KR101616367B1 - 메틸티오우라실을 유효성분으로 포함하는 패혈증 및 패혈증성 쇼크 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 메틸티오우라실을 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 메틸티오우라실을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 화합물은 패혈증의 주요 매개인자인 HMGB1(High mobility group box 1)의 분비를 억제하고 상기 HMGB1과 관련된 전염증성 시그날링(proinflammatory signaling)을 억제하는 효과를 지니며, 실제로 in vivo 패혈증 동물 모델에서 패혈증의 치료효과가 현저하다.

Description

메틸티오우라실을 유효성분으로 포함하는 패혈증 및 패혈증성 쇼크 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for sepsis and septic shock comprising methythiouracil}

본 발명은 메틸티오우라실(methylthiouracil)을 유효성분으로 포함하는 패혈증 및 패혈증성 쇼크 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 발명으로, 보다 구체적으로 HMGB1에 의해 유발되는 염증성 반응 등 패혈증의 병리상태를 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물에 관한 발명이다.

HMGB1(High-mobility group box 1 protein)은 뉴클레오솜(nucleosome)의 구조 및 안정성 유지와 전사 인자들이 그들의 동족 DNA 서열에 결합하는 것을 가능하게 하는 것에 의하여 유전자 발현의 조절에 기여하는 핵 염색체 단백질로서 처음 규명되었다. 최근, 실험 및 임상 연구로부터의 많은 데이터들이, 패혈증과 같은 여러 염증성 질환의 발병에 대한 세포외 HMGB1(extracellular HMGB1)의 기여를 강조하였다(Andersson and Tracey, 2011; Diener et al., 2013). 패혈증 동안, HMGB1은 감염에 기인하는 세포죽음에 따라 급속히 수동적으로 분비될 수 있고, 전-염증성 사이토카인들 및 PAMP(pathogen-associated molecular patterns)들에 대한 반응으로 면역 세포에서 능동적으로 분비될 수 있다. PAMP 및 내생적으로 유래된 염증 매개자(예를들어 TNF-α, IL-1b, NF-κB 및 ERK1/2)에 노출되었을 때, 세포외 산물과 원형질막 수용체의 상호작용에 의하여 촉발되는 세포적 신호 변환(cellular signaling transduction)을 통하여 내피세포는 HMGB1을 능동적으로 분비한다. 세포외 환경(extracellular milieu)으로 분비된 HMGB1은 전-염증성 사이토카인의 생성을 위하여 선천 면역 세포들을 자극하는 케모카인 또는 사이토카인으로서 역할을 한다. HMGB1 상호작용에 참여하는 세포 표면 수용체들은 RAGE(receptor for advanced glycation end products), TLR(toll like receptor)-2, 및 TLR-4를 포함한다. HMGB1이 세포외 공간으로 분비되는 방식은 두가지가 있는데, 하나는 대식세포 및 호중구와 같은 면역세포들이 관련되어 염증을 촉발하는 능동적 프로세스이고, 다른 하나는 괴사성 세포 및 선천 면역 시스템에 의해 채택된 매커니즘에 의하여 촉발되며 손상되거나 괴사된 세포를 인식하는 수동적 프로세스이다(Ulloa and Tracey, 2005). HMGB1으로 내피를 자극하는 것은 ICAM( intercellular adhesion molecule), VCAM(vascular cell-adhesion molecule), 및 E-Selectin과 같은 CMA(cell adhesion molecule)들의 발현을 증가시키며, 이는 백혈구의 소집(recruitment)을 통하여 염증을 촉진한다(Bae and Rezaie, 2011). 혈장에서 HMGB1 수준(level)의 증가는 패혈증 또는 패혈성 쇼크 진단 후 1주일까지 대부분의 환자에서 측정가능하며, 상기 HMGB1의 수준은 장기 기능이상(organ dysfunction) 정도와 연관되어있다(Gibot et al., 2007; Sunden-Cullberg et al., 2005).

한편, 패혈증(sepsis)은 감염된 미생물에 대항하는 신체의 비정상적인 방어작용에 의해 발생한다. 대식세포의 활성화와 이에 따른 염증관련 인자들의 과도한 생성이 연관되어 있는데, 이로 인해 전신에 심각한 염증 반응이 나타난다. 체온이 38℃ 이상으로 올라가는 발열 증상, 36℃ 이하로 내려가는 저체온증, 분당 24회 이상의 호흡수(빈호흡), 분당 90회 이상의 심박수(빈맥), 혈액 검사상 백혈구 수의 증가 또는 현저한 감소 중 두 가지 이상의 증상을 보이는 경우, 이를 전신성염증반응증후군(systemic inflammatory response syndrome; SIRS)이라하고, 이러한 전신성염증반응증후군이 미생물의 감염에 의한 것일 때 패혈증이라고 한다. 패혈증은 잠재적으로 패혈증성 쇼크(septic shock)를 유발할 수 있다. 패혈증이 심해지면 신체의 여러 기관(심장, 신장, 간, 뇌, 폐 등)의 기능이 나빠지고 더욱 심해지면 쇼크 상태가 되는 것이다. 다양한 종류의 병원체로 인해 패혈증이 발병할 수 있는데, 가장 발생률이 높은 것은 박테리아에 의한 것이지만 그 외에도 바이러스나 곰팡이에의해서도 일어날 수 있다. 폐에 감염을 일으키는 폐렴, 방광과 신장에 감염을 일으키는 요도감염, 피부에 일어나는 봉소염, 복부에 일어나는 충수염 또는 뇌에 일어나는 뇌막염 등이 있으며, 예를 들면 폐렴을 앓고 있는 환자가 패혈증에 걸리게 되면 뇌, 심장, 간, 폐 또는 신장에 손상이 일어나며 중증으로 진전되는 경우 환자의 약 20 ~ 50%는 패혈증성 쇼크에 의해 사망한다. 또한, 수술 후 감염에 의해 패혈증이 발생하기도 한다. 감염 또는 수술 후 감염에 의한 초급성 염증반응으로서 패혈증에 걸리게 되면 40 ~ 90%가 사망에 이르게 된다.

