WO2013172681A1 - 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 플라본계 화합물의 근육 질환 예방 또는 치료 및 근 기능 개선용도 - Google Patents

캠페리아 파비플로라 추출물 또는 플라본계 화합물의 근육 질환 예방 또는 치료 및 근 기능 개선용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to the use or prevention of the treatment or treatment of muscle diseases of the Kaempferia parviflora Wall, ex Baker extract or flavone-based compounds, and more specifically, to the camphor Paviflora extract or flavone-based compounds separated therefrom It relates to a pharmaceutical composition for the treatment of muscle diseases comprising as an active ingredient, a food composition for improving muscle function. -
  • T F- tumor necrosis factor
  • TNF- ⁇ an inflammatory cytokine that reduces muscle fiber regeneration, promotes catabolism, a function that fuses or inhibits differentiation of damaged muscle fibers and breaks down proteins in muscle, resulting in loss of skeletal muscle tissue.
  • foxo forkhead box
  • mTOR protein synthesis factor mammalian target of rapamycin
  • Muscle cell differentiation is regulated by a variety of muscle regulatory factors (MRFs) such as myoD, myf5, myogenin and mrf4.
  • MRFs muscle regulatory factors
  • myoD initiates the expression of muscle specific genes and induces mesenchymal stem cells to differentiate into muscle cell lines.
  • Induction of myogenin expression is regulated by myoD activity. Regeneration of damaged muscle cells can prevent or treat muscular dystrophy resulting from aging or chronic inflammation (J. Histochem. Cytochem. 54 (11): 1177-91, 2006)
  • Muscle atrophy due to aging is closely related not only to muscle function itself but also to osteoporosis, various diseases, and falls-related injuries. Therefore, proper exercise and nutritional interventions are important as early as possible to limit the loss of muscle mass due to possible aging (Exp. Gerontol. 37 (4): 477-89, 2002).
  • an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating muscle diseases, including the Camperia Fabiflora Tae / np / er / a parvi flora) extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating muscle diseases comprising the compound of Formula 4 or a salt thereof as an active ingredient.
  • R 2 and 3 ⁇ 4 means hydrogen or methoxy, respectively.
  • the present invention provides a food composition for muscle function improvement or exercise performance enhancement, comprising a camphor Faviflora extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a food composition for improving muscle function or enhancing athletic performance, comprising the compound of Chemistry 4 or a salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating muscle diseases, comprising as an active ingredient extract of Campia paviflora Uaempferia parviflora).
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating muscle diseases comprising the compound of Formula 4 or a salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a food composition for improving muscle function or enhancing exercise performance, including as an active ingredient in Camperia parviflora extract.
  • the present invention provides a food composition for improving muscle function or enhancing athletic performance, comprising the compound of Formula 4 or a salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating muscle diseases, comprising as an active ingredient afflp / er / a parviflora (camphoria parviflora) extract.
  • the extract may be, but is not limited to, a root crop extract of Campperia parviflora (feefflpier / a parw ' f ora).
  • Camperia Faviflora is a type of plant in the Zingiberaceae family, also called black ginger.
  • the organic solvent having 1 to 6 carbon atoms is 1 to 6 carbon atoms (alcohol), acetone (acetone), ether (ether), benzene (benzene), chloroform (chloroform), ethyl acetate (ethyl acetate), methylene chloride (methylene chloride), nucleic acid (hexane), cyclohexane, and petroleum ether.
  • camphor Paviflora extract of the present invention can be obtained by extracting and purifying the dried Camperia Paviflora rhizome with purified water, ethanol and subcritical water or supercritical carbon dioxide suitable for food processing, or Alternatively, it can be obtained by separating and purifying from the oil obtained by directly compressing the Camperia Fabiflora plant.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating muscle diseases comprising the compound of Formula 4 or a salt thereof as an active ingredient.
  • the compound of Chemical Formula 4 is preferably composed of 5,7-dimethicflavone, 5,7,4, -trimethoxyflavone and 3,5,7,3,4, -pentamethoxypolar Can be selected from the group. n>
  • the flavone compounds of the present invention may be used on their own or in the form of salts or pharmaceutically acceptable salts.
  • the term 'pharmaceutically acceptable' refers to a physiologically acceptable and normally does not cause an allergic reaction or similar reaction when administered to humans, and the salt includes a pharmaceutically acceptable free acid. Acid addition salts formed by) are preferred. Organic acids and inorganic acids may be used as the free acid.
  • the organic acid is not limited thereto, but citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propinic acid, oxalic acid, trifluoroacetic acid, benzoic acid, gluconic acid, metasulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, 4- Toluene sulfonic acid, glutamic acid and aspartic acid.
  • the inorganic acid includes, but is not limited to, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid.
  • Camperia Paviflora is a type of plant in the Zingiberaceae family, also called black ginger.
  • CAMPIA Paviflora extract of the present invention is a flavone compound, in particular, a large amount of 5, 7-dimethoxy flavone, 5, 7, 4, -trimethic flavone, 3, 5, 7, 3, 4,-pentamethoxy Flavones.
  • the camphor Paviflora extract and the compound of Formula 4 purified therefrom can treat muscle diseases, the muscle disease refers to a disease caused by muscle wastage or degeneration.
  • diseases include atony, muscular atrophy, muscular dystrophy, muscle degeneration, myasthenia gravis and sarcopenia.
  • Muscle wasting is characterized by gradual loss of muscle mass, weakness and degeneration of muscles, particularly skeletal or veterinary and cardiac muscles. Muscle wasting and degeneration It is caused by genetic factors, acquired factors, and aging. Ancestors of the present invention have a muscle growth promoting effect, the muscle does not limit its kind. Muscle gain is to improve the performance of the muscles, especially among the body components, can increase the muscle mass through physical exercise and endurance improvement, and can increase the muscle mass by administering a substance having a muscle increasing effect in the body.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further comprise suitable carrier excipients and diluents which are used alone or in the preparation of a pharmaceutical composition, either Camperia Paviflora extract or the compound of formula (4).
