KR101576916B1 - 설퍼레틴을 유효성분으로 포함하는 치수질환 치료 또는 개선용 조성물 - Google Patents
설퍼레틴을 유효성분으로 포함하는 치수질환 치료 또는 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 치수세포 보호효과를 갖는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 옻나무에서 분리된 성분 중 치수세포 보호효과가 우수한 물질이 설퍼레틴임을 확인하여 완성한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 치수질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 상기 설퍼레틴은 천연물인 옻나무로부터 분리된 것으로, 치수세포에 대한 세포보호효과가 우수하여 치수세포 손상으로 인한 치과 질환 치료, 개선 및 예방을 위한 약학 조성물 또는 건강기능성식품과 같은 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 치수질환 치료, 개선 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
치수(dental pulp)는 치아의 내부에 있는 치수강을 채우고 있는 부드러운 결합조직으로 신경과 혈관이 풍부하게 분포해 있는데, 치수의 신경은 치수의 최외층에서 치아의 상아질 내면에 접해 있는 상아아세포에서 신경총을 이루고, 그 가지가 상아질의 표층에까지 이르고 있다.
상기 치수 세포의 보호는 세포보호기전과 밀접하게 관련되어 있는 효소로 알려진 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 발현 또는 활성의 증가와 밀접하게 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
상기 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 주요 기능은 헤마틴(Heme)의 산화를 유도하여 상기 헤마틴(Heme)을 담록소(biliverdin), 유리형 철분(free iron)과 일산화탄소(carbon monoxide)로 분열시키는 것이다. 상기 담록소는 빌리베르딘 리덕타아제(biliverdin reductase)에 의해서 빌리루빈(bilirubin)으로 변환되고, 이는 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS) 소거제 역할을 하여 항산화 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다. 또한, 상기 일산화탄소는 항염 효과를 가지고, 상기 유리형 철분은 페레틴 합성(ferritin synthesis)에 관여하며, 세포보호효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 이러한 작용에 의하여, 상기 헤마틴 산화효소-1(HO-1)는 상기 헤마틴(Heme)의 산화유도를 통해 담록소(biliverdin), 궁극적으로는 빌리루빈(bilirubin), 유리 철(free iron) 및 일산화탄소(carbon monoxide)의 분해산물을 생산하여, 외부 자극에 대한 세포보호효과를 발휘하게 된다.
따라서, 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 발현 또는 활성의 증가는 외부 자극에 대한 세포 보호에 중요한 세포적인 메커니즘을 가지고 있는 것으로 보고되고 있다.
그러므로, 상기 치수 부위에서 헤마틴 산화효소-1의 발현 또는 활성의 증가는 치수조직에서 손상된 세포를 회복시키는 기전과 세포가 스트레스 상황에 적응하는 것과 관련된 기전에 모두 중요한 영향을 줄 수 있다.
상기 치수조직은 주변 환경에 의해 염증 반응이나 조직의 손상이 쉽게 일어나며, 상아질(dentinogenesis)과 같은 주변 조직의 손상까지 일으킬 수 있으므로, 치수조직의 손상과 관련해서는 조기치료가 요구되고, 무엇보다 치수조직의 손상을 예방하는 것이 중요하다.
이와 관련하여, 상대적으로 안전성에 대한 문제가 발생할 가능성을 최소화 할 수 있을 것으로 기대되는 천연물 유래 물질 중에서 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1)의 발현 유도에 의한 치수세포의 보호 및 산화적 손상 억제 효과가 우수하고, 부작용은 미약한 치수질환 치료, 개선 또는 예방을 위한 성분의 개발이 요구되고 있다.
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본 발명의 목적은 천연물 유래 치수세포 보호효과를 갖는 물질을 유효성분으로 하는 치수세포 보호용 조성물, 구체적으로 천연식물 유래 성분을 유효성분으로 포함하는 치수질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 천연식물 유래 성분을 유효성분으로 포함하는 치수질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 옻나무 유래 성분, 구체적으로 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 치수질환은 치수충혈, 치수염, 치수괴사, 치수괴저, 치수변성 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 치수질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 치수질환은 치수충혈, 치수염, 치수괴사, 치수괴저, 치수변성 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 또한, 상기 식품 조성물은 건강기능식품일 수 있다.
또한, 본 발명은 옻나무로부터 치수질환 예방 또는 개선 효과가 우수한 설퍼레틴을 분리하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자는 치수질환의 치료 또는 예방 효과가 있는 천연 유래 물질에 대하여 연구하던 중, 천연물인 옻나무의 메탄올 추출물에서 치수세포 보호 효과를 확인하였고, 추가로 상기 옻나무 메탄올 추출물의 용매분획물에 대한 치수세포 보호 효과를 확인한 결과, 에틸아세테이트 분획물이 치수세포 보호 효과가 가장 우수하다는 것을 확인하였으며, 상기 치수세포 보호 효과가 가장 우수한 것으로 확인된 분획물인 에틸아세테이트 분획물로부터 유효성분을 확인하여 상기 에틸아세테이트 분획물로부터 분리한 설퍼레틴(sulfuretin)이 산화적 스트레스로 인한 손상으로부터의 세포보호효과를 나타내는 효소로 알려진 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 발현 및 활성을 증가시키며, 활성산소종 억제 효과도 우수할 뿐만 아니라, 사람 치수 세포를 이용하여 실험한 결과 세포손상을 억제하는 세포보호효과도 우수하다는 것을 확인하였을 뿐만 아니라 세포독성을 통해 확인한 결과 부작용도 문제되지 않음을 확인하여 본 발명을 완성 하였다.
본 명세서에 있어서, "약학적으로 허용되는 염"이란 통상적인 방법으로 제조한 염을 의미하며, 당업자에게 공지되어 있는 방법에 의해 제조 또는 응용될 수 있는 것을 포함하는 개념이다. 상기 "약학적으로 허용되는 염"은 약리학 또는 생리학적으로 허용되는 무기산과 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다. 상기 약리학 또는 생리학적으로 허용되는 무기산과 유기산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등이 있다. 또한, 상기 약리학 또는 생리학적으로 허용되는 염기로부터 유도된 염은 알칼리 금속, 예를 들어, 나트륨, 알칼리코금속, 예를 들어, 마그네슘, 암모늄 등일 수 있다.
본 명세서에 있어서, "치료"란 본 발명에 따른 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, "예방"이란 본 발명에 따른 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, "담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체, 부형제, 또는 희석제를 의미한다.
본 발명은 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는 본 발명은 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 치수충혈, 치수염, 치수괴사, 치수괴저, 치수변성 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함한다.
상기 설퍼레틴(sulfuretin)은 옻나무 등의 식물에 포함된 물질, 구체적으로 옻나무로부터 분리한 식물성 폴리페놀 화합물로서, 항당뇨 효과, 항암효과, 퇴행성 뇌질환에 대한 치료 효과, 항류마티스 관절염 효과, 항혈소판 응집 효과 및 항알러지 효과 등이 보고되어 있으나, 치수질환과 관련된 효과는 전혀 보고되어 있지 않은 물질이다. 상기 설퍼레틴(sulfuretin)은 도 3에 기재된 화학식과 같은 화학구조를 갖는 물질일 수 있다.
상기 설퍼레틴(sulfuretin)은 옻나무나 합환피 등의 식물로부터 천연적으로 얻거나 또는 당업계에 알려진 방법에 의해 인공적으로 합성할 수 있으며, 일 예로, 상기 설퍼레틴(sulfuretin)은 옻나무 추출물로부터 분리된 것 일 수 있다.