상기 패혈증은 감염 원인균과 숙주의 면역, 염증 그리고 응고계통 사이의 복잡한 상호작용의 결과로 발생하는 것으로 이해되고 있다. 숙주의 반응 정도와 감염 원인균의 특성 모두 패혈증의 예후에 중대한 영향을 미친다. 패혈증에서 관찰되는 장기부전은 숙주의 감염 원인균에대한 반응이 부적절한 경우에 발생하며, 만일 숙주의 감염 원인균에대한 반응이 지나치게 증폭된다면 숙주 자체의 장기손상을 유발할 수 있다. 이러한 개념을 바탕으로 숙주의 염증 반응에 주도적인 역할을 수행하는 전염증사이토카인(proinflammatory cytokines)인 TNF-α, IL-1β, IL-6등에 대한 길항 물질이 패혈증의 치료제로 시도되었으나 대부분 실패하였으며, 기계환기치료, 활성 단백질 C(activated protein C) 투여, 글루코코르티코이드 치료 등이 현재 시도되고 있으나 여러 가지 한계점이 지적되고 있다. 따라서, 높은 사망률을 보임에도 아직까지 뚜렷한 치료제가 개발되지 않은 패혈증 및 패혈증 쇼크를 예방 또는 치료하기 위한 새로운 치료제에 대한 필요성이 요구되고 있다.

[비특허문헌 1] Andersson, U., Tracey, K.J., 2011. HMGB1 is a therapeutic target for sterile inflammation and infection. Annu Rev Immunol 29, 139-162. [비특허문헌 2] Diener, K.R., Al-Dasooqi, N., Lousberg, E.L., Hayball, J.D., 2013. The multifunctional alarmin HMGB1 with roles in the pathophysiology of sepsis and cancer. Immunology and cell biology 91, 443-450. [비특허문헌 3] Bae, J.S., Rezaie, A.R., 2011. Activated protein C inhibits high mobility group box 1 signaling in endothelial cells. Blood 118, 3952-3959. [비특허문헌 4] Gibot, S., Massin, F., Cravoisy, A., Barraud, D., Nace, L., Levy, B., Bollaert, P.E., 2007. High-mobility group box 1 protein plasma concentrations during septic shock. Intensive Care Med 33, 1347-1353. [비특허문헌 5] Sunden-Cullberg, J., Norrby-Teglund, A., Rouhiainen, A., Rauvala, H., Herman, G., Tracey, K.J., Lee, M.L., Andersson, J., Tokics, L., Treutiger, C.J., 2005. Persistent elevation of high mobility group box-1 protein (HMGB1) in patients with severe sepsis and septic shock. Crit Care Med 33, 564-573. [비특허문헌 6] Bae, J.S., Lee, W., Nam, J.O., Kim, J.E., Kim, S.W., Kim, I.S., 2014. Transforming Growth Factor beta-induced Protein Promotes Severe Vascular Inflammatory Responses. Am J Respir Crit Care Med 189, 779-786. [비특허문헌 7] Qureshi, S.H., Manithody, C., Bae, J.S., Yang, L., Rezaie, A.R., 2008. Autolysis loop restricts the specificity of activated protein C: analysis by FRET and functional assays. Biophys Chem 134, 239-245. [비특허문헌 8] Bae, J.S., 2012. Role of high mobility group box 1 in inflammatory disease: Focus on sepsis. Arch Pharm Res 35, 1511-1523. [비특허문헌 9] Bae, J.W., Bae, J.S., 2011. Barrier protective effects of lycopene in human endothelial cells. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society ... [et al.] 60, 751-758. [비특허문헌 10] Ozdulger, A., Cinel, I., Koksel, O., Cinel, L., Avlan, D., Unlu, A., Okcu, H., Dikmengil, M., Oral, U., 2003. The protective effect of N-acetylcysteine on apoptotic lung injury in cecal ligation and punctureinduced sepsis model. Shock 19, 366-372. [비특허문헌 11] Chen, G., Li, J., Ochani, M., Rendon-Mitchell, B., Qiang, X., Susarla, S., Ulloa, L., Yang, H., Fan, S., Goyert, S.M., Wang, P., Tracey, K.J., Sama, A.E., Wang, H., 2004. Bacterial endotoxin stimulates macrophages to release HMGB1 partly through CD14- and TNF-dependent mechanisms. J Leukoc Biol 76, 994-1001. [비특허문헌 12] Buras, J.A., Holzmann, B., Sitkovsky, M., 2005. Animal models of sepsis: setting the stage. Nature reviews. Drug discovery 4, 854-865. [비특허문헌 13] Hofbauer, R., Moser, D., Salfinger, H., Frass, M., Kapiotis, S., 1998. Sufentanil inhibits migration of human leukocytes through human endothelial cell monolayers. Anesth Analg 87, 1181-1185.

이에 본 발명자들은 패혈증 질환을 예방하고 치료할 수 있는 효과가 우수한 조성물을 개발하던 중, 하기 화학식 I로 표현되는 메틸티오우라실(methylthiouracil, MTU)이 패혈증 주요 인자인 HMGB1의 분비를 억제하고 이와 관련된 세포 시그날링의 분자적 매커니즘을 효과적으로 조절하여 HMGB1에 의한 혈관염증성 반응을 억제할 뿐만 아니라, 실제로 in vivo 패혈증 동물모델에 대하여 현저한 치료효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 하기 화학식 1의 메틸티오우라실(methylthiouracil) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

<화학식 1>

상기 목적을 달성 하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 메틸티오우라실(methylthiouracil) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 상기 메틸티오우라실(methylthiouracil, MTU)은 하기 화학식 I의 구조식을 갖는 화합물로, 상기 MTU는 본래 갑상선 호르몬의 생성을 저해하는 효과를 나타내 갑상선 기능 항진증의 치료제로서 개발되어 사용 되어진 화합물이다. 본 발명의 발명자들은 일련의 실험을 통해 상기 MTU가 패혈증의 예방 또는 치료에 효과가 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었으며, 이러한 MTU의 용도는 본 발명자들이 최초로 밝힌 신규한 용도이다.

즉, 본 발명은 하기 화학식 1의 메틸티오우라실 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 신규한 용도를 제공하는 것으로서, 하기 화학식 1의 메틸티오우라실 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 항-패혈증 용도를 제공한다;

<화학식 1>

본 발명의 실시예에서는, 패혈증의 주요 매개자인 HMGB1 및 이와 관련된 전염증성 시그날링 인자들에 대하여 메틸티오우라실(methylthiouracil,MTU)의 효과를 평가하였다. 메틸티오우라실(methylthiouracil,MTU)은 LPS- 또는 CLP(cecal ligation and puncture)-에의해 매개된 HMGB1의 분비, HMGB1 수용체(TLR-2, TLR-4 및 RAGE)의 발현 및 HMGB1에 의해 매개된 장벽 붕괴를 억제하였다. 또한 상기 메틸티오우라실(methylthiouracil,MTU)은 CAM들의 발현을 저해하며, HMGB1에 의해 매개된 인간 호중구의 부착 및 이동(이주, migration)을 억제하였다. 게다가 HMGB1에 의해 유도되는 nuclear factor-κB (NF-κB) 및 extracellular regulated kinases 1/2(ERK1/2)의 활성화와 IL-6, tumor necrosis factor-α(TNF-α)의 생산을 억제하였다. 또한 상기 메틸티오우라실(methylthiouracil,MTU)은 실제로 CLP-패혈증 동물모델에서 혈관 장벽의 보호효과를 나타내었으며, 사망률 및 폐 손상이 억제되며 현저한 치료효과를 나타내었다.