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in powder, granule, tablet, pill, dragee, capsulant, liquid, gel according to a method known in the art together with a suitable oral carrier. And can be formulated in the form of syrups, suspensions, wafers and the like.
  • suitable carriers include sugars, including lactose, textrose, sucrose, solbi, manny ' tul xili, erythritol and malty, and starch including corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch.
  • Layering agents such as cellulose, gelatin, polyvinylpyridone, and the like, including fractionation, salose, methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose and hydroxypropylmethyl-selose, and the like.
  • crosslinked polyvinylpyridone, agar, alginic acid or sodium alginate may be added as a disintegrating agent.
  • the pharmaceutical composition may further include an anticoagulant, a lubricant, a humectant, a perfume, an emulsifier, and an antiseptic.
  • compositions of the present invention may be formulated according to methods known in the art in the form of injections, transdermal and nasal inhalants with suitable parenteral carriers.
  • suitable parenteral carriers include, but are not limited to, solvents including water, ethane, poly (e.g. glyce, propylene glycol and liquid polyethylene glycols), combinations thereof and / or vegetable oils. Or dispersion medium.
  • suitable carriers are Hanks solution, Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) containing triethanol amine or sterile water for injection, 10% ethanol, 40% propylene glycol and 5% dextrose Etc. can be used.
  • PBS phosphate buffered saline
  • various antibacterial and antifungal agents such as paraben, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like may be further included.
  • the injection is in most cases sugar or sodium chloride and The same isotonicity agent may further be included.
  • transdermal administration means that the pharmaceutical composition is topically administered to the skin such that an effective amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition is delivered into the skin.
  • the compounds used according to the invention may be prepared using pressurized packs or by means of suitable propellants, for example dichlorofluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas. It can be delivered conveniently from the nebulizer in the form of an aerosol spray. In the case of a pressurized aerosol, the dosage unit can be determined by providing a valve to deliver a metered amount.
  • gelatin capsules and cartridges for use in inhalers or blowers may be formulated to contain compounds and powdered mixtures of matched powder bases such as lactose or starch.
  • Other pharmaceutically acceptable carriers may be referred to those described in the following references (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
  • compositions according to the invention may comprise one or more complete agents (e.g. saline or PBS), carbohydrates (e.g. glucose, mannose, sucrose or dextran), antioxidants, bacteriostatics , Chelating agents (eg, EDTA or glutathione), adjuvants (eg, aluminum hydroxide), suspending agents, thickening agents, and / or preservatives.
  • complete agents e.g. saline or PBS
  • carbohydrates e.g. glucose, mannose, sucrose or dextran
  • antioxidants e.g. glucose, mannose, sucrose or dextran
  • bacteriostatics e.g., bacteriostatics
  • Chelating agents eg, EDTA or glutathione
  • adjuvants eg, aluminum hydroxide
  • suspending agents e.g., thickening agents, and / or preservatives.
  • Preferred dosages of the extracts or compounds of the present invention vary depending on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the compound of the present invention is preferably administered at 0.001 to 300 mg / day / kg body weight, preferably 0.01 to 200 mg / day / kg body weight.
  • the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed depending on various factors such as the disease and its severity, the age, weight, health condition, sex, route of administration and duration of treatment of the patient.
  • composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, humans, etc. by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • the present invention provides a use for the preparation of a prophylactic or therapeutic agent for muscle diseases of the Camperia Paviflora extract or the compound of Formula 4 or salts thereof.
  • the present invention provides a method for preventing or treating muscle diseases, characterized in that an effective amount is administered to an individual in need thereof, either a Camperia Fabiflora extract or the compound of Formula 4 or a salt thereof.
  • Camphoria Fabiflora extract of the present invention or the compound of Formula 4, itself or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be administered in various amounts, including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular.
  • the term 'effective amount' refers to an amount that exhibits a therapeutic and prophylactic effect of muscle disease when administered to a patient.
  • the term 'subject' refers to an animal, preferably a mammal, particularly an animal including a human. It may be a cell, tissue, organ, etc. derived from an animal. The subject may be a patient in need of treatment.
  • the compound of Formula 4 or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be administered as it is or may be prepared and administered in various formulations as described above, preferably the desired effect That is, it can be administered until the effect of preventing or treating muscle disease is obtained.
  • the compounds of the present invention and their pharmaceutically acceptable salts can be administered by various routes according to methods known in the art. Oral or parenteral, such as oral, intramuscular, intravenous, intradermal, intraarterial, intramedullary, intradural, intraperitoneal, intranasal, intravaginal, rectal, sublingual or subcutaneous, or by gastrointestinal tract, mucosal or respiratory May be administered.
  • the compounds of and their pharmaceutically acceptable salts may be administered in a form that is bound to or encapsulated within a molecule that induces high affinity binding to a target cell or tissue (eg, ganglion cells or skin tissue).
  • Compounds of the invention and their pharmaceutically acceptable salts can be prepared using techniques known in the art, including sterols (e.g.
  • lipids e.g. cationic lipids, virosomes or liposomes
  • target cell specific e.g. cationic lipids, virosomes or liposomes
  • Binding agents eg ligands recognized by target cell specific receptors.
  • Suitable coupling or crosslinking agents can include, for example, Protein A, carbodiimide, N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propiotate (SPDP) and the like.
  • the present invention provides a food composition for improving muscle function or enhancing exercise performance, comprising a camphor Paviflora extract or a compound of Formula 4 or a salt thereof as an active ingredient.
  • Improving muscle function means enhancing muscle intrinsic properties or functions, such as increasing muscle mass, strengthening muscle strength, and restoring muscle fatigue.
  • Camperia Fabiflora extract flavone-based compound of the present invention increases the amount of PI3K / AKT and mTOR expression (chorus of Experimental Example 2), these factors are involved in improving the exercise capacity by increasing the muscle mass (Acta. Physiol. (Oxf). 191 (1): 67-75, 2007).