상기 옻나무(Rhus verniciflua)는 쌍떡잎식물 무환자나무목 옻나무과에 속하는 낙엽교목으로, 주로 중국, 한국 및 일본 등 동북아시아에서 주로 자라는 낙엽교목이며, 옻나무의 나무껍질에 상처를 내면 나오는 수액을 옻이라고 하여, 공업용 또는 약용으로 사용된다. 상기 옻은 구충, 복통, 통경, 변비, 어혈제증 또는 심통 등에 효과가 있어 한약재로 사용되며, 오래 저장해도 변하지 않고, 산이나 알칼리 또는 70℃ 정도의 열에서도 변하지 않으므로, 다른 색소와 섞어 여러 가구나 기계의 도료로 사용하거나 목제품의 접착제로 사용하기도 한다. 상기 옻나무 또는 옻나무 수액에는 우루시올(urushiol)이나 뷰테인(butein)과 같은 물질이 있다.
상기 옻나무 추출물은 본 발명이 속하는 분야에서 통상적인 추출방법으로 추출하여 제조될 수 있고, 상기 설퍼레틴(sulfuretin)은 본 발명이 속하는 분야에서 통상적인 분리방법으로 옻나무 추출물로부터 분리될 수 있다.
상기 치수질환은 이(teeth)의 치수 조직에 생기는 병변을 모두 포함하는 의미로, 구체적으로 치수충혈, 치수염, 치수괴사, 치수괴저, 치수변성, 치수괴사, 치수괴저, 치주염 및 치은염으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 치수충혈, 치수염, 치수괴사, 치수괴저, 치수변성 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 치수충혈은 치수에 물리적, 화학적 또는 세균성의 자극이 가해지는 경우 치수의 혈관이 확장되어 발생하는 질환을 의미한다.
또한, 상기 치수염은 상기 치수에 가해지는 자극에 의해서 치수에 염증이 발생하는 것을 의미한다.
상기 치수괴사는 염증 등에 의해 순환장애가 일어나는 경우 치수조직이 괴사하는 질병을 의미하고, 괴사한 치수조직이 부패 또는 분해되는 상태를 치수괴저라고 한다.
상기 치수변성은 차이에 변화 또는 자극을 주지 않더라도 노화에 의해서 퇴행성 또는 위축성 변화가 발생하는 것을 의미한다. 상기 치수는 단단한 상아질에 의해 싸여있어 염증 등이 발생하는 겨우 순환장애가 일어나기 쉬워 질병이 더욱 쉽게 악화될 수 있으므로, 상기 치수질환을 미리 예방하거나 초기에 치료하는 것이 더욱 요구된다.
상기 설퍼레틴(sulfuretin)은 치수의 세포 손상 및 활성산소종을 억제하여 치수질환을 치료 또는 개선할 수 있다. 구체적으로, 상기 설퍼레틴(sulfuretin)에 의하여 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 발현이 증가되면 헤마틴 산화효소-1에 의하여 헤마틴(heme)의 산화가 유도되어 빌리베르딘(biliverdin), 유리 철(free iron) 및 일산화 탄소(carbon nomoxide)로 분열되고, 상기 분해 산물에 의해서 외부 자극에 대한 치수세포의 손상이 억제되는 것을 실험적으로 확인하였다.
상기 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)은 햄(heme)의 산화를 유도하여 담록소(biliverdin), 유리형 철분(free iron)과 일산화 탄소(carbon monoxide)로 분열시키는데 관여하는 효소로서, 담록소는 빌리베르딘 리덕타아제(biliverdin reductase)에 의해서 빌리루빈(bilirubin)으로 변환되고, 이는 활성산소(ROS, Reactive Oxygen Species) 소거제 역할을 하여 항산화 효과를 나타낸다. 또한, 일산화 탄소는 항염 효과가 있고, 유리형 철분은 페레틴 합성(ferritin synthesis)에 관여하며, 세포보호효과를 나타낸다.
상기 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 치수질환 예방 또는 치료용 조성물은 총 중량에 대하여 상기 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 0.001 중량% 내지 99.9 중량% 또는 0.1 중량% 내지 99 중량% 또는 1 중량% 내지 20 중량% 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 조성물의 사용태양 및 사용방법에 따라 상기 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 함량은 약학적으로 유효한 양 또는 바람직한 양으로 적절히 조절하여 사용될 수 있다.
본 발명의 치수질환 예방 또는 치료용 조성물은 유효성분으로 하는 상기 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 단독으로 포함할 수 있고, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
상기 치수질환 예방 또는 치료용 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용될 수 있다. 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하고, 소화기관, 배설기관 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하며, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나는 치수질환 예방 또는 치료용 조성물 내에서 유효성분으로 단독으로 사용될 수 있고, 그 외 약리학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.
상세하게는 상기 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나가 약재로 사용되거나 의약 또는 약학적 용도로 사용되는 경우 상기 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나는 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증접제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 이란 생리학적으로 허용되고 동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀 및 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다.
상기 성분들은 상기 유효성분인 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
또한, 상기 치수질환 예방 또는 치료용 조성물은 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, pH 조절제, 영양제, 비타민, 전해질, 알긴산 및 그의 염, 펙트산 및 그의 염, 보호성 콜로라이드, 글리세린, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분들은 상기 치수질환 예방 또는 치료용 조성물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 공지의 치수질환 예방 또는 치료용으로 사용되는 물질을 더욱 포함할 수 있다. 상기 추가되는 공지의 치수질환 예방 또는 치료용으로 사용되는 물질은 바람직하게는 상기 치수질환 예방 또는 치료용 조성물 100 중량부 당 0.1 중량부 내지 20 중량부 범위 또는 상기 유효성분인 식물 추출물 100 중량부에 대하여 각각 5 중량부 내지 200 중량부 범위에서 추가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 치수질환 예방 또는 치료용 조성물이 약재로 사용하는 경우 투여방법은 경구 또는 비경구 모두 가능하며, 일 예로는 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.
또한, 상기 치수질환 예방 또는 치료용 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으며, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 상기 제형의 예로는 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 현탁제, 정제, 주사제, 주정제, 카타플라스마제(cataplasma), 캅살제, 연질 젤라틴 캅셀 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.
상기 제형을 위하여 부형제, 일 예로 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등을 더욱 포함할 수 있다.
일반적으로는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제(TABLETS), 알약, 연질 또는 경질 캅셀제(CAPSULES), 환제(PILLS), 산제(POWDERS) 및 과립제(GRANULES) 등이 포함되고, 이러한 제제는 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
또한, 경구 투여를 위한 액상제제에는 현탁제(SUSTESIONS), 내용액제, 유제(EMULSIONS) 및 시럽제(SYRUPS) 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 또는 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
더 나아가, 본 발명의 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 제형화될 수 있다.
상기 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 질환의 중증도, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 결정할 수 있다. 일 예로, 상기 조성물의 1일 유효성분을 기준으로 하였을 때, 상기 유효성분은 0.0001 mg/kg(체중) 내지 500 mg/kg(체중), 0.01 mg/kg(체중) 내지 400 mg/kg(체중) 또는 1 mg/kg(체중) 내지 300 mg/kg(체중)으로 투여될 수 있으며, 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여될 수 있다. 다만, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 치수질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는 본 발명은 설퍼레틴(sulfuretin) 및 약학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 치수충혈, 치수염, 치수괴사, 치수괴저, 치수변성 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 치수질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 치수질환 예방 또는 개선용 식품 조성물은 설퍼레틴(sulfuretin) 및 약학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 포함한다.
상기 상기 식품은 치수질환 예방 또는 개선용 건강기능식품일 수 있고, 상기 치수질환 예방 또는 개선용 식품 조성물은 바람직하게는 건강기능식품일 수 있다.
상기 유효성분인 설퍼레틴(sulfuretin) 및 약학적으로 허용되는 이의 염 및 상기 치수질환에 대하여는 상기 약학 조성물의 기재와 같다.
상기 식품이라 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의미이다.
상기 식품은 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품 등일 수 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 및 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 식품, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 명세서에 있어서, 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며, 건강기능음료를 포함하는 의도이다.