본 명세서 실시예의 in vitro 및 in vivo 실험을 통하여 보인 바와 같이, 메틸티오우라실(methylthiouracil,MTU)은 HMGB1에 의해 매개되는 염증성 반응들을 억제하며, 이러한 HMGB1 signaling pathway의 억제를 통해 패혈증 및 패혈성 쇼크를 치료하는 효과가 있다.

따라서, 본 발명은 하기 화학식 1의 메틸티오우라실 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 신규한 용도를 제공하는 것으로서, 하기 화학식 1의 메틸티오우라실 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 항-패혈증 용도를 제공한다;

<화학식 1>

본 발명의 상기 패혈증(sepsis) 또는 패혈성 쇼크(septic shock)는 HMGB1에 의해 (High mobility group box 1)에 의해 매개되는 것이 특징으로, 상기“패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료”란, 폐혈증에 연관된 임상 증상 및 다기관 기능부전 증후군에 연관된 상태(예를 들어 다양한 정도의 열, 저독소혈증, 사성, 빈맥, 내피염, 심근경색증, 고도착란, 변화성 정신 상태, 혈관 허탈 및 기관 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 응고장애, 심부전증, 신부전증, 쇼크 및(또는) 혼수상태 등)의 전부 또는 일부 증상을 감소, 개선 또는 제거하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 메틸티오우라실은 그 자체 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서 ‘약학적으로 허용되는’이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 부여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말하여, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한, 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 메틸티오우라실을 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 및 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명의 메틸티오우라실은 패혈증의 주요 매개인자인 HMGB1(High mobility group box 1)의 분비를 억제하고 상기 HMGB1과 관련된 전염증성 시그날링(proinflammatory signaling)을 억제하는 효과를 지니며, 실제로 in vivo 패혈증 동물 모델에서 패혈증의 치료효과가 현저하다.

도 1A는 HUVEC 세포를 LPS(100 ng/mL)로 16시간동안 자극한 후, 표시된 각각의 농도로 메틸티오우라실을 6시간 처리하였을 때 HMGB1 분비량을 나타낸 것으로, 상기 HMGB1 분비량은 ELISA에 의해 측정되었다.
도 1B는 CLP를 수행한 수컷 C57BL/6 마우스들(n=5)에 CLP로부터 12시간 후, 메틸티오우라실을 정맥투여하고, CLP로부터 24시간 후에 상기 마우스를 안락사시켜 혈장 속 HMGB1 level을 측정한 결과를 나타낸 것으로, 상기 HMGB1 분비량은 ELISA에 의해 측정되었다.
도 1C는 Confluent HUVEC 세포에 HMGB1(1 ㎍/mL)을 16시간 처리하고 메틸티오우라실과 6시간 배양하였을 때, TLR-2, TLR-4 및 RAGE의 HMGB1 receptor들 발현을 나타낸 것으로, 상기 HMGB1 receptor들의 발현은 cell-based ELISA에 의하여 측정되었다.
도 1D는 MTT assay 방법으로 세포 생존성(cell viability)에 대한 메틸티오우라실의 영향을 측정한 결과를 나타낸다
도 2A는 HUVEC 세포를 LPS (100 ng/mL, 4 h)로 자극시킨 후, 표시된 각각의 농도로 메틸티오우라실을 6시간 처리하였을 때 세포의 투과성을 평가한 결과를 나타내는 것으로, 상기 투과성은 HUVEC 단일층을 가로지른 Evans blue-결합된 알부민의 유출정도 측정에 의해 모니터링되었다.
도 2B는 HUVEC 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL, 16 h)로 자극시킨 후, 표시된 각각의 농도로 메틸티오우라실을 6시간 처리하였을 때 세포의 투과성을 평가한 결과를 나타내는 것으로, 상기 투과성은 HUVEC 단일층을 가로지른 Evans blue-결합된 알부민의 유출정도 측정에 의해 모니터링되었다.
도 2C는 HMGB1(2 ㎍/mouse, i.v.)으로 마우스에 혈관투과(vascular permeability)를 유도한 후, 말초혈관에서 5 또는 10μM/mouse의 농도가 되로록 메틸티오우라실을 주입하여 이의 효과를 확인한 결과를 나타내는 것으로서, 복강 세척액(peritoneal washes)에 포함된 Evans blue 염료의 양을 측정하여 투과성을 평가하였다.
도 2D는 HUVEC 세포를 HMGB1(1 ㎍/mL, 16 h)으로 활성화시키고 메틸티오우라실을 6시간동안 처리한 후, HMGB1에 의해 매개된 phospho-p38 발현에 대한 상기 화합물의 영향을 ELISA로 측정한 결과이다
도 2E는 HUVEC 세포를 HMGB1로 자극한 후, MTU를 처리했을 때 F-actin의 발현 변화를 평가한 결과이다(화살표는 세포 간극 틈을 의미함).
도 3A는 HUVEC 세포를 HMGB1(1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 메틸티오우라실을 6시간동안 처리한 후, HMGB1-매개 VCAM-1, ICAM-1 및 E-selectin의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 3B는 HUVEC 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 다양한 농도의 메틸티오우라실을 6시간동안 처리한 후, HUVEC monolayer에 대한 인간 monocyte의 부착정도를 나타낸 것이다.
도 3C는 HUVEC 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 다양한 농도의 메틸티오우라실을 6시간동안 처리한 후, HUVEC monolayer를 통한 인간 monocyte의 이동(migration)을 분석한 결과를 나타낸 것이다
도 3D는 C57BL/6 수컷 마우스를 HMGB1(2㎍ per mouse, i.v.)으로 자극하고, 말초혈관에서 5 또는 10μM/mouse의 농도가 되도록 메틸티오우라실을 주입하여, 상기 HMGB1에 의해 매개된 leukocyte의 복막강으로의 이동(migration)을 분석한 결과를 나타낸다.
도 3E는 HUVEC 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 다양한 농도의 메틸티오우라실을 6시간동안 처리한 후, HUVEC monolayer에 대한 인간 monocyte의 부착정도를 사진으로 촬영한 도면이다.
도 4A는 HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 메틸티오우라실을 6시간동안 처리한 후, HMGB1-매개 TNF-α의 생성 정도를 분석한 결과를 나타낸다.
도 4B는 HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 메틸티오우라실을 6시간동안 처리한 후, HMGB1-매개 IL-6의 생성 정도를 분석한 결과를 나타낸다.
도 4C는 Confluent HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 메틸티오우라실과 6시간동안 배양한 후, HMGB1-매개 phospho-NF-κB p65 활성화 정도 및 전체 NF-κB p65를 분석한 결과를 나타낸다.
도 4D는 Confluent HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 메틸티오우라실과 6시간동안 배양한 후, HMGB1-매개 phospho-ERK1/2 활성화 정도 및 전체 ERK1/2를 분석한 결과를 나타낸다
도 4E는 HUVEC 세포에서 NF-κB p65의 핵 내로의 이전을 면역형광현미경으로 관찰한 결과이다(DAPI : 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydroChloride counter staining)
도 5A는 수컷 C57BL/6 마우스들(n=20)에 CLP 후 12시간째 및 50시간째에 메틸티오우라실(71 μg/kg, i.v. □ 또는 142 μg/kg, i.v. ■)을 정맥투여하고, CLP 후 132시간까지 6시간마다 실험동물의 생존을 모니터링한 결과를 나타낸다. Control CLP mice(●로 표시) 및 sham-operated mice (○로 표시)들에는 살균한 식염수가 투여되었다. CLP군에 대비한(versus) 전체 생존률을 조사하기 위하여 Kaplan-Meier survival analysis 방법이 사용되었다.
도 5B는 CLP 받은 수컷 C57BL/6 마우스(n=5)들에 CLP 후 12 및 50시간째에 메틸티오우라실을 정맥투여하고, CLP 후 96시간째에 안락사시켜 관찰한 폐조직의 조직병리학적 스코어(Histopathological score)를 나타낸다
도 5C는 CLP 받은 수컷 C57BL/6 마우스(n=5)들에 CLP 후 12 및 50시간째에 메틸티오우라실을 정맥투여하고, CLP 후 96시간째에 안락사시켜 수득한 폐조직을 H&E staining한 현미경사진(200x)이다(Sham군: grade 1, CLP군: grade 3, CLP+MTU군: grade 2).이미지들은 세 번의 독립적 실험을 대표하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험준비>

