KR20110134552A - 향부자 메탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 향부자(Cyperus rotundus) 메탄올 추출물 또는 이에 함유된 누트카톤 또는 발렌센을 유효성분으로 함유하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 향부자로부터 메탄올을 추출용매로 하여 추출한 추출물 및 이의 분획물과 이로부터 분리 정제한 누트카톤 또는 발렌센을 유효성분으로 함유하는 패혈증 질환 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 패혈증 예방 또는 치료용 조성물은 헴 옥시게나아제-1의 발현 유도 물질로서 HMGB1을 억제하는 효과가 우수하여 패혈증 또는 패혈증성 쇼크 증상의 예방 또는 치료하기 위한 약제의 소재 및 건강 기능성 식품의 소재로 사용할 수 있다는 효과가 있다.

Description

향부자 메탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물 {Composition comprising Cyperus rotundus methalnol extracts for preventing or treating Sepsis}

본 발명은 향부자(Cyperus rotundus) 메탄올 추출물 또는 이에 함유된 누트카톤 또는 발렌센을 유효성분으로 함유하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 향부자로부터 메탄올을 추출용매로 하여 추출한 추출물 및 이의 분획물로부터 획득한 누트카톤 또는 발렌센을 유효성분으로 함유하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 패혈증은 병원성 그람 음성 세균이 생체에 감염된 경우 세포벽의 성분인 리포폴리사카라이드(LPS)가 독소로 작용하여 생체의 면역 체계가 과도하게 활성화됨으로써 유발되는 중증 전신성 감염 반응으로서, 중환자 병동에 입원한 환자가 사망하는 주요한 원인이 되며 이에 의한 치사율이 보통 30% 이상인 매우 심각한 질병이다. 구체적으로 패혈증은 악성종상, 백혈병, 악성림프종, 후천성면역부전증후군(AIDS), 교원병, 신부전, 간질환, 뇌혈관장해, 당뇨병 등의 기초질환을 가진 환자나 고령자, 미숙아 같은 체액성면역부전 또는 세포성면역부전을 가진 저항력이 약한 숙주가 부신스테로이드나 항종양제의 화학요법, 코발트 조사라는 방사선치료 또는 유치카테테르, 혈액투석, 장기이식, 심장수술 등의 처치, 수술을 받은 경우에 주로 발병한다.

패혈증은 다양한 항생제에 대한 내성을 갖는 병원균이 점차로 증가하는 현상과 관련하여 그에 대한 치료가 매우 중요한 문제로 대두되고 있으나 아직까지 이에 대한 적합한 치료제가 개발되지 못하고 있다. 다만, 근년 각종 유력한 항생물질이 개발되어 패혈증에 대한 치료가 행해지고는 있으나 페니실린 또는 메티실린 내성황색포도상구균이라는 각종 항생물질내성균의 출현을 초래하여, 여전히 패혈증과 그로인한 쇼크의 치사율은 높아 상당히 많은 환자가 매년 패혈증 또는 패혈증성 쇼크로 인해 사망하고 있다.

패혈증의 원인균으로서는, 상기 각종 항생물질내성균 이외에도 장연쇄상구균, 그람음성간균인 대장균, 녹농균, 클레브시엘라, 프로테우스등을 주된 것으로 들 수 있다. 이 중 그램 음성간균에 의한 패혈증에서는 초기에는 고열, 오한전율, 빈맥, 혈압경도저하, 말초저항저하, 심박출량증가, 호흡알칼로시스, 고유산혈증 등의 증상을 보이며 심부전에 이르기도 한다. 그 후 혈압과 심박출량이 저하하여, 대사성아시도시스, 의식장해, 사지냉감, 저혈당 등을 보이며, 특히 혈관이 과도하게 이완되면서 혈압이 떨어지는 패혈증성 쇼크 증상이 일어나 죽음에 이르기도 하는바 패혈증 치료의 중요성이 주창되고 있는 실정이다.

구체적으로 패혈증은 상기 리포폴리사카라이드(LPS)가 생체내에서 면역 체계를 과도하게 항진하여 대식세포와 같은 면역 세포에서 종양괴사인자-알파(TNF-α), 인터루킨-1(interleukin-1), 인터루킨-6, 프로스타글란딘(prostaglandin), 류코트라이엔(leucotriene) 및 나이트릭 옥사이드(NO), 활성산소 등의 염증 유발 물질을 생산함으로써 유발되는데, 생체 내에서 리포폴리사카라이드에 의한 독성이 나타나는 것은 상기의 염증 유발 인자 또는 이들의 상호 상승적 작용에 기인하는 것으로 알려져 있다.

실제로 아스피린 및 인도메타신과 같은 비스테로이드성 소염 진통제는 이러한 프로스타글란딘의 합성 과정에 작용하는 효소인 PGHS(prostaglandin H2 synthase, cyclooxygenase라고도 함)를 저해하여 강력한 소염진통 작용을 나타낸다고 알려져 있다. 또한 상기의 아스피린 및 인도메타신 등은 관절염 등에도 우수한 효과가 있으므로 프로스타글란딘의 합성을 저해하는 화합물들이 상기 작용 이외에 소염 진통 및 관절염 치료 등의 효과가 있을 것으로 예상할 수 있다.

생체 내에서 다량의 NO는 패혈증과 같은 중증 발병 후 내피에서의 NO의 과대 합성 및 박테리아 산물(예컨대 LPS) 또는 염증성 사이토카인(예컨대 인터루킨-1 및 종양 괴사 인자-I)에 대한 세포 반응으로서 유도성 NO 합성(iNOS)의 상향-조절(up-regulation)로 인해 야기된다고 밝혀져 다량의 NO가 패혈증에서의 혈관 기능부전의 병인에 기여하는 것으로 나타났다. 따라서 패혈증을 예방하기 위하여 항산화제, 소염제, 및 지질다당류(LPS)에 의해 유도되는 질소 산화물(NO) 합성의 저해제를 포함한 화합물들에 대해 많은 연구가 수행되어 왔다.

