내었으며, *p < 0.05 versus LPS (A) or HMGB1 (B, C, D).
도 3a는 LPS(100ng/ml, 4시간)에 의해 자극된 HUVEC 세포에 도면에 표시된 농도의 알로인을 각각 16시간 동안 처리한 후, 투과성(permeability)을 에반스 블루가 결합된 알부민의 유출량으로 표시한 결과이다.
도 3b는 HMGB1(1ug/mL, 16시간)에 의해 자극된 HUVEC 세포에 도면에 표시된 농도의 알로인을 각각 16시간 동안 처리한 후, 투과성(permeability)을 에반스 블루가 결합된 알부민의 유출량으로 표시한 결과이다.
도 3c는 마우스에서 HMGB1에 의해 유도된(2ug/mouse, 정맥투여) 혈관 투과성 변화에 대한 알로인의 효과를 복강에 유출된 에반스 블루 시약의 양으로 평가한 결과이다(ug/mouse로 결과를 표시함, n=5).
도 3d는 HMGB1(1ug/ml, 16시간)로 활성화된 HUVEC에 도면에 표시된 각 농도의 알로인을 16시간 동안 처리한 후 HMGB1에 의해 매개된 인산화-p38의 발현량을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 3e는 유리 커버슬립에 단층으로 배양된 HUVEC을 HMGB1으로 16시간 동안 자극한 후, 알로인을 16시간 동안 처리하고 F-actin을 항체를 이용하여 염색한 결과이다. 화살표는 세포 간극을 나타낸 것이다.
도 4는 알로인이 HMGB1에 의한 NF-κB/ERK 활성화 및 IL-6/TNF-α의 생성을 저해하는 것을 확인한 결과이다(모든 실험은 3회의 반복실험을 통해 평균 및 표준편차로 나타내었으며, *p < 0.05 versus HMGB1).
도 4a는 HMGB1(1ug/ml)로 16시간 동안 자극한 HUVEC 세포에 도면에 표시된 각 농도의 알로인을 16시간 동안 처리한 후 TNF-α의 생성량을 측정한 결과이다.
도 4b는 HMGB1(1ug/ml)로 16시간 동안 자극한 HUVEC 세포에 도면에 표시된 각 농도의 알로인을 16시간 동안 처리한 후 IL-6의 분비량을 측정한 결과이다.
도 4c는 HMGB1(1ug/ml)로 16시간 동안 자극한 HUVEC 세포에 도면에 표시된 각 농도의 알로인을 16시간 동안 처리한 후, HMGB1에 의해 매개된 인산화-NF-κB p65의 활성화(하얀색 막대) 및 전체 NF-κB p65(검정색 막대)의 발현량을 분석한 결과이다.
도 4d는 HMGB1(1ug/ml)로 16시간 동안 자극한 HUVEC 세포에 도면에 표시된 각 농도의 알로인을 16시간 동안 처리한 후, HMGB1에 의해 매개된 인산화-ERK1/2(하얀색 막대) 및 전체 ERK1/2(검정색 막대)의 발현량을 분석한 결과이다.
도 4e는 HUVEC에서 p65의 핵 이동을 면역형광(IF) 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 5는 알로인의 투여가 CLP-유도 패혈증 동물모델에서 동물의 생존율을 향상시키고 조직 손상을 감소시키는 것을 확인한 결과이다(모든 실험은 3회의 반복실험을 통해 평균 및 표준편차로 나타내었으며, *p < 0.05 versus CLP.).
도 5a는 CLP 후 12시간 및 50시간에 각각 6.2mg/kg(정맥투여) 또는 12.4mg/kg(정맥투여)의 알로인을 투여한 마우스에서의 생존을 132시간 동안 관찰하고 Kaplan-Meier 생존 분석으로 총 생존율을 분석한 결과이다. 대조군 CLP 마우스(●) 및 sham-마우스(○)는 각각 saline을 투여하였다(n=20).
도 5b는 CLP 후 12시간 및 50시간에 각각 6.2mg/kg(정맥투여) 또는 12.4mg/kg(정맥투여)의 알로인을 투여한 마우스를 CLP 후 96시간 째에 마취하여 폐를 적출한 후 조직학적 점수를 평가하여 기록한 결과이다(n=5).
도 5c는 도 5b에서 적출한 마우스의 폐 조직을 H&E 염색을 수행한 후 현미경으로 관찰한 도면이다. Sham 그룹: 1등급, CLP 그룹: 3등급, CLP+알로인 그룹: 2등급.
도 5d 내지 도 5g는 상기 도 5b 및 5c에서 실험에 이용한 마우스에서 수득한 혈장에서 AST, ALT, 크레아티닌, BUN 및 LDH의 양을 측정한 결과이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험준비>