1. 세포배양

인간 탯줄 정맥 내피세포(Primary human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)는 Cambrex Bio Science(Charles City, IA, USA)로부터 수득하였고, Bae et al., 2014의 연구에서 묘사된 바와 같이 유지되었다(maintained). 간략하게, growth supplements(Cambrex Bio Science)가 첨가된 EBM-2 basal media 용액에서 37℃, 5% CO2 조건으로, 세포들이 포화(confluency)되도록 배양하였다. 모든 실험은 3-5계대(passage) 배양된 HUVEC 세포를 사용하여 수행되었다. 인간 호중구(neutrophil)는 다섯명의 건강한 지원자로부터 정맥천자(venipuncture)에 의해 수득된 15 mL의 전혈(whole blood)로부터 분리되었고, Hofbauer R et al., 1998의 연구에서 묘사된 바와 같이 유지되었다.

2. 실험동물

수컷 C57BL/6 (6~7주령, 25~30g)를 Orient Bio Co.(Sungnam, Republic of Korea)로부터 구입하였고, 온도, 습도 및 조도가 조절된 환경에서 사육하였다. 모든 동물은 경북대학교에서 발행한 실험동물 관리 및 이용 가이드라인에 따라서 사육하였다.

3. CLP(Cecal ligation and puncture)

패혈증을 유발하기 위하여, 수컷 마우스들은 small rodent gas anesthesia machine(RC2, Vetequip, Pleasanton, CA)을 통하여 주입된 2% isoflurane(Forane, JW Pharmaceutical, South Korea)이 포함된 산소로 마취되었고, 최초에는 breathing chamber에서 마취하고 그 후에는 facemask를 사용하여 실험과정동안 자연스럽게 호흡할 수 있도록 하였다. CLP-유도 패혈증 모델은 Bae JS et al., 2014 의 연구에서 묘사된 바와 같이 수행되었다. 간략하게, 2cm의 정중절개(midline incision)를 수행하여 맹장 및 인접한 소장을 노출시켰다. 그 후 맹장 끝부분(cecal tip)으로부터 5.0mm 떨어진 부분을 3.0-비단봉합사(silk suture)로 단단히 묶고, 높은 수준의 패혈증을 유발하기 위하여 22-게이지의 바늘로 맹장에 1회 구멍을 냈다. 그 후, 상기 구멍 부위로부터 배설물을 압출시키기 위하여 맹장을 부드럽게 짜내었고(squeezed), 상기 맹장을 다시 복막강(peritoneal cavity)으로 복귀시켰다. 마지막으로 개복 부위(laparotomy site)를 4.0-silk로 봉합하였다. sham control 군의 실험동물은 맹장을 노출시킨 후 봉합(ligation) 또는 구멍을 내는 과정 없이 복강으로 복귀시켰다. 상기 실험 프로토콜은 실험 전, the Animal Care Committee at Kyungpook National University(IRB No. KNU 2012-13)에의해 승인 받았다.

4. HMGB1 측정을 위한 경쟁적 ELISA(Competitive enzyme-linked immunosorbent assay)

경쟁적 ELISA 방법을 이용하여 HMGB1의 농도를 조사하였다. 구체적으로 in vitro 실험에서 HUVEC 단일층(HUVEC monolayer)은 LPS(100 ng/mL)로 16시간 동안 처리되었으며, 그 후 MTU로 6시간동안 처리되었다. 그 다음에, HMGB1의 농도를 조사하기 위하여 세포배양액을 수집하였다. ELISA를 수행하기 위하여, 96-well flat plastic microtiter plates(Corning Inc., Corning, NY)를 HMGB1 단백질과 함께 4℃에서 오버나잇(overnight)하여 코팅하였으며, 이때 0.02% sodium azide가 포함된 20mM carbonate-bicarbonate buffer(pH 9.6)를 사용하였다. 상기 plate를 0.05% Tween 20이 포함된 PBS 용액(PBS-T)으로 3회 세척한 뒤, 4℃에서 보관하였다. 상기 수집된 세포배양액은 동결건조(Lyophilization)시킨 후, 이를 anti-HMGB1 antibody(PBS-T에 1:1000로 희석됨, Abnova, Taipei City, Taiwan)와 함께 96-well plastic round microtiter plate에서 37℃, 90분 동안 사전-배양(pre-incubate)하였고, 이를 상기 HMGB1으로 코팅된 플레이트에 옮긴 후, 30분 동안 실온에서 배양하였다. 그리고 나서 상기 플레이트를 PBS-T 용액으로 3회 세척하고, peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG antibody(PBS-T에 1:2000로 희석됨, Amersham Pharmacia Biotech)와 함께 실온에서 90분동안 배양하였으며, 다시 PBS-T 용액으로 3회 세척하고, 200㎕의 기질용액(100μg/mL o-phenylenediamine 및 0.003% H2O2)을 첨가하여 암실에서 상온으로 60분 동안 배양하였다. 8N H2SO4를 50㎕ 처리하여 반응을 종료시킨 후, 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

