KR20130128349A - 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 플라본계 화합물을 함유하는 근육 질환 예방 및 치료용 또는 근 기능 개선용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 캠페리아 파비플로라(Kaempferia parviflora Wall. ex Baker) 추출물 또는 플라본계 화합물을 함유하는 근육 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 이로부터 분리된 화학식 4로 표시되는 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 치료용 약학적 조성물, 근 기능 개선용 식품 조성물 및 운동수행능력 증강용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 캠페리아 파비플로라 추출물과 이로부터 분리된 플라본계 화합물은 근육 내 단백질의 이화 작용을 감소시키고 근육 세포 분화 및 동화 작용을 증가시키므로, 근육 질환 치료용 약학적 조성물 또는 근 기능 개선용 식품 조성물을 제조하는데 효과적이다.

Description

캠페리아 파비플로라 추출물 또는 플라본계 화합물을 함유하는 근육 질환 예방 및 치료용 또는 근 기능 개선용 조성물{Composition for prevention and treatment of muscular disorder or improvement of muscular functions comprising Kaempferia parviflora extract or flavone compounds}
본 발명은 캠페리아 파비플로라(Kaempferia parviflora Wall. ex Baker) 추출물 또는 플라본계 화합물을 함유하는 근육 질환 예방 및 치료용 또는 근 기능 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 이로부터 분리된 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 치료용 약학적 조성물 또는 근 기능 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 65-70세 인구 중 약 24%는 노화에 의한 근위축을 경험하고 있으며, 20%정도가 근 기능이 상실되고 있는 것으로 알려지고 있다(J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 60(2): 21316, 2005). 신체가 노화됨에 따라, 단백질을 합성하는 작용인 동화 작용(anabolism)에 관여하는 성장 호르몬, 성 호르몬, 유사 인슐린 성장인자 등의 호르몬 분비가 감소되어 근육의 단백질 합성이 저하되고 순환 염증성 사이토카인(cytokine), 특히 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-; TNF-)의 수치가 증가하게 된다. 근섬유의 재생능력을 저하시키는 요인으로 염증성 사이토카인의 하나인 TNF-α는 손상된 근섬유와 융합하거나 분화를 억제하며, 근육 내 단백질을 분해하는 작용인 이화 작용(catabolism)을 촉진하여 결국 골격근 조직의 손실을 야기할 수 있다(Clin. Nutr. 26(5): 52434, 2007).
노화에 따른 만성 염증으로 근위축을 유발하는 주요 신호전달체계인 forkhead box(foxo)경로가 활성화되면 단백질 분해에 관여하는 E3 ubiquitin ligase인 atrogin-1과 MuRF1의 발현이 증가된다(Cell Metab. 6(6): 47283, 2007). 반면, PI3K/AKT 신호전달 경로는 foxo의 활성을 억제시키고 단백질 합성 관련인자 mammalian target of rapamycin(mTOR)를 활성화시켜 근육성장을 유도한다(Int. J. Biochem. Cell Biol. 37(10): 1985-96, 2005). 특히, PI3K/AKT 및 mTOR는 운동에 의해 활성화되는 신호기작으로서 근육량을 증가시켜 운동능력을 향상시키는데 관여한다(Acta. Physiol. (Oxf). 191(1): 67-75, 2007).
근육세포 분화는 myoD, myf5, myogenin, mrf4와 같은 다양한 근육 조절 인자(muscle regulatory factors; MRFs)에 의해 조절된다. MyoD는 근육 특이 유전자의 발현을 개시하게 하고 중간엽줄기세포가 근육세포 계열로 분화하는 것을 유도한다. Myogenin 발현의 유도는 myoD 활성에 의해 조절된다. 손상된 근육세포의 재생은 노화 또는 만성 염증으로 발생한 근위축증을 예방 또는 치료할 수 있다(J. Histochem. Cytochem. 54(11): 1177-91, 2006)
노화에 의한 근위축은 근 기능 자체의 문제만이 아니라 골다공증, 다양한 질병으로의 전이, 낙상과 관련된 부상 등과 밀접하게 관계되어있다. 따라서 가능한 노화로 인한 근육량의 손실을 제한하기 위하여 가능한 빠른 시기에 적절한 운동과 영양학적 처치가 중요하다(Exp. Gerontol. 37(4): 477-89, 2002).