1. 세포배양 및 시약

HUVEC(Primary human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) 세포는 Cambrex Bio Science(Charles City, IA, USA)로부터 수득하였고, Bae et al., 2014;의 연구에서 묘사된 바와 같이 유지되었다(maintained). 간략하게, growth supplements(Cambrex Bio Science)가 첨가된 EBM-2 basal media 용액에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로, 세포들이 포화(confluency)되도록 배양하였다. 모든 실험은 3-5계대(passage) 배양된 HUVEC 세포를 사용하여 수행되었다.

알로인(aloin, >97% dissolved in 0.5% DMSO), 세균성 리포폴리사카라이드(LPS, 혈청형: 0111:B4, L5293), MTT, 에반스 블루(Evans blue), 크리스탈 바이올렛(crystal violet), 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 항생제(페니실린G 및 스트렙토마이신), DMSO(dimethyl sulfoxide) 및 PI3 kinase 저해제(LY294002)를 Sigma (St.Louis,MO).로부터 수득하였다. 인간 재조합 HMGB1(Human recombinant high mobility group box 1 protein)은 Abnova (Taipei City, Taiwan)로부터 구입하였다. 인간 HO-1 및 Nrf2 siRNA(small interfering RNA) 및 대조군 nonsense siRNA는 Santa Cruz Biotechnoloty에서 구입하여 사용하였다.

2. 실험 동물 및 CLP(cecal ligation and puncture)

몸무게가 27g인 6 내지 7주령 C57BL/6 수컷 마우스들을 orient Bio Co.(성남, 대한민국)로부터 구입하였고 12개월의 적응기간(acclimatization period) 후에 본 연구에 이용하였다.

패혈증을 유도하기 위해, 수컷 마우스들은 졸레틸(틸레타민과 졸라제팜, 1 : 1 혼합물, 30 mg/kg)과 럼푼(자일라진, 10mg/kg)로 마취되었다. 간략하게, 2cm의 정중절개(midline incision)를 수행하여 맹장 및 인접한 소장을 노출시켰다. 그 후 맹장 끝부분(cecal tip)으로부터 5.0mm 떨어진 부분을 3.0-비단봉합사(silk suture)로 단단히 묶고, 높은 수준의 패혈증을 유발하기 위하여 22-게이지의 바늘로 맹장에 1회 구멍을 냈다. 그 후, 상기 구멍 부위로부터 배설물을 압출시키기 위하여 맹장을 부드럽게 짜내었고(squeezed), 상기 맹장을 다시 복막강(peritoneal cavity)으로 복귀시켰다. 마지막으로 개복 부위(laparotomy site)를 4.0-silk로 봉합하였다. sham control 군의 실험동물은 맹장을 노출시킨 후 봉합(ligation) 또는 구멍을 내는 과정 없이 복강으로 복귀시켰다. 상기 실험 프로토콜은 실험 전, the Animal Care Committee at Kyungpook National University(IRB No. KNU 2016-54)에 의해 승인받았다.

3. HMGB1 측정을 위한 경쟁적 ELISA(Competitive enzyme-linked immunosorbent assay)

경쟁적 ELISA 방법을 이용하여 HMGB1의 농도를 조사하였다. HUVEC 단일층(HUVEC monolayer)을 LPS(100ng/mL)로 16시간 동안 처리하였으며, 그 후 알로인으로 16시간 동안 처리하였다.

