KR101018531B1

KR101018531B1 - 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 대사 증후군 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101018531B1
Application number: KR1020100095987A
Authority: KR
Inventors: 권혁상; 고종희; 유종수; 윤종민; 장현수; 연승우; 강재훈
Original assignee: 일동제약주식회사
Priority date: 2010-04-09
Filing date: 2010-10-01
Publication date: 2011-03-11
Also published as: JP2013523810A; JP5799082B2; WO2011126342A2; CN102844042A; WO2011126342A3

Abstract

본 발명은 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 대사증후군 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서 더욱 상세하게는 세포 내 SIRT1 단백질을 높은 수준으로 유지시켜 체중, 복부 지방 및 당 내성도를 감소시키는 비만, 비만 합병증 또는 대사증후군 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 지방세포 분화를 억제하고 SIRT1을 높은 수준으로 유지하여 체중, 복부지방 및 당내성도를 감소시켜 비만, 비만 합병증 또는 대사증후군 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 대사 증후군 예방 및 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating obesity or metabolic syndrome comprising Polygonatum falcatum or Polygonatum sibiricum extract as an active ingredient}

본 발명은 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만, 비만 합병증 또는 대사 증후군 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서 더욱 상세하게는 세포 내 SIRT1 단백질을 높은 수준으로 유지시켜, 체중, 복부지방 및 당 내성도를 감소시키는 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레를 유효성분으로 포함하는 비만, 비만 합병증 또는 대사 증후군 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

비만은 대표적인 성인형 대사성 질환으로, 의학 발달과 생활 수준의 향상으로 인한 평균 수명의 연장과 도시 중심의 생활 인구 증가로 인한 운동량의 감소에 따라 그 비율이 크게 증가하고 있다. 더불어 고혈압, 지질대사이상 및 인슐린 저항성 증가에 의한 고혈당증이 급증하는 추세에 있으며 이로 인하여 제2형 당뇨병 및 이의 합병증, 동맥 경화에 의한 심근 경색, 뇌졸중 등의 치명적 질환을 가진 환자 수가 증가 추세에 있다.

대사 증후군(Metabolic Syndrome)은 각종 심혈관 질환과 제2형 당뇨병의 위험 요인들이 서로 군집을 이루는 현상을 한 가지 질환군으로 개념화시킨 것이다. 인슐린저항성 및 이와 관련된 복잡하고 다양한 여러 대사이상과 임상양상을 모두 포괄하여 설명할 수 있는 유용한 개념이다. 대사증후군을 가질 경우 심혈관 질환 혹은 제2형 당뇨병의 발병 위험도가 증가된다. 이 증상은 오래전부터 알려져 왔으나 1988년 Reaven은 이러한 증상들의 공통적인 원인이 체내의 인슐린 작용이 잘 되지 않는 인슐린저항성 임을 주장하고 엑스(X)증후군, 인슐린저항성 증후군이라고 명명했다. 1998년 세계보건기구는 인슐린저항성이 이 증상들의 모든 요소를 다 설명할 수 있다는 확증이 없기에 '인슐린저항성 증후군' 이라는 용어 대신 '대사증후군'으로 부르기로 했다.

대사증후군의 원인은 체내에 인슐린이 있더라도 저항성으로 인해 고혈당은 개선되지 않은 채, 인슐린 농도만 높아지는 데 있다. 혈당을 낮추기 위해 과량 분비된 인슐린이 혈당을 정상으로 조절하지 못하고 오히려 혈관세포 증식을 유도해 혈관 벽을 두껍게 하거나 신장에서 나트륨 재흡수를 촉진해 혈압을 높이거나 지방 분해를 촉진하여 혈액 내 중성지방을 높이는 동시에 고밀도 콜레스테롤 (HDL-cholesterol)을 낮추며 이와 함께 내장에 지방 성분의 저장을 촉진시키는 등의 총체적인 작용에 의해 발병하게 되며, 혈당 대사이상으로 인한 당뇨병, 지질대사 이상으로 인한 중성지방 증가, 고밀도 콜레스테롤, 나트륨 성분 증가로 인한 고혈압, 요산 증가로 인한 통풍(痛風) 등이 이에 속한다. 이러한 인슐린 저항성이 생기는 이유는 아직 확실하게 규명되어 있지 않지만 영향을 미치는 가장 큰 인자로는 복부 비만인 것으로 알려져 있으며, 과도한 스트레스와 노화도 그 원인으로 알려져 있다. 또한 과거에는 인슐린저항성을 대사증후군의 단일병인으로 생각하였으나, 최근에는 인슐린 저항성 이외에 비만과 지방세포의 장애, 그리고 대사증후군 각 인자들의 복합적인 작용을 추가하여 3가지 주요 병인으로 추정하고 있다.

대사증후군의 판정은 다음과 같은 기준에 의한다. 2001년 공표된 미국 NCEP(National Cholesterol Education Program)의 기준에 따르면, ① 허리둘레가 남자 40 인치(102 cm), 여자 35 인치(88 cm) 이상인 복부 비만, ② 중성지방(triglycerides) 150 mg/dL 이상, ③ HDL 콜레스테롤이 남자 40 mg/dL, 여자 50 mg/dL 이하, ④ 혈압 130/85 mmHg 이상, ⑤ 공복혈당(fasting glucose)이 110 mg/dL 이상 등의 다섯 가지 위험인자 중 한 환자가 세 개 이상을 나타낼 경우 대사증후군으로 판정하게 된다. 동양인의 경우, 허리둘레가 남자 90 cm, 여자 80 cm 이상일 때 복부비만으로 다소 조정되어 있으며, 이 규정을 적용할 때 한국인은 전 인구의 25% 정도가 대사증후군 증상을 나타낸다는 최근의 연구보고도 있다.

대사증후군은 인구의 고령화와 환경변화에 의해 발병률과 유병률이 급증하고 있고 이에 따른 사망률도 매우 높을 뿐 아니라 합병증 발병률 또한 매우 높아 경제적 사회적으로 막대한 손실을 야기하지만, 현재 사용되고 있는 약물은 대부분 효능도 낮을뿐더러 장기 복용 시 부작용 발생률이 높아 삶의 질 향상 측면에서도 치료 약물 개발이 시급한 실정이다.