천연물 유래의 근 기능 조절 물질을 탐색한 결과, 캠페리아 파비플로라 (Kaempferia parviflora Wall. ex Baker) 추출물 및 이에 포함된 플라본계 화합물이 근육 내 단백질 이화 작용을 감소시키고 근육 세포 분화 및 동화 작용을 증가시키는 활성이 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 캠페리아 파비플로라(Kaempferia parviflora) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 하기 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 4]
Figure pat00001
상기 화학식 4에서 R1, R2 및 R3는 각각 수소 또는 메톡시기(methoxy)를 의미한다.
본 발명은 캠페리아 파비플로라 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 기능 개선용 또는 운동수행능력 증강용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 근 기능 개선용 또는 운동수행능력 증강용 식품 조성물을 제공한다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 캠페리아 파비플로라(Kaempferia parviflora) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 캠페리아 파비플로라 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 기능 개선용 또는 운동수행능력 증강용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 근 기능 개선용 또는 운동수행능력 증강용 식품 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 캠페리아 파비플로라(Kaempferia parviflora) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 추출물은 이에 한정하지는 않지만, 캠페리아 파비플로라(Kaempferia parviflora)의 근경 추출물일 수 있다.
캠페리아 파비플로라는 생강과(Zingiberaceae family)의 식물의 일종으로서 블랙 진저(black ginger)라고도 불린다.
본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물은 공지의 천연물 추출방법에 의하여 추출될 수 있으며, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 6개의 유기용매 및 아임계 또는 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출될 수 있으며, 더 바람직하게는 탄소수 1 내지 6개의 알콜 수용액일 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 6개의 유기용매는 탄소수 1 내지 6개의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane) 및 석유에테르(petroleum ether)로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물은 건조시킨 캠페리아 파비플로라 근경(rhizome)을 식품가공에 적합한 정제수, 에탄올 및 아임계수 또는 초임계 이산화탄소를 이용하여 추출, 정제하여 얻을 수 있거나, 또는 캠페리아 파비플로라 식물을 직접 압착하여 얻은 오일로부터 분리 정제하여 얻을 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 화학식 4의 화합물은 바람직하게는 5,7-디메톡시플라본, 5,7,4`-트리메톡시플라본 및 3,5,7,3`4`-펜타메톡시플라본으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 5,7-디메톡시플라본(5,7-dimethoxyflavone), 5,7,4`-트리메톡시플라본(5,7,4'-trimethoxyflavone), 3,5,7,3`4`-펜타메톡시플라본(3,5,7,3',4'-pentamethoxyflavone)으로 모두 플라본계 화합물에 속하는 화합물이다.
본 발명의 조성물에서, 상기 5,7-디메톡시플라본, 5,7,4`-트리메톡시플라본, 및 3,5,7,3`4`-펜타메톡시플라본은 화학적 합성방법에 의하여 합성되거나, 캠페리아 파비플로라 혹은 다른 식물로 부터 추출되어 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 상기 플라본계 화합물은 그 자체 또는 염 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용 가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약제학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
캠페리아 파비플로라는 생강과(Zingiberaceae family)의 식물의 일종으로서 블랙 진저(black ginger)라고도 불린다. 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물은 플라본계 화합물 특히, 다량의 5,7-디메톡시플라본, 5,7,4`-트리메톡시플라본, 3,5,7,3`4`-펜타메톡시플라본을 포함한다.
캠페리아 파비플로라의 추출물로부터 본 발명의 플라본계 화합물의 분리 및 정제는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있으나, 추출 및 분리정제 방법이 반드시 상기 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명인이 캠페리아 파비플로라 추출물 및 이로부터 정제한 화학식 4의 화합물로 근육 단백질 이화 작용 억제, 동화 작용 촉진, 근육 세포 분화 촉진 효과 및 근육량 증가 효과를 확인하였다(실험예 1 내지 3 참조).
