KR101696657B1 - 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비세닌-2(vicenin-2) 또는 스콜리모사이드(scolymoside)를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방, 개선 또는 치료용 (약학적 또는 식품)조성물에 관한 것이다.
본 발명의 화합물(특히 비세닌-2 및 스콜리모사이드)은 패혈증의 주요 매개인자인 HMGB1(High mobility group box 1)의 분비를 억제하고 상기 HMGB1과 관련된 전염증성 시그날링(proinflammatory signaling)을 억제하는 효과를 지니며, 실제로 in vivo 패혈증 동물 모델에서 패혈증의 치료효과가 현저하다.

Description

플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for prevention or treatment of sepsis comprising flavone-type compound}
본 발명은 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비세닌-2(vicenin-2) 또는 스콜리모사이드(scolymoside)를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
HMGB1(High-mobility group box 1 protein)은 뉴클레오솜(nucleosome)의 구조 및 안정성 유지와 전사 인자들이 그들의 동족 DNA 서열에 결합하는 것을 가능하게 하는 것에 의하여 유전자 발현의 조절에 기여하는 핵 염색체 단백질로서 처음 규명되었다. 최근, 실험 및 임상 연구로부터의 많은 데이터들이, 패혈증과 같은 여러 염증성 질환의 발병에 대한 세포외 HMGB1(extracellular HMGB1)의 기여를 강조하였다(Andersson and Tracey, 2011; Diener et al., 2013). 패혈증 동안, HMGB1은 감염에 기인하는 세포죽음에 따라 급속히 수동적으로 분비될 수 있고, 전-염증성 사이토카인들 및 PAMP(pathogen-associated molecular patterns)들에 대한 반응으로 면역 세포에서 능동적으로 분비될 수 있다. PAMP 및 내생적으로 유래된 염증 매개자(예를들어 TNF-α, IL-1b, NF-κB 및 ERK1/2)에 노출되었을 때, 세포외 산물과 원형질막 수용체의 상호작용에 의하여 촉발되는 세포적 신호 변환(cellular signaling transduction)을 통하여 내피세포는 HMGB1을 능동적으로 분비한다. 세포외 환경(extracellular milieu)으로 분비된 HMGB1은 전-염증성 사이토카인의 생성을 위하여 선천 면역 세포들을 자극하는 케모카인 또는 사이토카인으로서 역할을 한다. HMGB1 상호작용에 참여하는 세포 표면 수용체들은 RAGE(receptor for advanced glycation end products), TLR(toll like receptor)-2, 및 TLR-4를 포함한다. HMGB1이 세포외 공간으로 분비되는 방식은 두가지가 있는데, 하나는 대식세포 및 호중구와 같은 면역세포들이 관련되어 염증을 촉발하는 능동적 프로세스이고, 다른 하나는 괴사성 세포 및 선천 면역 시스템에 의해 채택된 매커니즘에 의하여 촉발되며 손상되거나 괴사된 세포를 인식하는 수동적 프로세스이다(Ulloa and Tracey, 2005). HMGB1으로 내피를 자극하는 것은 ICAM(intercellular adhesion molecule), VCAM(vascular cell-adhesion molecule), 및 E-Selectin과 같은 CMA(cell adhesion molecule)들의 발현을 증가시키며, 이는 백혈구의 소집(recruitment)을 통하여 염증을 촉진한다(Bae and Rezaie, 2011). 혈장에서 HMGB1 수준(level)의 증가는 패혈증 또는 패혈성 쇼크 진단 후 1주일까지 대부분의 환자에서 측정가능하며, 상기 HMGB1의 수준은 장기 기능이상(organ dysfunction) 정도와 연관되어있다(Gibot et al., 2007; Sunden-Cullberg et al., 2005).
한편, 패혈증(sepsis)은 감염된 미생물에 대항하는 신체의 비정상적인 방어작용에 의해 발생한다. 대식세포의 활성화와 이에 따른 염증관련 인자들의 과도한 생성이 연관되어 있는데, 이로 인해 전신에 심각한 염증 반응이 나타난다. 체온이 38℃ 이상으로 올라가는 발열 증상, 36℃ 이하로 내려가는 저체온증, 분당 24회 이상의 호흡수(빈호흡), 분당 90회 이상의 심박수(빈맥), 혈액 검사상 백혈구 수의 증가 또는 현저한 감소 중 두 가지 이상의 증상을 보이는 경우, 이를 전신성염증반응증후군(systemic inflammatory response syndrome; SIRS)이라하고, 이러한 전신성염증반응증후군이 미생물의 감염에 의한 것일 때 패혈증이라고 한다. 패혈증은 잠재적으로 패혈증성 쇼크(septic shock)를 유발할 수 있다. 패혈증이 심해지면 신체의 여러 기관(심장, 신장, 간, 뇌, 폐 등)의 기능이 나빠지고 더욱 심해지면 쇼크 상태가 되는 것이다. 다양한 종류의 병원체로 인해 패혈증이 발병할 수 있는데, 가장 발생률이 높은 것은 박테리아에 의한 것이지만 그 외에도 바이러스나 곰팡이에의해서도 일어날 수 있다. 폐에 감염을 일으키는 폐렴, 방광과 신장에 감염을 일으키는 요도감염, 피부에 일어나는 봉소염, 복부에 일어나는 충수염 또는 뇌에 일어나는 뇌막염 등이 있으며, 예를 들면 폐렴을 앓고 있는 환자가 패혈증에 걸리게 되면 뇌, 심장, 간, 폐 또는 신장에 손상이 일어나며 중증으로 진전되는 경우 환자의 약 20 ~ 50%는 패혈증성 쇼크에 의해 사망한다. 또한, 수술 후 감염에 의해 패혈증이 발생하기도 한다. 감염 또는 수술 후 감염에 의한 초급성 염증반응으로서 패혈증에 걸리게 되면 40 ~ 90%가 사망에 이르게 된다.
상기 패혈증은 감염 원인균과 숙주의 면역, 염증 그리고 응고계통 사이의 복잡한 상호작용의 결과로 발생하는 것으로 이해되고 있다. 숙주의 반응 정도와 감염 원인균의 특성 모두 패혈증의 예후에 중대한 영향을 미친다. 패혈증에서 관찰되는 장기부전은 숙주의 감염 원인균에대한 반응이 부적절한 경우에 발생하며, 만일 숙주의 감염 원인균에대한 반응이 지나치게 증폭된다면 숙주 자체의 장기손상을 유발할 수 있다. 이러한 개념을 바탕으로 숙주의 염증 반응에 주도적인 역할을 수행하는 전염증사이토카인(proinflammatory cytokines)인 TNF-α, IL-1β, IL-6등에 대한 길항 물질이 패혈증의 치료제로 시도되었으나 대부분 실패하였으며, 기계환기치료, 활성 단백질 C(activated protein C) 투여, 글루코코르티코이드 치료 등이 현재 시도되고 있으나 여러 가지 한계점이 지적되고 있다. 따라서, 높은 사망률을 보임에도 아직까지 뚜렷한 치료제가 개발되지 않은 패혈증 및 패혈증 쇼크를 예방 또는 치료하기 위한 새로운 치료제에 대한 필요성이 요구되고 있다.