in vivo 실험에서는 CLP를 수행한 수컷 C57BL/6 마우스들(n=5)에 CLP로부터 12시간 후, 말초혈관에서 5 또는 10μM/mouse의 농도가 되로록 MTU를 정맥투여하고, CLP로부터 24시간 후에 상기 마우스를 안락사시키고 수득한 혈액을 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 여기에 전술한 바와 같은 경쟁적 ELISA를 수행하여 마우스 혈장 속에 포함된 HMGB1 농도를 조사하였다.

5. 세포 생존 에세이(Cell viability assay)

세포 생존의 지표로서 MTT assay 방법을 이용하였다. 세포들은 96-well plates에서 5 × 10³ cells/well의 밀도로 배양되었다. 24시간 후에, 세포들을 새 배지(fresh medium)로 세척하였으며, MTU를 처리하였다. 48시간의 배양 후에, 세포들을 세척하고 100㎕의 MTT(1mg/mL)를 첨가하여 4시간 배양하였다. 마지막으로 DMSO(dimethyl sulfoxide) 150㎕를 첨가하여 생성된 formazan salt를 용해시키고, formazan salt의 양을 microplate reader(Tecan Austria GmbH, Austria)를 사용하여 540nm에서 OD(optical density)를 측정함으로서 조사하였다.

6. Permeability assay

각 화합물의 농도 증가에 대한 내피세포의 투과성을 분광측색 정량(spectrophotometric quantification)하기 위하여, 변형된 2-compartment chamber 모델을 이용하여 세포 단일막을 통해 유출되는 Evans blue-결합 알부민의 양을 측정하였다(Bae and Rezaie, 2011; Kim et al., 2012.). HUVEC 세포를 3 μm 의 공극크기 및 12 mm의 직경을 갖는 transwell에 5 X 10⁴ cells/well 로 분주한 후 3일간 배양하였다. 가득찬 단일층의 HUVEC 세포에 1 μg의 HMGB1을 16시간 동안 처리한 후, MTU를 처리하였다. Transwell을 PBS로 워싱한 후, 0.5 mL의 Evans blue alc 4% BSA가 포함된 growth medium을 첨가하였다. Fresh growth medium을 아래층의 chamber에 넣은 후, 위층 chamber의 medium을 Evans blue/BSA로 교체하였다. 10분 후, 아래층 chamber의 optical density를 650 nm에서 측정하였다.

7. 세포-세포 부착 어세이

HUVEC에 부착하는 neutrophils의 양을 평가하기 위해 형광으로 표지된 neutrophils을 이용하여 종래 방법에 따라 측정하였다(Akeson and Woods, 1993). 즉, neutrophil을 Vybrand DiD dye로 표지한 후, HUVEC 세포에 첨가되었다. HUVEC 단일층은 HMGB1로 16시간동안 처리된 후, MUT를 6시간 동안 처리하였다. THP-1 세포는 부착 되도록 하였고, 부착되지 않은 neutrophil은 워싱을 통해 제거하였다. 부착된 neutrophil의 비율을 다음과 같은 식으로 계산하였다;

% 부착률 = (adherent signal/total signal) X 100

8. Migration assay(in vitro)

세포 이동성 에세이는 8μm pore size filter를 포함하는 6.5mm직경의 transwell plate에서 수행되었다. HUVEC 세포(6 X 10⁴)들을 3일동안 배양하여, 융합된 내피세포 단일층을 수득하였다. 상기 세포 단층을 HMGB1(1㎍/mL)으로 16시간 처리하고 MTU를 6시간동안 처리한 후, transwell plate의 상부(upper compartment)에 인간 호중구를 첨가하였다. 그 후 상기 Transwell plate 는 37°C, 5% CO2 조건에서 2시간동안 배양되었다. 그 후 upper chamber의 세포들은 흡인되었으며(aspirated), 필터의 윗부분에 위치한 비이동성 세포들은 면봉을 이용하여 제거되었다. 필터의 아랫부분에 위치한 인간 호중구 세포들은 8% glutaraldehyde로 고정된 후, 0.25% crystal violet을 포함하는 20% methanol(w/v)을 첨가하여 염색되었다. 각각의 실험은 2배수 웰(duplicate well)에서 반복되었으며, 무작위로 선택된 9개의 high power microscopic field(HPF; 200× )들에서 이동성 세포의 개수가 카운팅(counting)되었다. 이러한 결과는 이동 지표(migration index)로서 나타내어진다.

9. In vivo 투과성 및 백혈구 이동성 에세이

in vivo 실험을 위하여, 수컷 마우스들은 small rodent gas anesthesia machine(RC2, Vetequip, Pleasanton, CA)을 통하여 주입된 2% isoflurane(Forane, JW Pharmaceutical, South Korea)이 포함된 산소로 마취되었고, 최초에는 breathing chamber에서 마취하고 그 후에는 facemask를 사용하여 실험과정동안 자연스럽게 호흡할 수 있도록 하였다. 마우스들에 HMGB1(2㎍/mouse)을 정맥주사(i.v.)하여 16시간동안 전처리하고, MTU를 28, 71 또는 142 μg/kg의 농도로 6시간동안 처리하였다.

in vivo 투과성 에세이를 위하여, 1% Evans blue dye solution(in normal saline)을 각 마우스에 정맥주사하였다. 30분 후에, 각 마우스들을 희생시켰으며, 5mL의 일반 식염수로 복막강을 세척하여 복막삼출물(peritoneal exudate)들을 수집하고 10분동안 200Xg으로 원심분리하였다. 상등액의 흡광도는 650nm에서 측정되었다. Bae JS et al., 2012의 연구에서 기술된 바와 같이, 혈관 투과성은 Evans blue dye의 표준 곡선을 이용하여 측정된 복막강(peritoneal cavity)으로 누설(leak)된 염료의 양(μg of dye/mouse)으로서 나타내었다.