더불어 산화성 손상의 원인이 되는 퍼옥시니트라이트 또한 혈관 세포의 세포자멸과 관련된 것으로 보고되어 있어, 혈관 세포의 세포자멸을 저해하고 이를 통해 혈관 및 다수 기관의 기능부전을 예방하는 화합물들이 패혈증 또는 패혈증과 관련된 증후의 치료 또는 예방용 약물 후보들로 평가받고 있다. 그러나 이러한 연구의 결과는 만족스럽지 못했다.

따라서 지금까지 연구된 결과를 이용한 패혈증 치료제로는 그람음성 세균의 세포벽 성분인 리피드 A에 대한 단일 클론 항체, 종양 괴사인자-알파에 대한 항체, 인터루킨-1 수용체(IL-1 receptor)를 차단하는 재조합 단백질 등을 이용한 물질이 개발되어 있는 실정으로, 앞으로 좀 더 다양한 패혈증 치료제의 개발이 요구되고 있다.

한편, 본 발명자들이 향부자로부터 분리해 메탄올을 이용하여 얻은 향부자 메탄올 추출물의 경우, 지금까지 패혈증 질환을 치료하는데 효과가 좋다는 사실은 전혀 보고된 바가 없었다. 또한 본 발명자들이 향부자 메탄올 추출물로부터 분리하여 보고한 누트카톤과 발렌센 또한 리포폴리사카라이드 등에 의해 유발된 패혈증 또는 패혈증성 쇼크를 치료하는데 효과가 좋다는 사실은 전혀 보고된 바가 없었다.

이에 본 발명자들은 패혈증 질환을 예방하고 개선시킬 수 있는 효과가 우수한 새로운 조성물을 개발하던 중, 향부자 추출물에서 우수한 패혈증 질환 치료 가능성을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 누트카톤 또는 발렌센을 유효성분으로 함유하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 향부자 메탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 패혈증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 누트카톤(nootkatone) 또는 발렌센(valencene)을 유효성분으로 함유하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 누트카톤 또는 발렌센은 향부자(Cyperus rotundus)로부터 유래된 것 일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 누트카톤 또는 발렌센은 헴 옥시게나아제(heme oxygenase)-1을 유도하여 HMGB1을 억제하는 활성이 있다.

또한, 본 발명은 향부자(Cyperus rotundus) 메탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유효성분으로 향부자 메탄올 추출물의 유기용매 분획물을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유기용매는 헥산, n-부탄올, 에틸아세테이트 및 디클로로메탄으로 이루어진 군중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 누트카톤 또는 발렌센을 함유하는 것을 특징으로 하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물 일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 향부자 메탄올 추출물은 헴 옥시게나아제(heme oxygenase)-1을 유도하여 HMGB1을 억제하는 활성이 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 패혈증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 누트카톤(nootkatone)과 발렌센(valencene) 및 상기 성분을 포함하는 향부자 메탄올 추출물은 헴 옥시게나아제(heme oxygenase)-1을 유도하여 HMGB1(high mobility group box 1)을 억제하는 활성이 우수하므로, 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 LPS 처리에 따른 RAW264.7 세포에서의 HMGB1의 생성 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 HO-1의 과발현과 HMGB1의 생성 억제 활성과의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 HO-1의 과발현이 LPS로 유발된 엔도톡세미아에서의 생존률에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3b는 HO-1의 과발현이 CLP로 유발된 패혈증에서의 생존률에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 향부자 메탄올 화합물 및 누트카톤과 발렌센의 HMGB1의 억제활성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 향부자 메탄올 화합물의 용량에 따른 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 향부자 메탄올 화합물의 HO-1 유도활성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 분획물의 HO-1 유도활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 누트카톤 및 발렌센의 HO-1 유도활성을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 누트카톤(nootkatone) 또는 발렌센(valencene)을 유효성분으로 함유하는 패혈증 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에 따른 상기 누트카톤 또는 발렌센은 하기 화학식 Ⅰ 및 Ⅱ로 각각 표시되는 화합물 일 수 있다.

[화학식 I] [화학식Ⅱ]

테르펜(terpene)은 2차 산물 중 가장 많은 종류를 가진 화합물로 C, H만으로 된 정유 성분을 말하는데, 이에 포함된 테르페노이드(terpenoid)는 C, H, O 로 구성된 정유 성분을 말하며 이소프렌(isoprene) 단위(C₅H₈)가 중합되어 생합성 되므로 이소프레노이드(isoprenoid)라고도 한다. 일반적으로 물에 녹지 않으며 이소프렌 단위의 수에 따라 몇 가지 종류로 분류된다. 이소프렌 단위가 1개인 것은 헤미테르펜(hemiterpene, C5)이라고 하는데 이는 실제로는 존재하지 않는 정유성분이며 이 자체가 이소프렌에 해당된다. 또한 이소프렌 단위가 2개인 것은 모노테르펜(monoperpene, C10), 3개인 것은 세스퀴테르펜(sesquiterpene, C15)에 해당하는데, 식물의 향기성분은 대부분이 모노테르펜과 세스퀴테르펜에 해당한다. 본 발명에 따른 누트카톤(nootkatone) 및 발렌센(valencene)은 바로 상기 세스퀴테르펜(sesquiterpene)에 속하는 화합물이다.

현재 상기 누트카톤은 식물의 정유(essential oil) 물질로, 그레이프후르츠 향기를 내는 성분에 포함된 것으로 널리 알려져 있다. 그레이프후르츠 향기는 정신을 안정시키고 혈액순환을 촉진시켜 주는 것으로 알려져 있으며, 교감신경을 자극하여 호르몬을 분비하게 하여 탈공역단백질(uncoupling protein, UCP)을 생성하게 하여 지방을 열에너지로서 연소시키게 한다고 알려져 있다. 그리하여 누트카톤은 다이어트를 목적으로 한 그레이프후르츠 에센셜오일의 중요 성분으로 사용되고 있는 실정이다.