  • Food composition of the present invention is a functional food (functional food), nutritional supplements
  • Food compositions of this type can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • the Camperia Fabiflora extract of the present invention or the compound of Formula 4 or a salt thereof may be prepared in the form of tea, juice, and drink for drinking, granulated, encapsulated, and powdered. can do.
  • it can be prepared in the form of a composition by mixing with a camphor Faviflora extract of the present invention or a compound of formula (4) or a salt thereof and a known substance or active ingredient known to have the effect of muscle function enhancement.
  • Functional foods also include beverages (including alcoholic beverages), fruits and processed foods (e.g. canned fruit, canned foods, jams, marmalade, etc.), fish, meat and processed foods (e.g.
  • the preferred content of the above-mentioned Camperia Fabiflora extract of the present invention or the compound of Formula 4 or a salt thereof in the food composition of the present invention is not limited thereto, but is preferably 0.01 to 100% by weight of the finally prepared food.
  • camphor Paviflora extract of the present invention or the compound of Formula 4 or a salt thereof in the form of a food additive can be prepared in powder or concentrate form.
  • the Camphoria Fabiflora extract of the present invention and the flavone-based compound separated therefrom reduce the catabolism of proteins in the muscle and increase muscle cell differentiation and assimilation, and thus the pharmaceutical composition for treating muscle diseases or It is effective in preparing food compositions for improving muscle function.
  • Figure 1 shows whether the mRNA expression level of atrogin-l, MuRFl by using RT-PCR in muscle cells according to the treatment of 5, 7- dimethoxy flavone according to the present invention.
  • Figure 2 shows whether the mRNA expression level of myogenin, myoD increased by using the RT—PCR in muscle cells according to the treatment of 5, 7-dimethoxyflavone according to the present invention.
  • Figure 3 shows whether the protein expression of PI3K, p-AKT, p-mTOR increased by using a Western blot in muscle cells according to the treatment of 5, 7-dimethoxy fulaboline according to the present invention.
  • Figure 4 shows the effect of increasing the mRNA expression of myogenin and myoD, muscle differentiation regulating factors of the Camperia Fabiflora extract in muscle cells.
  • Figure 5 shows the effect of increasing the enzymes involved in protein assimilation, PI3K, p-AKT and p-mTOR in the muscle cells Camparia Paviflora.
  • the concentrated Camperia Paviflora ethanol extract obtained in Example 1 was loaded on a column layered with silica gel at 6 ⁇ 15 cm, and ethyl acetate and methane were mixed at a ratio of 10: 0.5 (v / v) using a solvent system. Aliquots. The fractions were divided into a total of five fractions according to the aliquots, and each fraction was concentrated to dryness. Fraction 3 of the five fractions (fraction 3) was fractionated with developing solvent 70% methane using Rp-18 column chromatography (Lichroprep RP-18 25-40um, Merck & Co., USA). According to the preparative sequence was divided into a total of two fractions and concentrated to dryness.
  • Fraction 2 of the two fractions (fraction 3-2) was loaded onto a column layered with silica gel at 6x15 cm and ethyl acetate and methane were mixed at a ratio of 10: 0.4 (v / v) using a solvent system. After fractionation, finally fraction 1 of the two fractions (fraction 3-2-1) was concentrated to dryness to separate the sunscreen material.
  • the concentrated Camperia Paviflora ethanol extract obtained in Example 1 was loaded on a column layered with silica gel 6 ⁇ 15 cm, and fractionated using a mixed solvent system of ethyl acetate and methanol at a ratio of 10: 0.5 (v / v). It was. Each fraction was concentrated to dryness by dividing into a total of 5 fractions according to the aliquot sequence. Fraction 4 of the five fractions (fraction 4) was aliquoted with developing solvent 70% methanol using Rp-18 column chromatography (Lichroprep RP-18 25-40um, Merck & Co., USA). 70% methanol was used as the developing solvent. According to the preparative sequence was divided into a total of two fractions and concentrated to dryness. Finally, fraction 2 (fraction 4-2) was concentrated to dryness to isolate the sunscreen.
  • L6 myoblast American Type Culture Collect ion, Manassas, VA
  • Each relative mRNA expression level was normalized to ⁇ -actin. As shown in Figure 1, at the level of gene transcription, 5, 7-dimethoxyflavones can reduce the mRNA levels of atrogin-1 and MuRFl, the major lig ase involved in protein catabolism in muscle.
  • Reverse primer 5 '-CAGCCCAGCCACTGGCATCA-3' (SEQ ID NO: 8)
  • Each relative mRNA expression value was normalized to ⁇ -act in value.
  • 5,7-dimethoxyflavone increases mRNA levels of myogenin and myoD, which are muscle differentiation regulators.
  • Camperia Paviflora extract increases the mRNA levels of myogenin and myoD.
  • L6 cells treated in the same manner as in Experimental Example 1 were lysed with a RIPA complete solution containing a proteinase inhibitor cocktail. After boiling the sample for 5 minutes, the same amount of protein (20 yg) was separated by electrophoresis with 10% SDS-PAGE. After electrophoresis, the separated proteins were transferred to nitrocellulose membrane and Western blot was performed. After reacting with the primary antibody, it was washed three times for 10 minutes using TBST. At this time, the type and the dilution rate of the primary antibody used in the present invention is 1: 1000.
  • the secondary antibody reaction was performed by adding a secondary antibody (ant i -rabbit horseradish) to the membrane on which the primary antibody reaction was carried out and reacting at room temperature for 2 hours.
  • the dilution rate of the secondary antibody was 1: 5000.
  • Protein bands were developed using ECL western blotting detection reagent (Amer sham, Tokyo, Japan). Protein expression of PI3K, p-AKT, and p-mTOR, which is involved in intramuscular protein assimilation, was confirmed, and the protein loading was constant with a-tubulin. Proceed in the same manner as the above, the treatment was carried out with the Camperia Fabiflora extract (1, 10 g / ml) in addition to the 5, 7- dimethoxy flavone, 5, 7- dimethoxy flavone treatment results are shown in Figure 3 , The results of the camphor parviflora extract treatment are shown in FIG.