현재 미국, 유럽 및 일본을 포함한 서구에서 비만인구는 3억 명 이상으로 추산되고 개발도상국에서도 연간 약 1% 이상 증가하고 있어 전 세계적으로 비만 인구의 비율이 높아지고 있는 추세이다. 세계보건기구(WHO)조차 '치료가 필요한 질병'으로 정의하고 있는 비만은 미국의 경우 흡연에 이어 간접적 사망원인 2위를 차지하고 있으며 이로 인하여 매년 1,100억 달러 이상의 비용이 지출되어 경제적 부담이 높고 사회적으로도 심각성이 매우 커지고 있다.

비만치료제와 관련된 전 세계 특허 출원은 1999년 이후 2004년까지 증가세를 보였으며, 특히 미국의 경우 이 시기에 급격히 증가하는 추세였지만 2005년을 기점으로 점차 감소세를 보이는데 이는 실질적인 비만치료제의 개발이 가시화되지 않는 것과 연관이 있다. 비만관련 특허의 약 90%가 식욕억제, 식이조절 및 지방의 대사와 관련된 것이지만, 최근 들어 지방 증식의 조절 및 에너지 대사와 관련한 특허의 점유율이 점차 증가하는 추세로 이는 제니칼이나 리덕틸 같은 기존 비만치료제의 한계와 이를 개선하기 위한 새로운 기전의 비만치료제 개발 필요성이 인정받아가기 때문이다.

SIRT1은 효모(yeast)에서 수명연장 효과를 유도하는 것으로 알려진 Sirtuins (Sir2-related enzymes) 단백질의 포유류 동족체(~110kD)로 NAD⁺를 cofactor로 요구하는 class III의 히스톤 탈아세틸 효소(histone deacetylase)류에 속한다. 지금까지 동물에서 발견된 Sirtuins로는 SIRT1부터 SIRT7까지 총 7종이 있으며 이들은 작용하는 위치와 기능에서 서로 차이가 있고, 이중 SIRT1은 핵에서 활성화되어 대사, 염증반응 및 퇴행성 뇌질환과 관련된 다양한 기질의 활성을 조절한다.

식이제한 시 생체 내 간, 지방, 췌장 등 여러 조직에서 SIRT1의 발현 및 활성이 증가되면 PPARγ, FOXO1 등의 transcription factor와 UCP1, UCP2, UCP3 등의 미토콘드리아(Mitochondria)의 에너지 대사와 관련된 단백질들의 직접적인 탈아세틸화 혹은 p300, NcoR, PGC1α 등 보조조절자(coregulator)의 탈아세틸화에 의한 간접적인 활성 조절로 간에서는 해당작용을 막고 지방조직에서는 지방 축적을 감소시키며 췌장에서는 인슐린감수성을 증가시킬 뿐만 아니라 근육조직에서 에너지 대사를 증진시킴으로써 열 발산에 의한 체중감소를 일으키게 된다.

비만 인구가 급격하게 증가되는 현 상황에서 치료제의 수요가 감소되는 현상이 일어나고 있으며, 이는 기존 약물에 대한 부작용과 효능에 대한 불만임을 감안할 때 이를 극복할 수 있는 새로운 기전의 비만치료제 개발이 절실한 상황이다.

따라서 생체 내에서 소식 등의 식이제한에 의한 SIRT1의 발현 및 활성 증가를 대체할 수 있는 약물을 개발한다면 신규한 비만, 비만 합병증 치료제로 활용이 가능할 것이다.

본 발명자들은 SIRT1의 활성을 증가시키는 천연물질에 대하여 연구하던 중, 본 발명의 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물이 SIRT1의 활성을 증가시키고, 비만과 비만 합병증 또는 대사증후군에 효과가 있는 것을 밝혀내고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레인 둥굴레속 식물 추출물을 유효 성분으로 함유하는 비만, 비만 합병증 및 대사증후군으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레인 둥굴레속 식물 추출물을 유효 성분으로 함유하는 비만, 비만 합병증 및 대사증후군으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환의 예방 및 완화용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만, 비만 합병증 및 대사증후군으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만, 비만 합병증 및 대사증후군으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환의 예방 및 완화용 식품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 조성물은 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레의 추출물을 유효성분으로 포함하여, 비만, 비만 합병증 및 대사증후군으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환의 예방 및 치료의 목적으로 사용될 수 있다.

특히 본 발명의 조성물은 대잎둥굴레(Polygonatum falcatum) 또는 층층갈고리둥굴레(Polygonatum sibiricum)의 추출물, 보다 바람직하게는 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레의 근경 부위의 추출물을 유효성분으로 할 수 있다. 본 발명에서 층층갈고리둥굴레로 기재한 폴리고나툼 시비리쿰(Polygonatum sibiricum)은 층층갈고리둥굴레(Polygonatum sibiricum Delar), 죽대둥굴레(Polygonatum sibiricum Redout) 또는 황정(Polygonatum sibiricum Redt.)라고 불리우기도 하며, 본 발명의 층층갈고리둥굴레는 이들 모두를 포함한다. 한편, 본 발명의 추출물은 황정 추출물일수 있다. 본 발명에서의 황정은 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레의 근경(뿌리줄기) 부분에 해당하는 것으로, 보다 바람직하게는 본 발명에서의 황정은 진황정이라고 불리는 대잎둥굴레(Polygonatum falcatum)의 근경에 해당하는 것이다.

본 발명의 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물은 공지된 용매 추출법에 의해 추출될 수 있다. 예를 들어, 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레로부터 물, 에탄올, 주정, 메탄올, 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol)과 같은 탄소수 1 내지 6개의 알코올, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산, 시클로헥산, 석유에테르(petroleum ether), 디에틸에테르, 벤젠과 같은 유기용매 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출할 수 있다. 바람직하게는 에탄올, 주정, 아세톤, 에틸아세테이트 또는 메틸렌클로라이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매를 사용하거나 이들 용매를 그 밖의 공지된 용매와 혼합하여 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물은 용매 추출법에 의하여 추출된 추출물을 그대로 사용할 수 있으며 또는 불순물을 제거하고 활성성분의 농도를 높이기 위해 공지의 방법으로 분획 할 수 있다. 분획의 효율을 위하여 추출물을 감압 농축 할 수 있으며, 분획을 위한 용매로는 물, 에탄올, 주정 및 메탄올과 같은 탄소수 1 내지 6개의 알코올, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 디클로로메탄, 클로로포름, n-헥산(n-Hexane), 디에틸에테르, 아세톤, 벤젠과 같은 유기용매 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있으며 바람직하게는 물, n-부탄올, 에탄올 및 에틸아세테이트 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합용매로 분획할 수 있다. 분획물은 그대로 사용되거나 재분획 할 수 있으며 재분획 하는 경우 바람직하게는 에틸아세테이트를 사용할 수 있다. 특히 추출공정을 보다 경제적으로 수행하기 위해서는 단일 또는 혼합 용매로 1회 추출하는 것이 바람직한데, 물, 에탄올, 주정 및 메탄올과 같은 탄소수 1 내지 6개의 알코올, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 디클로로메탄, 클로로포름, n-헥산(n-Hexane), 디에틸에테르, 아세톤, 벤젠과 같은 유기용매 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합용매를 사용하는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 에탄올, 주정, 아세톤, 에틸아세테이트 및 메틸렌클로라이드를 사용할 수 있다. 에탄올, 특히 주정을 추출용매로 사용시 추출물의 분리과정을 단축할 수 있어 가장 바람직하다.

