JP6182640B2

JP6182640B2 - ケンペリア・パルウィフローラ抽出物、または、フラボン系化合物の筋肉疾患予防、治療及び筋機能改善用途

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Publication number: JP6182640B2
Application number: JP2016088470A
Authority: JP
Inventors: ゼグアンフアン; ボギョンサ; テユンキム
Original assignee: Maruzen Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Maruzen Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2016-04-26
Publication date: 2017-08-16
Anticipated expiration: 2033-05-16
Also published as: US10188690B2; KR101528023B1; EP2851071A4; US9669066B2; JP5903191B2; US20150190452A1; WO2013172681A1; EP2851071B1; JP2015522538A; JP2015107964A; US20180085417A1; JP2016155831A; JP5931309B1; KR20130128349A; CN104411310A; JP2016193906A; EP2851071A1; CN104411310B

Description

本出願は2012年5月16日に出願された大韓民国特願第10-2012-0051776号（出願番号）を優先権として主張し、上記明細書全体は本出願の参考文献である。

本発明はケンペリア・パルウィフローラ（Kaempferia parviflora Wall. ex Baker）抽出物、または、フラボン系化合物の筋肉疾患予防及び治療用途に関するもので、より詳しくはケンペリア・パルウィフローラ抽出物、または、それから分離したフラボン系化合物を有効成分として含む筋肉疾患の治療用の薬学的組成物、筋機能改善用の食品組成物に関する。

一般的に６５〜７０才の人口のうち、約２４％は老化による筋委縮を経験しており、２０％程度が筋機能が喪失されていることで知られている（J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 60(2)：21316, 2005，非特許文献１）。身体が老化に伴い、タンパク質を合成する作用である同化作用（anabolism）に関与する成長ホルモン、性ホルモン、インスリン様成長因子等のホルモン分泌が減少して、筋肉のタンパク質合成が低下して循環炎症性サイトカイン（cytokine）、特に、腫瘍壊死因子−α（tumor necrosis factor-；TNF-）の数値が増加することになる。筋繊維の再生能力を低下させる要因として、炎症性サイトカインの一つであるTNF-αは破損した筋繊維と融合したり、分化を抑制したりして、筋肉内のタンパク質を分解する作用である異化作用（catabolism）を促進して、最終的に骨格筋組織の損失を生じさせることができる（Clin. Nutr. 26(5)：52434, 2007，非特許文献２）。

老化による慢性炎症で筋委縮を誘発する主要なシグナル伝達体系であるforkhead box（foxo）経路が活性化すると、タンパク質の分解に関与するE3 ubiquitin ligaseであるatrogin-1とMuRF1の発現が増加する（Cell Metab. 6(6)：47283, 2007，非特許文献３）。

一方、PI3K/AKTシグナル伝達経路はfoxoの活性を抑制し、タンパク質合成の関連因子mammalian target of rapamycin（mTOR）を活性させ、筋肉成長を誘導する（Int. J. Biochem. Cell Biol. 37(10)：1985-96, 2005，非特許文献４）。特に、PI3K/AKT及びmTORは、運動により活性化されるシグナル経路で筋肉量を増加させ、運動能力を向上させるのに関与する（Acta Physiol. (Oxf). 191(1)：67-75, 2007，非特許文献５）。

筋肉細胞の分化は、myoD、myf5、myogenin、mrf4等の多様な筋肉調節因子（muscle regulatory factors；MRFs）によって調節される。MyoDは、筋肉の特異的遺伝子の発現を開始することにして、間葉幹細胞（mesenchymal stem cells）が筋肉細胞の系列に分化することを誘導する。Myogenin発現の誘導は、myoD活性によって調節される。損傷された筋肉細胞の再生は、老化または慢性炎症により発生した筋委縮症を予防または治療することができる（J. Histochem. Cytochem. 54(11)：1177-91, 2006，非特許文献６）。

老化による筋委縮は、筋機能そのものの問題だけではなく、骨粗鬆症、様々な疾病への転移、転倒と関連した怪我等と密接に関係している。従って、老化による筋肉量の損失を制限するため、できる限り早い時期に適切な運動と栄養学的処置が重要である（Exp. Gerontol. 37(4)：477-89, 2002，非特許文献７）。

J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 60(2)：21316, 2005 Clin. Nutr. 26(5)：52434, 2007 Cell Metab. 6(6)：47283, 2007 Int. J. Biochem. Cell Biol. 37(10)：1985-96, 2005 Acta Physiol. (Oxf). 191(1)：67-75, 2007 J. Histochem. Cytochem. 54(11)：1177-91, 2006 Exp. Gerontol. 37(4)：477-89, 2002