상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 설퍼레틴(sulfuretin) 및 약학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기의 천연 탄수화물의 예는 포도당이나 과당 등과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스 등과 같은 디사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 폴리사카라이드 또는 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올 등일 수 있다. 상기 향미제는 타우마틴이나 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제 또는 사카린, 아스파르탐 등과 같은 합성 향미제일 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 첨가량은 본 발명의 식품 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 5 g 내지 12 g일 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 유효성분 100 중량부 당 0 내지 20,000 중량부 범위에서 선택될 수 있다.
상기 건강기능음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.
상기 건강기능음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 유효성분을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기의 천연 탄수화물의 예는 포도당이나 과당 등과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스 등과 같은 디사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 폴리사카라이드 또는 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올 등일 수 있다. 상기 향미제는 타우마틴이나 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제 또는 사카린, 아스파르탐 등과 같은 합성 향미제일 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 첨가량은 본 발명의 식품 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 5 g 내지 12 g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.
또한, 치수질환 예방 또는 개선의 효과를 목적으로 하는 식품 조성물에 있어서, 상기 유효성분의 양은 전체 식품 중량의 0.01 중량% 내지 15 중량%로 포함될 수 있으며, 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 g 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 g 내지 1 g의 비율로 포함될 수 있다.
상기 설퍼레틴(sulfuretin)은 시험관내 실험 및 동물실험을 통하여 확인한 결과, 헤마틴 산화효소-1의 발현 및 활성을 증가시켜 치수세포 손상을 억제하고, 활성산소를 억제하며, 사람 치수세포를 이용한 세포 실험에서 세포보호효과가 우수한 것을 확인하였다.
상기 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 치수질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 유효성분의 양은 전체 식품 중량의 0.01 중량% 내지 15 중량%일 수 있다. 또한, 상기 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 치수질환 예방 또는 개선용 음료 조성물에 있어서, 상기 유효성분의 양은 상기 음료 조성물 100 ㎖를 기준으로 0.002 g 내지 5 g 또는 0.03 g 내지 1 g의 비율로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 옻나무로부터 치수질환 예방 또는 개선 효과가 우수한 설퍼레틴을 분리하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 관점에 의하면, 본 발명은 설퍼레틴(sulfuretin)을 유효성분으로 포함하는 치수질환 예방 또는 개선용 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 발명자는 천연물인 옻나무의 메탄올 추출물의 용매분획물에 대한 치수세포 보호 효과를 확인한 결과, 에틸아세테이트 분획물이 치수세포 보호 효과가 가장 우수하다는 것을 확인하였으며, 상기 치수세포 보호 효과가 가장 우수한 것으로 확인된 분획물인 에틸아세테이트 분획물로부터 분리된 설퍼레틴(sulfuretin)이 산화적 스트레스로 인한 손상으로부터의 세포보호효과를 나타내는 효소로 알려진 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 발현 및 활성을 증가시키며, 활성산소종 억제 효과도 우수할 뿐만 아니라, 사람 치수 세포를 이용하여 실험한 결과 세포손상을 억제하는 세포보호효과도 우수하다는 것을 확인하였다.
이러한 측면에서, 본 발명은 옻나무의 용매 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 옻나무의 용매 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 치수질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
상기 옻나무로부터 치수질환 예방 또는 개선 효과가 우수한 설퍼레틴을 분리하는 방법은 추출단계, 분획단계 및 화합물 분리 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 추출단계는 옻나무 추출물, 바람직하게는 옻나무 용매 추출물을 제조하는 방법으로 수행할 수 있고, 상기 분획단계는 상기 옻나무 용매 추출물로부터 에틸아세테이트 분획물을 제조하는 방법으로 수행할 수 있으며, 상기 화합물 분리 단계는 상기 에틸아세테이트 분획물로부터 설퍼레틴(sulfuretin)을 분리하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 추출단계는 상기 옻나무를 세절하는 옻나무를 세절과정; 및 상기 세절된 옻나무에 용매, 바람직하게는 탄소수 1 내지 5의 알코올, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나, 더욱 바람직하게는 메탄올 또는 메탄올 수용액을 첨가하고 추출하여 옻나무 용매 추출물을 제조하는 과정을 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 옻나무 세절과정은 상기 옻나무를 세척, 건조 및 세절, 구체적으로 세척 및 건조한 후, 세절하는 방법으로 수행할 수 있고, 상기 세척은 상기 옻나무를 유수로 세척하는 방법으로 수행할 수 있으며, 상기 건조는 통상의 식물 건조방법으로 수행할 수 있으며, 상기 세절은 통상의 식물 세절방법으로 수행할 수 있다.
상기 옻나무 용매 추출물을 제조하는 과정은 상기 세절된 옻나무에 용매, 바람직하게는 탄소수 1 내지 5의 알코올, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나, 더욱 바람직하게는 메탄올 또는 메탄올 수용액, 더더욱 바람직하게는 메탄올을 첨가하고 30℃ 내지 120℃, 바람직하게는 50℃ 내지 100℃, 더욱 바람직하게는 70℃ 내지 90℃에서 추출하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 분획단계는 상기 옻나무 추출물로부터 분획물, 바람직하게는 용매 분획물, 더욱 바람직하게는 에틸아세테이트 분획물을 제조하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 옻나무 추출물로부터 분획물을 제조하는 방법은 옻나무 추출물, 바람직하게는 옻나무 용매 추출물, 더욱 바람직하게는 옻나무 메탄올 추출물에 용매, 구체적으로, 극성의 차이가 있는 용매, 더욱 구체적으로 노르말-헥산(n-헥산), 에틸아세테이트 및 물을 순차적으로 첨가하면서 용매 분획법으로 분획하여, 옻나무 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 제조하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 화합물 분리 단계는 상기 에틸아세테이트 분획물로부터 설퍼레틴(sulfuretin)을 분리하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 화합물 분리 단계는 상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 분획물을 제조하는 과정 및 상기 역상의 중압 액체 크로마토그래피 분획물을 제조하는 과정을 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 분획물을 제조하는 과정은 상기 옻나무 추출물의 용매 분획물, 구체적으로 상기 옻나무 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물에 헥산 및 아세톤의 혼합 용매와 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 바람직하게는 부피비를 기준으로 4:1(헥산 : 아세톤) 내지 2:1(헥산 : 아세톤), 더욱 바람직하게는 3:1(헥산 : 아세톤)의 비율로 혼합한 헥산 및 아세톤의 혼합 용매와 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분획하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 분획물을 제조하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 역상의 중압 액체 크로마토그래피 분획물을 제조하는 과정는 상기 수득한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 분획물을 알코올 수용액, 바람직하게는 메탄올 수용액, 더욱 바람직하게는 50% 메탄올 수용액을 용매로 이용하여 역상의 중압 액체 크로마토그래피를 수행하여 설퍼레틴(sulfuretin)을 분리하는 방법으로 수행할 수 있다.