본 발명의 일실시예에서는 10g의 각각의 시료를 잘게 부순 후 30ml의 100% 메탄올을 침지하여 상온에서 24시간씩 3회 반복 추출한 추출용액을 거름 장치로 여과하고 감압장치로 메탄올을 제거하여 메탄올 추출액을 수득하였다. 상기 과정에 의해 수득된 메탄올 추출물에 에틸아세테이트와 물을 각각 20ml씩 첨가하여 혼합한 후 상층을 농축하여 에틸아세테이트 추출물을 수득하였다. 제조된 분획물의 SIRT1의 발현 증가 효능을 측정한 결과 본 발명의 에틸아세테이트 분획물에서 SIRT1의 발현이 높게 나오는 것을 확인하였다(실시예 1 참조). 본 발명의 또 다른 일실시예에서는 각 시료를 80% 에탄올로 직접 침지하여 추출한 추출용액도 역시 높은 SIRT1의 발현을 확인하였다(실시예 5 참조).

본 발명의 조성물은 비만, 비만 합병증 또는 대사증후군을 예방 및 치료하는 효능이 우수하다.

비만(obesity)은 과다한 체지방을 가진 상태를 의미한다. 비만 합병증은 장기간의 비만 상태의 결과로 나타나는 대사증후군을 나타내며, 대사증후군(Metabolic Syndrome)은 고중성지방혈증, 고콜레스테롤혈증, 고혈압, 당대사 이상, 혈액응고 이상 및 비만과 같은 위험 인자가 함께 나타나는 증후군을 지칭한다.

본 발명의 이러한 효능은 생체내(in vivo), 생체외(in vitro) 실험을 통하여 입증되었다.

한편, 본 발명의 조성물은 생체 내(in vivo) SIRT1의 수준을 증가시키는 효능이 있다. SIRT1은 효모에서 수명연장 효과를 유도하는 것으로 알려진 Sirtuins(Sir2-related enzymes) 단백질의 포유동물 동족체(~110kD)로 NAD⁺를 보조인자로 요구하는 class III의 히스톤 탈 아세틸화효소(Histone deacetylase)류에 속한다.

본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 조성물에 의한 SIRT1의 수준 증가효능을 생체내(in vivo) 실험을 통하여 확인하였다. 본 발명의 조성물을 투여한 생쥐와 대조군 생쥐들을 희생하여 근육, 간 및 지방세포에서 SIRT1 단백질의 양을 측정한 결과 지방과 근육에서 SIRT1의 양을 증가시키는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

또한 본 발명의 일실시예에서는 생쥐에 고지방 비만사료를 공급하여 비만모델을 제작하고 본 발명의 조성물을 투여한 후 체중과 복부지방의 변화를 관찰하였다. 그 결과 본 발명의 조성물을 투여한 군은 비만사료만을 투여한 군에 비하여 사료섭취량에서는 차이가 없음에도 불구하고 체중이 감소하였으며, 복부지방의 크기도 감소하였고, 지방의 양도 감소한 것을 확인하였다. 또한 인슐린 저항성에 의한 당내성도, 혈중 총 콜레스테롤, 중성지방, 유리지방산 수치와 조직내 대사증후군과 관련한 지표를 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 조성물에 의하여 당 내성도가 최고 60%이상 개선되었으며 (실시예 6 참조), 콜레스테롤, 중성지방과 유리지방산의 경우 각각 최고 27.8, 27.0, 38.2% 이상 감소한 것을 확인하였다. (실시예 3 참조)

이에 본 발명의 조성물은 비만, 비만 합병증 및 대사증후군의 예방 및 치료에 탁월한 효능이 있음을 확인하였다.

본 발명의 조성물은 상술한 바와 같은 효능을 나타낼 뿐만 아니라, 생약 추출물을 유효 성분으로 포함하고 있기 때문에, 인체에 대한 부작용이 화학적 합성 의약보다 극히 적다.

따라서 본 발명의 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물은 지방세포의 분화를 저해하고 SIRT1을 높은 수준으로 유지하여 고지방식이 비만유도 생쥐 모델에서 복부지방을 감소시키고, 체중을 현저하게 감소시켜 비만, 비만 합병증 또는 대사증후군을 예방 및 치료하는 효과가 있음을 알 수 있다.

따라서 본 발명은 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만, 비만 합병증 또는 대사증후군 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기에서 ‘약학적으로 유효한 양’이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 비만을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 말한다. 본 발명에 따른 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물의 유효한 양으로는 0.001 내지 1000mg/day/kg체중이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다. 경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 "경피 투여"는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.

이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.

흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA).

나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 비만, 비만 합병증 또는 대사증후군을 예방 및 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

아울러, 본 발명에 따른 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물은 비만, 비만 합병증 또는 대사증후군을 개선하기 위한 목적으로 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물과 비만, 비만 합병증 또는 대사증후군의 개선효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물 중 상기 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%이다.