따라서 상기 캠페리아 파비플로라 추출물 및 이로부터 정제한 화학식 4의 화합물은 근육 질환을 치료할 수 있는데, 상기 근육 질환은 근육 소모 또는 퇴화로 인한 질환을 의미한다. 상기 질환의 예로는 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근무력증 및 근육감소증(Sacopenia)을 들 수 있다. 근육 소모는 근육량의 점진적 손실, 근육, 특히 골격근 또는 수의근 및 심장근육의 약화 및 퇴행을 특징으로 한다. 근육 소모 및 퇴화는 유전적 요인, 후천적 요인, 노화 등을 원인으로 발생한다. 본 발명의 조성물은 근육 증가 촉진 효과를 가지고, 근육은 그 종류를 제한하지 않는다. 근육 증가는 신체 성분 중에서도 특히 근육의 성능을 향상시키는 것으로, 육체적 운동 및 지구력 향상을 통해 근육량을 증가시킬 수 있고, 근육 증가 효과를 가지는 물질을 체내에 투여하는 방식으로 근육량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 따른 약학적 조성물은 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 화학식 4의 화합물을 단독으로 사용하거나, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화 될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다.
상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 "경피 투여"는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문서(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화 할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington'sPharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 추출물 또는 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 0.001 내지 300mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.01 내지 200mg/day/체중kg으로 투여하는 것이 좋다. 그러나, 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포 좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한 본 발명은 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 근 기능 개선용 또는 운동수행능력 증강용 식품 조성물을 제공한다.
근 기능 개선은 근육량의 증가, 근력 강화, 근 피로 회복능 등 근육 본래적 성질 또는 기능을 강화한다는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물, 플라본계 화합물이 PI3K/AKT 및 mTOR 발현량을 증가(실험예 2 참조)시키고, 이런 인자들은 근육량을 증가시켜 운동능력을 향상시키는데 관여한다(Acta. Physiol. (Oxf). 191(1): 67-75, 2007).
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 화학식 4의 화합물 또는 이의 염 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 화학식 4의 화합물 또는 이의 염과 근육 기능 증진의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 화학식 4의 화합물 또는 이의 염의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 100 중량%이다.
또한, 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
상기와 같이, 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물과 이로부터 분리된 플라본계 화합물은 근육 내 단백질의 이화 작용을 감소시키고 근육 세포 분화 및 동화 작용을 증가시키므로, 근육 질환 치료용 약학적 조성물 또는 근 기능 개선용 식품 조성물을 제조하는데 효과적이다.
도 1은 본 발명에 따른 5,7-디메톡시플라본의 처리 여부에 따른 근육 세포에서 RT-PCR을 이용하여 atrogin-1, MuRF1의 mRNA 발현량 감소 여부를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 5,7-디메톡시플라본의 처리 여부에 따른 근육 세포에서 RT-PCR을 이용하여 myogenin, myoD의 mRNA 발현량 증가 여부를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 5,7-디메톡시플라본의 처리 여부에 따른 근육 세포에서 웨스턴 블롯을 이용하여 PI3K, p-AKT, p-mTOR의 단백질 발현량 증가 여부를 나타낸 것이다.
도 4는 근육 세포에서 캠페리아 파비플로라 추출물이 근육 분화 조절 인자인 myogenin 및 myoD의 mRNA 발현량을 증가시키는 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 근육 세포에서 캠페리아 파비플로라 추출물이 단백질 동화작용에 관여하는 인자인 PI3K, p-AKT 및 p-mTOR를 증가시키는 효과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다.
단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
캠페리아 파비플로라(흑생강) 에탄올 추출물의 제조
건조된 캠페리아 파비플로라 근경(rhizome)을 믹서로 분쇄한 다음, 분쇄한 캠페리아 파비플로라 시료 100 g을 95% 에탄올 1L에 넣고 48시간 상온에서 냉침하여 추출하였다. 추출된 시료는 와트만(Whatman) 2번 여과지로 여과하고, 여과된 추출액을 진공 회전 농축기로 농축하여 용매성분을 제거한 후 캠페리아 파비플로라 에탄올 추출물(9.56 g)을 얻었다.