백혈구 이동을 평가하기 위하여, 상기와 같이 MTU를 처리하고 6시간 후에 마우스들을 희생하였고, 복막강을 5 mL의 일반 식염수로 세척하였다. 20㎕의 상기 복막액(peritoneal fluid) 샘플을 0.38 mL Turk’s solution(0.01% crystal violet in 3% acetic acid)과 혼합하고, 광학현미경을 이용하여 백혈구의 수를 카운팅(counting)하였다.

10. CAMs(cell adhesion molecules) 및 HMGB1 receptor의 발현량 평가

VCAM-1, ICAM-1 및 E-selectin의 발현은 당업계에서 공지된 방법에 따라, whole-cell ELISA 법에 의해 평가되었다(Bae and Bae, 2011; Che et al., 2002). 즉, 가득찬 monolayer의 HUVEC 세포에 HMGB1 (1 μg/mL)를 16시간(VCAM-1 및 ICAM-1) 또는 22시간(E-selectin)을 처리한 후, MTU를 처리하고, 1% paraformaldehyde로 고정하였다. 3차례 세척한 후, mouse anti-human monoclonal 항체(VCAM-1, ICAM-1 및 E-selectin, Temecula, CA, 각각 1:50 )를 넣고 1시간 동안 배양하였다. 세포를 세척한 후 peroxidase-conjugated anti-mouse IgG 항체(Sigma, St. Louis, MO)를 1시간 동안 처리한 후, o-phenylenediamine substrate(Sigma)를 처리하였다.

상기한 방법과 동일한 절차로 TLR2, TLR4 및 RAGE 수용체의 세포 표면 발현량을 평가하였다.

11. ELISA (phosphorylated p38 MAPK, NF-κB, TNF-α, ERK1/2 및 IL-6)

인산화된 p38 MAPK(phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase)의 발현은 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)사의 상용화 ELISA kit를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 정량하였다. 핵 용해물(nuclear lysates)에서 전체(total) 및 인산화된 p65 NF-κB의 활성은 Cell Signaling Technology(Danvers, MA)사로 부터의 ELISA kit(Catalog NO. #7174, #7173)를, 전체(total) 및 인산화된 ERK 1/2(extracellular regulated kinase 1/2)의 활성은 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)사의 ELISA kit를 사용하여 조사하였다. 세포 배양액의 상층액에서 IL-6 및 TNF-α의 농도는 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)의 ELISA kit를 이용하여 조사하였다. ELISA plate reader (Tecan, Austria GmbH, Austria)를 이용하여 값을 측정하였다.

12. 헤마톡실린 & 에오신 염색 및 병리조직학적 시험

5 마리의 수컷 C57BL/6 마우스들에 CLP 를 수행하고 각각 12시간 및 50시간 후에, MTU를 28, 71 또는 142 μg/kg의 농도로 정맥주사하였다. 마우스들은 CLP 후 96시간째에 안락사되었다. 상기 마우스들에서 폐조직의 표현형 변화를 분석하기 위하여 각 마우스로부터 폐 샘플들을 적출하였고, 잔류 혈액을 제거하기 위하여 PBS(pH 7.4)로 3회 세척한 후 4% formaldehyde solution(in PBS (pH 7.4), Junsei, Tokyo, Japan)으로 4℃에서 20시간동안 고정하였다. 상기 고정 후, 각 샘플들은 일련의 증가되는 농도의 에탄올 수용액(ethanol series)으로 탈수되었고, 파라핀 포매된 후, 4μm두께로 절편화하여 슬라이드(slide)에 올려놓았다. 상기 슬라이드들은 60℃ 오븐에서 탈파라핀화(deparaffinize)되었고, 재수화(rehydrate)된 후, hematoxylin(Sigma)으로 염색되었다. 과도한 염색을 제거하기 위하여 각 슬라이드들을 0.3% acid alcohol에 3회 급속침지(quick-dip)시켰으며, eosin(Sigma)으로 대비염색하였다. 그리고나서 일련의 증가되는 농도의 에탄올 수용액(ethanol series) 및 자일렌(xylene)을 이용하여 과도한 염색을 제거하고, 커버슬립(coverslip)을 덮었다. 폐 조직구조(pulmonary architecture), 조직 부종(tissue edema) 및 염증성 세포의 침윤(infiltration of inflammatory cell)을 평가하기 위한 폐 표본에 대한 광학현미경분석은, Ozdulger A et al., 2003에 기술된 바와 같이 블라인드 관찰자(blinded observation)에 의해 수행되었다. 상기 관찰 결과는 하기의 4등급으로 분류되었다: 등급 1(grade 1)은 정상 조직병리(normal histopathology)를 나타내고, 등급 2(grade 2)는 소량의 호중구 백혈구 침윤을 나타내며, 등급 3(grade 3)은 중간정도의 호중구 백혈구 침윤, 혈관주위 부종(perivascular edema) 형성 및 폐 조직구조의 부분적 파괴를 나타내고, 등급 4(grade 4)는 밀도 높은 호중구 백혈구 침윤, 농양(abscess) 형성 및 완전한 폐 조직구조 파괴를 포함하는 의미이다.

13. 면역형광 염색(immunofluorescence staining)

HUVEC 세포는 0.05% 의 Poly-L-Lysine 및 10% FBS가 함유된 complete media로 코팅된 glass cover slip에 가득 차도록 48시간 동안 배양되었다. 이후 세포는 1 μg/mL의 HMGB1로 16시간 및 라이소자임(50 또는 100 nM)으로 6시간 동안 또는 1 μg/mL의 HMGB1 단독으로 16시간 자극시켰다. 세포골격(cytoskeletal) 염색을 위해, 세포는 4% 포름알데히드로 15분간 상온에서 고정되었고, 0.05% Triton X-100으로 permeabilize 된 후, blocking 버퍼로 4℃에서 블로킹 되었다. 이후, 세포는 F-actin으로 라벨된 fluorescein phalloidin 또는 primary rabbit monoclonal NF-κB p65 항체 및 anti-rabbit alexa 488 과 함께 배양되었다. 세포의 핵은 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydroChloride (DAPI) 으로 counterstining 되었고, 공초점 현미경(confocal microscope)으로 시각화 하였다.