4. 세포질 및 핵 추출물의 제조, 면역침전(IP) 및 웨스턴블롯

세포들을 침전에 의해 빠르게 수확하였고, 핵 및 세포질 추출물은 이전에 기술된 바와 같이 얼음 위에서 준비하였다(Mackman et al., 1991). 미리 씻어낸 세포 용해물을 항-HMGB1(Santa Cruz Biotechnology)과 함께 4℃에서 밤새 항온 배양한 후 이전에 기술된 바와 같이 면역침전(immunoprecipitation, IP)에 사용하였다(Lee et al., 2017). 웨스턴 블롯의 경우 항-SIRT1, 항-HMGB1, 항-Nrf2, 항-COX2, 항-phospho-ERK1/2, 항-total ERK1/2, 항-NF-κB p65 및 항-lamin A/C 또는 베타-actin 항체(Santa Cruz)를 사용하였다. 항체 베타-actin과 lamin A/C를 세포질 추출물과 핵 추출물의 loading control로 사용하였다.

5. 세포 생존 에세이(Cell viability assay)

세포 생존의 지표로서 MTT assay 방법을 이용하였다. 세포들은 96-well plates에서 5 × 10³ cells/well의 밀도로 배양되었다. 24시간 후에, 세포들을 새 배지(fresh medium)로 세척하였으며, 알로인을 처리하였다. 48시간의 배양 후에, 세포를 세척하고 100㎕의 MTT(1mg/mL)를 첨가하여 4시간 배양하였다. 마지막으로 DMSO(dimethyl sulfoxide) 150㎕를 첨가하여 를 용해시키고, formazan salt의 양을 microplate reader(Tecan Austria GmbH, Austria)를 사용하여 540nm에서 OD(optical density)를 측정함으로서 조사하였다.

6. RNA 간섭(interference)

인간 HO-1, Nrf2 및 대조군 nonsense siRNA를 종래 보고된 방법에 따라 형질감염 시켰다(Lee et al.2015, Thromb. Haemost. 114, 350-363.)

7. 투과성 어세이(permeability assay)

Qureshi et al., 2008의 연구에서 기술된 바와 같은 modified 2-compartment chamber model을 이용하여, 기능적 HUVEC 세포 단일층(functional HUVEC monolayer)을 가로지른 Evans blue-결합된 알부민의 유출(flux)을 분광광도 측정(spectrophotometric measurement)하는 방법에 의해 투과성을 정량하였다. 간략하게, HUVEC 세포들은 3μm pore size, 12mm 직경의 transwell 에 5 X10⁴/well 로 분주되었고, 3일 동안 배양되었다. 이렇게 생성된 HUVEC 세포에 LPS(100 ng/mL, 4h) 또는 HMGB1(1㎍/mL, 16h)을 처리하고, 그리고 나서 알로인을 6시간동안 처리하였다. 이어서, 트랜스웰 삽입물을 PBS (pH 7.4)로 세척하고, 0.5mL의 Evans blue(0.67mg/mL) 및 4% BSA를 함유하는 성장 배지를 첨가하였다. 신선한 성장 배지를 하부 chamber에 첨가하고, 상부 chamber의 배지를 Evans blue/BSA로 대체하였다. 10분 후, 하부 chamber 내의 광학밀도를 650nm에서 측정하였다.

In vivo 실험을 위해서, 수컷 마우스들에 우선 HMGB1(2ug/마우스, 정맥투여)로 16시간동안 투여하고, 그 다음에 알로인(6.2 또는 12.4 mg/kg, 정맥투여)을 투여하였다. 혈관 투과성은 마우스마다 복강에 누출된 염색약의 양을 ug으로 나타내었으며, 종래 보고된 방법에 따라 표준곡선을 작성하여 결정하였다(Toxicol. Appl. Pharmacol. 329, 202-211).