[비특허문헌 1] Andersson, U., Tracey, K.J., 2011. HMGB1 is a therapeutic target for sterile inflammation and infection. Annu Rev Immunol 29, 139-162. [비특허문헌 2] Diener, K.R., Al-Dasooqi, N., Lousberg, E.L., Hayball, J.D., 2013. The multifunctional alarmin HMGB1 with roles in the pathophysiology of sepsis and cancer. Immunology and cell biology 91, 443-450. [비특허문헌 3] Bae, J.S., Rezaie, A.R., 2011. Activated protein C inhibits high mobility group box 1 signaling in endothelial cells. Blood 118, 3952-3959. [비특허문헌 4] Gibot, S., Massin, F., Cravoisy, A., Barraud, D., Nace, L., Levy, B., Bollaert, P.E., 2007. High-mobility group box 1 protein plasma concentrations during septic shock. Intensive Care Med 33, 1347-1353. [비특허문헌 5] Sunden-Cullberg, J., Norrby-Teglund, A., Rouhiainen, A., Rauvala, H., Herman, G., Tracey, K.J., Lee, M.L., Andersson, J., Tokics, L., Treutiger, C.J., 2005. Persistent elevation of high mobility group box-1 protein (HMGB1) in patients with severe sepsis and septic shock. Crit Care Med 33, 564-573. [비특허문헌 6] Bae, J.S., Lee, W., Nam, J.O., Kim, J.E., Kim, S.W., Kim, I.S., 2014. Transforming Growth Factor beta-induced Protein Promotes Severe Vascular Inflammatory Responses. Am J Respir Crit Care Med 189, 779-786. [비특허문헌 7] Qureshi, S.H., Manithody, C., Bae, J.S., Yang, L., Rezaie, A.R., 2008. Autolysis loop restricts the specificity of activated protein C: analysis by FRET and functional assays. Biophys Chem 134, 239-245. [비특허문헌 8] Bae, J.S., 2012. Role of high mobility group box 1 in inflammatory disease: Focus on sepsis. Arch Pharm Res 35, 1511-1523. [비특허문헌 9] Bae, J.W., Bae, J.S., 2011. Barrier protective effects of lycopene in human endothelial cells. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society ... [et al.] 60, 751-758. [비특허문헌 10] Ozdulger, A., Cinel, I., Koksel, O., Cinel, L., Avlan, D., Unlu, A., Okcu, H., Dikmengil, M., Oral, U., 2003. The protective effect of N-acetylcysteine on apoptotic lung injury in cecal ligation and puncture-induced sepsis model. Shock 19, 366-372. [비특허문헌 11] Chen, G., Li, J., Ochani, M., Rendon-Mitchell, B., Qiang, X., Susarla, S., Ulloa, L., Yang, H., Fan, S., Goyert, S.M., Wang, P., Tracey, K.J., Sama, A.E., Wang, H., 2004. Bacterial endotoxin stimulates macrophages to release HMGB1 partly through CD14- and TNF-dependent mechanisms. J Leukoc Biol 76, 994-1001. [비특허문헌 12] Buras, J.A., Holzmann, B., Sitkovsky, M., 2005. Animal models of sepsis: setting the stage. Nature reviews. Drug discovery 4, 854-865. [비특허문헌 13] Hofbauer, R., Moser, D., Salfinger, H., Frass, M., Kapiotis, S., 1998. Sufentanil inhibits migration of human leukocytes through human endothelial cell monolayers. Anesth Analg 87, 1181-1185.
이에 본 발명자들은 천연물로부터 유래된 항-패혈증 효능 물질을 연구하던 중, 본 명세서에서 화학식 1로 대표되는 비세닌-2(vicenine-2) 또는 스콜리모사이드(scolymoside)가 패혈증 주요 인자인 HMGB1의 분비를 억제하고 이와 관련된 세포 시그날링의 분자적 매커니즘을 효과적으로 조절하여 HMGB1에 의한 혈관염증성 반응을 억제할 뿐만아니라, 실제로 in vivo 패혈증 동물모델에 대하여 현저한 치료효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다;
<화학식 1>
Figure 112015020034065-pat00001
단, 상기 화학식 1에서 R1, R2 및 R3은 수소 또는 글루코실기이고, 상기 R4는 수소 또는 하이드록실기임.
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다;
<화학식 1>
Figure 112015020034065-pat00002
단, 상기 화학식 1에서 R1, R2 및 R3은 수소 또는 글루코실기이고, 상기 R4는 수소 또는 하이드록실기임.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 신규한 용도를 제공하는 것으로서, 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 항-패혈증 용도를 제공한다;
<화학식 1>
Figure 112015020034065-pat00003
단, 상기 화학식 1에서 R1, R2 및 R3은 수소 또는 글루코실기(glucosyl group)이고, 상기 R4는 수소 또는 하이드록실기(hydroxyl group, 수산화기)임.
본 발명의 상기 글루코실기는 글루코피라노스(glucopyranose, Cyclic form of glucose) 단독인 형태 또는 글루코피라노스가 람노피라노스(rhamnopyranose) 등 다른 종류의 당과 결합된 형태를 모두 포함하며, 상기 글루코피라노스는 이의 고리상에 존재하는 임의의 하이드록실기를 통하여 부착된다.
바람직하게 상기 화학식 1에서 R1, R2, R3 및 R4 는 하기 (i) 또는 (ii)의 조합으로 이루어지는 것일 수 있다;
(i) R1은 글루코실기, R2는 수소, R3은 글루코실기, R4는 수소인 경우
(ii) R1은 수소, R2는 글루코실기, R3은 수소, R4는 하이드록실기 인 경우
구체적으로, 본 발명은 상기 (i)의 조합에 해당하는 물질로서 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 제공하며, 이는 당업계에 비세닌-2(vicenin-2)으로 알려져 있다.
<화학식 2>
Figure 112015020034065-pat00004
또한 본 발명은 상기 (ii)의 조합에 해당하는 물질로서 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제공하며, 이는 당업계에 스콜리모사이드(scolymoside)로 알려져있다.
<화학식 3>
Figure 112015020034065-pat00005
상기 화학식 1로 표시되는 화합물(특히 비세닌-2 및 스콜리모사이드)의 항-패혈증 효과는 본 발명자에 의하여 처음으로 규명된 것으로서, 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나 있다.
본 발명의 실시예에서는, 패혈증의 주요 매개자인 HMGB1 및 이와 관련된 전염증성 시그날링 인자들에 대하여 비세닌-2 및 스콜리모사이드의 효과를 평가하였다. 비세닌-2 및 스콜리모사이드는 LPS- 또는 CLP(cecal ligation and puncture)-에의해 매개된 HMGB1의 분비, HMGB1 수용체(TLR-2, TLR-4 및 RAGE)의 발현 및 HMGB1에 의해 매개된 장벽 붕괴를 억제하였다. 또한 상기 화합물들은 CAM들의 발현을 저해하며, HMGB1에 의해 매개된 인간 호중구의 부착 및 이동(이주, migration)을 억제하였다. 게다가 HMGB1에 의해 유도되는 nuclear factor-κB (NF-κB) 및 extracellular regulated kinases 1/2(ERK1/2)의 활성화와 IL-6, tumor necrosis factor-α(TNF-α)의 생산을 억제하였다. 또한 상기 화합물들은 실제로 CLP-패혈증 동물모델에서 혈관 장벽의 보호효과를 나타내었으며, 사망률 및 폐 손상이 억제되며 현저한 치료효과를 나타내었다.
본 명세서 실시예의 in vitro 및 in vivo 실험을 통하여 보인 바와 같이, 비세닌-2 및 스콜리모사이드는 HMGB1에 의해 매개되는 염증성 반응들을 억제하며, 이러한 HMGB1 signaling pathway의 억제를 통해 패혈증 및 패혈성 쇼크를 치료하는 효과가 있다.