天然物由来の筋機能の調節物質を探索した結果、ケンペリア・パルウィフローラ（Kaempferia parviflora Wall. ex Baker）抽出物及びこれに含まれたフラボン系化合物が筋肉内のタンパク質異化作用を減らし、筋肉細胞の分化及び同化作用を増加させる活性があることを見付けて本発明の完成に至った。

従って、本発明の目的は、ケンペリア・パルウィフローラ（Kaempferia parviflora）抽出物を有効成分として含む筋肉疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。

本発明は、下記一般式４の化合物またはその塩を有効成分として含む筋肉疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。
［一般式４］

上記一般式４でＲ₁、Ｒ₂及びＲ₃はそれぞれ水素又はメトキシ基を意味する。

本発明は、ケンペリア・パルウィフローラ抽出物を有効成分として含む筋機能の改善用または運動遂行能力の増強用の食品組成物を提供する。

本発明は、上記一般式４の化合物またはその塩を有効成分として含む筋機能の改善用または運動遂行能力の増強用の食品組成物を提供する。

上記本発明の目的を達成するため、本発明はケンペリア・パルウィフローラ（Kaempferia parviflora）抽出物を有効成分として含む筋肉疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。

本発明の他の目的を達成するため、本発明は上記一般式４の化合物またはその塩を有効成分として含む筋肉疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。

本発明の他の目的を達成するため、本発明はケンペリア・パルウィフローラ抽出物を有効成分として含む筋機能の改善用または運動遂行能力の増強用の食品組成物を提供する。

本発明の他の目的を達成するため、本発明は上記一般式４の化合物またはその塩を有効成分として含む筋機能の改善用または運動遂行能力の増強用の食品組成物を提供する。

上記のように、本発明のケンペリア・パルウィフローラ抽出物とそれから分離したフラボン系化合物は、筋肉内のタンパク質異化作用を減らし、筋肉細胞の分化及び同化作用を増加させるので、筋肉疾患の治療用の薬学的組成物や筋機能改善用の食品組成物を製造するのに効果的である。

図１は、本発明に係る５,７−ジメトキシフラボンの処理の有無による筋肉細胞でRT-PCRを用いてatrogin-1、MuRF1のmRNA発現量の減少の有無を示したものである。図２は、本発明に係る５,７−ジメトキシフラボンの処理の有無による筋肉細胞でRT-PCRを用いてmyogenin、myoDのmRNA発現量の増加の有無を示したものである。図３は、本発明に係る５,７−ジメトキシフラボンの処理の有無による筋肉細胞でウェスタンプロットを用いてPI3K、p-AKT、p-mTORのタンパク質発現量の増加の有無を示したものである。図４は、筋肉細胞でケンペリア・パルウィフローラ抽出物が筋肉分化調節の因子であるmyogeninやmyoDのmRNA発現量を増加させる効果を示したものである。図５は、筋肉細胞でケンペリア・パルウィフローラ抽出物がタンパク質同化作用に関与する因子であるPI3K、p-AKT、p-mTORを増加させる効果を示したものである。

以下、本発明を詳細に説明する。

＜１＞ケンペリア・パルウィフローラ（Kaempferia parviflora）抽出物を有効成分として含む筋肉疾患の予防又は治療用の薬学的組成物。
＜２＞前記抽出物は炭素数１から６個のアルコール水溶液で抽出したことを特徴とする＜１＞に記載の薬学的組成物。
＜３＞ケンペリア・パルウィフローラ（Kaempferia parviflora）抽出物の筋肉疾患の予防又は治療剤の製造のための用途。
＜４＞ケンペリア・パルウィフローラ（Kaempferia parviflora）抽出物を、これを必要とする個体に有効量で投与することを特徴とする筋肉疾患の予防又は治療方法。
＜５＞下記一般式４の化合物又はその塩を有効成分として含む筋肉疾患の予防又は治療用の薬学的組成物。
［一般式４］