8. HO-1, 인산화된 p38, MAPK(mitogen-activated protein kinase), NF-κB, TNF-α, ERK(extracellular signal-regulated kinase) 1/2 및 IL-6의 ELISA assay

인산화된 p38의 활성은 상업적으로 구매 가능한 ELISA 키트(cell signaling technology, Danvers, MA)를 제조자의 지시에 따라 수행하여 평가하였다.

핵 용해물에 포함된 전체 및 인산화된 형태의 p65 NF-κB(#7174, #7173, Cell Signaling Technology, Danvers, MA)의 활성 및 ERK 1/2(R&D Systems, Minneapolis, MN)의 활성은 ELISA 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 측정하였다.

세포 배양액의 상등액의 HO-1, IL-6 및 TNF-α의 농도는 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다.

9. 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색 및 조직학적 분석

수컷 C57BL/6 마우스(n=5)를 CLP법에 적용하여 패혈증을 유도한 후 알로인(6.2mg/kg 또는 12.4mg/kg, 정맥투여)을 CLP법 이후 12시간 및 50시간째에 투여하였다. CLP법 적용 후 96시간째에 마우스를 마취하고 종래 보고된 방법(Toxicol. Appl. Pharmacol. 329, 202-211)에 따라 H&E 염색을 수행하여 폐의 표현적 변화를 관찰하였다.

10. 면역형광염색

알로인을 처리(200 또는 400uM)하거나 또는 처리하지 않은 상태로 세포를 HMGB1(1ug/mL)로 16시간 동안 자극한 후, 종래 보고된 방법(Toxicol. Appl. Pharmacol. 329, 202-211)에 따라 F-actin 및 NF-κB p65의 면역형광염색을 수행하였다.

11. 조직손상 마커의 측정

AST(aspartate transaminase), ALT(alanine transaminase), BUN(blood urea nitrogen), 크레아티닌 및 LDH(lactate dehydrogenase)의 혈청 농도를 상업적으로 구매 가능한 분석 키트(Pointe scientific, Lincoln Park, MI)를 이용하여 분석하였다.

12. 통계학적 분석

각 실험은 적어도 3회씩 독립적으로 반복수행되었다. 값(Values)들은 평균± 평균의 표준오차(mean± standard error of the mean(SEM))로 나타내었다. 테스트 그룹간 통계적 유의성의 차이는 one-way analysis of variance (ANOVA) 및 Tukey's post-hoc test에 의하여 평가되었다. CLP법에 의해 유도된 패혈증 결과의 전체 생존률(overall survival rate) 평가를 위하여, Kaplan-Meier survival analysis가 수행되었다. SPSS for Windows, version 16.0(SPSS, Chicago, IL)을 이용하여 통계적 분석이 수행되었으며, 0.05 미만의 P-값(p <0.05)은 통계적으로 유의미한 것으로 생각되었다.

<실험결과>

1. 알로인이 LPS에 의해 활성화된 HUVEC 세포 및 CLP-유도된 패혈증 마우스 모델에서 HMGB1의 분비를 감소시키며, 이는 SIRT1 신호 활성화에 의한 것임

활성화된 면역세포와 손상된 세포에 의해 분비된 HMGB1 단백질은 패혈증 매개체로 작용하며(Bae, 2012 Arch. Pharm. Res. 35, 1511-1523.), LPS(lipopolysaccharide)는 동물 또는 세포 연구에서 심한 혈관 염증의 연구 도구로 사용된다(Buras et al., 2005 Nat Rev Drug Discov 4, 854-865.).

LPS는 HMGB1 분비를 크게 자극했으며, 이러한 양상은 알로인의 처리에 의해 억제되었다(도 1a). 생체 내에서(in vivo) HMGB1 방출에 대한 알로인의 억제 효과를 확인하기 위해 CLP 수술 후 12시간째에 알로인을 정맥 주사했다. 알로인은 CLP로 유도된 HMGB1 분비를 현저히 감소시키는 것으로 나타났다(도 1b). 또한 알로인의 독성을 확인하기 위해 HUVEC에서 MTT를 사용하여 세포 생존율 분석을 수행했다. 알로인은 시험에 사용된 농도(최대 800μM)로 48 시간 동안 세포에 처리하였을 때, 세포의 생존율에는 영향을 미치지 않았다(도 1c).