14. 통계적 분석

각 실험은 적어도 3회씩 독립적으로 반복수행되었다. 값(Values)들은 평균± 평균의 표준오차(mean± standard error of the mean(SEM))로 나타내었다. 테스트 그룹간 통계적 유의성의 차이는 one-way analysis of variance (ANOVA) 및 Tukey’s post-hoc test에 의하여 평가되었다. 전체 생존률(overall survival rate)의 평가를 위하여, Kaplan-Meier survival analysis가 수행되었다. SPSS for Windows, version 16.0(SPSS, Chicago, IL)을 이용하여 통계적 분석이 수행되었으며, 0.05 미만의 P-값(p values < 0.05)은 통계적으로 유의미한 것으로 생각되었다.

<실시예>

1. LPS 및 CLP 매개 HMGB1 분비에 대한 MTU의 영향

HMGB1은 LPS로 자극된 단핵구 및 대식세포에 의해 분비가 될 뿐만 아니라, necrotic 세포에 의해서도 분비가 된다고 알려져 있다(Bae and Rezaie, 2011; El Gazzar, 2007; Mullins et al., 2004; van Beijnum et al., 2008). HMGB1은 패혈증 유발 후 8시간 이후부터 서서히 증가하기 시작하여, 패혈증의 진행경과와 일치하게 분비가 진행된다(Czura et al., 2003). 이에, 본 발명의 발명자들은 LPS에 의해 자극된 HUVEC 세포에서 분비되는 HMGB1에 대한 MTU의 효과를 평가하였다. 이에 대한 결과를 도 1A에 나타내었다.도 1A에 나타낸 바와 같이, MTU는 LPS 자극에 의한 HUVEC 세포에서의 HMGB1 분비를 농도 의존적으로 억제하였으며, 최대 효과를 나타내는 농도는 10 μM 이었다.

이러한 효과를 in vivo에서 확인하기 위해, CLP-유도 패혈증 동물모델에서 MTU가 HMGB1 분비에 미치는 영향을 평가하였다. 도 1B에 나타낸 바와 같이, MTU 투여결과 HMGB1 분비가 현저하게 감소하였다. 마우스의 평균 혈액량이 72 mL/kg 이라는 보고가 있으며(Diehl et al., 2001), 마우스의 평균 체중은 27 g 이기 때문에 평균 혈액량은 2 mL라고 할 수 있다. 한편, 마우스에 투여된 MTU는 71 또는 142 μg/kg 으로 마우스에 투여 되었으므로, 말초 혈액에서 최대 효과를 나타낸 MTU의 농도는 5 또는 10 μM이라 할 수 있다.

본 발명의 발명자들은, MTU 및 HMGB1이 TLR2, TLR4 및 RAGE 수용체의 발현에 비치는 영향을 평가하였다. 이에 대한 결과를 도 1C에 나타내었다. 도 1C에 나타낸 바와 같이, HMGB1을 HUVEC 세포에 처리한 결과 TLR2, TLR4 및 RAGE의 발현이 유도되었고, MTU를 처리한 결과 이들의 발현이 감소되었다.

상기한 결과와 함께, MTU가 HUVEC 세포에 미치는 독성을 평가하기 위해 MTU를 처리하고 48시간이 지난 후 세포의 생존률을 평가하였다. 도 1D에 나타낸 바와 같이, 실험에 사용된 최대 농도인 20 μM가지 MTU는 세포 생존률에 영향을 미치지 않았다.

상기한 결과들을 종합하여 보았을 때, MTU는 HMGB1의 분비 및 심각한 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 진행을 중간에 차단할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

2. MTU가 HMGB1에 의한 혈관 장벽 붕괴에 미치는 영향

LPS 및 HMGB1은 내피세포 장벽의 절단 및 붕괴를 유발한다고 알려져 있기 때문에(Lee et al.,2014), MTU가 내피세포 장벽 기능 유지에 미치는 효과를 알아보기 위해 HUVEC 세포를 이용하여 투과성 실험을 진행하였다. HUVEC 세포를 LPS(100 ng/mL) 또는 HMGB1(1 μg/mL)로 처리한 후 다양한 농도의 MTU를 6시간 동안 처리하였다. 도 2A 및 도 2B에 나타낸 바와 같이, MTU는 농도 의존적으로 LPS 또는 HMGB1에 의해 유발되는 막 붕괴를 차단하였다. 본 발명의 발명자들은 상기 in vitro 결과와 함께, MTU의 효과를 in vivo에서 평가하였다. 도 2C에 나타낸 바와 같이, MTU는 HMGB1에 의해 유발되는 dye의 복강 내 유출을 현저하게 억제하였다.

한편, HMGB1은 다양한 경로에 의해 염증성 반응을 유발하는데, 이러한 경로로는 다음과 같은 것들이 있다;

NF-κB를 활성화 시키는 MyD88/IRAK/TRAF 경로, Rac1/PI3K 경로, ERK1/2 활성화, TLR2/4의 하위경로인 p38 MAPK의 활성화, RAGE의 하위경로인 Ras/p38 경로(Palumbo et al., 2007; Qin et al., 2009; Sun et al., 2009). p38 경로가 MUT에 의해 영향을 받는지 확인하기 위해, HUVEC 세포를 HMGB1에 의해 자극한 후 MTU를 처리하였다. 도 2D에 나타낸 바와 같이, HMGB1 처리에 의해 포스포화 된 p38의 발현은 증가 되었으며, 이는 MTU의 처리에 의해 감소하는 결과를 확인하였다. 뿐만 아니라, MTU 10 또는 20 μM를 처리한 결과 F-actin 고리의 형성과 함께 HMGB1에 의해 유발되는 세포 간극 틈의 형성이 감소하였다. HMGB1 에 의해 유발되는 내피세포 투과성과 p38 활성화가 MTU에 의해 감소된다는 것을 통해, 이의 패혈증 치료제로서의 가능성을 확인할 수 있었다.

3. MTU가 HMGB1에 의해 매개되는 CAMs 발현, THP-1 부착 및 이주에 미치는 영향

HMGB1은 ICAM-1, VCAM-1 및 E-selectin과 같은 내피세포 표면의 부착인자들의 발현을 증가시킨다고 알려져 있다(Luo et al., 2013). 이러한 부착인자들은 leukocyte들이 내피세포를 통과해 염증부위로 이주하는 것을 촉진하게 된다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, MTU는 CAMs의 발현을 감소시킨다. 게다가, 이러한 저해 효과는 농도 의존적이며, 이는 MTU가 HMGB1 signalling을 감쇠시킴으로써 CAMs의 발현을 저해한다는 것을 의미한다. 한편, 도 3B 내지 3E에 나타낸 바와 같이, MTU는 CAM 발현을 저해하는 효과에 더불어, neutrophil이 HUVEC에 부착하는 것과 이를 통한 이주를 저해한다. 뿐만 아니라, 도 3D에 나타낸 바와 같이 MTU는 HMGB1에 의해 유발되는 leukocyte의 마우스 복강 내 이주를 저해한다.