따라서 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 패혈증(sepsis) 또는 패혈성 쇼크(septic shock)는 HMGB1에 의해 (High mobility group box 1)에 의해 매개되는 것이 특징으로, 상기“패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료”란, 폐혈증에 연관된 임상 증상 및 다기관 기능부전 증후군에 연관된 상태(예를 들어 다양한 정도의 열, 저독소혈증, 사성, 빈맥, 내피염, 심근경색증, 고도착란, 변화성 정신 상태, 혈관 허탈 및 기관 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 응고장애, 심부전증, 신부전증, 쇼크 및(또는) 혼수상태 등)의 전부 또는 일부 증상을 감소, 개선 또는 제거하는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물(특히 비세닌-2 및 스콜리모사이드)은 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다. 예를들어, 본 발명의 비세닌-2 및 스콜리모사이드는 Cyclopia subternata Vogel(honeybush) 로부터 추출될 수 있다. 상기 화합물은 Cyclopia subternata 로부터 유기용매 추출 및 크로마토그래피 등의 당업계에서 통상적으로 사용되는 공지의 방법에 의해 추출될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 그 자체 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서 ‘약학적으로 허용되는’이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 부여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말하여, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한, 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 화학식 1의 화합물을 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 및 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
아울러, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 예방 또는 개선하기 위한 목적으로 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 및 개선효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만, 예를 들어 최종적으로 제조된 식품 중 0.001 내지 30 중량% 일 수 있다. 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 20 중량%일 수 있다.
또한, 본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물(특히 비세닌-2 및 스콜리모사이드)은 패혈증의 주요 매개인자인 HMGB1(High mobility group box 1)의 분비를 억제하고 상기 HMGB1과 관련된 전염증성 시그날링(proinflammatory signaling)을 억제하는 효과를 지니며, 실제로 in vivo 패혈증 동물 모델에서 패혈증의 치료효과가 현저하다.
도 1은 HUVEC 세포를 LPS(100 ng/mL)로 16시간동안 자극한 후, 표시된 각각의 농도로 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)를 6시간 처리하였을 때 HMGB1 분비량을 나타낸 것으로, 상기 HMGB1 분비량은 ELISA에 의해 측정되었다(D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미, LPS: lipopolysaccharide, *p < 0.05 versus LPS alone).
도 2는 CLP를 수행한 수컷 C57BL/6 마우스들(n=5)에 CLP로부터 12시간 후, 말초혈관에서 10 또는 20μM/mouse의 농도가 되로록 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)를 정맥투여하고, CLP로부터 24시간 후에 상기 마우스를 안락사시켜 혈장 속 HMGB1 level을 측정한 결과를 나타낸 것으로, 상기 HMGB1 분비량은 ELISA에 의해 측정되었다(D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미, *p < 0.05 versus CLP).
도 3은 Confluent HUVEC 세포에 HMGB1(1 ㎍/mL)을 16시간 처리하고 20μM의 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)와 6시간 배양하였을 때, TLR-2, TLR-4 및 RAGE의 HMGB1 receptor들 발현을 나타낸 것으로, 상기 HMGB1 receptor들의 발현은 cell-based ELISA에 의하여 측정되었다(D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미, *p < 0.05 versus HMGB1 alone).
도 4는 MTT assay 방법으로 세포 생존성(cell viability)에 대한 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)의 영향을 측정한 결과를 나타낸다(D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미).
도 5는 HUVEC 세포를 LPS (100 ng/mL, 4 h)로 자극시킨 후, 표시된 각각의 농도로 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)를 6시간 처리하였을 때 세포의 투과성을 평가한 결과를 나타내는 것으로, 상기 투과성은 HUVEC 단일층을 가로지른 Evans blue-결합된 알부민의 유출정도 측정에 의해 모니터링되었다(D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미, LPS: lipopolysaccharide, *p < 0.05 versus LPS).
도 6은 HUVEC 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL, 16 h)로 자극시킨 후, 표시된 각각의 농도로 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)를 6시간 처리하였을 때 세포의 투과성을 평가한 결과를 나타내는 것으로, 상기 투과성은 HUVEC 단일층을 가로지른 Evans blue-결합된 알부민의 유출정도 측정에 의해 모니터링되었다(D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미, *p < 0.05 versus HMGB1).
도 7은 HMGB1(2 ㎍/mouse, i.v.)으로 마우스에 혈관투과(vascular permeability)를 유도한 후, 말초혈관에서 10 또는 20μM/mouse의 농도가 되로록 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)를 주입하여 이의 효과를 확인한 결과를 나타내는 것으로서, 복강 세척액(peritoneal washes)에 포함된 Evans blue 염료의 양을 측정하여 투과성을 평가하였다(5마리의 마우스를 사용하였으며, 상기 투과된 염료의 양은 ㎍ /mouse로 표현된다. D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미, *p < 0.05 versus HMGB1 alone).
도 8은 HUVEC 세포를 HMGB1(1 ㎍/mL, 16 h)으로 활성화시키고 서로다른 농도의 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)를 6시간동안 처리한 후, HMGB1에 의해 매개된 phospho-p38 발현에 대한 상기 각 화합물의 영향을 ELISA로 측정한 결과이다(D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미, *p < 0.05 versus HMGB1 alone).
도 9는 HUVEC 세포를 HMGB1(1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 20μM의 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)를 6시간동안 처리한 후, HMGB1-매개 VCAM-1, ICAM-1 및 E-selectin의 발현 정도를 나타낸 것이다(D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미, *p < 0.05 versus HMGB1).
도 10은 HUVEC 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 다양한 농도의 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)로 6시간동안 처리한 후, HUVEC monolayer에 대한 인간 호중구의 부착정도를 나타낸 것이다(D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미, *p < 0.05 versus HMGB1).
도 11은 HUVEC 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 다양한 농도의 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)로 6시간동안 처리한 후, HUVEC monolayer를 통한 인간 호중구의 이동(migration)을 분석한 결과를 나타낸 것이다(D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미, *p < 0.05 versus HMGB1).
도 12는 C57BL/6 수컷 마우스를 HMGB1(2㎍ per mouse, i.v.)으로 자극하고, 말초혈관에서 10 또는 20μM/mouse의 농도가 되도록 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)를 주입하여, 상기 HMGB1에 의해 매개된 백혈구의 복막강으로의 이동(migration)을 분석한 결과를 나타낸다(D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미, *p < 0.05 versus HMGB1).
도 13은 HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 10 또는 20μM의 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)를 6시간동안 처리한 후, HMGB1-매개 TNF-α의 생성 정도를 분석한 결과를 나타낸다(D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미, *p < 0.05 versus HMGB1)
도 14는 HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 10 또는 20μM의 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)를 6시간동안 처리한 후, HMGB1-매개 IL-6의 생성 정도를 분석한 결과를 나타낸다(D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미, *p < 0.05 versus HMGB1)
도 15는 Confluent HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 10μM의 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)와 6시간동안 배양한 후, HMGB1-매개 phospho-NF-κB p65 활성화 정도 및 전체 NF-κB p65를 분석한 결과를 나타낸다(D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미, Active: phospho-NF-κB p65. Total: 전체 NF-κB p65, *p < 0.05 versus HMGB1)
도 16은 Confluent HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 20μM의 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)와 6시간동안 배양한 후, HMGB1-매개 phospho-NF-κB p65 활성화 정도 및 전체 NF-κB p65를 분석한 결과를 나타낸다(D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미, Active: phospho-NF-κB p65. Total: 전체 NF-κB p65, *p < 0.05 versus HMGB1)
도 17은 Confluent HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 10μM의 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)와 6시간동안 배양한 후, HMGB1-매개 phospho-ERK1/2 활성화 정도 및 전체 ERK1/2를 분석한 결과를 나타낸다(D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미, Active: phospho-ERK1/2, Total: 전체 ERK1/2, *p < 0.05 versus HMGB1)
도 18은 Confluent HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 20μM의 비세닌-2(VCN으로 표기) 또는 스콜리모사이드(SCL로 표기)와 6시간동안 배양한 후, HMGB1-매개 phospho-ERK1/2 활성화 정도 및 전체 ERK1/2를 분석한 결과를 나타낸다(D: PBS vehicle control, Comp:VCN 또는 SCL 처리를 의미, Active: phospho-ERK1/2, Total: 전체 ERK1/2 *p < 0.05 versus HMGB1)
도 19는 수컷 C57BL/6 마우스들(n=20)에 CLP 후 12시간째 및 50시간째에 VCN (23.8 μg/mouse, i.v. □) 또는 SCL(23.8 μg/mouse, i.v. ■)을 정맥투여하고, CLP 후 132시간까지 6시간마다 실험동물의 생존을 모니터링한 결과를 나타낸다. Control CLP mice(●로 표시) 및 sham-operated mice (○로 표시)들에는 살균한 식염수가 투여되었다. CLP군에 대비한(versus) 전체 생존률을 조사하기 위하여 Kaplan-Meier survival analysis 방법이 사용되었다.