上記一般式４でＲ₁、Ｒ₂及びＲ₃はそれぞれ水素又はメトキシ基を意味する。
＜６＞前記化合物は５,７−ジメトキシフラボン、５,７,４'−トリメトキシフラボン及び３,５,７,３',４'−ペンタメトキシフラボンからなる群から選択される化合物であることを特徴とする＜５＞に記載の薬学的組成物。
＜７＞上記一般式４の化合物又はその塩の筋肉疾患の予防又は治療剤の製造の為の用途。
＜８＞上記一般式４の化合物又はその塩を、これを必要とする個体に有効量で投与することを特徴とする筋肉疾患の予防又は治療方法。
＜９＞前記筋肉疾患は緊張減退症、筋委縮症、筋ジストロフィー、筋肉退化、筋無力症及び筋肉減少症からなる群から選択される一つ以上の疾患であることを特徴とする＜１＞＜２＞＜５＞及び＜６＞のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
＜１０＞ケンペリア・パルウィフローラ抽出物を有効成分として含む筋機能の改善用の食品組成物。
＜１１＞上記一般式４の化合物またはその塩を有効成分として含む筋機能の改善用の食品組成物。
＜１２＞前記化合物は５,７−ジメトキシフラボン、５,７,４'−トリメトキシフラボン及び３,５,７,３',４'−ペンタメトキシフラボンからなる群から選択される化合物であることを特徴とする＜１１＞に記載の食品組成物。
＜１３＞ケンペリア・パルウィフローラ抽出物を有効成分として含む運動遂行能力の増強用の食品組成物。
＜１４＞上記一般式４の化合物またはその塩を有効成分として含む運動遂行能力の増強用の食品組成物。
＜１５＞前記化合物は５,７−ジメトキシフラボン、５,７,４'−トリメトキシフラボン及び３,５,７,３',４'−ペンタメトキシフラボンからなる群から選択される化合物であることを特徴とする＜１４＞に記載の食品組成物。

本発明はケンペリア・パルウィフローラ（Kaempferia parviflora）抽出物を有効成分として含む筋肉疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。

上記抽出物は、これに限定されないが、ケンペリア・パルウィフローラ（Kaempferia parviflora）の根茎抽出物であることができる。

ケンペリア・パルウィフローラというショウガ科（Zingiberaceae family）の植物の一種としてブラックジンジャー（black ginger）とも呼ばれる。

本発明のケンペリア・パルウィフローラ抽出物は公知の天然物抽出方法に基づいて抽出することができ、好ましくは水、炭素数１〜６個の有機溶媒及び亜臨界または超臨界流体からなる群から選択された一つ以上の溶媒で抽出することができ、さらに好ましくは炭素数１〜６個のアルコール水溶液でありうる。上記炭素数１〜６個の有機溶媒は炭素数１〜６個のアルコール（alcohol）、アセトン（acetone）、エーテル（ether）、ベンゼン（benzene）、クロロホルム（chloroform）、エチルアセテート（ethyl acetate）、メチレンクロライド（methylene chloride）、ヘキサン（hexane）、シクロヘキサン（cyclohexane）及び石油エーテル（petroleum ether）からなる群の中から選択されたものでありうる。

なお、本発明のケンペリア・パルウィフローラ抽出物は、乾燥させたケンペリア・パルウィフローラ根茎（rhizome）を食品加工に適合した精製水、エタノール及び亜臨界水または超臨界二酸化炭素を用いて抽出、精製して得ることができるか、またはケンペリア・パルウィフローラ植物を直接圧着して得られたオイルから分離精製して得ることができる。

本発明は、上記一般式４の化合物またはその塩を有効成分として含む筋肉疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。

上記一般式４の化合物は、好ましくは５,７−ジメトキシフラボン、５,７,４'−トリメトキシフラボン及び３,５,７,３',４'−ペンタメトキシフラボンからなる群から選択されうる。

上記５,７−ジメトキシフラボン（5,7-dimethoxyflavone）、５,７,４'−トリメトキシフラボン（5,7,4'-trimethoxyflavone）、３,５,７,３',４'−ペンタメトキシフラボン（3,5,7,3',4'-pentamethoxyflavone）、いずれもフラボン系化合物に属する化合物である。

本発明の組成物から上記５,７−ジメトキシフラボン、５,７,４'−トリメトキシフラボン、及び３,５,７,３',４'−ペンタメトキシフラボンは化学的合成方法によって合成されるか、ケンペリア・パルウィフローラもしくは他の植物から抽出されて分離されたものでありうる。本発明の上記フラボン系化合物は、そのもの、塩または薬学的に許容可能な塩の形態で用いることができる。上記で‘薬学的に許容可能な’とは、生理学的に許容されて、人に投与された際、通常、アレルギー反応またはこれと類似した反応を引き起こさないことをいい、上記塩としては薬剤学的に許容可能な遊離酸（free acid）によって形成された酸付加塩が好ましい。上記フリー酸としては有機酸と無機酸を用いることが出来る。上記有機酸はこれに制限されるものではないが、クエン酸、酢酸、ラクトン酸、スズ酸、マレイン酸、フマル酸、ホルム酸、プロピオン酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、グリコール酸、コハク酸、４−トルエンスルホン酸、グルタミン酸及びアスパラギン酸を含む。なお、上記無機酸はこれに制限されるものではないが、塩酸、臭素酸、硫酸及びリン酸を含む。