발렌센 또한 식물의 정유 물질로서, 식물로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 포함하는 병해충 방제용 조성물(KR2005-0022491)에 포함된 한 성분으로 이용되고 있고, 락카제 촉매 반응에 의한 천연 향신료의 제조 방법(KR2000-0052648)에서 락카제에 의해 촉매화 된 발렌센의 산화반응으로 천연 향신료인 누트카톤을 제조하는 방법의 원료로 사용되고 있는 실정이다.

지금까지 누트카톤 또는 발렌센만을 분리하여 본 발명에 따른 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물로서의 활용을 위한 접근은 시도된 바 없으며, 더욱이 패혈증을 일으키는 염증성 사이토카인으로 알려진 HMGB1의 억제활성의 세포수준 및 동물모델에서의 데이터를 토대로 한 패혈증 치료제에 대한 연구는 시도된 바 없었다.

본 발명에 따른 상기 누트카톤 또는 발렌센은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 누트카톤 또는 발렌센은 종래의 물질을 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 향부자(Cyperus rotundu)로부터 수득될 수 있다. 이때, 상기 향부자는 목적하는 추출물을 획득하기 위해 적절히 탈수하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 탈수한 후 마쇄하여 분말화 된 것을 사용할 수 있다.

상기 향부자(Cyperus rotundu)는 사초과(莎草科, Cyperaceae)에 속하는 다년초로서 바닷가와 냇가의 양지쪽에서 잘 자라며, 근경(根莖)은 옆으로 길게 뻗고 끝부분에 괴경이 생기고 수염뿌리가 내리는 식물이다. 괴경의 살은 백색이며 향기가 있고, 잎은 총생하고 폭은 2-6mm로 선형이며 밑부분이 염초로 되어 화경을 둘러싼다. 7-8월에 잎 사이에서 높이 20-30cm의 화경이 나와 꽃이 피고 포는 2-3개이며 화서의 가지는 1-7개로서 길이가 서로 같지 않다. 수과는 긴 타원형이고 흑갈색이며 향부자의 가는 뿌리를 제거한 뿌리줄기는 민간이나 한방에서 진통, 소염, 이뇨, 통경제로서 부인병의 요약으로 알려져 있고 향소산, 향사육군자탕, 향사평위산 등에 배합되거나 수치(修治)하여 사용하기도 한다. 향부자에는 1% 정도의 정유(essential oil)가 함유되어 있으며 주성분은 사이페론(cyperone), 사이페롤(cyperol), 사이페렌(cyperene), 파출리논(patchoulenone), 사이페로턴돈(cyperotundone) 등이다.

본 발명에 따른 누트카톤 또는 발렌센을 향부자로부터 추출 및 분리하는 과정을 보다 상세하게 살펴보면 다음과 같다.

먼저, 제주도 남부나 다도해에서 주로 재배되는 향부자를 구입하여 상기 기술한 바와 같이 마쇄하여 분말화 한 후, 상기 분말화된 향부자의 건조 중량에 대해 약 1배 내지 10배, 바람직하게는 약 2배 내지 5배의 메탄올을 첨가한 후, 당업계에 공지된 용매 추출 방법을 통해 향부자의 조추출물을 수득할 수 있다. 상기 용매 추출 방법으로는 이에 제한되지는 않으나, 열수 추출법, 냉침 추출법, 환류 냉각 추출법 또는 초음파 추출법 등을 1회 또는 수회 반복하여 추출할 수 있다.

이후, 상기 수득한 향부자 메탄올 추출물은 감압, 여과 및 농축 과정을 거쳐 각종 용매에 용해될 수 있도록 농축 건조된 향부자 메탄올 추출물의 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 공기 건조시킨(air dried) 향부자 뿌리줄기 부분을 메탄올을 사용하여 실온에서 향부자 메탄올 조추출물을 3차례에 걸쳐 수득한 후 감압 과정을 거쳐 농축 건조된 메탄올 추출물을 제조하였다(실시예 1 참조).

상기 농축된 향부자 메탄올 추출물은 다시 물에 현탁한 다음, 유기 용매들을 이용하여 용매 추출방법을 통해 향부자 메탄올 추출물의 분획물을 수득할 수 있다.

상기 유기 용매로는 이에 제한되지는 않으나, 앞서 용매로 사용한 메탄올을 제외한 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 시클로헥산 등을 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 n-부탄올을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 헥산을 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 물에 현탁된 상기 향부자의 메탄올 추출물을 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 n-부탄올을 추출용매로 사용하여 상기 추출과정을 통해 본 발명의 향부자 메탄올 추출물의 각 분획물을 수득하였다(실시예 1참조).

이후, 본 발명에 따른 누트카톤 또는 발렌센은 상기 기술된 방법으로 수득한 향부자 메탄올 추출물 또는 그의 분획물을 실리카겔(silica gel)이나 키에셀 겔 또는 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그래피(column chromatography) 및 고속액체크로마토그래피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행함으로써 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 향부자의 헥산 가용추출물인 헥산 분획물에 대하여 실리카 겔 컬럼에서 단계적으로 헥산-디클로로메탄(3:1과 1:1), 디클로로메탄, 헥산-디클로로메탄-메탄올(10:10:1) 용매를 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 실시하였고, 추출된 분획물들은 그들의 TLC 패턴에 따라 분획 F1-F12의 12개의 분획으로 모았다. 그리고는 F1-F3의 분획을 다시 실리카 겔에서 헥산-에틸 아세테이트 혼합용매를 이용해 크로마토그래피를 하여 발렌센을 추출해 내었고, 분획 7의 단계적 용리 용매 시스템(헥산:에틸아세테이트=15:1,7:1,3:1,1:1)을 통해 누트카톤을 분리 및 정제하였다(실시예 1 참조).

그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.

따라서 본 발명의 누트카톤 또는 발렌센은 순수하게 분리 및 정제된 화합물의 형태로 사용될 수 있으며, 또한 이를 함유하는 추출물의 형태로도 사용될 수 있다. 본 발명에서 상기 추출물은 향부자를 앞서 기술한 바와 같이 메탄올로 추출하여 수득한 추출물 또는 그의 분획물로서 헥산, n-부탄올, 에틸아세테이트 또는 디클로로메탄 가용추출물일 수 있으며, 그 중 특히 헥산 분획물 또는 디클로로메탄 분획물 일 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 누트카톤 또는 발렌센과 향부자 메탄올 추출물 및 이의 유기용매 가용 추출물인 분획물은 패혈증 또는 패혈증성 쇼크를 예방 또는 치료할 수 있다는 특징이 있다.