도 20은 CLP 받은 수컷 C57BL/6 마우스(n=5)들에 CLP 후 12 및 50시간째에 23.8μg/mouse씩 VCN 또는 SCL을 각각 정맥투여하고, CLP 후 96시간째에 안락사시켜 관찰한 폐조직의 조직병리학적 스코어(Histopathological score)를 나타낸다.
도 21은 CLP 받은 수컷 C57BL/6 마우스(n=5)들에 CLP 후 12 및 50시간째에 23.8 μg/mouse(말초혈관에서 20μM/mouse의 농도가 되는 양)씩 VCN 또는 SCL을 각각 정맥투여하고, CLP 후 96시간째에 안락사시켜 수득한 폐조직을 H&E staining한 현미경사진(200x)이다; Sham group (grade 1); CLP group (grade 4); CLP + VCN group(grade 2); CLP + SCL group(grade 2). 이미지들은 세 번의 독립적 실험을 대표하는 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험준비>
1.시약
비세닌-2(vicenin-2, VCN) 및 스콜리모사이드(scolymoside, SCL), 박테리아 리포폴리사카라이드(LPS, serotype: 0111:B4, L5293, 100 ng/mL로 사용), 에반스 블루(Evans blue) 및 크리스탈 바이올렛(crystal violet)은 Sigma(St. Louis, MO, USA)로부터 수득하였다. Vybrant DiD(5μM로 사용)는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)으로부터 수득하였다. 인간 재조합 HMGB1(Human recombinant high mobility group box 1 protein)은 Abnova (Taipei City, Taiwan)로부터 구입하였다.
2. 실험동물 및 사육
몸무게가 18-20g인 6 내지 7주령 C57BL/6 수컷 마우스들을 Orient Bio Co. (Sungnam, KyungKiDo, Republic of Korea)로부터 구입하였고, 12일의 적응기간(acclimatization period) 후에 본 연구에 이용하였다. 실험동물들은 polycarbonate cage 당 5마리씩, 20-25℃의 온도, 40%-45%의 습도 및 12시간 주기의 낮/밤 순환 조건에서 사육되었다. 상기 적응기간 동안, 실험동물들은 일반 설치류 펠렛 사료(rodent pellet diet) 및 물을 자유식이(ad libitum)하였다. 모든 동물들은 Kyungpook National University에 의해 발행된‘Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals’에 따라 처리되었다(IRB No. KNU2012-13).
3. CLP(Cecal ligation and puncture)
패혈증을 유발하기 위하여, 수컷 마우스들은 small rodent gas anesthesia machine(RC2, Vetequip, Pleasanton, CA)을 통하여 주입된 2% isoflurane(Forane, JW Pharmaceutical, South Korea)이 포함된 산소로 마취되었고, 최초에는 breathing chamber에서 마취하고 그 후에는 facemask를 사용하여 실험과정동안 자연스럽게 호흡할 수 있도록 하였다. CLP-유도 패혈증 모델은 Bae JS et al., 2014 의 연구에서 묘사된 바와 같이 수행되었다. 간략하게, 2cm의 정중절개(midline incision)를 수행하여 맹장 및 인접한 소장을 노출시켰다. 그 후 맹장 끝부분(cecal tip)으로부터 5.0mm 떨어진 부분을 3.0-비단봉합사(silk suture)로 단단히 묶고, 높은 수준의 패혈증을 유발하기 위하여 22-게이지의 바늘로 맹장에 1회 구멍을 냈다. 그 후, 상기 구멍 부위로부터 배설물을 압출시키기 위하여 맹장을 부드럽게 짜내었고(squeezed), 상기 맹장을 다시 복막강(peritoneal cavity)으로 복귀시켰다. 마지막으로 개복 부위(laparotomy site)를 4.0-silk로 봉합하였다. sham control 군의 실험동물은 맹장을 노출시킨 후 봉합(ligation) 또는 구멍을 내는 과정 없이 복강으로 복귀시켰다. 상기 실험 프로토콜은 실험 전, the Animal Care Committee at Kyungpook National University(IRB No. KNU 2012-13)에의해 승인 받았다.
4. 세포배양
인간 탯줄 정맥 내피세포(Primary human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)는 Cambrex Bio Science(Charles City, IA, USA)로부터 수득하였고, Bae et al., 2014의 연구에서 묘사된 바와 같이 유지되었다(maintained). 간략하게, growth supplements(Cambrex Bio Science)가 첨가된 EBM-2 basal media 용액에서 37℃, 5% CO2 조건으로, 세포들이 포화(confluency)되도록 배양하였다. 모든 실험은 3-5계대(passage) 배양된 HUVEC 세포를 사용하여 수행되었다. 인간 호중구(neutrophil)는 다섯명의 건강한 지원자로부터 정맥천자(venipuncture)에 의해 수득된 15 mL의 전혈(whole blood)로부터 분리되었고, Hofbauer R et al., 1998의 연구에서 묘사된 바와 같이 유지되었다.
5. HMGB1 측정을 위한 경쟁적 ELISA(Competitive enzyme-linked immunosorbent assay)
경쟁적 ELISA 방법을 이용하여 HMGB1의 농도를 조사하였다. 구체적으로 in vitro 실험에서 HUVEC 단일층(HUVEC monolayer)은 LPS(100 ng/mL)로 16시간 동안 처리되었으며, 그 후 0 내지 20μM의 각 평가대상 화합물(비세닌-2 또는 스콜리모사이드)로 6시간동안 처리되었다. 그 다음에, HMGB1의 농도를 조사하기 위하여 세포배양액을 수집하였다. ELISA를 수행하기 위하여, 96-well flat plastic microtiter plates(Corning Inc., Corning, NY)를 HMGB1 단백질과 함께 4℃에서 오버나잇(overnight)하여 코팅하였으며, 이때 0.02% sodium azide가 포함된 20mM carbonate-bicarbonate buffer(pH 9.6)를 사용하였다. 상기 plate를 0.05% Tween 20이 포함된 PBS 용액(PBS-T)으로 3회 세척한 뒤, 4℃에서 보관하였다. 상기 수집된 세포배양액은 동결건조(Lyophilization)시킨 후, 이를 anti-HMGB1 antibody(PBS-T에 1:1000로 희석됨, Abnova, Taipei City, Taiwan)와 함께 96-well plastic round microtiter plate에서 37℃, 90분 동안 사전-배양(pre-incubate)하였고, 이를 상기 HMGB1으로 코팅된 플레이트에 옮긴 후, 30분동안 실온에서 배양하였다. 그리고나서 상기 플레이트를 PBS-T 용액으로 3회 세척하고, peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG antibody(PBS-T에 1:2000로 희석됨, Amersham Pharmacia Biotech)와 함께 실온에서 90분동안 배양하였으며, 다시 PBS-T 용액으로 3회 세척하고, 200㎕의 기질용액(100μg/mL o-phenylenediamine 및 0.003% H2O2)을 첨가하여 암실에서 상온으로 60분 동안 배양하였다. 8N H2SO4를 50㎕ 처리하여 반응을 종료시킨 후, 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
in vivo 실험에서는 CLP를 수행한 수컷 C57BL/6 마우스들(n=5)에 CLP로부터 12시간 후, 말초혈관에서 10 또는 20μM/mouse의 농도가 되로록 비세닌-2 또는 스콜리모사이드를 정맥투여하고, CLP로부터 24시간 후에 상기 마우스를 안락사시키고 수득한 혈액을 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 여기에 전술한 바와 같은 경쟁적 ELISA를 수행하여 마우스 혈장 속에 포함된 HMGB1 농도를 조사하였다.