ケンペリア・パルウィフローラはショウガ科（Zingiberaceae family）の植物の一種としてブラックジンジャー（black ginger）とも呼ばれる。本発明のケンペリア・パルウィフローラ抽出物はフラボン系化合物、特に、多量の５,７−ジメトキシフラボン、５,７,４'−トリメトキシフラボン、及び３,５,７,３',４'−ペンタメトキシフラボンを含む。

ケンペリア・パルウィフローラの抽出物から本発明のフラボン系化合物の分離及び精製はシリカゲル（silica gel）、活性アルミナ（alumina）等の各種合成樹脂を充填したカラムクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等を単独または並行して用いることが出来るが、抽出及び分離精製の方法が必ず上記方法に限定されるものではない。

本発明人がケンペリア・パルウィフローラ抽出物及びこれにより精製した一般式４の化合物として筋肉タンパク質異化作用の抑制、同化作用の促進、筋肉細胞分化の促進効果及び筋肉量の増加効果を確認した（実験例１乃至３参照）。

従って、上記ケンペリア・パルウィフローラ抽出物及びこれにより精製した一般式４の化合物は筋肉疾患を治療することができ、上記筋肉疾患は筋肉消耗または退化による疾患を意味する。上記疾患の例としては緊張減退症（atony）、筋委縮症（muscular atrophy）、筋異栄養症（muscular dystrophy）、筋肉退化、筋無力症及び筋肉減少症（sacopenia）を挙げられる。筋肉消耗は、筋肉量の漸進的損失、筋肉、特に、骨格筋または随意筋及び心臓筋肉の弱化及び退行を特徴とする。筋肉消耗及び退化は、遺伝的要因、後天的要因、老化等を原因と発生する。本発明の組成物は筋肉増加の促進効果を有し、筋肉はその種類を制限しない。筋肉増加は身体成分の中でも、特に、筋肉の性能を向上させるもので、肉体的運動及び持久力の向上を通じて筋肉量を増加させることができ、筋肉増加の効果を有する物質を体内に投与する方式で筋肉量を増加させることができる。

本発明による薬学的組成物は、ケンペリア・パルウィフローラ抽出物または一般式４の化合物を単独で用いるか、さらに薬学的組成物の製造に通常用いる適切な担体、賦形剤及び希釈剤を含むことができる。

本発明の薬学的組成物を経口投与する場合、本発明の薬学的組成物は適合な経口投与用担体とともに、当業界に公知の方法に基づいて粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、懸濁液、ウエハー等の形態で剤形化することができる。適合した担体の例としてはラクトース、デクストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール及びマルチトール等を含む糖類とトウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉及びジャガイモ澱粉等を含む澱粉類、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチル‐セルロース等を含むセルロース類、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等のような充填剤が含まれることができる。また、場合によって、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはナトリウムアルギネート等を崩壊剤として添加することができる。なお、上記薬学組成物は抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤等をさらに含むことができる。

また、非経口的に投与する場合、本発明の薬学的組成物は適合な非経口用担体とともに注射剤、経皮投与剤及び鼻腔吸入剤の形態で当業界に公知の方法に基づいて剤形化することができる。上記注射剤の場合には、必ず滅菌する必要があり、バクテリア及び真菌のような微生物の汚染から保護されなければならない。注射剤の場合、適合な担体の例としてはこれに限定されないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの混合物、及び／または、植物油を含む溶液、リンガー液、トリエタノールアミンが含有されたPBS（phosphate buffered saline）、または注射用滅菌水、１０％エタノール、４０％プロピレングリコール及び５％デクストロースのような等張溶液などを用いることが出来る。

上記注射剤を微生物の汚染から保護するためにはパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等のような多様な抗菌剤及び抗真菌剤をさらに含むことができる。また、上記注射剤は、多くの場合、糖またはナトリウムクロライドと同様の等張化剤をさらに含むことができる。

経皮投与剤の場合、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、パスタ剤、リニメント剤、エアロール剤等の形態が含まれる。上記で“経皮投与”は、薬学的組成物を局所的に皮膚に投与して薬学的組成物に含有された有効な量の活性成分が皮膚内に伝達されることを意味する。これらの剤形は、製薬化学において一般に公知の処方箋である文書（Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania）に記述されている。

吸入投与剤の場合、本発明によって用いられる化合物は適合な噴射剤、例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または、他の適合な気体を用いて加圧パックまたは煙霧機からエアロゾルスプレーの形で便利に伝達することができる。加圧エアロゾルスの場合、投薬単位は計量した量を伝達するバルブを提供して決めることができる。例えば、吸入器または吹き込み機に用いられるゼラチンカプセル及びカートリッジは化合物、及びラクトースまたは澱粉のように適合な粉末基剤の粉末混合物を含有するように剤形化することができる。その他の薬学的に許容される担体としては次の文献に記載されているものを参考にできる（Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995）。