일반적으로 세균이 혈액 속에 들어가 번식하면서 그 생산한 독소에 의해 중독 증세를 나타내거나, 전신에 감염증을 일으키는 질환인 패혈증과 그로인한 쇼크는 사망률이 매우 높아 환자들에게 큰 생명의 위협이 되고 있으나, 현재까지 적합한 치료제가 개발되지 못하고 있어 이에 대한 치료용 조성물의 개발이 시급한 실정이다.

패혈증은 초기 단계에 세균성 내독소(endotoxin)가 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)(TNF, IL-1α 및 IL-6)을 분비하는 선천적 면역계의 세포들을 자극한다. 이와 같은 초기의 사이토카인은 뒤이어 TNF, IL-1α, IL-1β, IL-1Ra, IL-6, IL-8, IL-18, IFN-γ, PAF, 등과 같은 사이토카인의 분비에 의해 매개되는 병리적 후유증을 유발하는 후기-작용 하류 매개자(later-acting downstream mediator)인 단백질 HMGB1 분비를 유도하여, 다발적 발병(multisystem pathogenesis) 또는 치명적인 전신성 염증(lethal systemic inflammation)을 초래한다.

상기 HMGB1 단백질은 고 이동성 군(high mobility group:HMG) 단백질의 패밀리에 속한다. 폴리아크릴아미드 겔에서의 높은 전기영동 이동성 때문에 고 이동성 그룹 단백질(HMG)이라 불리는 HMG 단백질은 진핵생물 세포에서 분리된 크로마틴과 결합된 가장 편재된 비-히스톤 단백질이다. 이 단백질은 DNA 구조를 비틀고, 구부리거나 또는 변형시키고 전사 인자 또는 히스톤과 복합체를 형성하기 때문에 DNA 벤딩(bending), 루핑(looping), 폴딩(folding) 및 랩핑(wrapping)에서 일반화된 '구성적(architectural)' 역할을 수행한다. 고 이동성 그룹 1(HMGB1) 단백질은 통상적으로 핵 인자(nuclear factor), 특히 DNA 벤딩을 유발하고 여러 전사 복합체(transcriptional complex)의 결합을 촉진하는 전사 조절 분자이다.

구조적으로, HMGB1 단백질은 포유류에서 고도로 보존되어, 모든 포유류의 종들에서 214개의 아미노산 중 2개가 보존성 치환(conservative substitution)을 갖는 것인 서열을 갖는 약 25kDa의 단백질이다. HMGB1은 모든 척추동물 핵에 존재하고 특히, 섬유아세포, 신경세포, 간세포, 신경교세포 및 단핵구/대식세포, 호중구 및 혈소판을 포함하는, 조혈모 간세포로부터 유래된 세포들에서 확인될 수 있다.

세포 외로 분비된 HMGB1은 강력한 사이토카인 및 매우 강력한 대식세포-자극 인자로 작용한다. HMGB1은 직접 세포막에 결합하여, 신호전달 및 주화성을 유도하고, 케모카인-유사 기능(chemokine-like function)을 가지며, 전-염증성 사이토카인의 발현 및 분비를 상향조절하는 것에 의해 간접적으로 작용한다. 이에 의해, 세포 외 HMGB1 단백질은 효과적인 염증성 면역 반응을 촉진하는 강력한 주화성 단백질 및 면역조절 단백질이 된다.

체내에서 분비되는 경우, HMGB1은 매우 강력한 사이토카인이고 강력한 대식세포-자극 인자이다. 실제로, 내독소혈증(endotoxemia)의 다른 사이토카인 매개자들과 같이, HMGB1은 생체 외에서 인간 대식세포로부터의 복수의 전-염증성 사이토카인(TNF,IL-1α, IL-1β, IL-1Ra, IL-6, IL-8, MIP-1α 및 MIP-1β)의 케스캐이드(cascade)를 활성화시킨다. 따라서 HMGB1은 급성 염증 시 후기 매개자(late mediator)로 작용하고 조기 매개자 반응이 해소된 후 전신성 염증의 발병에 중요하게 관여한다.

따라서 HMGB1의 방출 및 작용을 억제하게 되면 엑도톡세미아(내독소혈증) 및 패혈증의 발병을 억제할 수 있게 된다.

한편, 이러한 HMGB1의 억제활성은 HO-1의 과발현으로 인해 가능하다. 헴 옥시게나제(Heme oxygenase, HO)는 조직 및 세포 내 헴(Heme)의 생성 및 축적을 억제하기 위한 헴 분해효소로, 다양한 유도체들에 의해서 유도 발현되는 HO-1(inducible form)과 세포 내에서 항상 일정한 정도로 존재하는 HO-2(constitutive form) 효소들이 생체 내 세포, 조직 및 기관보호를 위하여 그 활성을 나타낸다. 이와 같은 보호 작용은 HO 효소활성으로 생성되는 세포 내 주요 성분인 철분(iron)의 생성, 그리고 일산화탄소(carbon monoxide, CO) 생성 및 담즙 색소인 담록소와 담록소들의 항산화효과 등의 중요한 기전에서 비롯된다.

특히, 유도형인 HO-1은 세포 및 기관들이 다양한 자극으로 손상될 수 있는 염증반응, 저/고산소증, 심혈관계질환, 퇴행성질환, 노화 등 무수한 자극에 대한 방어효과로 유전자발현의 전사단계에서부터 유도된다. 이에 본 발명자들은 HO-1의 유도발현이 HMGB1의 방출을 억제하여 LPS와 CLP로 인해 유도된 패혈증 모델에서의 생존율을 높이는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명자들은 결과적으로 본 발명에 따른 누트카톤, 발렌센, 향부자의 메탄올 추출물 및 향부자 메탄올 추출물의 유기용매 가용추출물이 HO-1 효소의 활성을 과조절하여 생체 내에서 과발현시키고, 이로 인해 HMGB1의 생성을 억제하게 되어 패혈증의 발병을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인해 보고자 하였다.