6. 세포 생존 에세이(Cell viability assay)
세포 생존의 지표로서 MTT assay 방법을 이용하였다. 세포들은 96-well plates에서 5 × 103 cells/well의 밀도로 배양되었다. 24시간 후에, 세포들을 새 배지(fresh medium)로 세척하였으며, 0 내지 50μM의 각 평가대상 화합물(비세닌-2 또는 스콜리모사이드)을 처리하였다. 48시간의 배양 후에, 세포들을 세척하고 100㎕의 MTT(1mg/mL)를 첨가하여 4시간 배양하였다. 마지막으로 DMSO(dimethyl sulfoxide) 150㎕를 첨가하여 생성된 formazan salt를 용해시키고, formazan salt의 양을 microplate reader(Tecan Austria GmbH, Austria)를 사용하여 540nm에서 OD(optical density)를 측정함으로서 조사하였다.
7. CAM들의 발현 및 HMGB1 수용체 발현 측정
전세포 ELISA(whole cell ELISA)방법에 의하여, HUVEC 세포에서의 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1), ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1) 및 E-selectin 발현을 조사하였다. 간략하게, HUVEC 세포의 융합된 단층(confluent monolayer)에 HMGB1(1 ㎍/mL)을 16시간 처리하고, 그 후 각 평가대상 화합물(비세닌-2 또는 스콜리모사이드) 20μM 을 6시간 처리하였다. 배지를 제거하고, 세포들은 PBS로 세척하였으며, 1% paraformaldehyde용액 50㎕를 상온에서 15분동안 처리하여 세포를 고정하였다. 세척 후, 100㎕의 mouse anti-human monoclonal antibody (VCAM-1, ICAM-1 및 E-selectin 각각에 대한 항체를 의미, 각각 PBS-T에 1:50으로 희석됨, Chemicon, Temecula, CA)를 첨가하고, 37°C, 5% CO2 조건에서 1시간동안 배양하였다. 상기 배양된 세포들을 3회 세척한 후, 1:2000으로 희석된 peroxidase-conjugated anti-mouse IgG antibody(Sigma) 100㎕를 1시간동안 처리하였다. 그 후 세포를 3회 세척하고, o-phenylenediamine substrate(Sigma)를 이용하여 디벨로핑(developing)하였다. 비색분석(Colorimetric analysis)는 490nm에서 흡광도를 측정하는 것에 의하여 수행되었다. 모든 측정은 3배수의 웰(triplicate well)에서 수행되었다.
상기와 같은 실험과정이 TLR2, TLR4 및 RAGE와 같은 HMGB1 리셉터들의 세포표면 발현을 모니터링하기 위해 이용되었으며, 이때 Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA)로부터 수득한 상기 리셉터별 특수항체(각각 A-9, H-80 및 A-9)들을 사용하였다.
8. in vitro 투과성 에세이 (Permeability assay)
Qureshi et al., 2008의 연구에서 기술된 바와 같은 modified 2-compartment chamber model을 이용하여, 기능적 HUVEC 세포 단일층(functional HUVEC monolayer)을 가로지른 Evans blue-결합된 알부민의 유출(flux)을 분광광도 측정(spectrophotometric measurement)하는 방법에 의해 투과성을 정량하였다. 간략하게, HUVEC 세포들은 3μm pore size, 12mm 직경의 transwell 에 5 X104/well 로 분주되었고, 3일 동안 배양되었다. 이렇게 생성된 HUVEC 융합 단층(Confluent monolayers)에 LPS (100 ng/mL, 4h) 또는 HMGB1(1㎍/mL, 16h)을 처리하고, 그리고나서 0 내지 20μM의 각 평가대상 화합물(비세닌-2 또는 스콜리모사이드)을 6시간동안 처리하였다.
9. In vitro 이동성 에세이(migration assay)
세포 이동성 에세이는 8μm pore size filter를 포함하는 6.5mm직경의 transwell plate에서 수행되었다. HUVEC 세포(6 X 104)들을 3일동안 배양하여, 융합된 내피세포 단일층을 수득하였다. 상기 세포 단층을 HMGB1(1㎍/mL)으로 16시간 처리하고 0 내지 20μM의 각 평가대상 화합물(비세닌-2 또는 스콜리모사이드)을 6시간동안 처리한 후, transwell plate의 상부(upper compartment)에 인간 호중구를 첨가하였다. 그 후 상기 Transwell plate 는 37℃, 5% CO2 조건에서 2시간동안 배양되었다. 그 후 upper chamber의 세포들은 흡인되었으며(aspirated), 필터의 윗부분에 위치한 비이동성 세포들은 면봉을 이용하여 제거되었다. 필터의 아랫부분에 위치한 인간 호중구 세포들은 8% glutaraldehyde로 고정된 후, 0.25% crystal violet을 포함하는 20% methanol(w/v)을 첨가하여 염색되었다. 각각의 실험은 2배수 웰(duplicate well)에서 반복되었으며, 무작위로 선택된 9개의 high power microscopic field(HPF; 200× )들에서 이동성 세포의 개수가 카운팅(counting)되었다. 이러한 결과는 이동 지표(migration index)로서 나타내어진다.
10. In vivo 투과성 및 백혈구 이동성 에세이
in vivo 실험을 위하여, 수컷 마우스들은 small rodent gas anesthesia machine(RC2, Vetequip, Pleasanton, CA)을 통하여 주입된 2% isoflurane(Forane, JW Pharmaceutical, South Korea)이 포함된 산소로 마취되었고, 최초에는 breathing chamber에서 마취하고 그 후에는 facemask를 사용하여 실험과정동안 자연스럽게 호흡할 수 있도록 하였다. 마우스들에 HMGB1(2㎍/mouse)을 정맥주사(i.v.)하여 16시간동안 전처리하고, 11.9㎍/mouse 또는 23.8 ㎍/mouse씩 각 평가대상 화합물(비세닌-2 또는 스콜리모사이드)을 6시간동안 처리하였다.
in vivo 투과성 에세이를 위하여, 1% Evans blue dye solution(in normal saline)을 각 마우스에 정맥주사하였다. 30분 후에, 각 마우스들을 희생시켰으며, 5mL의 일반 식염수로 복막강을 세척하여 복막삼출물(peritoneal exudate)들을 수집하고 10분동안 200Xg으로 원심분리하였다. 상등액의 흡광도는 650nm에서 측정되었다. Bae JS et al., 2012의 연구에서 기술된 바와 같이, 혈관 투과성은 Evans blue dye의 표준 곡선을 이용하여 측정된 복막강(peritoneal cavity)으로 누설(leak)된 염료의 양(μg of dye/mouse)으로서 나타내었다.
백혈구 이동을 평가하기 위하여, 상기와 같이 각 평가대상 화합물을 처리하고 6시간 후에 마우스들을 희생하였고, 복막강을 5 mL의 일반 식염수로 세척하였다. 20㎕의 상기 복막액(peritoneal fluid) 샘플을 0.38 mL Turk’s solution(0.01% crystal violet in 3% acetic acid)과 혼합하고, 광학현미경을 이용하여 백혈구의 수를 카운팅(counting)하였다.