또한, 본 발명의 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

따라서 본 발명은 대잎둥굴레 또는 층층갈고리둥굴레 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만, 비만 합병증 또는 대사 증후군 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 SIRT1을 높은 수준으로 유지하여 체중, 복부 지방 및 당 내성도를 감소시켜 비만, 비만 합병증 또는 대사증후군의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1A는 HEK 293 세포주에 둥굴레속 (Polygonatum)에 속하는 생약의 에틸아세테이트 추출물을 처리하여 SIRT1 단백질 발현 변화를 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정한 결과이고 도 1B는 대잎둥굴레와 층층갈고리둥굴레를 더 넓은 범위의 농도에서 SIRT1 단백질 발현을 측정한 결과이다(C: 음성대조군; ID1216: 층층갈고리둥굴레 에틸아세테이트 추출물; ID1215: 대잎둥굴레 에틸아세테이트 추출물; ID1214: 층층둥글레 에틸아세테이트 추출물; ID1213: 죽대 에틸아세테이트 추출물).
도 2는 대잎둥굴레 에틸아세테이트 추출물과 층층갈고리둥굴레 에틸아세테이트 추출물 투여에 의한 생쥐의 각 조직 내 SIRT1 발현 증가여부를 측정한 웨스턴 블롯 결과로 간, 지방과 근육조직 순으로 SIRT1의 발현을 측정한 것이다 (Vehicle: 음성 대조군).
도 3은 비만유도 동물모델에서 본 발명 조성물의 항비만 효과를 시험한 결과 중 생쥐의 체중을 시간별로 측정한 것이다. 수치는 9~10마리 쥐의 평균±표준편차 값이며 * 는 p<0.05, **는 p<0.01로 고지방식이와 비교하였을때 유의함을 의미한다 (□: 정상식이; ■: 고지방식이; ▲: 고지방식이+시부트라민 (100mg/kg사료); ●: 고지방식이+ID1216(5000mg/kg사료); ◆: 고지방식이+1215(5000mg/kg사료)).
도 4는 비만유도 동물모델에서 본 발명 조성물의 항비만 효과를 시험한 결과로, 간과 지방 조직의 무게를 측정한 그래프이다. 수치는 9~10마리 쥐의 평균±표준편차 값이며 * 는 p<0.05, **는 p<0.01로 고지방식이와 비교하였을때 유의함을 의미한다(ND: 정상식이군; HF:고지방식이군; Sibutramine: 고지방식이+시부트라민(100mg/kg사료); ID1216: 고지방식이+층층갈고리둥굴레 에틸아세테이트 추출물(5000mg/kg사료); ID1215: 고지방식이+대잎둥굴레 에틸아세테이트 추출물(5000mg/kg사료)).
도 5는 비만유도 동물모델에서 혈중 지질 농도를 측정한 결과이다. 도 5A는 혈중 콜레스테롤을, 도 5B는 혈중 중성지방을, 도 5C는 혈중 유리 지방산 농도를 고지방식이군과 비교한 도면이다 (ND: 정상식이군; HF:고지방식이군; Sibutramine: 고지방식이+시부트라민(100mg/kg사료); ID1216: 고지방식이+층층갈고리둥굴레 에틸아세테이트 추출물(5000mg/kg사료); ID1215: 고지방식이+대잎둥굴레 에틸아세테이트 추출물(5000mg/kg사료)).
도 6은 HEK 293 세포주에 대잎둥굴레와 층층갈고리둥굴레의 에탄올추출물과 에틸아세테이트 추출물을 각각 처리하여 SIRT1 단백질 발현 변화를 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정한 결과이다 (C: 음성대조군; ID1216: 층층갈고리둥굴레 에틸아세테이트 추출물; ID1215: 대잎둥굴레 에틸아세테이트 추출물, ID1216B: 층층갈고리둥굴레 80% 에탄올 추출물; ID1215B: 대잎둥굴레 80% 에탄올 추출물)
도 7은 비만유도 동물모델에서 본 발명 조성물의 항비만 효과를 시험한 결과 중 생쥐의 체중을 시간별로 측정한 것이다. 수치는 8마리 쥐의 평균±표준편차 값이며 * 는 p<0.05, **는 p<0.01로 고지방식이와 비교하였을때 유의함을 의미한다 (□: 정상식이; ■: 고지방식이; ◆: 고지방식이+ID1215B(250mg/kg); ▲: 고지방식이+ID1215B(500mg/kg); ●: 고지방식이+ID1215B(750mg/kg)).
도 8은 비만유도 동물모델에서 본 발명 조성물의 항비만 효과를 시험한 결과로, 간과 지방 조직의 무게를 측정한 그래프이다. 수치는 8 마리 쥐의 평균±표준편차 값이며 * 는 p<0.05, **는 p<0.01로 고지방식이와 비교하였을 때 유의함을 의미한다(ND: 정상식이군; HF:고지방식이군; 250mg/kg: 고지방식이+ID1215B-250mg/kg; 500mg/kg: 고지방식이+ID1215B-500mg/kg; 750mg/kg: 고지방식이+ID1215B-750mg/kg).
도 9는 비만 유도 동물모델에서, 본 발명 조성물의 항비만 효과와 관련된 저온시험(Cold test)결과이다. 수치는 8마리 쥐의 평균±표준편차 값이며 *는 p<0.05, **는 p<0.01로 고지방식이와 비교하였을때 유의함을 의미한다(■: 고지방식이; ◆: 고지방식이+ID1215B(250mg/kg); ▲: 고지방식이+ID1215B(500mg/kg); ●: 고지방식이+ID1215B(750mg/kg)).
도 10은 비만유도 동물모델에서 대사증후군 관련 효과를 시험한 결과이다. 도 10A는 글루코오스 경구투여에 의한 혈중 글루코오스 농도를 측정한 결과이다. 수치는 8 마리 쥐의 평균±표준편차 값이며 *는 p<0.05로 고지방식이와 비교하였을때 유의함을 의미한다(□: 정상식이; ■: 고지방식이; ◆: 고지방식이+ID1215B(250mg/kg); ▲: 고지방식이+ID1215B (500mg/kg); ●: 고지방식이+ID1215B(750mg/kg)). 도 10B는 비만식이군과 ID1215B 투여군의 8주 후 곡선하 면적(AUC, Area under curves)을 비교한 것이다.
도 11은 비만유도 동물모델에서 혈중 지질 농도를 측정한 결과이다. 도 11A는 혈중 콜레스테롤을, 도 11B는 혈중 중성지방을, 도 11C는 혈중 유리 지방산 농도를 고지방식이군과 비교한 도면이다 (ND: 정상식이군; HF:고지방식이군; 250mg/kg: 고지방식이+ID1215B-250 mg/kg; 500mg/kg: 고지방식이+ID1215B-500 mg/kg; 750mg/kg: 고지방식이+ID1215B-750 mg/kg).
도 12는 비만유도 동물모델에서 8주 후 간과 지방 조직을 광학 현미경으로 관찰하여 지방 및 간 세포 차이를 비교한 도면이다. 도 12A는 지방 세포의 크기 차이를 나타낸 도면이고, 도 12B는 간 세포의 상태 및 지방공포 정도를 보여주는 도면이다 (ND: 정상식이군; HF:고지방식이군; 250mg/kg: 고지방식이+ID1215B-250 mg/kg; 500mg/kg: 고지방식이+ID1215B-500 mg/kg; 750mg/kg: 고지방식이+ID1215B-750 mg/kg).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