상기한 결과들을 통해, MTU가 leukocyte들이 염증성 내피세포로의 부착 및 이주를 저해하는 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.

4. MTU가 HMGB1에 의해 유도되는 NF-κB/ERK 활성화 및 IL-6, TNF-α 생성에 미치는 영향

TNF-α 및 IL-6는 단독 또는 양자 조합에 의해 효과를 발휘하는 pro-inflammatory 사이토카인으로서, 이들은 HMGB1의 자극에 의해 분비되며, 치명적인 systemic inflammation의 병리과정에 기여하는 것으로 보고되고 있다(Erlandsson Harris and Andersson, 2004). HMGB1의 자극에 의한 pro-inflammatory 사이토카인의 분비는 ERK1/2를 포함한 다양한 경로를 통해 유발되는데, 이러한 다양한 경로들은 궁극적으로 NF-κB 활성화 및 사이토카인 분비에 필요한 유전자의 과발현을 촉진한다. 따라서, MTU가 이러한 염증성 신호 전달 분자들의 활성화 및 TNF-α, IL-6의 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해, HUVEC 세포를 HMGB1로 16시간 동안 자극한 이후에, MTU를 6시간 동안 처리하였다.

도 4A 및 4B에 나타낸 바와 같이, MTU 는 TNF-α 및 IL-6의 분비를 현저하게 억제하였다. 도 4C 및 4D에 나타낸 바와 같이, HMGB1의 처리에 의해 NF-κB 및 ERK1/2의 활성화는 증가되었고, 이러한 증가는 MTU를 6시간 처리한 결과 현저히 감소하였다. 한편, 본 발명의 발명자들은 HMGB1에 의해 유도되는 NF-κB의 세포기질(cytosol)로부터 핵으로의 translocation을 평가한 결과, 도 4E에 나타낸 바와 같이 HMGB1의 처리에 의해 NF-κB p65는 세포기질에서 핵으로 translocation이 되었으나, 이러한 효과는 MTU 처리에 의해 상쇄되는 것을 확인할 수 있었다.

5. CLP 유발 패혈증 동물모델에서 MTU의 효과

높은 농도의 HMGB1은 심각한 패혈증, 패혈성 쇼크 및 사망과 밀접하게 관련되어 있다. 본 발명의 발명자들은 MTU가 HMGB1의 분비를 저해하고, 이의 하위 signaling 및 영향을 억제하는 효과를 있음을 확인하고, 이에 더 나아가 CLP 법에 의해 패혈증이 유발된 동물모델에서 MTU 투여에 따른 생존률 변화를 확인하고자 하였다. 우선, CLP법에 의해 패혈증이 유발된 마우스에 MTU 71 또는 142 μg/kg을 CLP 법 수행 12시간 경과 후 단회 투여하였으나 동물의 생존률에는 아무런 변화가 없었다(데이터 미도시). 이에 본 발명의 발명자들은 MTU를 CLP법 수행 12시간 후에 한 차례 및 50시간 후 한 차례씩 MTU 71 또는 142 μg/kg을 마우스에 투여하였다. 그 결과 도 5A에 나타낸 바와 같이, Kaplan-Meier survival analysis에 따라 동물의 생존률은 30% 내지 50% 증가하는 것을 확인하였다(p<0.00001).

MTU의 투여에 따른 생존률 변화는 HMGB1 분비 및 HMGB1 매개 염증성 반응의 차단이 패혈증 및 패혈성 쇼크의 관리에 있어서 유효한 치료 전략이 될 수 있다는 것을 의미한다고 할 수 있다.

6. CLP에 의해 유발된 폐 손상에 대한 MTU의 방어 효과

CLP 법에 의해 유도된 동물의 사망에 대한 MTU의 보호효과를 확인하기 위해, 본 발명의 발명자들은 CLP에 의해 유발된 폐 손상에 대한 MTU의 방어 효과를 평가하였다. Sham 마우스들의 폐에는 아무런 손상이 발견되지 않았으며, MTU를 처리한 sham 마우스들의 폐에서도 아무런 손상이 발견되지 않았다(데이터 미도시). 도 5B 및 5C에 나타낸 바와 같이, CLP법을 수행한 마우스군(이하, CLP군)에서는 폐 조직 간극 및 폐포에 염증성 세포들의 침윤이 광범위하게 동반된 부종이 발견되었으며, 폐 조직이 심각하게 훼손되었다. MTU를 투여받은 CLP군에서는 상기한 폐의 형태학적 변화가 훨씬 완화되어 있었으며, 폐 조직도 보존되어 있었고 폐 손상 평가 점수도 감소되어 있었다.

결론적으로, 상기 일련의 실험들을 통해 MTU는 LPS 자극 또는 CLP법에 의한 HMGB1 분비를 저해, HMGB1 수용체의 발현을 저해, CAMs의 발현을 저해 및 HMGB1 매개 내피세포 장벽 훼손을 완화시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, MTU는 leukocytes의 HUVEC 세포로의 부착 및 이주를 저해한다. MTU의 내피세포 장벽 보호 효과는 동물실험을 통해 한번 더 확인하였고, 이는 결과적으로 CLP법에 의한 동물의 사망률 감소 및 폐 손상을 완화시키는 효과로 연결되었다.

상기한 본 발명의 결과들은 MTU가 패혈증 및 패혈성 쇼크를 비롯한 염증성 혈관 질환에 대한 치료제로서 사용될 수 있음을 의미한다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 메틸티오우라실(methylthiouracil)을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 메틸티오우라실을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 화합물은 패혈증의 주요 매개인자인 HMGB1(High mobility group box 1)의 분비를 억제하고 상기 HMGB1과 관련된 전염증성 시그날링(proinflammatory signaling)을 억제하는 효과를 지니며, 실제로 in vivo 패혈증 동물 모델에서 패혈증의 치료효과가 현저하므로 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (2)

1. 하기 화학식 1의 메틸티오우라실(methylthiouracil) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
   <화학식 1>
   

   

   
   
2. 제1항에 있어서, 상기 패혈증 또는 패혈성 쇼크는 HMGB1(High mobility group box 1)에 의해 매개되는 패혈증 또는 패혈성 쇼크인 것을 특징으로 하는 조성물.

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