なお、本発明による薬学的組成物は一つ以上の緩衝剤（例えば、食塩水またはPBS）、カーボハイドレート（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、抗酸化剤、静菌剤、キレート化剤（例えば、EDTAまたはグルタチオン）、アジュバント（例えば、アルミニウム、ヒドロキシド）、懸濁剤、濃厚剤、及び/または、保存剤をさらに含むことができる。

本発明の抽出物または化合物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者により適切に選択されうる。しかし、好ましい効果のために、本発明の化合物は、0.001〜300mg/day/体重kg、好ましくは0.01〜200mg/day/体重kgに投与することがよい。しかしながら、上記薬学的に有効な量は疾患及びその重症程度、患者の年齢、体重、健康状態、性別、投与経路及び治療期間等の複数の因子に応じて適切に変化することが出来る。

上記で“薬学的に許容される”とは生理学的に許容されて人に投与される際、活性成分の作用を阻害せず、通常、胃腸障碍、眩気症のようなアレルギー反応またはこれと類似した反応を起こさない非毒性の組成物をいう。上記担体としては全ての種類の溶媒、分散媒質、水中油、油中水エマルション、水性組成物、リポソーム、ミクロビード及びミクロソームが含まれる。

本発明の組成物は、ネズミ、ハツカネズミ、家畜、人等の哺乳動物に多様な経路に投与できる。投与の全ての方式は予想できるが、例えば、経口、直腸、静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内（intracerebroventricular）注射により投与できる。

本発明はケンペリア・パルウィフローラ抽出物、または上記一般式４の化合物もしくはその塩の筋肉疾患の予防または治療剤の製造のための用途を提供する。

本発明はケンペリア・パルウィフローラ抽出物、または上記一般式４の化合物もしくはその塩を、これを必要とする個体に有効量で投与することを特徴とする筋肉疾患の予防または治療方法を提供する。

本発明のケンペリア・パルウィフローラ抽出物、または上記一般式４の化合物そのもの、もしくはその薬学的に許容できる塩は、有効量で経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含む複数の経路を介して投与できる。上記で“有効量”とは、患者に投与した際、筋肉疾患の治療及び予防効果を表す量をいい、上記“個体（subject）”とは、動物、好ましくは哺乳動物、特に人を含む動物である場合もあり、動物に由来した細胞、組織、器官などの場合もある。上記の個体は、治療が必要な患者（patient）の場合もある。

上記本発明のケンペリア・パルウィフローラ抽出物、上記一般式４の化合物、または、その薬学的に許容できる塩は、そのものをそのまま投与するか、上述の通りに様々な剤形に製造して投与でき、好ましくは所望の効果、すなわち、筋肉疾患の予防または治療効果が得られるまで投与できる。本発明の化合物及びその薬学的に許容できる塩は、当業界に公知の方法に基づいて多様な経路で投与できる。すなわち、経口または非経口、例えば、口腔、筋肉内、静脈内、皮内、動脈内、骨髄内、硬膜内、腹腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、舌下または皮下に投与するか、胃腸管、粘膜または呼吸器に投与できる。例えば、本発明の抽出物、化合物またはその薬学的に許容できる塩を皮膚に直接塗布する方法、または、上記ポリペプチドを注射用剤形に製造して、これを３０ゲージの細い注射針で皮膚の下層に一定量を注入するか、注射針で皮膚を軽く刺す（prick）方法で投与できる。好ましくは皮膚に直接塗布できる。なお、本発明の化合物及びその薬学的に許容できる塩は、標的細胞や組織（例：皮膚細胞や皮膚組織）に高親和性結合を誘発する分子と結合するか、上記分子内にカプセル化した形で投与できる。本発明の化合物及びその薬学的に許容できる塩は、当業界に公知の技術を用いてステロール（例：コレステロール）、脂質（例：陽イオン脂質、ビロソームまたはリポソーム）または標的細胞の特異的結合剤（例：標的細胞の特異的水溶体により認知される配位子）と結合できる。適合なカブリング剤または架橋剤としては、例えば、タンパク質Ａ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）等を含むことができる。

これらの剤形は、製薬化学における一般に公知の処方箋である文献（Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania）に記述されている。

また、本発明はケンペリア・パルウィフローラ抽出物、または一般式４の化合物もしくはその塩を有効成分として含む筋機能の改善用または運動遂行能力の増強用食品の組成物を提供する。

筋機能の改善は筋肉量の増加、筋力強化、筋疲労の回復など、筋肉本来の性質または機能を強化することを意味する。また、本発明はケンペリア・パルウィフローラ抽出物、フラボン系化合物がPI3K/AKT及びmTOR発現量を増加（実験例２参照）させて、このような因子は、筋肉量を増加させて運動能力を向上させるのに関与する（Acta. Physiol. (Oxf). 191(1)：67-75, 2007）。