SIRT1 발현 증강 추출물의 효능 확인

<1-1> SIRT1 발현 증강 정도 비교(in vitro)

SIRT1 활성을 가장 높이는 추출물을 선별하기 위하여 국내의 여러 산지에서 채취한 본 발명의 층층갈고리둥굴레 (Polygonatum sibiricum: ID1216), 대잎둥굴레 (Polygonatum falcatum: ID1215), 층층둥굴레 (Polygonatum stenophyllum: ID1214) 및 죽대 (Polygonatum lasianthum: ID1213) 등 4종에 대한 에틸아세테이트(ethyl acetate) 추출물을 비교하였다.

에틸 아세테이트 추출물의 수득 방법은 10g의 각각의 시료를 잘게 부순 후 30ml의 100% 메탄올을 침지하여 상온에서 24시간씩 3회 반복 추출한 추출용액을 거름 장치로 여과하고 감압장치로 메탄올을 제거하여 메탄올 추출액을 수득하였다. 상기 과정에 의해 수득된 메탄올 추출물에 에틸아세테이트와 물을 각각 20ml씩 첨가하여 혼합한 후 상층을 농축하여 에틸아세테이트 추출물을 수득하였다.

각각의 에틸아세테이트 추출물들은 에탄올로 2회 세척하여 잔류 용매를 제거한 후 감압 농축하고 DMSO에 일정농도로 용해시켜 무혈청 Dulbecco's modified Eagle 배지(DMEM)에 0.5% (v/v) 비율로 첨가한 배지에서 HEK 293 세포를 16 내지 20시간 동안 배양한 후 얻은 단백질을 8% SDS-PAGE 겔에서 전기영동하고 PVDF 막(membrane)으로 옮겨 SIRT1 특이항체(Cell Signalling Technology, 미국)로 면역블럿(immunoblotting) 하는 검색시스템을 확립하였다. 대조군으로는 약물이 포함되지 않은 DMSO 처리군을 사용하여 SIRT1의 발현을 대조군보다 증가시킨 약물을 선별하였다.

그 결과, 도 1A에서 보듯이, 상기 4종의 에틸아세테이트 추출물 모두 SIRT1 발현 증강 활성이 확인되었으며 대잎둥굴레 추출물(ID1215)의 활성이 가장 높은 것을 확인하였다. 또한 도 1B에서 보는 바와 같이, 대잎둥굴레 추출물(ID1215)은 층층갈고리둥굴레(ID1216)에 비해 8배 이상 낮은 농도에서도 SIRT1 발현 증강 효능을 나타냈다.

<실시예 2>

ID1215와 ID1216에 대한 생체 내 SIRT1 발현 시험

ID1215와 ID1216이 생체 내에서 SIRT1 발현을 증강시키는지를 확인하고자 C57BL6 쥐를 대상으로 각 장기별로 SIRT1 발현 양상을 확인하였다.

모든 동물 시술은 일동제약 동물 윤리위원회의 가이드라인에 따라 수행하였다. 8 주령 C57BL/6인 수컷 쥐를 오리엔탈바이오에서 구입하였다. 사육실 온도가 23°C, 습도는 50±10 %가 되도록 유지하였고, 명암은 12 시간으로 (day light 08:00~20:00)을 주기로 하여 1 주일간 환경에 적응시킨 후 실험에 착수하였다. 흡수를 돕기 위해 절식한 쥐에 ID1215와 ID1216을 각각 500 mg/kg 체중(=500mpk)이 되도록 투여하였다. 투여 5 시간 후, 쥐를 희생시키고 간, 지방, 근육을 적출하였다. 적출한 조직 일부는 RNA 추출을 위하여 액체 질소에 급속 냉동 후 -70℃ 에서 사용시까지 보관하고 나머지 적출한 조직은 단백질 추출을 위해 단백분해효소 억제제(Protease inhibitor)와 Na₃VO₄가 포함된 파쇄용 완충용액(Homogenization buffer) (10 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 % glycerol, 0.1 % Triton X-100) 에 넣은 후, BCA 정량법을 이용하여 단백질을 정량하였다. SIRT1의 발현을 확인하기 위해 근육을 제외한 나머지 조직은 60㎍ 단백질(근육은 100㎍)을 8 % SDS-PAGE 겔에서 분리한 후 PVDF 막으로 옮겨 5 % 탈지유(skim milk)로 10 분간 블로킹하여 항-Sirt1 항체로 웨스턴 블럿(Western blot)을 시행하였다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 ID1216과 ID1215 모두 지방과 근육에서 유사한 양상으로 SIRT1 단백질 발현을 증가시켰다.

<실시예 3>

ID1215와 ID1216에 대한 항비만 효능 시험

SIRT1 발현 시험을 통해 ID1215와 ID1216 모두 항비만 효과를 나타낼 것으로 예상되었다. 생체 외 실험에서 SIRT1 활성 증강 효능이 높았던 ID1215와 ID1216에 대한 항비만 효능을 비교하기 위하여 DIO모델 시험을 실시하였다.

<3-1> 고지방식이에 의한 비만 유도 생쥐 모델 제작

시험은 8주령의 C57BL6 생쥐에 40% 지방이 함유된 고지방식이에 ID1215와 ID1216을 첨가한 사료를 먹이면서 12 주 동안 진행하였다.

고지방식에 항 비만 효능에 대한 양성 대조군으로 시부트라민(sibutramine)은 0.01%, ID1215와 ID1216은 각각 0.5%가 되도록 섞어서 제작하고 사용 전까지 냉장 보관하였다. 사료의 구성 성분은 표 1과 같다.