또 다른 관점에 의하면, 상기 치수질환 예방 또는 개선용 조성물의 제조 방법은 옻나무 추출물을 제조하는 단계, 상기 옻나무 추출물로부터 에틸아세테이트 분획물을 제조하는 단계 및 상기 에틸아세테이트 분획물로부터 설퍼레틴(sulfuretin)을 분리하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 옻나무 추출물을 제조하는 단계는 상기 옻나무를 세척, 건조 및 세절하는 옻나무 세절과정; 및 상기 세절된 옻나무에 용매, 바람직하게는 탄소수 1 내지 5의 알코올, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나, 더욱 바람직하게는 메탄올 또는 메탄올 수용액을 첨가하고 추출하여 옻나무 용매 추출물을 제조하는 과정을 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 옻나무 추출물로부터 분획물을 제조하는 단계, 바람직하게는 옻나무 추출물로부터 에틸아세테이트 분획물을 제조하는 단계는 상기 옻나무 추출물, 바람직하게는 옻나무 용매 추출물, 더욱 바람직하게는 옻나무 메탄올 추출물에 n-헥산, 에틸아세테이트 및 물을 순차적으로 첨가하면서 용매 분획법으로 분획하여, 옻나무 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 제조하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 에틸아세테이트 분획물로부터 설퍼레틴(sulfuretin)을 분리하는 단계는 상기 옻나무 추출물의 용매 분획물, 구체적으로 상기 옻나무 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물에 헥산 및 아세톤의 혼합 용매와 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 바람직하게는 부피비를 기준으로 4:1(헥산 : 아세톤) 내지 2:1(헥산 : 아세톤), 더욱 바람직하게는 3:1(헥산 : 아세톤)의 비율로 혼합한 헥산 및 아세톤의 혼합 용매와 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분획하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 분획물을 제조하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 분획물 제조 과정; 및 상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 분획물을 알코올 수용액, 바람직하게는 메탄올 수용액, 더욱 바람직하게는 50% 메탄올 수용액을 이용해서 역상의 중압 액체 크로마토그래피를 수행하여 역상의 중압 액체 크로마토그래피 분획물을 제조하는 역상의 중압 액체 크로마토그래피 분획물 제조과정을 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 제조된 설퍼레틴(sulfuretin) 또는 상기 설퍼레틴(sulfuretin)을 포함할 뿐만 아니라 치수조직에서 세포 보호 효과가 우수한 것으로 확인된 옻나무의 용매 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 헤마틴 산화효소-1의 발현 및 활성을 증가시켜 치수세포 손상을 억제하는 효과가 우수하여, 치수질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 치수질환 개선 또는 예방용 식품 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
구체적으로, 옻나무의 메탄올 추출물의 용매분획물, 바람직하게는 상기 옻나무 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 다른 용매 추출물 또는 다른 옻나무 메탄올 추출물의 다른 용매 분획물, 구체적으로 물 분획물 또는 헥산 분획물에 비하여 치수세포 보호 효과가 가장 우수하다는 것을 확인하였다.
이러한 측면에서, 본 발명은 옻나무의 용매 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.
또한, 본 발명은 옻나무의 용매 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 치수질환 예방 또는 개선용 식품 조성물일 수 있다.
상기 치수질환에 대한 사항, 상기 약학 조성물에 대한 사항 및 상기 식품 조성물에 대한 사항은 상기 기재와 같다.
본 발명의 발명자는 치수세포를 이용하여 실험한 결과, 옻나무의 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 다른 용매를 이용한 분획물에 비하여 치수세포 보호 효과가 가장 우수하다는 것을 확인하였고, 상기 치수세포 보호 효과가 가장 우수한 것으로 확인된 분획물인 에틸아세테이트 분획물로부터 유효성분을 확인하여 상기 에틸아세테이트 분획물로부터 분리한 설퍼레틴(sulfuretin)이 산화적 스트레스로 인한 손상으로부터의 세포보호효과를 나타내는 효소로 알려진 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 발현 및 활성을 증가시키며, 활성산소종 억제 효과도 우수할 뿐만 아니라, 사람 치수 세포를 이용하여 실험한 결과 세포손상을 억제하는 세포보호효과도 우수하다는 것을 확인하였다.
이러한 측면에서, 상기 옻나무의 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물이나 상기 설퍼레틴(sulfuretin)은 치수질환의 치료, 개선 또는 예방 효과를 위한 의약 조성물 또는 식물 조성물에 응용될 수 있으며, 상기 설퍼레틴 또는 옻나무 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 제조에 사용되는 옻나무가 우리나라의 남부지역에 풍부하게 자생하는 식물이므로, 산업적 가치도 우수할 것으로 예상된다.
본 발명을 통하여 옻나무 추출물의 분획물로부터 분리된 설퍼레틴(sulfuretin)은 산화적 스트레스와 같은 외부 자극으로 인한 손상으로부터의 세포보호효과를 나타내는 효소로 알려진 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 발현 및 활성을 증가시키고, 활성산소종 억제 효과도 우수할 뿐만 아니라, 치수조직에서 세포손상을 억제하는 세포보호효과도 우수하다는 것이 확인되어, 치수조직 내 치수세포를 보호하여, 치수조직의 염증이나 손상을 억제 또는 개선하고, 주변 조직인 상이질 등의 조직 손상도 예방 또는 개선할 수 있을 뿐만 아니라 천연물 유래 물질으로 세포 독성도 낮아 안전성 및 부작용 관련 문제가 발생될 가능성도 낮으므로, 치수질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 의약이나 건강기능식품을 비롯한 식품 관련 산업에서 널리 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 옻나무로부터 설퍼레틴(sulfuretin)을 분리하는 방법을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 옻나무로부터 분리한 물질에 관한 자료로, 도 2a는 옻나무로부터 분리한 물질의 1H-NMR(A) 분석 결과 및 13C-NMR(B) 분석 결과를 나타내는 것이고, 도 2b는 옻나무로부터 분리한 물질의 분자량 확인을 위한 MS 분석 결과이며, 도 2c는 HPLC 분석법을 이용하여 옻나무로부터 분리한 물질(설퍼레틴(sulfuretin))의 순도를 확인한 결과를 나타내는 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 옻나무로부터 분리한 물질로 확인된 물질의 구조, 즉 설퍼레틴의 구조를 나타낸 화학식이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 설퍼레틴의 세포독성을 알아보기 위해 세포사멸효과(Viabillity)를 확인한 결과를 나타낸 그래프로, 도 4a는 설퍼레틴의 농도별 사용량(가로축, μM)에 따라 설퍼레틴을 처리하지 않은 대조군(-)의 세포수(세포생존율)를 기준으로 세포수를 상대적으로 표시한(세로축, %) 그래프이고, 상기 도 4b는 설퍼레틴을 40 μM씩 처리한 시간(가로축, hour(h))에 따라 설퍼레틴을 처리하지 않은 대조군(-)의 세포수(세포생존율)를 기준으로 세포수를 상대적으로 표시한(세로축, %) 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 설퍼레틴(sulfuretin)의 인간유래 치수세포(HDP)의 보호효과, 구체적으로 치수질환에 대한 예방효과를 나타낸 그래프로, 도 5a는 설퍼레틴의 농도별 사용량(가로축, μM)에 따른 인간유래 치수세포의 생존율(세로축, %)을 과산화수소(H2O2 , 500 μM) 및 설퍼레틴을 처리하지 않은 음성대조군(-)의 세포수(세포생존율)를 기준으로 나타낸 그래프로, 헤마틴 산화효소-1 발현을 유도하는 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP, 20 μM)을 양성대조군으로 사용한 것이고, 도 5b는 설퍼레틴의 농도별 사용량(가로축, μM)에 따른 활성산소종 생성 또는 억제여부(세로축, %)를 과산화수소(H2O2 , 500 μM) 및 설퍼레틴을 처리하지 않은 음성대조군(-)의 활성산소종 함량을 나타내는 형광광도를 기준으로 나타낸 그래프로, 상기 