이에 본 발명의 일실험예에 따르면, 본 발명자들은 우선 HO-1의 과발현에 따른 HMGB1 방출 억제 활성을 확인해보고자 HO-1 유도물질(inducer)로 알려진 헤민(hemin) 또는 CoPPIX과 HO-1의 활성을 방해하는 siHO-1과 세포내 HO-1을 발현시킬 수 있는 mHO-1을 이용하여 상기 실험을 수행하였다. 그리고 각각의 비교실험으로 스크램블(scramble)로 형질 전환된 세포와 빈 벡터(empty vector)로 형질전환 시킨 세포를 이용하였고, LPS로 자극을 주고 16시간 이후에 배양된 배지를 모아 HMGB1의 레벨을 측정하였다. 그리고 당업자에게 잘 알려진 웨스턴 블롯(Western Blot)을 통해 세포 전체를 용출시켜 HO-1의 검출을 실시하였다. 그 결과, 도 2a 및 b에서 볼 수 있듯이 HO-1의 과발현이 HMGB1의 발현을 억제한다는 사실을 확인할 수 있었다(실험예 1 참조).

또한, 본 발명의 다른 일실험예에 따르면, 상기 실험예에서 더 나아가 HO-1의 과발현이 치명적인 엔도톡세미아(내독소혈증)과 패혈증에서 동물 모델의 생존률을 높힐 수 있는지에 대해 실험을 실시하였다. LPS로 유도한 엔도톡세미아와 외과적 수술인 CLP로 유도된 패혈증 동물 모델에서 HO-1의 유도물질인 헤민(hemin)과 CORM(CO-releasing molecule)-2의 처리는 도 3a 및 b에서와 같이 엔도톡세미아와 패혈증을 방어함을 알 수 있었는바, 결과적으로 본 발명자들은 HO-1의 과발현이 HMGB1의 방출을 감소시키고 치명적인 엔도톡세미아(lethal todoxemia)와 패혈증에서의 생존률을 높힐 수 있음을 확인할 수 있었다(실험예 2 참조).

또한, 본 발명의 다른 일실험예에 따르면, 본 발명에 따른 향부자 메탄올 추출물 및 그의 유기용매를 이용해 분획화한 프랙션과 그 프랙션에서 분리한 누트카톤과 발렌센 성분이 HO-1의 유도활성이 있는지 확인하고자 하였다. 그 결과, 도 6에서와 같이 향부자 메탄올 추출물의 경우 그 농도에 비례하게 배양된 세포의 배지에서 발견되는 HO-1의 양이 점차 많이 발견됨을 확인할 수 있었다. 또한 향부자 메탄올 추출물의 실시예 1에서 분획화 한 프랙션들 중 헥산 프랙션에서 매우 강한 HO-1 유도활성을 발견할 수 있었으며, 디클로로메탄 프랙션에서는 미약한 HO-1 유도활성을 발견할 수 있었다(도 7 참조). 더불어 여러 프랙션에서 정제 및 분리된 여러 성분의 HO-1 유도 여부를 확인한 결과 도 8에서와 같이 누트카톤과 발렌센 성분만이 첨가된 군에서만 강한 HO-1 유도 활성이 확인되었다(실험예 4 참조).

그리하여 본 발명의 다른 일실험예에서는 본 발명에 따른 향부자 메탄올 추출물 및 그의 유기용매를 이용해 분획화한 분획물에서 분리한 누트카톤과 발렌센이 최종적으로 패혈증을 방어할 수 있는 HMGB1의 억제활성이 존재하는지 확인하였다. 그 결과, 도 4에서와 향부자 메탄올 추출물과 누트카톤, 발렌센을 첨가한 군에서 HMGB1의 방출 효과가 효과적으로 차단되는 것을 확인할 수 있었다(실험예 3 참조).

따라서 상기 실험예의 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 누트카톤 및 발렌센, 향부자 메탄올 추출물 및 이의 분획물이 HO-1의 유도 활성이 우수하여 HMGB1을 효과적으로 억제할 수 있는바, HMGB1으로 인해 유도된다고 알려진 패혈증 및 패혈증으로 인한 쇼크를 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명에 따른 누트카톤 및 발렌센, 향부자 메탄올 추출물 및 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 헴 옥시게나아제-1의 발현을 유도하고, 패혈증을 일으키는 HMGB1 단백질의 생성을 억제하는 활성이 우수하므로 패혈증 및 패혈증성 쇼크의 증상들을 예방, 개선 및 치료하는데 사용할 수 있다.

그러므로 본 발명은 누트카톤 및 발렌센을 유효성분으로 함유하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하며, 또한 본 발명은 상기 화합물들을 포함하는 향부자 추출물 또는 이의 분획물인 헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올, 디클로로메탄 가용추출물을 유효성분으로 함유하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 조성물은 패혈증 또는 패혈증성 쇼크 증상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 누트카톤 또는 발렌센을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 “약학적으로 유효한 양”이란 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 누트카톤 또는 발렌센의 약학적으로 유효한 양은 0.0001~ 100mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.001~10mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 패혈증 또는 패혈증성 쇼크 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 약제학적 분야의 통상적인 방법에 따라 주사제, 액상제, 환제, 정제, 캅셀제, 산제 및 현탁제 등의 제제로 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있으며, 바람직하게는 정제, 캅셀제, 또는 액상제이다.

본 발명에 따른 패혈증 또는 패혈증성 쇼크 증상의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 패혈증 또는 패혈증성 쇼크 증상의 예방 또는 치료용 조성물은 패혈증 또는 패혈증성 쇼크 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 본 발명에 따른 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약제를 제공할 수 있다.

나아가 본 발명에 따른 패혈증 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 천연식물인 향부자로부터 유래된 약리성분인 누트카톤 및 발렌센을 포함하고 있어 약물에 대한 독성 및 부작용이 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있으므로 체내에 대해 매우 안정한 특징이 있다.