성분	g/kg
카제인(Casein)	120
DL-메티오닌(DL-Methionine)	1.8
옥수수 전분(Cornstarch)	90
수크로오스(Sucrose)	300
셀룰로오스(Cellulose)	30
옥수수 기름(Corn Oil)	30
염 혼합물(Salt Mix)	21
비타민 혼합물(Vitamin Mix)	6
타타르산수소콜린 (Choline Bitartrate)	1.2
우지(Beef Tallow)	400

동물의 준비는 실시예 2와 동일하게 진행하였다. 생쥐는 12 주 동안 고지방식이를 자유롭게 식이하였다. 시험군은 우지가 포함되지 않은 일반사료처리군(ND), 약물 미처리 고지방식이군(HF), ID1215와 ID1216을 고지방식이 사료 kg 당 5000mg씩 포함하는 군 (ID1215, ID1216), 고지방식이 사료 kg 당 100mg의 시부트라민을 포함하는 군(sibutramine)으로 나누어 10 마리씩 시험을 시행하였다.

<3-2> 체중 변화 측정

체중은 일주일에 한 번 측정 되었다. 실험 종료 후 모든 군의 생쥐는 혈장을 회수하고 해부하여 간과 복부 지방의 중량을 측정하였다. 일부 간 조직과 지방조직은 조직 염색을 하여 관찰 하였다.

그 결과, 도 3에서 보듯이, ID1216과 ID1215를 각각 첨가한 비만사료 투여군은 고지방식이군에 비해 12주후 체중이 각각 8.6%, 25.9% 감소하였으며, 양성 대조군인 시부트라민 투여군은 초반에는 비만 억제 효능이 있었지만 8주 이후 효능이 사라졌다. 또한, 표 2 및 도 4에 나타난 바와 같이, 약물 투여군은 12주후 부검 시 고지방식이군에 비해 복부지방조직의 양이 고지방식이군에 비해 ID1216의 경우 3.2%, ID1215의 경우 41.9% 감소하였고, 시부트라민 투여군은 3.2% 감소하였다. 간의 질량은 ID1216이 지방식이군에 비해 6.2%, ID1215가 31.2% 감소하였고, 시부트라민 투여군에서는 간 질량의 변화가 없었다. 간 조직에 대한 조직학적 분석 결과, 고지방식이군의 간 조직에서 광범위하고 치밀하게 분포하던 지방이 ID1215 투여군에서 국소적이고 경증으로 완화된 것을 확인하였다. (결과미도시)

%비율	간	지방
ND	68.8	32.3
HF	100.00	100.00
시부트라민	100.00	96.8
ID1216	93.8	96.8
ID1215	68.8	58.1

<3-3> 혈액 검사

실험 종료 후 각 군의 생쥐로부터 혈액을 채취하여 혈장을 분리하였다. 콜레스테롤은 자동건조 화학 분석기(A25 analyzer, Biosystems)를 사용하여 분석하고 중성지방은 Triglyceride assay kit(Cayman)으로, 유리지방산은 NEFA(Wako)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다.

그 결과 도 5 및 표 3에서 보듯이, 대사증후군에 관한 지표로서 혈액 내 총 콜레스테롤 양은 고지방식이군 대비 ID1216 투여군은 10.6%, ID1215 투여군에서는 27.8% 감소되었고, 중성지방과 유리지방산은 ID1216 투여군에서 각각 14.9%, 15.4% 감소했고 ID1215 투여군에서는 27.0%, 38.2% 감소한 것을 확인하였다. ID1216의 경우 체중 증가 억제 효능 및 지방과 간 조직량의 감소 정도가 미약한데 반해 대사증후군 관련 지표의 개선 효과는 비교적 높았으며, ID1215는 ID1216과 비교하여 비만을 비롯한 모든 대사증후군 질환의 개선 효과가 높을 것으로 예상되었다.

%비율	콜레스테롤	중성지방	유리지방산
ND	52.6	55.7	53.2
HF	100.00	100.00	100.00
시부트라민	112.2	89.7	96.4
ID1216	89.4	83.1	84.6
ID1215	72.2	73.0	61.8

상기 실시예의 ID1215 및 ID1216에 대한 비만 및 대사증후군과 관련한 효능 시험 결과를 종합해 보면, 이들 조성물 모두 500mg/kg 용량으로 장기간 경구투여 시에도 독성이 없는 것으로 판단되며, 현재 비만치료제로 시판 중인 시부트라민과 비교하여 동등 이상의 항비만 효능을 나타낼 뿐만 아니라 비만 및 대사증후군과 관련된 다양한 표지들을 개선시키는 것을 알 수 있었다.

<실시예 4>

추출물의 최적 추출 조건 확립

에틸아세테이트 등의 유기용매를 사용하는 경우 식용이나 인체에 사용하려고 할 때, 분리정제과정이 복잡하거나 잔류 유기용매로 인해서 사용이 불가능한 경우가 발생하기 때문에 식용이 가능한 에탄올(주정)을 이용한 추출법을 확립하였다. 아울러, 추출물 내 본 발명의 유효성분의 함량이 높고 추출량이 많으며 대량생산 시 공정화가 용이하고 생산단가를 낮추기 위한 목적으로도 최적 추출 조건 시험을 실시하였다.

에틸아세테이트 추출물의 수득방법은 실시예 1의 방법과 같다. 10g의 시료를 잘게 부순 후 30ml의 100% 메탄올을 침지하여 상온에서 24시간씩 3회 반복 추출한 추출용액을 거름장치로 여과하고 감압장치로 메탄올을 제거하여 메탄올 추출물을 수득하였다. 상기 과정에 의해 수득된 메탄올 추출액에 메탄올 추출물에 에틸아세테이트와 물을 각각 20ml씩 첨가하여 혼합한 후 상층을 농축하여 에틸아세테이트 추출물을 수득하였다.

아울러, 추출공정을 간소화하기 위하여 80% 에탄올을 사용하여 다음과 같이 추출하였다. 잘게 부순 10g의 시료에 80%의 에탄올을 30ml씩 침지하여 24시간씩 3회 반복 추출한 추출용액을 거름장치로 여과하고 감압장치로 용매들을 제거하여 80% 에탄올 추출물을 수득하였다. 80% 에탄올 추출물은 시료 무게 대비 17%의 추출율을 나타내어 에틸아세테이트 추출물의 추출율 0.2%에 비해 85배 높은 추출율을 나타내었다.

<실시예 5>

ID1215와 ID1216의 에탄올 추출물의 SIRT1 발현 증강 효과 시험

상기 실시예 4에서 추출한 각각의 추출물을 DMSO에 일정농도로 용해시켜 실시예 1의 방법으로 SIRT1 활성 여부를 시험하였다.