<실시예 2>
흑생강 에탄올 추출물로부터 플라본계 화합물 분리
<2-1> 5,7-디메톡시플라본의 분리 및 구조결정
상기 실시예 1에서 얻은 농축된 캠페리아 파비플로라 에탄올 추출물을 실리카겔을 6x15 cm로 충진한 컬럼에 적재하고 에틸아세테이트 및 메탄올을 10:0.5 (v/v)의 비율로 혼합한 용매시스템을 이용하여 분취하였다. 상기 분취 순서에 따라서 총 5개의 분획으로 나누어 각각의 분획을 농축 건조하였다. 5개의 분획 중 3번 분획(분획 3)을 Rp-18 컬럼 크로마토그래피(Lichroprep RP-18 25~40um, Merck & Co., 미국)를 이용하여 전개 용매 70% 메탄올로 분취하였다. 상기 분취 순서에 따라서 총 2개의 분획으로 나누어 농축 건조하였다. 상기 2개의 분획 중 2번 분획(분획 3-2)을 실리카겔을 6x15 cm로 충진한 컬럼에 적재하고 에틸아세테이트 및 메탄올을 10:0.4 (v/v)의 비율로 혼합한 용매시스템을 이용하여 분취하여 최종적으로 상기 2개의 분획 중 1번 분획 (분획 3-2-1)을 농축 건조시켜 자외선 차단물질을 분리하였다.
상기에서 분리된 단일 활성물질의 구조결정을 위하여 1H-NMR 스펙트럼과 13C-NMR 스펙트럼을 각각 500 MHz 와 125 MHz (용매: CDCl3)에서 측정하였다. 본 화합물은 EI/MS에서 [M]가 m/z 282에서 관측되어 분자량이 282로 판명되었다. 이상의 1H-NMR, 13C-NMR, 및 EI/MS에 대한 결과와 기존에 발표된 연구보고(Sutthanut K. et al., J. Chromatogr A., 1143:227-233, 2007)를 비교 분석하여 동정한 결과, 상기에서 분리된 단일물질은 하기 화학식 1로 표시되는 5,7-디메톡시플라본으로 확인되었다.
[화학식 1]
Figure pat00002

<2-2> 5,7,4`-트리메톡시플라본의 분리 및 구조결정
상기 실시예 1에서 얻은 농축된 캠페리아 파비플로라 에탄올 추출물을 실리카겔을 6x15cm로 충진한 컬럼에 적재하고 에틸아세테이트, 메탄올을 10:0.5 (v/v)의 비율로 혼합한 용매시스템을 이용하여 분취하였다. 상기 분취 순서에 따라서 총 5개의 분획으로 나누어 각각의 분획을 농축 건조하였다. 5개의 분획 중 4번 분획(분획 4)을 Rp-18 컬럼 크로마토그래피(Lichroprep RP-18 25~40um, Merck & Co., 미국)를 이용하여 전개 용매 70% 메탄올로 분취하였다. 70% 메탄올을 전개 용매로 이용하여 분취하였다. 상기 분취 순서에 따라서 총 2개의 분획으로 나누어 농축 건조하였다. 최종적으로 2번 분획(분획 4-2)을 농축 건조시켜 자외선 차단물질을 분리하였다.
상기에서 분리된 단일 활성물질의 구조결정을 위하여 1H-NMR 스펙트럼과 13C-NMR 스펙트럼을 각각 500 MHz 와 125 MHz (용매: CDCl3)에서 측정하였다. 본 화합물은 EI/MS에서 [M]가 m/z 312에서 관측되어 분자량이 312로 판명되었다. 이상의 1H-NMR, 13C-NMR, 및 EI/MS에 대한 결과와 기존에 발표된 연구보고(Sutthanut K. et al., J. Chromatogr A., 1143:227-233, 2007)를 비교 분석하여 동정한 결과, 상기에서 분리된 단일물질은 하기 화학식 2으로 표시되는 5,7,4`-트리메톡시플라본으로 확인되었다.