本発明の食品組成物は、機能性食品（functional food）、栄養補助剤（nutritional supplement）、健康食品（health food）及び食品添加剤（food additives）等の全ての形態を含む。上記類型の食品組成物は、当業界に公知の通常の方法に基づいて様々な形で製造することができる。

例えば、健康食品としては、本発明のケンペリア・パルウィフローラ抽出物、または一般式４の化合物もしくはその塩自体を茶、ジュースやドリンクの形で製造して飲用するようにするか、顆粒化、カプセル化及び粉末化して摂取することができる。また、本発明のケンペリア・パルウィフローラ抽出物、または一般式４の化合物もしくはその塩と筋肉機能増進の効果があると知られた公知の物質または活性成分とともに混合して組成物の形で製造することができる。

なお、機能性食品としては、飲料（アルコール性飲料含み）、果実及びその加工食品（例：果物缶詰、瓶詰、ジャム、マーマレード等）、魚類、肉類及びその加工食品（例：ハム、ソーセージ、コンビーフ等）、パン類及び麺類（例：うどん、そば、らーめん、スパゲティー、マカロニ等）、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品（例：バター、チーズ等）、食用植物油脂、マーガリン、植物性タンパク質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料（例：味噌、醤油、ソース等）などに本発明のケンペリア・パルウィフローラ抽出物、または一般式４の化合物もしくはその塩を添加して製造することができる。

本発明の食品組成物の中、上記本発明のケンペリア・パルウィフローラ抽出物、または一般式４の化合物もしくはその塩の好ましい含有量としては、これに限定されないが、好ましくは最終的に製造した食品の中の０．０１〜１００質量％である。

また、本発明のケンペリア・パルウィフローラ抽出物、または一般式４の化合物もしくはその塩を食品添加剤の形で用いるためには、粉末や濃縮液の形で製造して用いることができる。

以下、本発明の実施例を通じてより詳細に説明する。
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞
ケンペリア・パルウィフローラ（黒生姜）エタノール抽出物の製造
乾燥されたケンペリア・パルウィフローラ根茎（rhizome）をミキサーで粉砕した後、粉砕したケンペリア・パルウィフローラ試料１００ｇを９５％エタノール１Ｌに入れて４８時間常温で冷浸して抽出した。抽出された試料はワットマン（Whatman）２番濾紙で濾過し、濾過された抽出液を真空回転濃縮機で濃縮して溶媒成分を取り除いた後、ケンペリア・パルウィフローラエタノール抽出物（９．５６ｇ）を得た。

＜実施例２＞
黒生姜エタノール抽出物からフラボン系化合物の分離
＜２−１＞５,７−ジメトキシフラボンの分離及び構造決定
上記実施例１で得られた濃縮したケンペリア・パルウィフローラエタノール抽出物を、シリカゲルを６×１５ｃｍで充填したカラムに積載し、エチルアセテートやメタノールを１０：０．５（v/v）の割合で混合した溶媒システムを用いて分取した。上記分取の手順に沿って総５個の分画に分けてそれぞれの分画を濃縮乾燥した。５個の分画の中の３番分画（分画３）をRp-18カラムクロマトグラフィー（Lichroprep RP-18 25〜40μm, Merck & Co., 米国）を用いて展開溶媒７０％メタノールを分取した。上記分取の手順に沿って総２個の分画に分けて濃縮乾燥した。上記２個の分画の中の２番分画（分画３−２）を、シリカゲルを６×１５ｃｍで充填したカラムに積載し、エチルアセテートやメタノールを１０：０．４（v/v）の割合で混合した溶媒システムを用いて分取して最終的に上記２個の分画の中の１番分画（分画３−２−１）を濃縮乾燥させて紫外線の遮断物質を分離した。

上記で分離した単一活性物質の構造決定のために¹H-NMRスペクトラムと¹³C-NMRスペクトラムをそれぞれ500MHzと125MHz（溶媒：ＣＤＣｌ₃）で測定した。本化合物はEI/MSで、［M］がm/z 282で観測されて分子量が282と判明した。以上の¹H-NMR、¹³C-NMR、及びEI/MSに対する結果と、既存に発表された研究報告（Sutthanut K. et al., J. Chromatogr A., 1143:227-233, 2007）を比較分析して同定した結果、上記で分離した単一物質は下記一般式１で表わされる５,７−ジメトキシフラボンであると確認した。
［一般式１］