11. 세포-세포 부착 어세이(Cell-Cell adhesion assay)
내피세포에 대한 인간 호중구의 부착정도는, Bae and Bae, 2011의 연구에서 묘사된 바와 같이 호중구의 형광표지방법에 의해 평가되었다. 간략하게, 정제된 인간 호중구(1.5 × 106/mL, 200㎕/well)세포들을 Vybrant DiD dye로 표지하고, 세척 및 자극된 HUVEC 세포들에 상기 호중구 세포들을 첨가하였다. 상기 자극된 HUVEC 세포는, HUVEC 세포 단층을 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 처리하고, 6시간동안 0 내지 20μM의 각 평가대상 화합물(비세닌-2 또는 스콜리모사이드)을 처리한 것이다.
12. 인산화된 p38 MAPK, NF-κB, TNF-α, ERK 1/2 및 IL-6의 측정을 위한 ELISA
인산화된 p38 MAPK(phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase)의 발현은 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)사의 상용화 ELISA kit를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 정량하였다. 핵 용해물(nuclear lysates)에서 전체(total) 및 인산화된 p65 NF-κB의 활성은 Cell Signaling Technology(Danvers, MA)사로 부터의 ELISA kit(Catalog NO. #7174, #7173)를, 전체(total) 및 인산화된 ERK 1/2(extracellular regulated kinase 1/2)의 활성은 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)사의 ELISA kit를 사용하여 조사하였다. 세포 배양액의 상층액에서 IL-6 및 TNF-α의 농도는 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)의 ELISA kit를 이용하여 조사하였다. ELISA plate reader (Tecan, Austria GmbH, Austria)를 이용하여 값을 측정하였다.
13. 헤마톡실린 & 에오신 염색 및 병리조직학적 시험
5 마리의 수컷 C57BL/6 마우스들에 CLP 를 수행하고 각각 12시간 및 50시간 후에, 23.8 ㎍/mouse씩 각각 비세닌-2 또는 스콜리모사이드를 정맥주사하였다. 마우스들은 CLP 후 96시간째에 안락사되었다. 상기 마우스들에서 폐조직의 표현형 변화를 분석하기 위하여 각 마우스로부터 폐 샘플들을 적출하였고, 잔류 혈액을 제거하기 위하여 PBS(pH 7.4)로 3회 세척한 후 4% formaldehyde solution(in PBS (pH 7.4), Junsei, Tokyo, Japan)으로 4℃에서 20시간동안 고정하였다. 상기 고정 후, 각 샘플들은 일련의 증가되는 농도의 에탄올 수용액(ethanol series)으로 탈수되었고, 파라핀 포매된 후, 4μm두께로 절편화하여 슬라이드(slide)에 올려놓았다. 상기 슬라이드들은 60℃ 오븐에서 탈파라핀화(deparaffinize)되었고, 재수화(rehydrate)된 후, hematoxylin(Sigma)으로 염색되었다. 과도한 염색을 제거하기 위하여 각 슬라이드들을 0.3% acid alcohol에 3회 급속침지(quick-dip)시켰으며, eosin(Sigma)으로 대비염색하였다. 그리고나서 일련의 증가되는 농도의 에탄올 수용액(ethanol series) 및 자일렌(xylene)을 이용하여 과도한 염색을 제거하고, 커버슬립(coverslip)을 덮었다. 폐 조직구조(pulmonary architecture), 조직 부종(tissue edema) 및 염증성 세포의 침윤(infiltration of inflammatory cell)을 평가하기 위한 폐 표본에 대한 광학현미경분석은, Ozdulger A et al., 2003에 기술된 바와 같이 블라인드 관찰자(blinded observation)에 의해 수행되었다. 상기 관찰 결과는 하기의 4등급으로 분류되었다: 등급 1(grade 1)은 정상 조직병리(normal histopathology)를 나타내고, 등급 2(grade 2)는 소량의 호중구 백혈구 침윤을 나타내며, 등급 3(grade 3)은 중간정도의 호중구 백혈구 침윤, 혈관주위 부종(perivascular edema) 형성 및 폐 조직구조의 부분적 파괴를 나타내고, 등급 4(grade 4)는 밀도 높은 호중구 백혈구 침윤, 농양(abscess) 형성 및 완전한 폐 조직구조 파괴를 포함하는 의미이다.
14. 통계적 분석
각 실험은 적어도 3회씩 독립적으로 반복수행되었다. 값(Values)들은 평균± 평균의 표준오차(mean± standard error of the mean(SEM))로 나타내었다. 테스트 그룹간 통계적 유의성의 차이는 one-way analysis of variance (ANOVA) 및 Tukey’s post-hoc test에 의하여 평가되었다. 전체 생존률(overall survival rate)의 평가를 위하여, Kaplan-Meier survival analysis가 수행되었다. SPSS for Windows, version 16.0(SPSS, Chicago, IL)을 이용하여 통계적 분석이 수행되었으며, 0.05 미만의 P-값(p values < 0.05)은 통계적으로 유의미한 것으로 생각되었다.
<실시예 1>
LPS- 또는 CLP-매개(mediated) HMGB1 분비에 있어서, 비세닌-2 또는 스콜리모사이드의 영향
이전의 연구들은 쥐 대식세포 및 인간 내피세포에서 LPS가 HMGB1의 분비를 자극함을 밝혔고, Chen et al. 은 100ng/mL LPS가 HMGB1의 분비를 유도하기에 충분한 것으로 보고하였다(Chen et al., 2004). 이와 유사하게, 본 연구에서도 100 ng/mL의 LPS는 HUVEC 세포로부터 HMGB1의 분비를 자극하였다(도 1 참조). LPS-매개 HMGB1 분비에 대한 비세닌-2 또는 스콜리모사이드의 영향을 조사하기위하여, HUVEC 세포들을 100ng/mL LPS로 16시간동안 처리하여 자극하고, 0 내지 20μM 농도의 비세닌-2 또는 스콜리모사이드를 6시간동안 처리하였다. 도 1에서 보는 바와 같이, 비세닌-2와 스콜리모사이드는 HUVEC 세포에서 HMGB1의 분비를 억제하였고, 이러한 효과는 2μM 이상의 농도에서 유효하게 나타났다. 이때, LPS의 전처리 없이 수행된 비세닌-2 또는 스콜리모사이드의 단독처리는 HMGB1의 분비에 영향을 주지 않았다(도 1 참조).
in vivo상에서 상기 효과를 확인하기 위하여, CLP에 의해 패혈증을 유발시킨 마우스모델을 사용하였는데, 상기 마우스 CLP 모델은 인간 패혈증과 매우 유사한 것으로 알려져있다(Buras et al., 2005). 도 2에서 보는 바와 같이, 비세닌-2 또는 스콜리모사이드의 처리는 마우스에서 CLP에 의해 유도된 HMGB1 분비를 현저히 억제하였다. 이때, 실험에 사용된 마우스들의 평균 몸무게가 20g, 평균 혈액량(blood volume)이 2 mL인 것을 고려하여, 말초혈액에서 10μM 또는 20μM 농도가 되도록 상응하는 양(11.9 또는 23.8 μg per mouse)의 비세닌-2 또는 스콜리모사이드가 투여되었다.
다음으로 HUVEC에서 HMGB1 receptor들(구체적으로 TLR2, TLR4 및 RAGE) 발현에 대한 비세닌-2 또는 스콜리모사이드의 영향을 조사하였다. 도 3에서 보는 바와 같이, HMGB1(1㎍/mL, 16h)의 처리는 HUVEC에서 TLR2(white bar), TLR4(gray bar) 및 RAGE(black bar)의 발현을 4배 이상 증가시켰다. 여기에 비세닌-2 또는 스콜리모사이드의 처리는 TLR2, TLR4 및 RAGE의 발현을 현저하게 억제하였다.