이전 연구에 따르면, DNA에 대한 HMGB1의 결합은 과아세틸화(hyperacetylation)에 의해 영향을 받는 것으로 나타났으며(Bonaldi et al., 2003 EMBO J 22, 5551-5560.), HMGB1의 핵으로의 이송 및 세포질 분비는 HMGB1의 세린 잔기에서의 과아세틸화에 의해 차단되는 것으로 확인된 바 있다(Youn and Shin, 2006 J Immunol 177, 7889-7897).

또한, Sirtuin1(SIRT1)의 활성화는 HMGB1의 탈아세틸화에 중요한 역할을 한다. 따라서 HMGB1은 SIRT1의 신규한 탈아세틸화 타겟이 된다(Rabadi et al., 2015). 따라서, SIRT1 발현에 대한 알로인의 영향을 시험하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. SIRT1의 발현은 4시간 후 분명하게 나타났으며, 12시간 후에 최고조가 되었고, 16시간까지 유지되었고, 24시간 후에 사라졌다(도 1d).

또한 LPS-유도된 알로닌-매개 HMGB1의 분비의 기초가 되는 분자 메커니즘을 결정하기 위해, HMGB1의 탈아세틸화 및 SIRT1 발현 유도에 대한 알로인의 효과를 시험하였다. 그 결과 LPS가 HMGB1의 아세틸화를 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 다시 알로인에 의해 억제되었다(도 1e).

이어서, LPS에 의해 활성화된 세포에서 HMGB1의 탈아세틸화를 통한 HMGB1 분비 억제에 SIRT1 활성이 관여한다는 것을 확인하기 위하여 SIRT1 억제제인 서티놀(sirtinol)l이 HMGB1의 방출에 미치는 영향을 확인하였다.

그 결과, 서티놀(sirtinol)이 명확하게 알로인의 효과를 뒤집었음을 확인할 수 있었고, HMGB1의 아세틸화와 분비는 서티놀(sirtinol)에 의해 증가되었다(도 1e). 따라서, 이들 결과는 LPS-매개 HMGB1 분비가 알로인의 처리에 의한 HMGB1의 SIRT1-매개 탈아세틸화를 통해 감소됨을 나타내었다:

1) SIRT1 발현은 알로인에 의해 유의하게 증가됨;

2) HMGB1 분비는 알로인에 의한 HMGB1 탈아세틸화를 통해 억제됨; 및

3) 알로인에 의한 HMGB1 방출의 억제 효과는 서티놀(sirtinol)에 의해 현저하게 역전됨.

2. 알로인은 Nrf2-의존적인 HO-1 유도 및 PI3K 경로를 통해 LPS에 의해 활성화된 HUVEC에서 HMGB1의 분비를 감소시킴

종래 보고된 바에 따르면, HO(heme oxygenase) 유도제가 패혈증 동물 모델에서 HMGB1 수준을 유의하게 감소시킨다(Takamiya et al., 2009; Tsoyi et al., 2009). 따라서 본 발명자는 HO-1의 유도에 대한 알로인의 효과를 확인해 보았다.

도 2a 및 2b를 참고하면, HO-1 단백질 발현이 농도- 및 시간-의존적으로 알로인에 의해 유도되었음을 확인할 수 있다. 이러한 알로인의 효과를 다시 한번 확인하고자, HO-1 siRNA를 사용하여 알로인에 의한 HO-1 발현이 HO-1 siRNA로 형질 감염된 세포에서 완전히 제거되었음을 확인할 수 있었다(도 2c).

그 다음으로, Nrf2(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2)가 HO-1의 전사 조절에 중요한 역할을 하기 때문에(Ryter et al., 2006), 본 발명자는 알로인이 Nrf2의 핵 축적을 일으키는지 조사했다.