SIRT1 활성을 가장 높이는 용매별 추출물을 선별하기 위하여 국내의 여러 산지에서 채취한 본 발명의 대잎둥굴레 (Polygonatum falcatum), 층층갈고리둥굴레 (Polygonatum sibiricum)의 80% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 추출물을 비교하였다. 실험은 실시예 1에서와 같이 추출물을 농도별로 HEK 293 세포에 처리한 후 SIRT1의 발현 증가를 웨스턴 블럿팅으로 확인하였다.

그 결과, 도 6에서 보듯이, 층층갈고리둥굴레 80% 에탄올 추출물(ID1216B) 및 대잎둥굴레 80% 에탄올 추출물(ID1215B)은 층층갈고리둥굴레 에틸아세테이트 추출물(ID1216) 및 대잎둥굴레 에틸아세테이트 추출물(ID1215)과 유사한 SIRT1 발현 증강 효능을 나타냈다.

추출물의 안전성 및 경제성 측면에서 장점이 있을 뿐만 아니라 세포 내 SIRT1 발현 증강 효과도 높은 대잎둥굴레 80% 에탄올 추출물(ID1215B)에 대하여 250, 500, 750 mg/kg 용량으로 마우스에 투여하면서 항비만 효능을 검증하였다.

<실시예 6>

ID1215B에 대한 항비만 효능 시험

<6-1> 고지방식이에 의한 비만 유도 생쥐 모델 제작

시험은 8주령의 C57BL6 생쥐에 40% 지방이 함유된 사료를 먹이면서 PBS 용해시킨 ID1215B를 250, 500, 750 mg/kg로 매일 1 회 경구 투여하는 방법으로 8주간 체중변화를 측정하고, 8주 후 다양한 비만 및 관련 지표들의 변화를 일반식이 및 비만식이 생쥐 군들과 비교하였다.

시험군은 우지가 포함되지 않은 일반사료처리군(ND), 약물 미처리 고지방식이군(HF), 고지방식이를 제공하면서 하루 한번 ID1215B를 250 mg/kg 투여하는 군(ID1215B-250mg/kg), 500 mg/kg 투여하는 군(ID1215B-500mg/kg), 750 mg/kg 투여하는 군(ID1215B-750mg/kg)으로 나누어 8 마리씩 시험을 시행하였다. ND와 HF는 ID1215B 투여군과 동일한 시험결과를 위해 하루 한 번 PBS를 투여하였다.

<6-2> 체중 변화 측정

그 결과, 도 7에서 보듯이, ID1215B 투여군은 고지방식이군에 비해 8주후 체중이 250, 500, 750 mg/kg 투여군에서 각각 17.0, 15.4, 17.0 % 감소하였다. 또한, 표 4, 도 8 및 도 12에 나타난 바와 같이, 약물 투여군은 8주 후 부검 시 고지방식이군에 비해 복부지방조직의 양이 모든 ID1215B 투여군에서 10% 이상 감소하였고 지방 세포의 크기도 줄었다(도 12A 참조). 간의 질량은 250, 500, 750 mg/kg 투여군에서 고지방식이군에 비해 각각 18.6, 14.0, 24.4 % 감소하였다. 간 조직에 대한 조직학적 분석 결과, 고지방식이군의 간 조직에서 광범위하고 치밀하게 분포하던 지방이 ID1215B 투여군에서 국소적이고 경증으로 완화된 것을 확인하였다(도 12B 참조).

%비율		간	지방
ND		126.7	28.2
HF		100.0	100.0
ID1215B	250mg/kg	81.4	68.6
	500mg/kg	86.0	69.5
	750mg/kg	75.6	68.6

<6-3> 저온 시험 (cold test)

체중감소의 원인을 확인하기 위하여 저온 시험(cold test)을 실시하였다. 생쥐를 4℃ 저온 공간에 두고, 8 시간 동안 1-2 시간마다 직장 내 온도를 측정해 기록하고 이를 초기 체온과 비교하였다.

그 결과, 도 9에서 보듯이, ID1215B 투여군은 고지방식이군에서 보이는 체온 저하를 상당히 극복하였으므로 ID1215B 투여에 의한 체중증가 억제 효능은 체내 활발한 대사를 통한 열 발산 증가에 의한 결과임을 알 수 있었다.

<6-4> 인슐린 저항성에 대한 당내성도 측정

인슐린 저항성에 의한 당내성도를 측정하기 위하여 16 시간 이상 금식한 생쥐의 꼬리에서 혈액을 얻어 혈당을 측정하고(0 분), 포도당을 2g/kg로 주사 후, 10, 20, 30, 60, 120 분에 혈액을 얻어 혈당을 측정하여 기록하였다.

그 결과 도 10에서 보듯이, ID1215B를 250, 500, 750 mg/kg 용량으로 투여한 군의 곡선하 면적(AUC, Area under curves)은 각각 14236±3021.8^*, 8387±2612.1^*, 7789±2604.8^*으로 고지방식이군에 비해 각각 31.6, 59.7, 62.6 % 감소하여 당내성이 개선되었다(*는 p<0.05).

<6-5> 혈액 검사

실험 종료 후 각 군의 생쥐로부터 혈액을 채취하여 혈장을 분리하였다. 독성 관련 지표와 콜레스테롤은 자동건조 화학 분석기(A25 analyzer, Biosystems)를 사용하여 분석하고 중성지방과 유리지방산은 Triglyceride assay kit(Cayman)과 NEFA(Wako)를 각각 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다.

그 결과 표 5와 도 11에서 보듯이, 대사증후군에 관한 지표로서 혈액 내 콜레스테롤은 유의적인 차이는 없었으나, 중성지방은 ID1215B 투여군에서 고지방식이군에 비해 각각 30.1, 42.5, 47.2 % 감소하여 농도의존성을 나타내었으며, 유리 지방산도 각각 7.1, 7.1, 14.3 % 감소하였다. 따라서 ID1215B는 체중 증가 억제뿐만 아니라 다양한 대사증후군 질환의 개선 효과가 높을 것으로 예상되었다.

%비율		콜레스테롤	중성지방	유리지방산
ND		55.9	90.0	92.9
HF		100.0	100.0	100.0
ID1215B	250mg/kg	97.9	69.9	92.9
	500mg/kg	107.1	57.4	92.9
	750mg/kg	96.5	52.7	85.7

또한 표 6에서 보는 바와 같이 ID1215B 투여군은 비만유도군에서 보여지는 간독성 관련된 지표 (ALT, AST 등)의 이상을 정상식이군과 유사한 정도로 낮추었으며, 약물투여 시 우려되는 신장독성과 관련된 지표 (크레아틴, BUN 등)는 정상식이군과 비교하여 유의적 변화를 보이지 않았다.