[화학식 2]
Figure pat00003

<2-3> 3,5,7,3`,4`- 펜타메톡시플라본 분리
상기 실시예 1에서 얻은 농축된 캠페리아 파비플로라 에탄올 추출물을 실리카겔을 6x15cm로 충진한 컬럼에 적재하고 에틸아세테이트, 메탄올을 10:0.5 (v/v)의 비율로 혼합한 용매시스템을 이용하여 분취하였다. 상기 분취 순서에 따라서 총 5개의 분획으로 나누어 각각의 분획을 농축 건조하였다. 5개의 분획 중 3번 분획(분획 3)을 Rp-18 컬럼 크로마토그래피(Lichroprep RP-18 25~40um, Merck & Co., 미국)를 이용하여 전개 용매 70% 메탄올로 분취하였다. 70% 메탄올을 전개 용매로 이용하여 분취하였다. 상기 분취 순서에 따라서 총 2개의 분획으로 나누어 농축 건조하였다. 최종적으로 1번 분획(분획 3-1)을 농축 건조시켜 자외선 차단 물질을 분리하였다.
상기에서 분리된 단일 활성물질의 구조결정을 위하여 1H-NMR 스펙트럼과 13C-NMR 스펙트럼을 각각 500 MHz 와 125 MHz(용매: CDCl3)에서 측정하였다. 본 화합물은 EI/MS에서 [M]가 m/z 372에서 관측되어 분자량이 372로 판명되었다. 이상의 1H-NMR, 13C-NMR, 및 EI/MS에 대한 결과와 기존에 발표된 연구보고(Sutthanut K. et al., J. Chromatogr A., 1143:227-233, 2007)를 비교 분석하여 동정한 결과, 상기에서 분리된 단일물질은 하기 화학식 3으로 표시되는 3,5,7,3`,4`-펜타메톡시플라본으로 확인되었다.
[화학식 3]
Figure pat00004

< 실험예 1>
세포 모델에서 근육 내 단백질 이화 작용 감소 효과
근육세포인 L6 myoblast(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)를 DMEM(10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 g/mL streptomycin)에서 배양하였다. 세포밀도가 약 80~85%가 되었을 때 세포 배지를 2%의 FBS를 첨가한 DMEM 성장배지로 교체하여 6일간 분화한 후 실험을 진행하였다. 분화된 L6 세포에 근 감소를 유도시키기 위하여 TNF-α를 24시간 처리한 후, 상기 실시예 2-1에서 제조한 5,7-디메톡시플라본을 농도별 (1, 5 μM)로 처리하였다. 근육 내 단백질 이화 작용에 관여하는 주요 ligase인 atrogin-1과 MuRF1의 mRNA 발현량을 알아보기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 분화한 세포로부터 TRIzol시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 수확하여 역전사시킨 후, RT-PCR 분석을 다음과 같이 수행하였다. 먼저 cDNA 합성을 위해 상기 RNA를 reverse transcriptase로 역전사시켰다. RT-PCR은 다음의 특정 프라이머로 수행하였다:
β-actin
Forward primer: 5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3' (서열번호 1)
Reverse primer: 5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3' (서열번호 2)
Atrogin-1
Forward primer: 5'-CCCTGAGTGGCATCGCCCAA-3' (서열번호 3)
Reverse primer: 5'-AGGTCCCGCCCATCGCTCA-3' (서열번호 4)
MuRF1
Forward primer: 5'-TCTACTCGGCCACAGGCGCT-3' (서열번호 5)
Reverse primer: 5'-CTTGACAGCTCCCGCCGCAA-3' (서열번호 6)
각각의 상대적인 mRNA 발현량 값은 β-actin 값으로 표준화하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 유전자 전사의 수준에서, 5,7-디메톡시플라본이 근육 내 단백질 이화 작용에 관여하는 주요 ligase인 atrogin-1과 MuRF1의 mRNA 수준을 감소시킴을 알 수 있다.