헤마틴 산화효소-1 발현을 유도하는 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP, 20 μM)을 양성대조군으로 사용한 것이며, +는 물질을 처리한 경우를 의미하고, -는 처리하지 않은 경우를 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 설퍼레틴(sulfuretin)의 인간유래 치수세포(HDP) 보호효과, 구체적으로 치수질환에 대한 치료 또는 개선 효과를 나타낸 그래프로, 도 6a는 과산화수소(H2O2)를 500 μM 처리한 후, 설퍼레틴의 농도별 사용량(가로축, μM) 또는 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP, 양성대조군) 및 틴 프로토포르피린(Tin protophorphyrin, SnPP, 비교군)의 처리여부에 따른 세포 보호 효과를 아무런 시료를 처리하지 않은 음성대조군(-)의 세포수(세포생존율)를 기준으로 인간유래 치수세포의 생존율(세로축, %)을 나타낸 그래프이고, 도 6b는 과산화수소(H2O2)를 500 μM 처리한 후, 설퍼레틴의 농도별 사용량(가로축, μM) 또는 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP, 양성대조군) 및 틴 프로토포르피린(Tin protophorphyrin, SnPP, 비교군)의 처리여부에 따른 활성산소종 생성 억제 효과를 아무런 시료를 처리하지 않은 음성대조군(-)의 활성산소종 생성 억제 효과를 나타내는 형광광도를 기준으로 활성산소종 생성 또는 억제여부(세로축, %)를 나타낸 그래프이며, +는 물질을 처리한 경우를 의미하며, -는 처리하지 않은 경우를 의미한다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 설퍼레틴의 헤마틴 산화효소-1(HO-1) 발현 유도 효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프로, 도 7a는 설퍼레틴의 농도별 사용량(가로축, μM) 또는 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP, 양성대조군) 사용 여부에 따른 헤마틴 산화효소-1(HO-1)의 발현 유도 효과를 설퍼레틴을 처리하지 않은 대조군(-)에서의 헤마틴 산화효소-1(HO-1) 발현정도를 기준으로 표시한(세로축, 배수(Fold)) 그래프이고, 상기 도 7b는 설퍼레틴을 40 μM씩 처리한 시간(가로축, hour(h))에 따라 헤마틴 산화효소-1(HO-1)의 발현 유도 효과를 설퍼레틴을 처리하지 않은 대조군(-)에서의 헤마틴 산화효소-1(HO-1) 발현 정도를 기준으로 표시한(세로축, 배수(Fold)) 그래프이며, +는 물질을 처리한 경우를 의미하며, -는 처리하지 않은 경우를 의미한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 옻나무로부터 분리한 물질에 관한 자료로, 도 2a는 옻나무로부터 분리한 물질의 1H-NMR(A) 분석 결과 및 13C-NMR(B) 분석 결과를 나타내는 것이고, 도 2b는 옻나무로부터 분리한 물질의 분자량 확인을 위한 MS 분석 결과이며, 도 2c는 HPLC 분석법을 이용하여 옻나무로부터 분리한 물질(설퍼레틴(sulfuretin))의 순도를 확인한 결과를 나타내는 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 옻나무로부터 분리한 물질로 확인된 물질의 구조, 즉 설퍼레틴의 구조를 나타낸 화학식이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 설퍼레틴의 세포독성을 알아보기 위해 세포사멸효과(Viabillity)를 확인한 결과를 나타낸 그래프로, 도 4a는 설퍼레틴의 농도별 사용량(가로축, μM)에 따라 설퍼레틴을 처리하지 않은 대조군(-)의 세포수(세포생존율)를 기준으로 세포수를 상대적으로 표시한(세로축, %) 그래프이고, 상기 도 4b는 설퍼레틴을 40 μM씩 처리한 시간(가로축, hour(h))에 따라 설퍼레틴을 처리하지 않은 대조군(-)의 세포수(세포생존율)를 기준으로 세포수를 상대적으로 표시한(세로축, %) 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 설퍼레틴(sulfuretin)의 인간유래 치수세포(HDP)의 보호효과, 구체적으로 치수질환에 대한 예방효과를 나타낸 그래프로, 도 5a는 설퍼레틴의 농도별 사용량(가로축, μM)에 따른 인간유래 치수세포의 생존율(세로축, %)을 과산화수소(H2O2 , 500 μM) 및 설퍼레틴을 처리하지 않은 음성대조군(-)의 세포수(세포생존율)를 기준으로 나타낸 그래프로, 헤마틴 산화효소-1 발현을 유도하는 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP, 20 μM)을 양성대조군으로 사용한 것이고, 도 5b는 설퍼레틴의 농도별 사용량(가로축, μM)에 따른 활성산소종 생성 또는 억제여부(세로축, %)를 과산화수소(H2O2 , 500 μM) 및 설퍼레틴을 처리하지 않은 음성대조군(-)의 활성산소종 함량을 나타내는 형광광도를 기준으로 나타낸 그래프로, 상기 헤마틴 산화효소-1 발현을 유도하는 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP, 20 μM)을 양성대조군으로 사용한 것이며, +는 물질을 처리한 경우를 의미하고, -는 처리하지 않은 경우를 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 설퍼레틴(sulfuretin)의 인간유래 치수세포(HDP) 보호효과, 구체적으로 치수질환에 대한 치료 또는 개선 효과를 나타낸 그래프로, 도 6a는 과산화수소(H2O2)를 500 μM 처리한 후, 설퍼레틴의 농도별 사용량(가로축, μM) 또는 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP, 양성대조군) 및 틴 프로토포르피린(Tin protophorphyrin, SnPP, 비교군)의 처리여부에 따른 세포 보호 효과를 아무런 시료를 처리하지 않은 음성대조군(-)의 세포수(세포생존율)를 기준으로 인간유래 치수세포의 생존율(세로축, %)을 나타낸 그래프이고, 도 6b는 과산화수소(H2O2)를 500 μM 처리한 후, 설퍼레틴의 농도별 사용량(가로축, μM) 또는 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP, 양성대조군) 및 틴 프로토포르피린(Tin protophorphyrin, SnPP, 비교군)의 처리여부에 따른 활성산소종 생성 억제 효과를 아무런 시료를 처리하지 않은 음성대조군(-)의 활성산소종 생성 억제 효과를 나타내는 형광광도를 기준으로 활성산소종 생성 또는 억제여부(세로축, %)를 나타낸 그래프이며, +는 물질을 처리한 경우를 의미하며, -는 처리하지 않은 경우를 의미한다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 설퍼레틴의 헤마틴 산화효소-1(HO-1) 발현 유도 효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프로, 도 7a는 설퍼레틴의 농도별 사용량(가로축, μM) 또는 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP, 양성대조군) 사용 여부에 따른 헤마틴 산화효소-1(HO-1)의 발현 유도 효과를 설퍼레틴을 처리하지 않은 대조군(-)에서의 헤마틴 산화효소-1(HO-1) 발현정도를 기준으로 표시한(세로축, 배수(Fold)) 그래프이고, 상기 도 7b는 설퍼레틴을 40 μM씩 처리한 시간(가로축, hour(h))에 따라 헤마틴 산화효소-1(HO-1)의 발현 유도 효과를 설퍼레틴을 처리하지 않은 대조군(-)에서의 헤마틴 산화효소-1(HO-1) 발현 정도를 기준으로 표시한(세로축, 배수(Fold)) 그래프이며, +는 물질을 처리한 경우를 의미하며, -는 처리하지 않은 경우를 의미한다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
[
제조예
: 식물 추출물과
분획물의
제조 및 이로부터
설퍼레틴(sulfuretin)의
분리]
옻나무 추출물 및 분획물의 제조는 도 1에 나타낸 방법으로 수행하였다.
우선, 경동 시장에서 구입한 옻나무(Rhus verniciflua) 심재 1 kg을 세척, 건조 및 세절한 후, 상기 세절된 옻나무에 메탄올 1 L를 가하고 80℃에서 3시간 동안 추출하여 옻나무 메탄올 추출액을 제조한 후, 상기 옻나무 메탄올 추출액에 대해 여과 및 감압농축과정을 수행하고, 건조를 통해 추출용매를 제거하여 옻나무 메탄올 추출물 37.78 g을 수득하였다.
상기 메탄올 추출물을 물에 녹인 후, 분별깔때기에 노르말-헥산(n-헥산), 에틸아세테이트 및 물을 순차적으로 첨가하여, 용액-용액 분배법(partition)으로 각 용매별 분획을 제조하였으며, 상기 제조된 분획액에 대해 여과 및 감압농축과정을 수행하고, 건조를 통해 분획용매를 제거하여 각 용매분획물을 제조하였다. 상기 제조된 용매분획물을 물에 녹인 후, 과산화수소(H2O2)와 상기 용매분획물을 처리한 인간 치수세포주(HDP)의 세포 생존율을 통해 분획용매에 따른 용매분획물의 치수세포에 대한 세포보호효과를 확인하였고, 상기 확인결과 에틸아세테이트 분획물이 가장 효과가 우수한 것으로 확인되었다.