비세닌-2 또는 스콜리모사이드의 세포독성을 평가하기 위하여, 비세닌-2 또는 스콜리모사이드가 48시간 처리된 HUVEC 세포에서 세포 생존 에세이(Cell viability assay)가 수행되었다. 도 4에서 보는 바와 같이, 비세닌-2 또는 스콜리모사이드는 50μM의 농도까지, 세포 생존성에 영향을 주지 않았다. 염증성 질환의 환자에서 HMGB1의 높은 혈장 농도는 나쁜 예후 및 높은 사망률과 관계된 것으로 알려져있다. 게다가 HMGB1의 약학적 억제는 엔도톡신(endotoxin challenge)에 대한 반응으로 유발된 급성 염증 동물모델에서 생존을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 그러므로 비세닌-2 또는 스콜리모사이드에 의하여 CLP-에 의해 유도된 HMGB1의 분비가 억제되는 것은, 비세닌-2 또는 스콜리모사이드가 패혈증의 치료에 사용될 수 있음을 시사한다.
<실시예 2>
HMGB1-매개 혈관 장벽(vascular barrier) 붕괴에 있어서, 비세닌-2 또는 스콜리모사이드의 효과
HUVEC세포의 장벽 온전성(barrier integrity, 장벽 통합성)에 대한 비세닌-2 또는 스콜리모사이드의 효과를 조사하기 위하여 투과 에세이(permeability assay)가 수행되었다. 20μM의 비세닌-2 또는 스콜리모사이드 단독처리는 장벽 온전성(barrier integrity)을 변화시키지 않았다(도 5 참조). 대조적으로, LPS 및 HMGB1은 내피세포 장벽 온전성(endothelial barrier integrity)의 분열 및 붕괴를 야기하는 것으로 알려져 있으며, 본 실험에서도 확인되었다(도 5 및 도6 참조).
HUVEC 세포들은 LPS(100 ng/mL, 4h) 또는 HMGB1 (1μg/mL, 16h)의 첨가 후에, 다양한 농도(0 내지 20μM)의 각 평가대상 화합물(비세닌-2 또는 스콜리모사이드)로 6시간동안 처리되었다. 도 5 및 도6에서 보는 바와 같이, 비세닌-2 및 스콜리모사이드의 처리는 LPS- 또는 HMGB1-에 의해 매개된 장벽 온전성(barrier integrity)의 붕괴를 농도 의존적으로 억제하였다.
상기와 같은 혈관장벽 보호효과를 in vivo상에서 확인하기 위하여, 마우스에서 HMGB1에 의해 매개된 혈관 투과성(vascular permeability)을 평가하였다. 도 7에서 보는 바와 같이, 비세닌-2 또는 스콜리모사이드의 처리는 HMGB1에 의해 유도되는 evans blue 염료의 복막 누설(peritoneal leakage)을 현저하게 억제하는 결과를 나타내었다.
HMGB1은 p38 MAPK의 인산화를 촉진하는 것에 의해 전염증성(pro-inflammatory) 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. HUVEC세포에서 HMGB1에 의해 유도된 p38 MAPK의 활성화를 비세닌-2 또는 스콜리모사이드가 억제하는지를 알아보기 위하여, 상기 세포들은 HMGB1으로 활성화된 후 비세닌-2 또는 스콜리모사이드와 6시간동안 배양되었다. 그 후에 상기 세포에서 인산화된 p38 MAPK의 수준(level)을 산정하였다.도 8에서 보는 바와 같이, HMGB1은 인산화된 p38의 발현을 증가시켰으며, 이는 비세닌-2 또는 스콜리모사이드의 처리에 의하여 현저히 억제되었다. 이러한 결과는 비세닌-2 또는 스콜리모사이드가 HMGB1-매개 내피붕괴(endothelial disruption, 내피분열)를 억제하고, 인간 내피세포의 장벽 온전성(barrier integrity)을 유지한다는 것을 입증한다.
<실시예 3>
HMGB1-매개 CAM(cell-adhesion molecule)들의 발현, 인간 호중구 부착 및 이동에 대한, 비세닌-2 또는 스콜리모사이드의 효과
이전의 연구들은 HMGB1이 내피세포의 표면에 ICAM-1, VCAM-1 및 E-selectin과 같은 CAM들의 발현을 증가시킴으로서 염증성 반응을 매개하고, 그 때문에 내피(endothelium)를 가로질러 염증 부위에 백혈구의 이동 및 부착을 촉진한다고 보고하였다. 본 연구에 따르면, HMGB1은 VCAM-1, ICAM-1 및 E-selectin의 표면 발현 증가를 유도하며(도 9 참조), 비세닌-2 및 스콜리모사이드는 상기 CAM들의 발현을 억제하는데, 이는 CAM들의 발현에 대한 비세닌-2 및 스콜리모사이드의 억제효과가 상기 화합물들에 의해 HMGB1 signaling pathway의 약화를 통하여 매개된다는 것을 제시한다. 본 실험에서 각 평가대상 화합물의 최적농도는 20μM이었다(데이터 미도시).
게다가, 증가된 CAM들의 발현은 HMGB1에 의해 활성화된 내피세포에 대한 인간 호중구의 증가된 결합 및 이에 이어서 발생되는 호중구 이동(migration)과 부합된다. 비세닌-2 또는 스콜리모사이드의 처리는 인간 호중구의 부착 및 차후 활성화된 내피세포를 가로지르는 이동(migration)을 농도 의존적으로 감소시키는 결과를 보였다(도10 및 도 11 참조). 이러한 결과는 비세닌-2 및 스콜리모사이드가 단지 내피세포에서 내독소-매개(endotoxin-mediated) HMGB1의 분비를 억제하는 것 뿐만 아니라, HMGB1의 분비에 의해 야기된 전염증성 시그날링 효과(proinflammatory signaling effect)를 억제하며, 그 때문에 핵 사이토카인(nuclear cytokine)들에 의한 염증성 경로(inflammatory pathway)의 증폭과정을 억제한다는 것을 제시한다.
이러한 효과를 in vivo 상에서 확인하기 위하여, 마우스에서 HMGB1-에 의해 유도된 백혈구 이동을 조사하였다. HMGB1은 마우스의 복막강(peritoneal cavity)으로 백혈구의 이동을 촉진하였고, 비세닌-2 또는 스콜리모사이드의 처리는 이러한 이동을 현저히 억제하였다(도 12참조).
백혈구 및 내피세포 사이의 상호작용 조절에 대한 연구를 위해, in vitro상에서 CAM들에 대한 실험이 널리 수행된다. 본 연구에서 비세닌-2 및 스콜리모사이드는 HMGB1에의해 유도되는 VCAM-1, ICAM-1, 및 E-selectin 수준(level)을 감소하는 결과를 나타냈으며, 이는 활성화된 내피에 백혈구가 부착 및 이동하는 것을 비세닌-2 및 스콜리모사이드가 억제 한다는 것을 제시한다.
<실시예 4>
HMGB1에 의해 자극된 TNF-α/IL-6의 생성 및 NF-κB/ERK의 활성화에 대한, 비세닌-2 및 스콜리모사이드의 효과
전염증성 사이토카인들(TNF-α, IL-1α 및 IL-1β, IL-12, 및 IL-6)은 감염에 대항하여 효과적인 염증 프로세스를 촉발하는데 있어 필요하지만, 이들의 과잉 생성은 여러 장기의 기능부전(multiple organsystem dysfunction) 및 사망률과 관계되어있다. 그러므로 우리는 HMGB1에 의해 매개된 전염증성 사이토카인의 생성에 대한 비세닌-2 및 스콜리모사이드의 영향을 조사하였다. 본 실험결과에 따르면, HMGB1으로 자극된 내피세포에서 IL-1α및 IL-1β(데이터 미도시), TNF-α(도 13참조), 및 IL-6(도 14참조)의 수준이 증가되었으나, 이러한 증가 현상은 비세닌-2 또는 스콜리모사이드의 처리에 의하여 현저히 감소되었으며(도 13 및 도 14참조), 이는 비세닌-2 및 스콜리모사이드가 인간 내피세포에서 전염증성 반응의 유도와 관계된 가장 중요한 신호(시그널, signal)을 조절한다는 사실을 나타낸다.