그 결과, 알로인이 농도 의존적 방식으로 세포질에서 핵으로의 Nrf2의 전이를 매개한다는 것을 확인할 수 있었다(도 2d). 또한, HO-1 발현 유도에 Nrf2의 활성화가 필요하다는 것을 확인하기 위해 Nrf2 발현이 억제된 상태에서 HO-1의 발현 유도를 조사하였다. 도 2e에 나타낸 바와 같이, 알로인은 Nrf2-silenced 조건 하에서 HO-1 발현을 유도할 수 없었다.

HMGB1 방출이 HO-1에 의해 negative-조절되고(Tsoyi et al., 2009) 알로인이 HO-1을 유도한다는 것에 주목하여, 본 발명자는 Nrf2가 저해되어 있는 동안에 알로인에 의한 HMGB1 분비 저해가 역전되는지 여부를 확인하고자 하였다. 예상한 바와 같이, 알로인에 의한 HMGB1 방출의 저해는 LPS로 처리된 형질 감염된 세포에서 Nrf2 siRNA에 의해 길항되었다(도 2f). 또한 ZnPPIX (HO-1 효소 억제제)는 알로인의 효과에 유의한 길항 작용을 했다(도 2f).

그 다음으로, 본 발명자는 알로인에 의해 매개되는 HO-1 유도에 관여되어 있는 신호체계를 확인하고자 하였다. PI3K 활성화는 많은 세포 유형에서 HO-1의 유도에서 가장 중요한 신호 중 하나이다(Ha et al., 2012). 도 2e에 나타낸 바와 같이, 알로인 매개 HO-1 발현은 PI3K 억제제인 LY294002에 의해 현저하게 역전되었다. 만약 HMGB1 방출의 억제에 HO-1 활성이 필요한 경우 HMGB1의 방출은 LY294002의 존재 하에서 변화되어야 한다. 예상한 바와 같이, 알로인에 의한 HMGB1 분비 억제는 LY294002에 의해 역전되었다(도 2f). 따라서, 이러한 결과를 통해 PI3K/Nrf2/HO-1 신호전달 축이 HMGB1 분비를 억제를 포함하여 패혈증 상태에서 알로인의 항-패혈증 효과에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

3. 알로인은 HMGB-1에 의한 혈관 장벽 붕괴를 저해함

HMGB1과 LPS는 혈관 장벽의 온전성을 파괴하는 것으로 알려져 있으므로 (Lee et al., 2014), HUVEC의 장벽 온전성 유지에 대한 알로인의 효과를 평가하기 위해 혈관 투과성을 평가하였다.

이를 위해 HUVEC를 LPS(도 3a, 100ng/mL) 또는 HMGB1(도 3b, 1μg/mL)로 활성화시킨 다음 16시간 동안 알로닌으로 처리하였다. 그 결과 LPS 및 HMGB1 매개 과투과도(hyperpermeability)가 알로인에 의해 저해되었음을 확인할 수 있었다(도 3a 및 3b). 알로인의 장벽 보호 효과는 마우스에서도 확인되었다(도 3c).

종래 보고에 따르면 HMGB1에 의한 혈관 파괴 반응은 p38 MAPK의 활성화를 통해 일어난다(Palumbo et al., 2007; Qin et al., 2009; Sun et al., 2009). 따라서 본 발명자는 p38의 활성화에 대한 알로인의 효과를 확인해 보았다. 그 결과 p38의 활성화가 HMGB1에 의해 증가되었으며, 알로인에 의해 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 3d). 또한 알로인은 밀도가 높은 F-actin 고리를 형성함으로써 HMGB1에 의해 유도된 세포 간극을 회복시켰다(도 3e). HMGB1에 의한 과투과도(hyperpermeability)와 p38 활성화의 감소는 패혈증 치료제로서 알로인의 효과를 나타내 준다고 할 수 있다.