상기 옻나무 세절물 1 kg과 메탄올 1 L를 이용하여 제조된 메탄올 추출물로부터 에틸아세테이트 용매를 이용하여 에틸아세테이트 분획물을 제조하는 과정을 통해 에틸아세테이트 분획물 8.71 g을 수득하였다.
상기 치수세포에 대한 세포보호효과가 가장 우수한 것으로 확인된 에틸아세테이트 분획물의 세포보호효과를 나타낸 유효성분을 분리하기 위하여, 상기 에틸아세테이트 분획물에 대해 부피비를 기준으로 3:1(헥산:아세톤)의 비율로 혼합한 헥산 및 아세톤 혼합 용매와 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silicagel C.C., 6.5×60 cm, 200 내지 300 mesh, Merck, USA)를 이용하여 분획을 수행하여, 총 2개의 분획을 수득하였다.
상기 2개의 분획 중 치수세포 보호효과가 우수한 것으로 확인된 2번째 분획(660 mg)에 대해 50% 메탄올 수용액 용매를 단계적 기울기 용리법을 이용하여 역상의 중압 액체 크로마토그래피(MPLC, ODS-S-50 B, 120 Å, 50㎛)를 수행하여 단일물질이 확인된 분획을 수득하였다. 상기 단일물질이 확인된 분획에 포함된 단일물질(500 mg)을 확인하기 위하여 구조 동정을 수행하였다.
보다 구체적으로, 상기 단일물질에 대한 1H-NMR과 13C-NMR을 이용 구조 동정을 하였고, MS를 이용하여 분자량을 측정하였으며, 측정한 결과 도 2a 및 도 2b에서와 같은 결과를 얻었다. 상기 도 2a 및 도 2b에 의한 결과는 하기와 같다.
1H NMR(500 MHz, Acetone-D3) δ: 7.504(1H, d, J = 8.25 Hz, H-4), 7.421(1H, br s, H-2'), 7.130 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-6'), 6.740 (1H, d, J = 8.25 Hz, H-5'), 6.626~6.587 (3H, m, H-5, H-7, H-10)
13CNMR(125 MHz, Methanol-D3) δ: 183.12 (C-3), 168.51 (C-6), 167.28 (C-8), 148.06 (C-4'), 146.40 (C-2), 145.41 (C-3'), 125.50 (C-4), 125.07 (C-6'), 124.22 (C-1'), 117.60 (C-2'), 115.35 (C-5'), 113.43 (C-9), 113.30 (C-10), 112.88 (C-7), 98.06 (C-5)
상기 도 2 a 및 도 2b의 결과를 통해 확인한 결과로 상기 단일물질의 구조식을 도출하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 상기 도 3에서 나타낸 확인된 단일물질의 구조를 Jung의 문헌(Jung MJ, Chung HY, Kang SS, Choi JH, Bae KS, Choi JS. Antioxidant activity from the stem bark of Albizzia julibrissin. Arch Pharm Res. 26, pp.458-462(2003))과 비교하여 확인한 결과, 상기 단일물질의 구조가 설퍼레틴(sulfuretin)가 동일하여, 상기 단일물질이 설퍼레틴(sulfuretin)인 것으로 확인되었다. 상기 단일물질이 확인된 분획에 포함된 설퍼레틴(sulfuretin)의 순도를 확인하기 위해 HPLC를 수행하였으며, 그 결과를 도 2c에 나타내었다.
[
실험예1
.
인간유래
치수세포에서 세포독성 측정]
상기 제조예에서 옻나무로부터 수득한 설퍼레틴의 세포주에 대한 세포독성 측정을 위한 세포 생존율의 확인은 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 하였다(Mosmann T, Journal of immunological methods 65, p55 - p63(1983)). 구체적으로 실험방법은 다음과 같다.
우선, 상기 제조예에서 얻은 설퍼레틴(sulfuretin)의 치수세포에 대한 세포독성을 측정하기 위해 인간유래 치수세포(HDP, 원광대학교 치과대학에서 분양, 2 × 104 cells/well)를 10% heat-inactivated FBS 및 penicillin G(100 IU/ml, Gibco co, USA)와 streptomycin(100 μg/ml, Gibco co, USA)을 함유한 DMEM 배지에 분주하고, 5% CO2 배양기(Sanyo, MCO175)를 이용하여, 37℃에서 24시간 배양하였다. 이 후, 설퍼레틴(sulfuretin)을 농도 별로 1, 5, 10, 20, 40 및 50 μM씩 처리하고, 추가로 5% CO2 배양기 내에서 24시간 동안 더 배양하였다. 상기 배양 후, 세포생존율을 MTT 법을 활용하여 측정하였다. 상기 실험을 각각 3회 반복 수행한 후, 상기 측정 결과의 평균값을 아무런 처리를 수행하지 않은 대조군에 대한 상대적 수치로 도 4a에 나타내었다. 또한, 설퍼레틴(sulfuretin) 40 μM을 처리한 후, 3, 6, 12, 24, 36 및 48 시간 동안 유지한 후, 추가로 5% CO2 배양기 내에서 24시간 동안 더 배양하였다. 상기 배양 후, 세포생존율을 MTT 법을 활용하여 측정하였다. 상기 실험을 각각 3회 반복 수행한 후, 상기 측정 결과의 평균값을 아무런 처리를 수행하지 않은 대조군에 대한 상대적 수치로 도 4b에 나타내었다.
상기 도 4a에 나타낸 바와 같이, 40 μM 농도의 이하 설퍼레틴(sulfuretin) 처리 하였을 때는 설퍼레틴(sulfuretin) 농도와 상관없이 세포 생존율이 아무런 시료를 처리하지 음성 대조군과 유사한 정도를 나타내었으나, 50 μM 농도 처리에서는 음성대조군에 비하여 세포 생존율이 낮게 나타나 40 μM 농도까지는 안전한 것으로 확인되었다. 또한, 상기 도 4b에 나타낸 바와 같이, 40 μM 농도처리시 안전성을 추가로 확인하기 위하여, 상기 설퍼레틴(sulfuretin) 40 μM 투여 후 3, 6, 12, 24, 36 및 48 시간 처리하여 나타나는 세포 독성을 알아 본 결과 48시간 까지 세포 독성이 나타나지 않아, 상기 설퍼레틴(sulfuretin)의 40 μM의 농도에서는 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다.
상기 도 4a 및 도 4b에서 확인된 바에 따라, 이하의 상기 설퍼레틴(sulfuretin)의 치수세포보호 효과를 확인하기 위한 실험예에서는 상기 설퍼레틴(sulfuretin)을 50 μM 미만, 구체적으로 40 μM 이하의 농도로 처리하여 실험을 수행하였다.
[
실험예2
.
설퍼레틴(sulfuretin)의
치주질환 예방 효과 확인]
상기 제조예에서 얻어진 설퍼레틴(sulfuretin)의 치수세포 보호 효과 및 활성산소종 억제 효과를 확인하기 위하여, 구체적으로 치수질환 관련 예방 효과를 인간유래 치수세포(HDP)를 활용하여 실험을 수행하였다.
상기 치수질환 관련 예방 효과는 문헌(Jeong GS et al, Natural Product Sciences, 13, pp.268-272(2007))에 기재된 방법을 응용하여 MTT 실험법으로 확인하였다.
구체적으로, 상기 치수세포 보호 효과를 확인하기 위한 실험은 상기 실험예 1의 인간유래 치수세포주(HDP)에 상기 제조예에서 얻어진 설퍼레틴(sulfuretin)을 5, 10, 20 및 40 μM의 함량으로 각각 처리한 후, 과산화수소(H2O2)를 500 μM 함량으로 처리하고, 12시간 동안 5% CO2 배양기 내에서 배양하였다. 양성 대조군으로는 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP)를 20 μM 사용하였다. 상기 배양 후, MTT 실험법을 통하여 세포 생존률을 확인하였다.