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Abstract

본 발명은 캠페리아 파비플로라 (Kaempferia parviflora Wall, ex Baker ) 추출물을 함유하는 근육 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로， 보다 상세하게는 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 이로부터 분리된 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 치료용 약학적 조성물 또는 근 기능 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 캠페리아 파비플로라 추출물과 이로부터 분리된 플라본계 화합물은 근육 내 단백질의 이화 작용을 감소시키고 근육 세포 분화 및 동화 작용을 증가시키므로, 근육 질환 치료용 약학적 조성물 또는 근 기능 개선용 식품 조성물을 제조하는데 효과적이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭]
캠페리아 파비플로라 추출물 또는 플라본계 화합물의 근육 질환 예방 또는 치료 및 근 기능 개선용도 '
【기술분야]
본 출원은 2012년 5월 16일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2012-0051776 호 (출원번호)를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이 다.
본 발명은 캠페리아 파비플로라 (Kaempferia parviflora Wall, ex Baker) 추 출물 또는 플라본계 화합물의 근육 질환 예방 또는 치료 용도에 관한 것으로， 보다 상세하게는 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 이로부터 분리된 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 치료용 약학적 조성물， 근 기능 개선용 식품 조 성물에 관한 것이다. -
【배경기술]
일반적으로 65-70세 인구 중 약 24%는 노화에 의한 근위축을 경험하고 있으 며， 20%정도가 근 기능이 상실되고 있는 것으로 알려지고 있다 (J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 60(2)： 21316, 2005). 신체가 노화됨에 따라, 단백질을 합성 하는 작용인 동화 작용 (anabolism)에 관여하는 성장 호르몬， 성 호르몬， 유사 인슐 린 성장인자 등의 호르몬 분비가 감소되어 근육의 단백질 합성이 저하되고 순환 염 증성 사이토카인 (cytokine), 특히 종양괴사인자 -알파 (tumor necrosis factor-; T F-)의 수치가 증가하게 된다. 근섬유의 재생능력을 저하시키는 요인으로 염증성 사이토카인의 하나인 TNF- α는 손상된 근섬유와 융합하거나 분화를 억제하며， 근육 내 단백질을 분해하는 작용인 이화 작용 (catabolism)을 촉진하여 결국 골격근 조직 의 손실을 야기할 수 있다 (Clin. Nutr . 26(5)： 52434, 2007) .
노화에 따른 만성 염증으로 근위축을 유발하는 주요 신호전달체계인 forkhead box(foxo)경로가 활성화되면 단백질 분해에 관여하는 E3 ubiquitin ligase인 atrogin-1과 MuRFl의 발현이 증가된다 (Cell Metab. 6(6)： 47283, 2007). 반면, PI3K/AKT 신호전달 경로는 foxo의 활성을 억제시키고 단백질 합성 관련인자 mammalian target of rapamycin(mTOR)를 활성화시켜 근육성장을 유도한다 (Int. J. Biochem. Cell Biol. 37(10)： 1985-96, 2005) . 특히， PI3K/AKT 및 mTOR는 운동에 의해 활성화되는 신호기작으로서 근육량을 증가시켜 운동능력을 향상시키는데 관여 한다 (Acta. Physiol. (Oxf). 191(1)： 67-75， 2007) .
근육세포 분화는 myoD, myf5, myogenin, mrf4와 같은 다양한 근육 조절 민 자 (muscle regulatory factors; MRFs)에 의해 조절된다. MyoD는 근육 특이 유전자 의 발현을 개시하게 하고 중간엽줄기세포가 근육세포 계열로 분화하는 것을 유도한 다. Myogenin 발현의 유도는 myoD 활성에 의해 조절된다. 손상된 근육세포의 재생 은 노화 또는 만성 염증으로 발생한 근위축증을 예방 또는 치료할 수 있다 (J. Histochem. Cytochem. 54(11)： 1177-91, 2006)
노화에 의한 근위축은 근 기능 자체의 문제만이 아니라 골다공증， 다양한 질병으로의 전이, 낙상과 관련된 부상 등과 밀접하게 관계되어있다. 따라서 가능한 노화로 인한 근육량의 손실을 제한하기 위하여 가능한 빠른 시기에 적절한 운동과 영양학적 처치가 중요하다 (Exp. Gerontol . 37(4)： 477-89, 2002).
【발명의 상세한 설명】
[기술적 과제】
천연물 유래의 근 기능 조절 물질을 탐색한 결과， 캠페리아 파비플로라 (Kaempferia parvi flora Wall, ex Baker) 추출물 및 이에 포함된 플라본계 화합물 이 근육 내 단백질 이화 작용을 감소시키고 근육 세포 분화 및 동화 작용을 증가시 키는 활성이 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서 본 발명의 목적은 캠페리아 파비플로라 Tae/np/er/a parvi flora) 추출 물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한 다. 본 발명은 하기 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 4]
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상가 화학식 4에서 R2 및 ¾는 각각 수소 또는 메톡시 기 (methoxy)를 의 미 한다 . 본 발명은 캠페리아 파비플로라 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 기능 개 선용 또는 운동수행능력 증강용 식품 조성물을 제공한다 . 본 발명은 상기 화학삭 4의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 근 기능 개선용 또는 운동수행능력 증강용 식품 조성물을 제공한다.
【기술적 해결방법】
상기 본 발명 의 목작을 달성하기 위해， 본 발명은 캠페리아 파비플로라 Uaempferia parviflora) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치 료용 약학적 조성물을 제공한다 . 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해， 본 발명은 상기 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 을 제공한다. 본 발명와 다른 목적을 달성하기 위해， 본 발명은 캠페리아 파비플로라 추출 물올 유효성분으로 포함하는 근 기능 개선용 또는 운동수행능력 증강용 식품 조성 물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해， 본 발명은 상기 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 근 기능 개선용 또는 운동수행능력 증강용 식품 조성물을 제공한다 . 29>
30> 이하 본 발명을 상세히 설명한다.