＜２−２＞５,７,４'−トリメトキシフラボンの分離及び構造決定
上記実施例１で得られた濃縮したケンペリア・パルウィフローラエタノール抽出物を、シリカゲルを６×１５ｃｍで充填したカラムに積載し、エチルアセテートやメタノールを１０：０．５（v/v）の割合で混合した溶媒システムを用いて分取した。上記分取の手順に沿って総５個の分画に分けてそれぞれの分画を濃縮乾燥した。５個の分画の中の４番分画（分画４）をRp-18カラムクロマトグラフィー（Lichroprep RP-18 25〜40μm, Merck & Co., 米国）を用いて展開溶媒７０％メタノールを分取した。７０％メタノールを展開溶媒と用いて分取した。上記分取の手順に沿って総２個の分画に分けて濃縮乾燥した。最終的に２番分画（分画４−２）を濃縮乾燥させて紫外線の遮断物質を分離した。

上記で分離した単一活性物質の構造決定のために¹H-NMRスペクトラムと¹³C-NMRスペクトラムをそれぞれ500MHzと125MHz（溶媒：ＣＤＣｌ₃）で測定した。本化合物はEI/MSで、［M］がm/z 312で観測されて分子量が312と判明した。以上の¹H-NMR、¹³C-NMR、及びEI/MSに対する結果と、既存に発表された研究報告（Sutthanut K. et al., J. Chromatogr A., 1143:227-233, 2007）を比較分析して同定した結果、上記で分離した単一物質は下記一般式２で表わされる５,７,４'−トリメトキシフラボンであると確認した。
［一般式２］

＜２−３＞３,５,７,３',４'−ペンタメトキシフラボンの分離
上記実施例１で得られた濃縮したケンペリア・パルウィフローラエタノール抽出物を、シリカゲルを６×１５ｃｍで充填したカラムに積載し、エチルアセテートやメタノールを１０：０．５（v/v）の割合で混合した溶媒システムを用いて分取した。上記分取の手順に沿って総５個の分画に分けてそれぞれの分画を濃縮乾燥した。５個の分画の中の３番分画（分画３）をRp-18カラムクロマトグラフィー（Lichroprep RP-18 25〜40μm, Merck & Co., 米国）を用いて展開溶媒７０％メタノールを分取した。７０％メタノールを展開溶媒と用いて分取した。上記分取の手順に沿って総２個の分画に分けて濃縮乾燥した。最終的に１番分画（分画３−１）を濃縮乾燥させて紫外線の遮断物質を分離した。

上記で分離した単一活性物質の構造決定のために¹H-NMRスペクトラムと¹³C-NMRスペクトラムをそれぞれ500MHzと125MHz（溶媒：ＣＤＣｌ₃）で測定した。本化合物はEI/MSで、［M］がm/z 372で観測されて分子量が372と判明した。以上の¹H-NMR、¹³C-NMR、及びEI/MSに対する結果と、既存に発表された研究報告（Sutthanut K. et al., J. Chromatogr A., 1143:227-233, 2007）を比較分析して同定した結果、上記で分離した単一物質は下記一般式３で表わされる３,５,７,３',４'−ペンタメトキシフラボンであると確認した。
［一般式３］

＜実験例１＞
細胞モデルで筋肉内のタンパク質異化作用の減少効果
筋肉細胞であるL6 myoblast（American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）をDMEM（10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100g/mL streptomycin）で培養した。細胞密度が約８０〜８５％になった際、細胞培地を２％のFBSを添加したDMEM成長培地に交替して、６日間分化した後実験を行った。分化したL6細胞に筋減少を誘導するためにTNF-αを２４時間処理した後、上記実施例２−１で製造した５,７−ジメトキシフラボンを濃度別（１，５μＭ）に処理した。筋肉内のタンパク質異化作用に関与する主要ligaseであるatrogin-1と、MuRF1のmRNA発現量を調べるためにRT-PCRを行った。分化した細胞からTRIzol試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて総RNAを収穫して逆転写した後、RT-PCR分析を次のように行った。まず、cDNA合成のために上記RNAをreverse transcriptaseで逆転写した。RT-PCRは次の特定プライマーで行った。

それぞれの相対的なmRNA発現量の値はβ-actinの値で標準化した。図１に示したように、遺伝子転写の水準で、５,７−ジメトキシフラボンが筋肉内のタンパク質異化作用に関与する主要ligaseであるatrogin-1と、MuRF1のmRNA水準を減少させることがわかる。

＜実験例２＞
細胞モデルで筋肉分化及び同化作用の増加効果
＜２−１＞筋肉細胞分化の増加効果
上記実験例１と同じ方法で分化した細胞から総RNAを収穫して逆転写した後、RT-PCRを行った。この際、５,７−ジメトキシフラボンのほか、ケンペリア・パルウィフローラ抽出物（１，１０μｇ／ｍｌ）を処理して実験例１と同じ方法で分化した細胞でもRT-PCRを行った。