게다가, NF-κB 및 ERK1/2의 활성화는 전염증성 반응의 촉발을 위해 필요하다. HMGB1은 혈관 염증성 반응에 있어서 NF-κB 및 ERK 1/2를 활성화하는 것으로 알려져있다. 그러므로 우리는 HMGB1에 의한 NF-κB 및 ERK 1/2의 활성화에 대하여 비세닌-2 및 스콜리모사이드의 영향을 평가하였다. 도 15 내지 도 18에서 보는 바와 같이, HMGB1의 처리는 NF-κB 및 ERK 1/2의 활성화를 증가시켰고, 이러한 증가는 비세닌-2 또는 스콜리모사이드의 처리에 의하여 현저하게 감소되는 결과를 나타냈다. 염증성 반응은 혈관 손상의 발병에 있어서 중요한 요소이고, 내피 기능이상(endothelial dysfunction)은 혈관의 염증성 병변 생성 동안에 백혈구의 소집(recruitment)과 특히 관련되어있다. TNF-α(Tumor necrosis factor-α) 및 NF-κB(nuclear factor-κB)는 혈관 염증성 프로세스에 관련된 중요한 매개자(mediator)들이다. NF-κB는 잘 알려진 전-염증성 전사 인자(transcriptional factor)이다. NF-κB의 활성화는 TNF-α 및 IL-1β와 같은 전-염증성 사이토카인들에 대한 반응으로서 발생된다. NF-κB 시그날링 경로의 억제가 상당한 혈관 보호 효과에 기여하며, 이는 질환 동물 모델에서 혈관 질환이 진행되는 것을 막거나 지연시킨다는 것을 제시하는 상당한 증거들이 존재한다. 그러므로, 혈관 내피세포에서 TNF-α의 생성 및 NF-κB 활성화를 막는 것은 혈관염증질환의 치료를 위한 유망한 치료적 타겟으로 고려되고 있으며, 비세닌-2 및 스콜리모사이드는 염증 매개자 생산 및 NF-κB 경로를 억제하는 것을 통하여 항염증 효과를 나타낸다.
<실시예 5>
CLP-유도 패혈증 사망률에 있어서, 비세닌-2 및 스콜리모사이드의 보호 효과
패혈증은 심각한 감염에 대한 전신성 반응(systemic response)으로서, 장기 기능부전(organ dysfunction), 저혈류(hypoperfusion) 또는 저혈압(hypotension)과 관련되어있을 때 나쁜 예후를 보인다(Bae, 2012). 전술한 실험결과들에 기초하여, CLP-유도 패혈증 마우스 모델에서 비세닌-2 또는 스콜리모사이드의 처리가 사망률(mortality)을 감소시킬수 있을 것이라는 가정을 하였다. 비세닌-2 또는 스콜리모사이드가 CLP-유도 패혈증 치사(lethality)로부터 마우스를 보호할 수 있을지 조사하기 위하여, 20 마리의 마우스들을 대상으로 CLP 수술 후, 비세닌-2 또는 스콜리모사이드를 주입하였다. CLP 수술 24시간 후에, 실험동물들은 떨림(shivering), 거친 털(bristled hair) 및 쇄약(weakness)과 같은 패혈증 증상을 나타냈다. CLP 후 12시간째에 비세닌-2 또는 스콜리모사이드(23.8 μg/mouse)를 1회 투여하는 것은 CLP에 의한 죽음을 막지 못하였다(데이터 미도시). 그러므로, 2회 걸쳐 상기 화합물들을 투여하였으며(1차 투여는 CLP 후 12시간째에, 2차 투여는 CLP 후 50시간째에), Kaplan-Meier 생존 분석 결과 상기 2회 처리로 인하여 40 내지 50%로 생존률이 증가되었다(p < 0.0001, 도 19참조). 이러한 결과는, HMGB1의 분비와 HMGB1-매개 염증 반응의 저해는 패혈증 및 패혈성 쇼크의 관리를 위한 치료적 전략임을 제시한다.
<실시예 6>
CLP-유도 폐 손상에 대한, 비세닌-2 및 스콜리모사이드의 보효 효과
CLP-유도성 죽음에 대한 비세닌-2 및 스콜리모사이드의 보호효과를 확인하기 위하여, CLP-유도 폐 손상에 대한 상기 각 화합물의 효과를 조사하였다. CLP 받은 수컷 C57BL/6 마우스(n=5)들에 대하여 CLP 후 12시간 및 50시간째에 23.8 ㎍/mouse씩 각각 비세닌-2 또는 스콜리모사이드를 정맥투여하고, CLP 후 96시간째에 안락사시켜 폐조직을 관찰하였다. 광학현미경을 통한 관찰에서 sham 및 ‘sham + 각 화합물 처리군(비세닌-2 또는 스콜리모사이드 처리군)’의 폐 사이에는 유의적인 차이가 없었다(데이터 미도시). CLP 군에서, 간질조직(interstitium) 및 허파꽈리(alveolar spaces)로 염증성 세포들의 광범위한 침윤(massive infiltration)과 함께 간질성 부종(interstitial edema)이 관찰되었으며, 폐 구조가 심각하게 손상되었다(도 20 및 도 21 참조). ‘CLP + 각 화합물 처리군(비세닌-2 또는 스콜리모사이드 처리군)’에서는 상기 CLP군과 비교하여 형태학적인 변화가 적게 나타났으며 폐구조가 보존되었고, 폐손상 스코어(lung injury score)가 감소되었다(도 20 및 도 21 참조). 대조군 및 실험군에서의 폐손상 스코어는 구체적으로, Sham 군에서는 grade 1, CLP 군에서는 grade 4, CLP + 비세닌-2 처리군은 grade 2, CLP+ 스콜리모사이드 처리군은 grade 2로 평가되었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비세닌-2(vicenin-2) 또는 스콜리모사이드(scolymoside)를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방, 개선 또는 치료용 (약학적 또는 식품)조성물에 관한 것이다.
본 발명의 화합물(특히 비세닌-2 및 스콜리모사이드)은 패혈증의 주요 매개인자인 HMGB1(High mobility group box 1)의 분비를 억제하고 상기 HMGB1과 관련된 전염증성 시그날링(proinflammatory signaling)을 억제하는 효과를 지니며, 실제로 in vivo 패혈증 동물 모델에서 패혈증의 치료효과가 현저하므로 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (4)

  1. 하기 화학식 2로 표시되는 비세닌-2(vicenin-2) 또는 하기 화학식 3으로 표시되는 스콜리모사이드(scolymoside) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

    <화학식 2>
    Figure 112016079263873-pat00031


    <화학식 3>
    Figure 112016079263873-pat00032


  2. 하기 화학식 2로 표시되는 비세닌-2(vicenin-2) 또는 하기 화학식 3으로 표시되는 스콜리모사이드(scolymoside) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 개선용 식품 조성물.

    <화학식 2>
    Figure 112016079263873-pat00033


    <화학식 3>
    Figure 112016079263873-pat00034

  3. 삭제
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 패혈증 또는 패혈성 쇼크는 HMGB1(High mobility group box 1)에 의해 매개되는 패혈증 또는 패혈성 쇼크인 것을 특징으로 하는 조성물.
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Inflammation. 2014. Vol.37, No.5, pp.1705-1717.*
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