31>
32> 본 발명은 캠페리아 파비플로라 aefflp/er/a parviflora) 추출물을 유효성분 으로 포함하는 근육 질환 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
33> 상기 추출물은 이에 한정하지는 않지만， 캠페리아 파비플로라 (feefflpier/a parw'f ora)의 근경 추출물일 수 있다.
34> 캠페리아 파비플로라는 생강과 (Zingiberaceae family)의 식물의 일종으로서 블랙 진저 (black ginger)라고도 불린다.
35> 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물은 공지의 천연물 추출방법에 의하여 추출될 수 있으며， 바람직하게는 물， 탄소수 1 내지 6개의 유기용매 및 아임계 또 는 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출될 수 있으며, 더 바람직하게는 탄소수 1 내지 6개의 알콜 수용액일 수 았다. 상기 탄소수 1 내지 6개의 유기용매는 탄소수 1 내지 6개의 알코올 (alcohol), 아세톤 (acetone)， 에테르 (ether), 벤젠 (benzene), 클로로포름 (chloroform) , 에틸아세테이트 (ethyl acetate), 메틸렌클로라이드 (methylene chloride), 핵산 (hexane), 시클로핵산 (cyclohexane) 및 석유에테르 (petroleum ether)로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다.
!6> 또한, 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물은 건조시킨 캠페리아 파비플로 라 근경 (rhizome)을 식품가공에 적합한 정제수， 에탄올 및 아임계수 또는 초임계 이산화탄소를 이용하여 추출, 정제하여 얻을 수 있거나, 또는 캠페리아 파비플로라 식물을 직접 압착하여 얻은 오일로부터 분리 정제하여 얻을 수 있다.
S7>
!8> 본 발명은 상기 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
19>
w> 상기 화학식 4의 화합물은 바람직하게는 5,7-디메특시플라본， 5，7，4、-트리메 톡시플라본 및 3，5，7,3、4、-펜타메톡시폴라본으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. n>
\2> 상기 5,7-디메톡시플라본(5,7-(1^^1^에^01 ), 5，7，4、-트리메록시플라본
(5 , 7 , 4 ' -t r i methoxy f 1 avone ) , 3，5，7，3、4、-펜타메톡시플라본 (3，5，7,3'，4'- pentamethoxyf lavone)으로 모두 플라본계 화합물에 속하는 화합물이다. 본 발명의 조성물에서， 상기 5， 7-디메록시플라본， 5，7，4、-트리메록시플라 본， 및 3，5，7,3、4、-펜타메록시플라본은 화학적 합성방법에 의하여 합성되거나, 캠 페리아 파비플로라혹은 다른 식물로 부터 추출되어 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 상기 플라본계 화합물은 그 자체 또는 염 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용 가능한 '이란 생리 학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때， 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사 한 반웅을 일으키지 않는 것을 말하며， 상기 염으로는 약제학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구 연산， 초산， 젖산， 주석산， 말레인산， 푸마르산， 포름산， 프로피은산, 옥살산， 트 리플로오로아세트산， 벤조산， 글루콘산， 메타술폰산， 글리콜산， 숙신산， 4-틀루엔 술폰산， 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브름산， 황산 및 인산을 포함한다.
캠페리아파비플로라는 생강과 (Zingiberaceae family)의 식물의 일종으로서 블랙 진저 (black ginger)라고도 불린다. 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물은 플라본계 화합물 특히， 다량의 5, 7-디메톡시플라본， 5，7,4、-트리메특시플라본， 3，5,7，3、4、-펜타메록시플라본을 포함한다.
캠페리아 파비플로라의 추출물로부터 본 발명의 플라본계 화합물의 분리 및 정제는 실리카겔 (silica gel)이나 활성 알루미나 (alumina)등의 각종 합성수지를 층 진한 컬럼 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 등을 단독으로 혹 은 병행하여 사용할 수 있으나， 추출 및 분리정제 방법이 반드시 상기 방법에 한정 되는 것은 아니다. 본 발명인이 캠페리아 파비플로라 추출물 및 이로부터 정제한 화학식 4의 화 합물로 근육 단백질 이화 작용 억제， 동화 작용 촉진， 근육 세포 분화 촉진 효과 및 근육량 증가 효과를 확인하였다 (실험예 1내지 3 참조).
따라서 상기 캠페리아 파비플로라 추출물 및 이로부터 정제한 화학식 4의 화 합물은 근육 질환을 치료할 수 있는떼， 상기 근육 질환은 근육 소모 또는 퇴화로 인한 질환을 의미한다. 상기 질환의 예로는 긴장감퇴증 (atony), 근위축증 (muscular atrophy), 근이영양증 (muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근무력증 및 근육감소증 (Sacopenia)을 들 수 있다. 근육 소모는 근육량의 점진적 손실， 근육， 특히 골격근 또는 수의근 및 심장근육의 약화 및 퇴행을 특징으로 한다. 근육 소모 및 퇴화는 유전적 요인, 후천적 요인， 노화 등을 원인으로 발생한다. 본 발명의 조상물은 근 육 증가 촉진 효과를 가지고， 근육은 그 종류를 제한하지 않는다. 근육 증가는 신 체 성분 중에서도 특히 근육의 성능을 향상시키는 것으로, 육체적 운동 및 지구력 향상을 통해 근육량을 증가시킬 수 있고， 근육 증가 효과를 가지는 물질을 체내에 투여하는 방식으로 근육량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 따른 약학적 조성물은 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 화학식 4 의 화합물을 단독으로 사용하거나， 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체 부형제 및 회석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말， 과립， 정제， 환제， 당의정제， 캡술제, 액제， 겔제， 시럽제, 현탁액, 웨이퍼등의 형태로 제형화 될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈， 텍스트로즈， 수크로즈, 솔비를, 만니 ' 틀 자일리를, 에리스리틀 및 말티를 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분， 밀 전분， 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 샐를로즈， 메틸 셀를로즈， 나트륨 카 르복시메틸셀를로오즈 및 하아드록시프로필메틸-셀를로즈 등을 포함하는 셀를로즈 류, 젤라틴， 폴리비닐피를리돈 등과 같은 층전제가 포함될 수 있다. 또한， 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피를리돈， 한천， 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해 제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학 조성물은 항웅집제， 윤활제， 습윤제， 향 료， 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경 구용 담체와 함께 주사제， 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화 될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나， 물， 에탄을， 폴리을 (예를 들어， 글 리세를, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)， 이들의 흔합물 및 /또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는， 적합한 담 체로는 행크스 용액, 링거 용액， 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수， 10% 에탄올， 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱 스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다.