보다 구체적으로, 상기 MTT 실험법을 통하여 세포 생존률을 확인한 실험은 96 웰 플레이트에 2X104 세포/웰 농도로 인간유래 치수세포주(HDP)를 24시간 배양시키고, 설퍼레틴(sulfuretin)을 5, 10, 20 및 40 μM의 함량으로 각각 처리한 후, 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)를 500 μM 함량으로 처리하고 12시간 동안 5% CO2 배양기에서 유지하여 세포독성을 유발시켰다. 이후, 0.5 mg/ml 농도로 MTT(Sigma, M2128) 시약을 넣고, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 배양액의 상등액을 버리고 DMSO(Junsei, 35535-0350) 150 ?를 첨가한 후, 30분간 흔들어주고, ELISA reader(Bio-Rad, Microplate reader model 680)를 사용하여 파장 570nm 에서 흡광도를 측정하였다. 상기 동일한 실험을 각각 3회 반복한 후, 상기 각각의 실험결과를 상기 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2) 및 설퍼레틴을 모두 처리하지 않은 음성대조군의 세포수(세포생존율 또는 세포보호율)를 기준으로 계산한 후, 상기 3회 반복 실험결과의 평균치를 도 5a로 표시하였다.
상기 도 5a에 나타낸 바와 같이, 설퍼레틴(sulfuretin)의 처리 함량이 증가됨에 따라, 인간유래 치수세포주(HDP) 의 생존율이 증가된 것이 확인되었고, 특히, 20μM 이상 처리한 실시예에서는 양성대조군인 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP)을 처리한 경우 세포 생존율이 양성대조군과 거의 유사한 정도로 증가된 것이 확인되었다.
또한, 상기 치수질환 관련 예방 효과는 문헌(Royall J and H Ischiropoulos, Archives of biochemistry and biophysics, 302, 348-355(1993))에 기재된 방법을 응용하여 활성산소종(ROS) 생성 억제정도 형광측정법을 이용하여 확인하였다.
구체적으로, 상기 형광측정법으로 상기 활성산소종(ROS) 생성 억제정도를 확인하기 위한 실험은 상기 치수세포 보호 효과를 확인하기 위한 배양한 인간유래 치수세포주를 PBS로 세척한 후, 10 μM 2',7'-dichlofluorescein diacetate(DCFDA, 35845, Fluka)를 포함하는 Hank's balanced salt 용액과 30분 동안 암실에서 반응시켰다. 상기 반응시킨 후, 세포의 형광광도(SpectramaxGemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.S.A.)를 측정하였다(excitation wavelengh : 490nm; emission wavelengh : 525nm). 상기 동일한 실험을 각각 3회 반복한 후, 상기 각각의 실험결과를 상기 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2) 및 설퍼레틴을 모두 처리하지 않은 음성대조군의 세포수(세포생존율 또는 세포보호율)를 기준으로 계산한 후, 상기 3회 반복 실험결과의 평균치를 도 5b로 표시하였다.
상기 도 5b에 나타낸 바와 같이, 설퍼레틴(sulfuretin)의 처리 함량이 증가됨에 따라, 인간유래 치수세포주(HDP)의 활성산소종 생성 정도가 감소된 것이 확인되었고, 특히, 설퍼레틴(sulfuretin)을 20μM 이상 처리한 실시예에서는 양성대조군인 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP)을 처리한 경우에 비하여 낮은 활성산소종 생성량이 확인되어, 활성산소종 생성 억제능 또는 활성산소종 제거능이 더 우수한 것으로 확인되었다.
상기 결과로부터 상기 설퍼레틴(sulfuretin)은 인간유래 치수세포주의 세포 보호 활성 및 활성산소종 생성 억제능이 확인되어, 상기 설퍼레틴은 치수세포에 대한 보호 효과 즉, 치수질환에 대한 예방 효과가 있는 것으로 확인되었다.
[
실험예3
.
설퍼레틴(sulfuretin)의
치주질환 치료 또는 개선 효과 확인]
상기 제조예에서 얻어진 설퍼레틴(sulfuretin)의 치수질환 관련 치료 또는 개선 효과를 인간유래 치수세포(HDP)를 활용하여 실험을 수행하였다. 상기 치수질환 관련 치료 효과, 구체적으로 치수세포에 대한 보호효과는 문헌(Jeong GS et al, Natural Product Sciences, 13, pp.268-272(2007))에 기재된 방법을 응용한 상기 실험예2에 기재된 방법으로 확인하였다. 또한, 상기 치수질환 관련 치료 효과, 구체적으로 활성산소종(ROS) 생성 억제 또는 제거 효과는 문헌(Royall J and H Ischiropoulos, Archives of biochemistry and biophysics, 302, 348-355(1993))에 기재된 방법을 응용한 상기 실험예2에 기재된 방법으로 확인하였다.
상기 치수세포에 대한 처리와 관련하여, 우선 인간유래 치수세포주(HDP)에 과산화수소(H2O2)를 500 μM 함량으로 처리하여 독성을 유발한 후, 각각 상기 제조예에서 얻어진 설퍼레틴(sulfuretin)을 20 및 40 μM 처리하여 12시간 동안 5% CO2 배양기 내에서 배양하였다. 양성대조군으로는 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP)를 20 μM 함량으로 처리하였다. 또한, 비교군으로는 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 억제제인 틴 프로토포르피린(Tin protophorphyrin, porphyrin products, SnPP)을 50 μM 함량으로 처리하였다
상기 배양 후, MTT 실험법을 통하여 세포 생존률을 확인하였고, 상기 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2) 및 설퍼레틴을 모두 처리하지 않은 음성대조군의 세포수(세포생존율 또는 세포보호율)를 기준으로 계산한 후, 상기 3회 반복 실험결과의 평균치를 도 6a로 표시하였다.
상기 도 6a에 나타낸 바와 같이, 설퍼레틴(sulfuretin)의 처리 함량이 증가됨에 따라, 인간유래 치수세포주(HDP)의 생존율이 증가된 것이 확인되었고, 특히, 40μM 처리한 실시예에서는 양성대조군인 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP)을 처리한 경우 세포 생존율이 양성대조군과 거의 유사한 정도로 증가된 것이 확인되었다. 또한, 틴 프로토포르피린(Tin protophorphyrin, porphyrin products, SnPP)을 처리한 경우에는 오히려 세포 생존율이 감소되었으며, 이로부터 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 억제제인 틴 프로토포르피린(Tin protophorphyrin, porphyrin products, SnPP)의 투여에 의한 감소효과에 의해, 설퍼레틴(sulfuretin)의 인간유래 치수세포주(HDP) 보호효과 즉, 치주질환의 치료효과는 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 발현 또는 활성화와 밀접하게 관련이 있는 것으로 예상되었다.
또한, 상기 배양한 인간유래 치수세포주와 10 μM 2',7'-dichlofluorescein diacetate(DCFDA, 35845, Fluka)를 포함하는 Hank's balanced salt 용액을 반응시켜, 세포의 형광정도 즉, 활성산소종 생성 억제능 또는 활성산소종 제거능을 확인하였고, 상기 측정된 형광정도를 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2) 및 설퍼레틴을 모두 처리하지 않은 음성대조군의 형광정도를 기준으로 계산한 후, 상기 3회 반복 실험결과의 평균치를 도 6b로 표시하였다.
상기 도 6b에 나타낸 바와 같이, 설퍼레틴(sulfuretin)의 처리 함량이 증가됨에 따라, 인간유래 치수세포주(HDP) 내의 활성산소종 제거 효과 또는 생성 억제 효과가 증가된 것이 확인되었다. 또한, 틴 프로토포르피린(Tin protophorphyrin, porphyrin products, SnPP)을 처리한 경우에는 오히려 활성산소종 함량이 증가되었으며, 이로부터 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 억제제인 틴 프로토포르피린(Tin protophorphyrin, porphyrin products, SnPP)의 투여에 의한 활성산소종 생성 억제 감소 효과에 의해, 설퍼레틴(sulfuretin)의 인간유래 치수세포주(HDP) 보호효과 즉, 치주질환의 치료효과는 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 발현 또는 활성화와 밀접하게 관련이 있는 것으로 예상되었다.