< 실험예 2>
세포 모델에서 근육 분화 및 동화 작용 증가 효과
<2-1> 근육세포 분화 증가 효과
상기 실험예 1에서와 동일한 방법으로 분화한 세포로부터 총 RNA를 수확하여 역전사시킨 후, RT-PCR을 수행하였다. 이때, 5,7-디메톡시플라본 외에도 캠페리아 파비플로라 추출물(1, 10 ㎍/ml)을 처리하여 실험예 1과 동일한 방법으로 분화한 세포로도 RT-PCR을 수행하였다.
Myogenin
Forward primer: 5'-TGGGCTGCCACAAGCCAGAC-3' (서열번호 7)
Reverse primer: 5'-CAGCCCAGCCACTGGCATCA-3' (서열번호 8)
MyoD
Forward primer: 5'-GGATGGTGCCCCTGGGTCCT-3' (서열번호 9)
Reverse primer: 5'-TGGCCTTCGCTGTGAGTCGC-3' (서열번호 10)
각각의 상대적인 mRNA 발현량 값은 β-actin 값으로 표준화하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 유전자 전사의 수준에서, 5,7-디메톡시플라본이 근육 분화 조절 인자인 myogenin과 myoD의 mRNA 수준을 증가시킴을 알 수 있다. 또한, 도 4에서도 캠페리아 파비플로라 추출물이 myogenin과 myoD의 mRNA 수준을 증가시킴을 확인할 수 있다.
<2-2> 근육세포 단백질 동화 작용 증가 효과
상기 실험예 1과 같은 방법으로 처리된 L6세포를 proteinase inhibitor cocktail이 포함된 RIPA 완충용액으로 용해시켰다. 상기시료를 5분간 끓인 후, 동량의 단백질(20 μg)을 10% SDS-PAGE로 전기영동하여 분리하였다. 전기영동 후 분리된 단백질들을 니트로셀룰로스 막으로 전달하고 웨스턴 블롯을 수행하였다. 1차 항체에 반응시킨 다음 TBST를 이용하여 10분간 3회 세척하였다. 이때, 본 발명에서 사용된 1차 항체의 종류와 희석률은 1:1000이다. 2차 항체반응은 상기 1차 항체반응을 수행한 막에 2차 항체(anti-rabbit horseradish)를 넣고 상온에서 2시간 동안 반응하였다. 이때 2차 항체의 희석률은 1:5000으로 하였다. Protein band는 ECL western blotting detection reagents(Amersham, Tokyo, Japan)를 사용하여 발색하였다. 근육 내 단백질 동화 작용에 관여하는 PI3K, p-AKT, p-mTOR의 단백질 발현을 확인하였으며, a-tubulin으로 단백질 로딩량이 일정함을 나타내었다. 상기 방법과 동일하게 진행하되, 처리물질을 5,7-디메톡시플라본 외에도 캠페리아 파비플로라 추출물(1, 10 ㎍/ml)로 하여 진행하였고, 5,7-디메톡시플라본 처리 결과는 도 3, 캠페리아 파비플로라 추출물 처리 결과는 도 5에 표시하였다.
도 3 및 도 5에 나타난 바와 같이, 5,7-디메톡시플라본과 캠페리아 파비플로라 추출물이 PI3K, p-AKT, p-mTOR의 단백질 발현량 증가를 알 수 있었다. 이러한 결과는 처리물질들이 근육량을 증가시키고 운동능력을 향상시키는 것을 의미한다.
< 실험예 3>
동물 모델에서 근육량 증가 효과 확인
5주령된 Wistar rat을 1주간 적응시키고 TNF-α 100 ng/g을 2주간 공급하여 근위축을 유도시킨 다음, 체중을 기초로 무작위적으로 군을 배치하여 각각 8마리씩 총 4군으로 나누어 실험에 이용하였다. 실험군으로는 캠페리아 파비플로라 추출물을 500 mg/kg체중, 5,7-디메톡시플라본, 5,7,4`-트리메톡시플라본, 3,5,7,3`4`-펜타메톡시플라본을 300 mg/kg체중의 농도로 0.25% 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose)에 현탁하여 1일 1회씩 8주간 일정한 시간에 투여하였다. 이때, 대조군으로는 실험군이 섭취하는 동일한 양의 0.25% 카르복시메틸셀룰로오스에 TNF-α를 투여한 군을 사용하였다.