상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤， 클로로부탄 올, 페놀， 소르빈산， 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포 함할 수 있다. 또한， 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제， 크림제， 로션제, 겔제， 외용액제， 파스타제， 리 니멘트제， 에어를제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 "경피 투여"는약학적 조성물 을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공자된 처방서인 ¾- Ί (Remington' s Pharmaceutical Science, 15th Edit ion, 1975, Mack Publishing Company, East on, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제， 예 를 들면， 디클로로플루오로메탄， 트리클로로플루오로메탄， 디클로로테트라플루오로 에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면， 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물， 및 락토즈 또는 전분 과 같은 작합한 분말 기제의 분말 흔합물을 함유하도록 제형화 할 수 있다. 그 밖 의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington 'sPharmaceutical Sciences, 19th ed. , Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995) .
또한， 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완층제 (예를 들어, 식염 수 또는 PBS), 카보하이트레이트 (예를 들어， 글루코스， 만노즈， 슈크로즈 또는 덱 스트란)， 항산화제， 정균제, 킬레아트화제 (예를 들어， EDTA 또는 글루타치은)， 아 쥬반트 (예를 들어， 알루미늄 하이드록사이드)， 현탁제， 농후제 및 /또는 보존제를 추가로 포함할수 있다.
본 발명의 추출물 또는 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중， 질병의 정도， 약물형태， 투여경로 및 기간에 따라 다르지만， 당업자에 의해 적절하 게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 0.001 내 지 300mg/day/체중 kg, 바람직하게는 0.01 내지 200mg/day/체중 kg으로 투여하는 것 이 좋다. 그러나, 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도， 환자의 연 령, 체중， 건강상태， 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적 절히 변화될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는'' 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여 될 때， 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애 , 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매， 분산매질, 수증유 또는 유중수 에멀견， 수성 조 성물， 리포 좀， 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
> 본 발명의 조성물은 쥐， 생쥐， 가축， 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구， 직장 또 는 정맥， 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주 사에 의해 투여될 수 있다.
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> 본 발명은 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 상기 화학식 4의 화합물 또는 이의 염의 근육 질환의 예방또는 치료제 제조를 위한 용도를 제공한다.
> 본 발명은 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 상기 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 것을 특징으로 하는 근육 질환 예방또는 치료 방법을 제공한다.
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> 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 상기 화학식 4의 화합물 , 그 자 체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 유효량으로 경구, 경피， 피하， 정맥 또 는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자 에게 투여하였을 때, 근육 질환의 치료 및 예방 효과를 나타내는 양을 말하며， 상 기 '개체 (subject)'란 동물， 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동물에서 유래한 세포， 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료 가 필요한 환자 (patient)일 수 있다.
> 상가 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물， 상기 화학식 4의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 그 자체를 그대로 투여하거나 상술한 바와 같은 여러 제형으로 제조되어 투여될 수 있으며， 바람직하게는 원하는 효과 즉， 근육 질 환 예방 또는 치료 효과 가 도출될 때까지 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 경로로 투 여될 수 있다. 즉， 경구 또는 비경구, 예컨대 구강, 근육내， 정맥내, 피내， 동맥 내， 골수내， 경막내， 복강내， 비강내， 질내， 직장내， 설하 또는 피하 투여되거나, 위장관, 점막 또는 호흡기로 투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 추출물， 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 피부에 직접적으로 도포하는 방법 또는 상 기 폴리펩티드를 주사용 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피 부 아래층에 일정량을 주입하거나 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자 (prick)하는 방 법으로 투여될 수 았다. 바람직하게는 피부에 직접 도포될 수 있다. 또한 본 발명 의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 표적 세포나 조직 (예 : 괴부 세포나 피부 조직)에 고친화성 결합을 유발하는 분자와 결합되거나 상기 분자 내에 캡슐화 된 형태로 투여될 수도 있다. 본 발명의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염 은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 스테를 (예: 콜레스테를)， 지질 (예: 양이온 지 질, 비로좀 또는 리포좀) 또는 표적 세포 특이적 결합제 (예: 표적세포특이적 수용 체에 의해 인지되는 리간드)와 결합될 수 있다. 적합한 커플링제 또는 가교제로는 예컨대 단백질 A, 카보디이미드， N-숙신이미딜 -3-(2-피리딜디티오)프로피오테이트 (SPDP) 등을 포함할 수 있다.
이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문한 feffl/i io: 's Pharmaceutical Science, 15th Edit ion, 1975, Mack Publishing Company , Easton, Pennsylvania)에 기술되어 았다.
또한 본 발명은 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 근 기능 개선용 또는 운동수행능력 증강용 식품 조성물을 제공한다.
근 기능 개선은 근육량의 증가, 근력 강화， 근 피로 회복능 등 근육 본래적 성질 또는 기능을 강화한다는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 캠페리아 파비플로 라 추출물 플라본계 화합물이 PI3K/AKT 및 mTOR 발현량을 증가 (실험예 2 참초)시 키고， 이런 인자들은 근육량을 증가시켜 운동능력을 향상시키는데 관여한다 (Acta. Physiol. (Oxf). 191(1)： 67-75, 2007).