따라서 본 발명의 패혈증 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 패혈증 또는 패혈증성 쇼크 증상을 예방 또는 개선하기 위한 식품에 첨가할 수 있으므로, 상기 본 발명의 조성물은 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 개선을 위한 식품용 조성물로 사용할 수 있다.

그러므로 본 발명의 패혈증 또는 패혈증성 쇼크 증상의 예방 또는 개선을 위한 식품용 조성물은 패혈증 증상의 예방 또는 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.

본원에서 상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.

본원발명에 따른 패혈증 또는 패혈증성 쇼크 증상의 예방 또는 개선용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 “기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 본원발명에서 상기“음료”란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 패혈증 또는 패혈증성 쇼크 증상의 예방 및 개선용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 패혈증 또는 패혈증성 쇼크 증상의 예방 또는 개선용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본원발명의 패혈증 또는 패혈증성 쇼크 증상의 예방 또는 개선용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

향부자 메탄올 추출물과 그의 분획물의 제조 및 누트카톤과 발렌센의 분리

향부자의 메탄올 추출물을 제조하기 위해 향부자(Cyperus rotundus)의 뿌리줄기를 서울의 경동시장에서 구입하여 원료로 사용하였다. 건조된 상태의 향부자 뿌리줄기 3kg을 절단한 후, 메탄올을 이용하여 상온에서 3차례에 걸쳐 추출하였다. 메탄올 추출물(ECR)을 감압하에서 증발시켰고, 남은 침전물은 증류수에서 현탁시켰다.

이를 통해 획득한 추출물을 헥산, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, n-부탄을 이용해 분획화하였다. 그 결과 헥산 추출물은 34.61g, 디클로로메탄 추출물은 10.71g, 에틸 아세테이트 추출물은 3.7g, n-부탄올 추출물은 18.31g, 물 추출물은 204.51g이 얻어졌다. 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 분획물은 컬럼 크로마토그래피 분리를 하였다. 헥산 분획물은 실리카 겔 컬럼에서 단계적으로 헥산-디클로로메탄(3:1과 1:1), 디클로로메탄, 헥산-디클로로메탄-메탄올(10:10:1) 용매를 이용해 분획화하였다. 그리고 이러한 분획물들은 그들의 TLC 패턴에 따라 분획 F1-F12로 모았다.

F1-F3의 분획은 다시 실리카 겔에서 헥산-에틸 아세테이트 혼합용매를 이용해 크로마토그래피를 하여 발렌센, 베타-핀넨(β-pinene), 리모넨(limonene), 파라-사이멘(p-cymene), 1,8-시네올(cineole)을 수득하였다. 이들은 이전에 공표된 문서(Guerrini, 2006; Minyard, Tumlinson, Hedin, & Thompson, 1965; Miyazawa, Kameoka, Morinaga, Negoro, & Mura, 1989; Majetich, Behnke, & Hull, 1985)의 데이터와 본 실험을 통한 상기 물질들의 스펙트럼의 데이터를 상호 비교하여 확인할 수 있었다.

누트카톤은 분획 7의 단계적 용리 용매 시스템(헥산:에틸아세테이트=15:1,7:1,3:1,1:1)을 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 수득하였고, 이는 이전에 공표된 스펙트럼의 데이터(Miyazawa, Nakamura, & Ishikawa, 2000)를 기준으로 상호 비교하여 확인하였다.

< 실시예 2>

향부자 메탄올 추출물과 그의 분획물 , 누트카톤과 발렌센의 활성분석

본 실시예에 사용된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)은 Gibco BRL에서 구입하였고, 항(Anti)-iNOS 항체는 트랜스덕션 래버러토리스(Transduction Laboratories)에서, 항 β-actin과 항 HO-1은 산타크루즈바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)에서, 웨스턴 블로팅(Western blotting)에 사용된 ECL(Enhanced chemiluminescence) 검출 시약은 엠머샴(Amersham)에서, 그 외 LPS를 포함한 모든 화학물질은 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich)사에서 구입하여 사용하였다. 또한 실험 전반에 사용된 RAW264.7 세포는 ATTC(American Type Culture Collection)에서 구입하였으며, 상기 세포는 RPMI-1640 배지에 25mM의 HEPES(N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N-2-ethanesulphonic acid), 100U/ml 페니실린, 100g/ml 스트렙토마이신, 10% 열-불활성된(heat-inactivated) 소태아혈청(fetal calf serum)을 섞어 배양하였다.

향부자 메탄올 추출물과 그의 분획 및 그로부터 분리한 누트카톤과 발렌센이 패혈증 증상의 예방 또는 치료용 효과에 관한 활성 분석을 위해, 본 발명자들은 우선 HO-1의 과발현에 따른 HMGB1의 생성 억제 활성을 확인하였고, HO-1의 과발현이 치명적인 내독성혈증(lethal endotoxemia)과 패혈증에서 생존률을 높힐 수 있는 지에 관한 실험을 시행하였으며 본 발명에 따른 향부자 메탄올 추출물 및 그의 분획과 누트카톤, 발렌센의 HO-1의 유도활성 여부 및 그로 인한 HMGB1 단백질의 억제활성을 확인하였다.

상기의 실험에서 도출된 모든 데이터는 반복실험에서 얻어진 값을 평균±표준편차의 값으로 나타내었고, 데이터 사이의 차이는 뉴만-컬스 테스트(Newman-Keuls tests)에 따라 변수 한 방향 분석(one-way analysis of variance)에 따라 평가하였고, P < 0.05 혹은 P < 0.01 일 때만이 통계적으로 유의하다고 보았다.

< 실험예 1>

HO -1의 발현에 따른 HMGB1 의 방출 억제 활성

HO-1은 잠재점인 염증성 사이토카인의 조절자로 알려져 있으나 대식세포에서의 HMGB1에 대한 영향력은 아직 알려져 있지 않다. RAW264.7 세포에 LPS 1㎕/㎖를 4, 8, 16, 24시간 동안 반응시킨 후, 배양된 배지 샘플들을 각각 농축한 뒤 HMGB1을 검출하였다. 그 결과, 도 1에서 알 수 있듯 대식세포에서의 HMGB1 방출은 RAW264.7 세포의 LPS 처리이후 16시간 흐른 후 발견됨을 알 수 있다. 따라서 하기의 실험은 LPS 처리이후 16시간을 기준으로 시행하였다.