それぞれの相対的なmRNA発現量の値はβ-actinの値で標準化した。図２に示したように、遺伝子転写の水準で、５,７−ジメトキシフラボンが筋肉分化調節因子であるmyogeninと、myoDのmRNA水準を増加させることがわかる。また、図４でもケンペリア・パルウィフローラ抽出物が、myogeninとmyoDのmRNA水準を増加させることを確認することができる。

＜２−２＞筋肉細胞のタンパク質同化作用の増加効果
上記実験例１と同じ方法で処理したL6細胞を、proteinase inhibitor cocktailが含まれたRIPA緩衝溶液で溶解した。上記の試料を５分間煮た後、同量のタンパク質（２０μｇ）を１０％ SDS-PAGEで電気泳動して分離した。電気泳動後、分離したタンパク質をニトロセルロース膜で伝達してウェスタンプロットを行った。１次抗体に反応させた後、TBSTを用いて１０分間３回洗浄した。この際、本発明において用いられた１次抗体の種類と希釈率は１：１０００である。２次抗体反応は、上記１次抗体反応を行った膜に２次抗体（anti-rabbit horseradish）を入れて常温で２時間反応させた。この際、２次抗体の希釈率は１：５０００とした。Protein bandはECL western blotting detection reagents（Amersham, Tokyo, Japan）を用いて発色した。筋肉内のタンパク質同化作用に関与するPI3K、p-AKT、p-mTORのタンパク質発現を確認し、α-tubulinにタンパク質ローディング量が一定であることを示した。上記の方法と同様に行い、処理物質を５,７−ジメトキシフラボンのほか、ケンペリア・パルウィフローラ抽出物（１，１０μｇ／ｍｌ）として行った。５,７−ジメトキシフラボンの処理結果は図３、ケンペリア・パルウィフローラ抽出物の処理結果は図５に示した。

図３及び図５に示したように、５,７−ジメトキシフラボンとケンペリア・パルウィフローラ抽出物がPI3K、p-AKT、p-mTORのタンパク質発現量の増加を知ることが出来た。かかる結果は、処理物質が筋肉量を増加させ、運動能力を向上させることを意味する。

＜実験例３＞
動物モデルで筋肉量増加効果の確認
５週齢のWistar ratを１週間適応させ、TNF-α 100 ng/gを２週間供給して筋委縮を誘導した後、体重を基にしてランダムに群を配置して、それぞれ８匹ずつ総４群に分けて実験に利用した。実験群としてはケンペリア・パルウィフローラ抽出物を500mg/kg体重、５,７−ジメトキシフラボン、５,７,４'−トリメトキシフラボン、３,５,７,３',４'−ペンタメトキシフラボンを300mg/kg体重の濃度で０．２５％カルボキシメチルセルロース（carboxymethylcellulose）に懸濁して１日１回８週間一定の時間に投与した。この際、対照群としては実験群が摂取する同じ量の０．２５％カルボキシメチルセルロースにTNF-αを投与した群を用いた。

８週間試料を投与した後、右ふくらはぎの下の筋肉を切除してmicrobalance（Mettler PE160, USA）で重さを測定した。その結果、表１に示したように、対照群と比べてケンペリア・パルウィフローラ抽出物、５,７−ジメトキシフラボン、５,７,４'−トリメトキシフラボン、３,５,７,３',４'−ペンタメトキシフラボンを投与した群から筋肉の重さが、それぞれ有意的（p<0.01）に１２５％、１２６％、１１８％、１２０％増加した。このような結果として、本発明のケンペリア・パルウィフローラ抽出物とそれから分離したフラボン系化合物が筋肉量増大に効率的に作用していることを意味する。

本発明のケンペリア・パルウィフローラ抽出物と、そこから分離されたフラボン化合物は、筋肉内のタンパク質異化作用を減少させて、筋肉細胞の分化及び同化作用を増加させることにより、筋肉疾患の治療用の薬学的組成物または筋機能の改善用の食品組成物を製造することができ、産業上の利用可能性が高い。

Claims

５,７,４'−トリメトキシフラボン若しくは３,５,７,３',４'−ペンタメトキシフラボン又はその塩を有効成分とする筋肉疾患の予防又は治療剤（重症筋無力症および筋萎縮性側索硬化症の治療用途を除く）。
５,７,４'−トリメトキシフラボン若しくは３,５,７,３',４'−ペンタメトキシフラボン又はその塩を有効成分とする筋肉疾患の予防又は治療用機能性食品組成物（重症筋無力症および筋萎縮性側索硬化症の治療用途を除く）。