[
실험예4
.
설퍼레틴(sulfuretin)의
헤마틴
산화효소-1(
HO
-1) 발현 및 활성에 대한 효과 확인]
상기 제조예에서 얻어진 설퍼레틴(sulfuretin)의 치수세포 보호 효과 및 활성산소종 억제 효과, 즉 치수질환 관련 치료, 개선 또는 예방 효과가 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)와 관련이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 웨스턴블롯팅(Western blotting)을 통해 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 발현 여부를 확인하였다.
상기 제조예에서 얻은 설퍼레틴(sulfuretin)의 인간유래 치수세포에서의 보호효과와 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 관계를 확인하기 위하여, 인간유래 치수세포(HDP)를 활용하여 실험을 수행하였다.
상기 설퍼레틴(sulfuretin)의 인간유래 치수세포에서의 보호효과와 헤마틴 산화효소-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 관계를 확인하기 위한 실험, 구체적으로 헤마틴 산화효소-1(Heme oxygenase-1, HO-1) 발현 정도를 측정하기 위해 문헌(Li B et al, European Journal of Pharmacology 614, p58 - p65(2009))에 기재된 방법을 응용하여 웨스턴블롯팅(Western blot analysis)을 수행하였다.
구체적으로, 상기 헤마틴 산화효소-1(Heme oxygenase-1, HO-1) 발현 정도를 측정하기 위한 웨스턴블롯팅(Western blot analysis)은 상기 실험예1의 인간유래 치수세포주(HDP)에 상기 제조예에서 얻어진 설퍼레틴(sulfuretin)을 5, 10, 20 및 40 μM 농도로 12시간 처리를 하고, 웨스턴블롯팅(Western blot analysis)을 수행하였으며, 헤마틴 산화효소-1를 발현 촉진하는 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP)를 양성대조군으로 사용하였다(도 7a). 또한, 상기 인간유래 치수세포주에 설퍼레틴(sulfuretin)을 40 μM 농도로 처리하고, 3, 6, 12, 18 및 24시간 유지한 후, 웨스턴블롯팅(Western blot analysis)을 수행하였다(도 7b).
구체적으로, 상기 설퍼레틴의 함량 및 처리시간에 따른 헤마틴 산화효소-1 발현 촉진 효과를 확인하기 위하여, 웨스턴 블럿 분석법(western blot analysis)을 수행한 실험 방법은 다음과 같다.
우선, 60 mm 디쉬에 3 X 106 cells/ml 농도로 인간유래 치수세포주를 24시간 배양한 후, 헤마틴 산화효소-1 유도제인 코발트 프로토포르피린(Cobalt protophorphyrin, CoPP) 20 μM 또는 설퍼레틴을 농도별로 처리하고, 12시간 동안 배양하거나 상기 설퍼레틴 40 μM 을 주입한 후, 각 시간별로 배양하하였다. 상기 배양 후, RIPA 완충액(RIPA buffer, 89900, Thermo)를 첨가하고, 4℃ 및 14,000 X g의 조건에서 25분 동안 원심분리한 후, 상등액을 분리하였다. 상기 분리된 상등액에서 단백질 정량은 BSA 단백질 실험 키트(Pierce Biotechnology)를 이용하여 수행하였다.
구체적으로, 상기 상등액을 12.5% SDS-폴리아크릴아마이드겔(polyacrylamide gel)를 이용하여 2시간 동안 전기영동한 후, 나이트로셀룰로스 멤브레인(Nitrocellulose membrane, NC membrane)를 이용하여 상기 폴리아크릴아마이드겔로부터 나이트로셀룰로스 멤브레인으로 전사하였다. 상기 전사된 나이트로셀룰로스 맴브레인을 5% 무지방유가 포함된 신선한 블로킹 버퍼(blocking buffer, 0.1% Tween 20 in Tris-buffered saline)에서 1시간 동안 반응을 정지시켰다. 상기 반응 정지 후, 상기 멤브레인을 PBST(PBS, 0.1% Tween 20)로 10분에 1회씩 3회 세척한 후에, 헤마틴 산화효소-1의 항체(Ab, Calbiochem)를 1:1000으로 희석하여 넣고 1시간 동안 반응을 수행하였다. 상기 반응 후, 상기 PBST로 10분에 1회씩 3회 세척하고, 2차 항체(Anti-mouse IgG, NA934, Amersham Pharmacia Biotech)를 1:1000으로 희석하여 넣고 1시간 동안 반응을 수행하였다.
상기 반응 후, PBST로 10분에 1회씩 3회 세척한 다음, ECL(Amersham Pharmacia Biotech) 용액을 1:1로 잘 섞어서 나이트로셀룰로스 맴브레인 위에 부어서 발광시키고, 암실에서 X선 필름에 감광한 후 현상하였다. 동일한 방법으로 Actin에 대한 항체(SC1616, Santacruz biotechnology, USA)를 이용하여 Actin의 함량을 측정하였다. 상기 감광한 후 현상한 사진을 도 7a 및 도 7b에 나타내었다.
상기 도 7a에 나타낸 바와 같이, 설퍼레틴(sulfuretin)을 처리한 경우 다른 단백질(Actin)의 발현량에는 영향을 미치지 아니하였으나, 헤마틴 산화효소-1의 발현량은 현저하게 상승하였고, 상기 발현량의 증가는 설퍼레틴의 투여량에 비례하였으며, 상기 설퍼레틴(sulfuretin)을 40 μM 함량으로 처리한 경우에는 양성대조군인 코발트 프로토포르피린(CoPP)를 20 μM 투여한 경우와 거의 유사한 정도의 헤마틴 산화효소-1의 발현량이 확인되었다.
또한, 상기 도 7b에 나타낸 바와 같이, 설퍼레틴(sulfuretin)의 처리시간은 다른 단백질(Actin)의 발현량에는 영향을 미치지 아니하였으나, 상기 헤마틴 산화효소-1의 발현량은 처리 시간이 증가함에 따라 전반적으로 증가하는 것이 확인되었다.
따라서, 상기 결과로부터 설퍼레틴(sulfuretin)의 처리량 또는 처리시간이 증가됨에 따라 인간유래 치수세포주(HDP)의 세포보호효과, 구체적으로 과산화수소(H2O2) 처리에 따른 인간유래 치수세포주의 사멸 방지 및 인간유래 치수세포주의 활성산소종 생성 억제 효과가 개선될 뿐만 아니라, 상기 설퍼레틴(sulfuretin)의 처리량 또는 처리시간이 증가됨에 따라 인간유래 치수세포주(HDP) 내의 헤마틴 산화효소-1의 발현량이 증가하여, 상기 설퍼레틴(sulfuretin)은 치수조직 내 치수세포의 헤마틴 산화효소-1의 발현량을 증가시켜 치수세포의 사멸을 억제하고, 이의 원인이 되는 활성산소종의 생성을 억제할 수 있을 것으로 확인되었되므로, 상기 설퍼레틴(sulfuretin)은 치수질환의 치료, 개선 또는 예방에 매우 효과적일 것으로 검토되었다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
Claims (7)
- 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 치수질환은 치수충혈, 치수염, 치수괴사, 치수괴저, 치수변성 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 설퍼레틴(sulfuretin), 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 치수질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 치수질환은 치수충혈, 치수염, 치수괴사, 치수괴저, 치수변성 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 치수질환 예방 또는 개선용 식품 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 식품 조성물은 건강기능식품인 치수질환 예방 또는 개선용 식품 조성물. - 삭제
- 삭제
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| KR1020140034981A KR101576916B1 (ko) | 2014-03-26 | 2014-03-26 | 설퍼레틴을 유효성분으로 포함하는 치수질환 치료 또는 개선용 조성물 |
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