본 발명자들은 본격적으로 HO-1 단백질의 과발현이 HMGB1의 방출을 저하 조절 시킬 수 있는지 알아보기 위해, HO-1 유도물질(inducer)로 알려진 헤민(hemin) 또는 CoPPIX과 HO-1의 활성을 방해하는 siHO-1, 세포내 HO-1을 발현시킬 수 있는 mHO-1을 이용하여 실험을 수행하였다. 우선 siHO-1 또는 스크램블(scramble)로 형질 전환된 세포를 준비한 후, 형질 전환된 세포들에 미리 헤민(10M) 또는 CoPPIX(10M)을 1시간 동안 처리한 후, LPS(1g/ml)로 반응시켰다. 그런 후 HMGB1과 HO-1의 레벨을 측정하였다.

그 결과, 도 2a에서 볼 수 있듯이 우선 LPS만을 처리한 군에서는 HO-1가 정상적으로 발현되었고 HMGB1의 방출도 확인되었다. 그러나 HO-1 유도물질이 첨가되고 스크램블된 대조군 형질전환 세포를 첨가한 군에서는 HO-1이 과발현된 것이 확인되었고, 이에 HMGB1이 억제되어 발현되지 않음을 확인할 수 있었다. 그러나 HO-1 유도물질이 첨가됨과 동시에 HO-1의 활성을 막는 siHO-1가 첨가된 군에서는 모두 HMGB1가 그대로 발현되었다. 이는 siHO-1로 인해 HO-1의 활성이 억제되는바, HO-1이 제대로 기능하지 못하게 되어 HMGB1이 그대로 발현되는 것을 증명하는 것이라 할 수 있다.

또한, 또 다른 실험에서는 mHO-1 혹은 빈 벡터(empty vector)로 형질전환 시킨 세포를 이용하여 LPS로 자극을 준 후, 16시간 이후에 배양된 배지를 모아 HMGB1의 레벨을 측정하였다. 그리고 당업자에게 잘 알려진 웨스턴 블롯(Western Blot)을 통해 세포 전체를 용출시켜 HO-1의 검출을 실시하였다. 그 결과, 도 2b에서 볼 수 있듯이 빈 벡터와 LPS만을 넣은 군에서는 정상적으로 HO-1이 발현되었고 이에 HMGB1 또한 정상적으로 발현되었으나, mHO-1을 넣은 실험군에서는 HO-1이 과발현되어 HMGB1의 생성이 억제되었음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명자들은 상기 실험들을 통해 HO-1의 과발현이 HMGB1의 발현을 억제한다는 사실을 확인할 수 있었다.

< 실험예 2>

HO -1의 과발현이 치명적인 엔도톡세미아(lethal todoxemia)와 패혈증에서 생존률 높힐 수 있는지 여부

상기 실시예의 결과와 더불어 본 발명자들은 패혈증과 치명적인 엔도톡세미아에 걸린 동물 모델에서의 HO-1의 과발현에 대한 영향력을 확인하기 위하여 하기의 실험을 시행하였다. 그 결과, 헤민(hemin)과 CORM(CO-releasing molecule)-2의 처리는 도 3a에서와 같이 치명적인 엔도톡세미아로 인한 동물의 죽음을 감소시켰다. 엔도톡세미아가 복잡한 패혈증의 사이토카인 캐스케이드를 조사하는데 유용하다 할지라도, 좀 더 임상적으로 관련 있는 동물 모델은 CLP로 인해 유도된 패혈증 모델이다. 따라서 본 발명자들은 HO-1 유도자가 CLP로 자극된 동물의 치사율을 감소시킬 수 있는지 또한 조사하였다.

엔도톡세미아는 7~8주 정도의 20~25g의 BALB/c의 수컷 쥐의 복막 내부에 박테이아 엔도톡신(LPS 15mg/kg)을 주입하여 유발하였다. 패혈증을 유발하기 위해 BALB/c 쥐는 자일라진(6mg/kg)과 케타민(30mg/kg)으로 마취시킨 후, 2cm 미드라인 절개를 실시하여 맹장과 이에 인접해 있는 장을 노출시켰다. 맹장은 맹장 팁에서부터 5mm를 3.0-실크 봉합(silk suture)으로 단단히 접합시키고, 22-게이지 바늘(gauge needle)로 하나의 구멍을 내었다. 그 후 맹장은 약하게 손으로 짜 구멍난 곳으로부터 적은량의 배설물은 제거하였으며 다시 복막강으로 위치시켜 놓았고, 개복수술 자리는 4.0 실크로 꿰맸다. 대조군 동물은 맹장을 노출시켰으나 접합시키거나 구멍을 내지 않고 다시 복강으로 되돌려 놓았다. 상기 실험에 사용된 쥐는 동물 실험실의 사용과 주의에 대한 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals , Institute of Laboratory Animal Resources)에 따라 관리되었고, 상기 프로토콜은 미리 경상대학교 동물 보존 협회에 승인을 받았다.

BALB/c 쥐 20마리에 헤민(10mg/kg)과 ZnPPIX(5mg/kg)을 함께, CORM-2(30mg/kg), ruthenium chloride(30mg/kg), DMSO을 2시간 동안 각각 처리하였다. 그런 다음 한 군의 쥐에 LPS(15mg/kg)를 첨가하여 치명적인 엔도톡시미아(lethal endotoxemia)를 유발시켰고, 다른 한 군의 쥐에는 CLP의 방법으로 패혈증을 유발하였다. 그 후, 12, 24, 28, 48, 96시간 이후에 모델 동물의 복막 안쪽으로 DMSO, 헤민(10mg/kg), CORM-2(30mg/kg)을 처리하고는 2주 동안 매일 쥐의 생존 여부를 관찰하였다. 상기 실험은 3번 독립적으로 반복하였고, 그 결과는 평균±표준오차로 나타내었고, P<0.01은 DMSO 처리된 동물과 비교하였다.