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품 (functional food) , 영양 보조제
(nutritional supplement), 건강식품 (health food) 및 식품 첨가제 (food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공 지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 화 학식 4의 화합물 또는 이의 염 자체를 차， 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용 하도록 하거나, 과립화， 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 화학식 4의 화합물 또는 이의 염과 근육 기능 증 진의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 흔합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다. 또한， 기능성 식품으로는 음료 (알콜성 음료 포함)， 과실 및 그의 가공식품( 예: 과일통조림， 병조림， 잼, 마아말레이드 등)， 어류， 육류 및 그 가공식품 (예: 햄， 소시지콘비이프 등)， 빵류 및 면류 (예: 우동， 메밀국수, 라면， 스파게티， 마카 로니 등), 과즙， 각종 드링크， 쿠키， 엿, 유제품 (예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지， 마아가린， 식물성 단백질， 레토르트 식품， 냉동식품, 각종 조미료 (예: 된장， 간장， 소스 등) 등에 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 화학식 4의 화합 물 또는 이의 염을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 화학식 4의 화합물 또는 이의 염의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 100중량 %이다.
또한， 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조 하여 사용할 수 있다.
【유리한 효과】
상기와 같이， 본 발명의 캠페리아 파비플로라 추출물과 이로부터 분리된 플 라본계 화합물은 근육 내 단백질의 이화 작용을 감소시키고 근육 세포 분화 및 동 화 작용을 증가시키므로， 근육 질환 치료용 약학적 조성물 또는 근 기능 개선용 식 품 조성물을 제조하는데 효과적이다.
【도면의 간단한 설명]
도 1은 본 발명에 따른 5, 7-디메록시플라본의 처리 여부에 따른 근육 세포에 서 RT-PCR을 이용하여 atrogin-l, MuRFl의 mRNA 발현량 감소 여부를 나타낸 것이 다.
도 2는 본 발명에 따른 5, 7-디메톡시플라본의 처리 여부에 따른 근육 세포 에서 RT— PCR을 이용하여 myogenin, myoD의 mRNA 발현량 증가 여부를 나타낸 것이 다.
도 3은 본 발명에 따른 5, 7-디메톡시풀라본의 처리 여부에 따른 근육 세포 에서 웨스턴 블롯을 이용하여 PI3K, p-AKT, p-mTOR의 단백질 발현량 증가 여부를 나타낸 것이다.
도 4는 근육 세포에서 캠페리아 파비플로라 추 물이 근육 분화 조절 인자인 myogenin및 myoD의 mRNA발현량을 증가시키는 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 근육 세포에서 캠페리아 파비플로라 추출물이 단백질 동화작용에 관 여하는 인자인 PI3K, p-AKT및 p-mTOR를 증가시키는 효과를 나타낸 것이다. 【발명의 실시를 위한 형태】
이하본 발명을 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다 .
단， 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
캠페리아파비플로라 (혹생강) 에탄올추출물의 체조 건조된 캠페리아 파비플로라 근경 (rhizome)을 믹서로 분쇄한 다음， 분쇄한 캠페리아 파비플로라 시료 100 g을 95% 에탄을 1L에 넣고 48시간 상은에서 넁침하 여 추출하였다. 추출된 시료는 와트만 (Whatman) 2번 여과지로 여과하고， 여과된 추 출액을 진공 회전 농축기로 농축하여 용매성분을 제거한 후 캠페리아 파비플로라 에탄올 추출물 (9.56 g)을 얻었다.
<실시예 2>
혹생강에탄올추출물로부터 폴라본계 화합물분리 <2-1> 5, 7-디메특시플라본의 분리 및 구조결정
상기 실시예 1에서 얻은 농축된 캠페리아 파비플로라 에탄올 추출물을 실리 카겔을 6x15 cm로 층진한 컬럼에 적재하고 에틸아세테이트 및 메탄을을 10:0.5 (v/v)의 비율로 흔합한 용매시스템을 이용하여 분취하였다. 상기 분취 순서에 따라 서 총 5개의 분획으로 나누어 각각의 분획을 농축 건조하였다. 5개의 분획 중 3번 분획 (분획 3)을 Rp-18 컬럼 크로마토그래피 (Lichroprep RP-18 25~40um, Merck & Co., 미국)를 이용하여 전개 용매 70% 메탄을로 분취하였다. 상기 분취 순서에 따 라서 총 2개의 분획으로 나누어 농축 건조하였다. 상기 2개의 분획 중 2번 분획 (분 획 3-2)을 실리카겔을 6x15 cm로 층진한 컬럼에 적재하고 에틸아세테이트 및 메탄 을을 10:0.4 (v/v)의 비율로 흔합한 용매시스템을 이용하여 분취하여 최종적으로 상기 2개의 분획 중 1번 분획 (분획 3-2-1)을 농축 건조시켜 자외선 차단물질을 분 리하였다.
상기에서 분리된 단일 활성물질의 구조결정을 위하여 -NMR스펙트럼과 13C-NMR 스펙트럼을 각각 500 MHz 와 125 MHz (용매: CDC13)에서 측정하였다. 본 화합물은 EI/MS에서 [M]가 m/z 282에서 관측되어 분자량이 282로 판명되었다. 이 상의 — NMR, 13C-NMR, 및 EI/MS에 대한 결과와 기존에 발표된 연구보고 (Sutthanut K. et al., J. Chromatogr A., 1143:22그 233， 2007)를 비교 분석하여 동정한 결과， 상기에서 분리된 단일물질은 하기 화학식 1로 표시되는 5， 7-디메특시플라본으로 확 인되었다.
[화학식 1]
Figure imgf000014_0001
<2-2> 5, 7, 4、-트리메록시플라본의 분리 및 구조결정
상가실시예 1에서 얻은 농축된 캠페리아 파비플로라 에탄올 추출물을 실리 카겔을 6x15cm로 층진한 컬럼에 적재하고 에틸아세테이트， 메탄올을 10:0.5 (v/v) 의 비율로 흔합한 용매시스템을 이용하여 분취하였다. 상기 분취 순서에 따라서 총 5개의 분획으로 나누어 각각의 분획을 농축 건조하였다. 5개의 분획 중 4번 분획 ( 분획 4)을 Rp-18 컬럼 크로마토그래피 (Lichroprep RP-18 25~40um, Merck & Co., 미 국)를 이용하여 전개 용매 70% 메탄올로 분취하였다. 70% 메탄올을 전개 용매로 이 용하여 분취하였다. 상기 분취 순서에 따라서 총 2개의 분획으로 나누어 농축 건조 하였다. 최종적으로 2번 분획 (분획 4-2)을 농축 건조시켜 자외선 차단물질을 분리 하였다.