8주간 시료를 투여한 후 오른쪽 종아리 아래 근육을 절제하여 microbalance (Mettler PE160, USA)로 무게를 측정하였다. 그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 캠페리아 파비플로라 추출물, 5,7-디메톡시플라본, 5,7,4`-트리메톡시플라본, 3,5,7,3`4`-펜타메톡시플라본을 투여한 군에서 근육의 무게가 각각 유의적(p<0.01)으로 125%, 126%, 118%, 120% 증가하였다. 이와 같은 결과로 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물과 이로부터 분리된 플라본계 화합물이 근육량 증대에 효율적으로 작용하고 있음을 의미한다.
처리물질 별 종아리 근육 무게
처리물질 종아리 근육 무게 (mg)
TNF-a 437
캠페리아 파비플로라 추출물 547
5,7-디메톡시플라본 551
5,7,4`-트리메톡시플라본 519
3,5,7,3`4`-펜타메톡시플라본 528
본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물과 이로부터 분리된 플라본계 화합물은 근육 내 단백질의 이화 작용을 감소시키고 근육 세포 분화 및 동화 작용을 증가시키므로, 근육 질환 치료용 약학적 조성물 또는 근 기능 개선용 식품 조성물을 제조할 수 있어, 산업상 이용가능성이 높다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Composition for prevention and treatment of muscular disorder or improvement of muscular functions comprising Kaempferia parviflora extract or flavone compounds <130> NP13-0036 <150> KR 10-2012-0051776 <151> 2012-05-16 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for beta-actin <400> 1 agccatgtac gtagccatcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for beta-actin <400> 2 ctctcagctg tggtggtgaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Atrogin-1 <400> 3 ccctgagtgg catcgcccaa 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Atrogin-1 <400> 4 aggtcccgcc catcgctca 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MuRF1 <400> 5 tctactcggc cacaggcgct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MuRF1 <400> 6 cttgacagct cccgccgcaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Myogenin <400> 7 tgggctgcca caagccagac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Myogenin <400> 8 cagcccagcc actggcatca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MyoD <400> 9 ggatggtgcc cctgggtcct 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MyoD <400> 10 tggccttcgc tgtgagtcgc 20

Claims (11)

  1. 캠페리아 파비플로라(Kaempferia parviflora) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 탄소수 1 내지 6개의 알콜 수용액으로 추출한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 하기 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물;
    [화학식 4]
    Figure pat00005

    상기 화학식 4에서 R1, R2 및 R3는 각각 수소 또는 메톡시기(methoxy)를 의미한다.
  4. 제3항에 있어서, 상기 화합물은 5,7-디메톡시플라본, 5,7,4`-트리메톡시플라본 및 3,5,7,3`4`-펜타메톡시플라본으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육 질환은 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근무력증 및 근육감소증(Sacopenia)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 캠페리아 파비플로라 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 기능 개선용 식품 조성물.
  7. 하기 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 근 기능 개선용 식품 조성물;
    [화학식 4]
    Figure pat00006

    상기 화학식 4에서 R1, R2 및 R3는 각각 수소 또는 메톡시기(methoxy)를 의미한다.
  8. 제7항에 있어서, 상기 화합물은 5,7-디메톡시플라본, 5,7,4`-트리메톡시플라본 및 3,5,7,3`4`-펜타메톡시플라본으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  9. 캠페리아 파비플로라 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 증강용 식품 조성물.
  10. 하기 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 증강용 식품 조성물;
    [화학식 4]
    Figure pat00007

    상기 화학식 4에서 R1, R2 및 R3는 각각 수소 또는 메톡시기(methoxy)를 의미한다.
  11. 제10항에 있어서, 상기 화합물은 5,7-디메톡시플라본, 5,7,4`-트리메톡시플라본 및 3,5,7,3`4`-펜타메톡시플라본으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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