그 결과, 도 3b에서 볼 수 있는 헤민과 CORM-2는 CLP로 인해 유도된 쥐의 사망률을 감소시켰고, 헤민과 HO-1 억제제인 ZnPPIX를 함께 처리했을 경우는 동물의 치사율을 감소시키지 못했다. 이러한 실험 결과를 통해 HO-1의 과조절과 CO는 패혈증과 엔도톡세미아로부터 생존을 가능함을 알 수 있었다. 더불어, RuCl₂의 처리와 CORM-2의 네거티브 대조군(negative control)은 CLP로 유도된 패혈증과 치명적인 엔도톡세미아에 대항한 어떤 방어도 발견되지 않았다. 결과적으로, HO-1의 유도자인 헤민의 처리는 치명적인 엔도톡세미아와 패혈증을 방어함을 알 수 있었는바, 이를 통해 HO-1의 과발현은 HMGB1의 방출 감소시키고, 치명적인 엔도톡세미아(lethal todoxemia)와 패혈증에서 생존률을 높힐 수 있음을 확인할 수 있었다.

< 실험예 3>

향부자 메탄올 추출물 및 누트카톤과 발렌센의 HMGB1 의 억제 활성

상기 실험예에서 확인한 바와 같이 HO-1의 과조절은 LPS로 활성화된 대식세포에서 HMGB1의 방출을 억제한다. 이에 본 발명자들은 향부자 메탄올 추출물과 그의 프랙션과 거기에서 분리된 누트카톤과 발렌센이 활성화된 대식세포에서 HMGB1의 방출을 억제할 수 있는지 확인하고자 하였다.

HMGB1 분석은 이전에 공지된 방법(Tsoyi et al., 2009)에 따라 수행하였는데, 배양된 배지 샘플들을 원심분리하여 세포의 잔해를 제거한 후, 샘플들과 같은 볼륨을 아미콘(Amicon) Ultra-4-10000 NMWL(Millipore)의 40-폴드로 농축시켰다. 원심분리는 4℃에서 고정각(fixed angle)이 35°가 되도록 하고 7500g에서 20분간 시행하였다. 농축된 샘플은 2x 로딩 다이(loading dye)와 섞어 당업자에게 잘 알려진 면역염색법(immunoblotting)을 시행하여 HMGB1의 방출정도를 파악하였다.

그 결과, 도 4에서와 같이 LPS만이 처리된 대식세포에서의 HMGB1의 방출은 매우 높게 나타났다. 반면, 향부자 메탄올 추출물과 누트카톤, 발렌센을 첨가한 실험군에서는 HMGB1의 방출 효과가 효과적으로 차단되는 것을 볼 수 있었다.

< 실험예 4>

향부자 메탄올 추출물 및 누트카톤과 발렌센의 H0 -1의 유도 활성

우선 향부자 메탄올 추출물이 가진 세포의 생존능력을 확인하기 위하여 RAW264.7 세포를 이용하여 당업자에서 잘 알려진 공지의 MTT 어세이를 통해 실험을 수행하였다. 도 5에서와 같이 향부자 메탄올 추출물(ECR)의 세포독성(cytotoxicity)은 그 용량이 50/ml가 될 때까지 나타나지 않았다.

다음으로 본 발명자들은 향부자 메탄올 추출물이 HO-1의 유도활성이 있는지 향부자 메탄올 추출물의 첨가량을 달리하며 테스트하였다. 그 결과, 도 6에서와 같이 향부자 메탄올 추출물의 농도에 비례하게 HO-1이 점차 많이 발현됨을 확인할 수 있었다.

또한 향부자 메탄올 추출물의 상기 실시예 1에서 분획화 한 분획물들에서의 HO-1 유도 활성에 대해서도 실험을 시행하였다. 그 결과, 도 7에서와 같이 헥산 프랙션에서 매우 강한 HO-1 유도활성을 발견할 수 있었으며, 디클로로메탄 프랙션에서는 아주 미약한 HO-1 유도활성을 발견할 수 있었고 그 외의 프랙션에서는 HO-1의 유도활성이 전혀 확인되지 않았다.

더불어 본 발명자들은 향부자 메탄올 추출물에서 최소 10개의 화합물을 확인하였는데, 이에 각 성분의 HO-1 유도 여부를 확인하였다. 그 결과, 도 8에서와 같이 누트카톤과 발렌센이 첨가된 군에서만 강한 HO-1 유도 활성이 확인되었다.

따라서 상기 결과를 통해 본 발명은 HO-1의 유도 활성이 우수하여 HMGB1을 효과적으로 억제할 수 있는바, HMGB1으로 인해 유도된다고 알려진 패혈증 및 패혈증으로 인한 쇼크를 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

1. 누트카톤(nootkatone) 또는 발렌센(valenecene)을 유효성분으로 함유하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 누트카톤 또는 발렌센은 향부자(Cyperus rotundus)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 누트카톤 또는 발렌센은 헴 옥시게나아제(heme oxygenase)-1을 유도하여 HMGB1을 억제하는 것을 특징으로 하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물.
4. 향부자(Cyperus rotundus) 메탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   상기 유효성분으로 향부자 메탄올 추출물의 유기용매 분획물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물.
6. 제5항에 있어서,
   상기 유기용매는 헥산, n-부탄올, 에틸아세테이트 및 디클로로메탄으로 이루어진 군중에서 선택된 것을 특징으로 하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물.
7. 제4항에 있어서,
   상기 추출물은 누트카톤 또는 발렌센을 함유하는 것을 특징으로 하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물.
8. 제4항에 있어서,
   상기 향부자(Cyperus rotundus) 메탄올 추출물은 헴 옥시게나아제(heme oxygenase)-1을 유도하여 HMGB1을 억제하는 것을 특징으로 하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 패혈증 예방 또는 개선용 건강기능식품.

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