4. 알로인은 HMGB1에 의해 자극된 NF-κB/ERK의 활성화 및 IL-6/TNF-α의 생성을 저해함

HMGB1은 ERK1/2 및 NK-κB와 같은 다양한 신호전달 경로를 통해 TNF-α 및 IL-6와 같은 염증성 사이토카인의 발현을 증가시킴으로써 패혈증의 병리학 및 생리 조건을 악화시키는 것으로 보고된 바 있다(Erlandsson Harris and Andersson, 2004; Jung et al., 2016; Min et al., 2016). 따라서, 본 발명자는 HMGB1에 의한 TNF-α 및 IL-6의 생산과 NF-κB와 ERK 1/2의 활성화에 대한 알로인의 억제 효과를 확인하고자 하였다.

그 결과, 염증성 사이토카인 생산과 전사인자의 활성화가 HMGB1에 의해 강화된 것으로 나타났으며, 이는 알로인의 처리에 의해 억제되었다(도 4a-4d). 또한, p65 NF-κB의 핵 내 발현은 HMGB1에 의해 증가되었는데, 이는 알로인 처리에 의해 억제되었다(도 4e).

5. 알로인의 투여는 CLP-유도된 패혈증 마우스 모델에서 생존율을 향상시키고 조직 손상을 감소시킴

본 발명자는 CLP-유도된 패혈증의 치사율에 있어서 알로인의 보호 효과를 평가해 보았다.

CLP 수술 후 알로인을 마우스에게 투여하였다. 알로인(CLP 12 시간 후 6.2 또는 12.4mg/kg)의 단회 투여는 CLP-유도된 사망률에 영향을 미치지 못했다(데이터 미표시). 이에, 본 발명자는 알로인을 CLP 후 12시간과 50시간에 두 번 투여해 보았다. 그 결과 알로인이 패혈증으로 인한 마우스의 생존율을 향상시켰다(p <0.00001; Fig.5a).

다음으로 본 발명자는 CLP-유도된 폐 손상에 대한 알로인의 잠재적인 보호 효과를 확인해 보았다. CLP는 폐포 조직에서 염증 세포의 대규모 침윤과 폐 조직의 심각한 손상에 의한 조직간 부종을 유발했으나, 이러한 현상들은 알로인에 의해 감소되었다(도 5b 및 5c).

패혈증의 병리과정 동안에 전신성 염증반응은 주로 간 및 신장을 주요 타겟으로 하여 다발성 장기 기능 부전을 유발한다(Astiz and Rackow, 1998). CLP는 간 손상의 마커인 ALT 및 AST(도 5d) 및 신 손상의 마커인 크레아티닌 및 BUN(도 5e 및 5f)의 혈장 수준의 유의한 증가를 초래하였다. 이러한 마커들의 발현 증가는 알로인에 의해 완화되었다. 조직 손상의 또 다른 중요한 마커인 LDH는 CLP 유도 마우스에서 알로인 투여에 의해 감소되었다(도 5g).

본 발명의 알로인은 패혈증의 주요 매개인자인 HMGB1(High mobility group box 1)의 분비를 억제하고 상기 HMGB1과 관련된 전염증성 시그날링(proinflammatory signaling)을 억제하는 효과를 지니며, 실제로 CLP-유도된 in vivo 패혈증 동물 모델에서 패혈증의 치료효과가 현저하여 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

Claims (6)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 알로인(aloin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 제1항에 있어서, 상기 패혈증 또는 패혈성 쇼크는 HMGB1(high mobility group box 1)에 의해 매개되는 패혈증 또는 패혈성 쇼크인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 알로인은 HMGB1(high mobility group box 1)의 발현을 억제하는 효과가 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물에 알로인이 0.001~50중량%로 포함이 되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
5. 하기 화학식 1로 표시되는 알로인 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
6. 제5항에 있어서, 상기 패혈증 또는 패혈성 쇼크는 HMGB1(high mobility group box 1)에 의해 매개되는 패혈증 또는 패혈성 쇼크인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.

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