그룹	용량 (mg/kg)	알부민 (U/L)	ALP (mg/dL)	ALT (mg/dL)	AST (mg/dL)	빌리루빈 (mg/dL)	크레아틴 (mg/dL)	BUN (mg/dL)
ND	0	3.3± 0.37	171.1± 18.9	102.4± 27.8	241.4± 57.7	0.65± 0.10	0.42±0.06	30.9± 4.58
HF	0	3.6± 0.06	138.3± 17.4	98.0± 23.7	259.8± 49.3	0.73± 0.17	0.47±0.03	26.5± 5.81
ID1215B	250	3.7± 0.21	128.1± 24.5	61.4± 23.9*	182.8± 72.5*	0.64± 0.20	0.45±0.07	21.6± 3.38
	500	3.7± 0.35	101.9± 15.8*	47.9± 8.9*	139.5± 34.5*	0.59± 0.11	0.45±0.07	25.9± 4.82
	750	3.9± 0.14*	107.6± 8.9*	58.4± 23.1*	159.5± 55.9*	0.78± 0.16	0.42±0.06	25.0± 3.12

<6-6> 간과 지방조직의 광학 현미경적 관찰

동물실험 종료 후 간과 지방 조직의 변화를 확인하기 위하여 H&E (헤마토실린과 에오신) 염색 후 광학 현미경 관찰을 실시하였다.

적출한 간과 지방 조직은 일정 부위를 적당한 크기로 자른 다음 통상의 방법에 따라 10% 포르말린에 고정하고 수세, 파라핀 포매 과정을 거쳐 블록을 제작하였다. 만들어진 블록은 4 μm 두께로 절편을 만들어 일반적인 변화를 관찰하기 위해 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin) 염색을 실시하였다.

모든 농도의 ID1215B 투여군은 고지방식이군과 같은 황갈색으로의 변색 없이 일반식이군과 유사한 선홍색을 나타내었으며 공포변성의 범위나 정도도 뚜렷하게 감소하였다. 지방 조직분석 결과에서도 고지방식이군과 비교하여 모든 용량의 ID1215B 투여군에서 지방세포의 크기가 작음을 확인할 수 있었다 (도 12 참조).

<실시예 7>

단회 및 반복 투여 독성 시험

ID1215B를 경구 투여 시 독성 유발 여부를 확인하기 위해 단회 독성 및 4 주 반복 투여 독성시험을 수행하였다.

단회 독성은 6주령 웅성 ICR 생쥐 각 6마리를 한 군으로 하여 ID1215B를 경구로 1,000~5,000mg/kg체중으로 단회 투여 후 2주간 생존 여부를 살피고 실험동물을 안락사 후 부검을 통해 장기 이상 소견을 관찰하였다. 모든 농도의 ID1215B 투여군에서 사망한 동물은 없었고 장기 이상 소견도 발견되지 않아 독성이 없는 것으로 판단되었다(결과미도시).

반복 투여 독성은 6주령 웅성 ICR 생쥐 각 6마리를 한 군으로 하여 ID1215B를 경구로 1,000~3,000mg/kg체중으로 하루 한 번 28일간 반복 투여하면서 체중변화, 일반 증상 및 생존 여부를 살피고 실험동물을 안락사 후 부검을 통해 장기이상 소견을 관찰하였다. 모든 농도의 ID1215B 투여군에서 사망한 동물은 없었고 장기 이상 소견도 발견되지 않았으며, 표 7에서 보는 바와 같이 ALT, AST 등의 간독성과 관련된 지표 및 크레아틴, BUN 등과 같은 신장독성과 관련된 지표들에서는 모두 유의적인 변화가 없었다.

ID1215도 또한 위와 같은 방법으로 단회(1,000~3,000mg/kg체중) 및 7일간 반복 투여 독성(500~1,500mg/kg체중)을 확인하였으나, 모든 농도에서 생존률, 부검 시 이상 소견, 간독성 및 신장 독성과 관련된 혈액생화학적 지표들에서 vehicle과 유의적인 차이를 보이지 않았다(결과미도시).

그룹	용량 (mg/kg)	알부민(g/dL)	ALP (U/L)	ALT (U/L)	AST (U/L)	빌리루빈 (mg/dL)	크레아틴 (mg/dL)	BUN (mg/dL)
Vehicle	0	2.6± 0.1	184± 58.7	41± 13.2	67± 6.4	0.54± 0.1	0.33± 0.06	17.5± 1.6
ID1215B	1000	2.7± 0.07	166± 45.1	42± 10.2	62± 6.0	0.77± 0.4	0.36± 0.06	16.8± 1.2
	2000	2.9± 0.35	171± 34.2	45± 7.4	67± 9.3	0.62± 0.1	0.29± 0.05	17.8± 3.4
	3000	2.7± 0.07	144± 22.3	45± 15.3	67± 13.2	0.58± 0.1	0.28± 0.07	16.3± 1.0

상기 실시예의 ID1215B에 대한 비만 및 대사증후군과 관련한 효능 및 독성 시험 결과를 종합해 보면, 본 조성물은 최대 5000mg/kg의 고용량 단회 투여 및 3000mg/kg 용량으로 반복투여 시에도 독성이 없을 뿐만 아니라, 최대 750mg/kg 용량으로 장기간 경구투여 시에도 독성 없이 항비만 효능 및 대사증후군과 관련된 다양한 표지들을 개선시킴을 알 수 있었다.

Claims

대잎둥굴레 (Polygonatum falcatum) 또는 층층갈고리둥굴레 (Polygonatum sibiricum)인 둥굴레속 식물의 물, 에탄올, 주정, 메탄올, 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산, 시클로헥산, 석유에테르(petroleum ether), 디에틸에테르, 벤젠으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매 추출물을 함유하는 비만, 비만 합병증 및 대사증후군으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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대잎둥굴레 (Polygonatum falcatum) 또는 층층갈고리둥굴레 (Polygonatum sibiricum)인 둥굴레속 식물의 물, 에탄올, 주정, 메탄올, 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산, 시클로헥산, 석유에테르(petroleum ether), 디에틸에테르, 벤젠으로 이루어진 군에서 선택된 하나이상의 용매 추출물을 함유하는 비만, 비만 합병증 및 대사증후군으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환의 예방 및 완화용 식품 조성물.
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