상기에서 분리된 단일 활성물질의 구조결정을 위하여 -賺 스펙트럼과 13c-
NMR 스펙트럼을 각각 500 MHz 와 125 MHz (용매: CDC13)에서 측정하였다. 본 화합 물은 EI/MS에서 [M]가 m/z 312에서 관측되어 분자량이 312로 판명되었다. 이상의
'H-NMR, 13C-NMR, EI/M l 대한 결과와 기존에 발표된 연구보고 (Sutthanut K. et al., J. Chromatogr A., 1143:22그 233， 2007)를 비교 분석하여 동정한 결과, 상기: 에서 분리된 단일물질은 하기 화학식 2으로 표시되는 5，7, 4、-트리메톡시플라본으로 확인되었다.
[화학식 2]
Figure imgf000015_0001
>
> <2-3> 3,5，7，3、,4、-펜타메특시플라본분리
> 상기 실시예 1에서 얻은 농축된 캠페리아 파비플로라 에탄을 추출물을 실리 카겔을 6x15cm로 충진한 컬럼에 적재하고 에틸아세테이트， 메탄을을 10:0.5 (v/v) 의 비율로 흔합한 용매시스템을 이용하여 분취하였다. 상기 분취 순서에 따라서 총 5개의 분획으로 나누어 각각의 분획을 농축 건조하였다. 5개의 분획 증 3번 분획 ( 분획 3)을 Rp-18 컬럼 크로마토그래피 (Lichroprep RP-18 25~40um, Merck & Co., 미 국)를 이용하여 전개 용매 70% 메탄올로 분취하였다. 70% 메탄올을 전개 용매로 이 용하여 분취하였다. 상기 분취 순서에 따라서 총 2개의 분획으로 나누어 농축 건조 하였다. 최종적으로 1번 분획 (분획 3-1)을 농축 건조시켜 자외선 차단 물질을 분리 하였다.
> 상기에서 분리된 단일 활성물질의 구조결정을 위하여 -NMR스펙트럼과
13C-NMR 스펙트럼을 각각 500 MHz 와 125 MHz (용매: CDC13)에서 측정하였다. 본 화 합물은 EI/MS에서 [M]가 m/z 372에서 관측되어 분자량이 372로 판명되았다. 이상의
H-NMR, 13C-NMR, 및 EI/MS에 대한 결과와 기존에 발표된 연구보고 (Sutthanut K. et al., J. Chromatogr A., 1143:227-233, 2007)를 비교 분석하여 동정한 결과, 상기 에서 분리된 단일물질은 하기 화학식 3으로 표시되는 3，5,7，3\4、-펜타메톡시플라 본으로 확인되었다.
> [화학식 3]
Figure imgf000015_0002
12> <실험예 1>
13> 세포모델에서 근육내 단백질 이화작용감소효과
14>
15> . '근육세포인 L6 myoblast (American Type Culture Col lect ion, Manassas , VA
USA)를 DMEM(10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 g/mL streptomycin)에서 배양하였 다. 세포밀도가 약 80~85%가 되었을 때 세포 배지를 2%의 FBS를 첨가한 DMEM 성장 배지로 교체하여 6일간 분화한 후 실험을 진행하였다. 분화된 L6 세포에 근 감소를 유도시키기 위하여 TNF- α를 24시간 처리한 후， 상기 실시예 2-1에서 제조한 5， 7- 디메특시플라본을 놈도별 (1, 5 μΜ)로 처리하였다. 근육 내 단백질 이화 작용에 관여하는 주요 ligase인 atrogin-1과 MuRFl의 mRNA 발현량을 알아보기 위해 RT-PCR 을 수행하였다. 분화한 세포로부터 1 12 시약(111 0 11, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 수확하여 역전사시킨 후， RT-PCR 분석을 다음과 같이 수행하였 다. 먼저 cDNA 합성을 위해 상기 RNA를 reverse transcriptase로 역전사시켰다. RT-PCR은 다음의 특정 프라이머로 수행하였다:
16> β -act in
i7> Forward primer: 5 ' -AGCCATGTACGTAGCCATCC-3 ' (서열번호 1)
i8> Reverse primer: 5 ' -CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3 ' (서열번호 2)
19> Atrogin- 1
20> Forward primer: 5' -CCCTGAGT(^ATCGCCCAA-3' (서열번호 3)
2i> Reverse primer: 5 ' -AGGTCCCGCCCATCGCTCA-3 ' (서열번호 4)
22> . . MuRFl
23> Forward primer: 5 ' -TCTACTCGGCCACAGGCGCT-3 ' (서열번호 5)
24> Rever se primer: 5' -CTTGACAGCTCCCGCCGCAA-3 ' (서열번호 6 )
25> 각각의 상대적인 mRNA 발현량 값은 β-actin 값으로 표준화하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 유전자 전사의 수준에서， 5, 7-디메록시플라본이 근육 내 단백질 이화 작용에 관여하는 주요 ligase인 atrogin-1과 MuRFl의 mRNA 수준을 감소시킴을 알수 있다.
<실험예 2>
세포모델에서 근육분화및 동화작용증가효과 <2-1>근육세포분화증가효과 3i> 상기 실험예 1에서와 동일한 방법으로 분화한 세포로부터 총 RNA를 수확하 여 역전사시킨 후， RT-PCR을 수행하였다. 이때, 5,7-디메톡시플라본 외에도 캠페리 아 파비플로라 추출물 (1， 10 //g/ml)을 처리하여 실험예 1과 동일한 방법으로 분화 한 세포로도 RT-PCR을 수행하였다.
32>
33> Myogenin
34> Forward primer: 5 ' -TGGGCTGCCACAAGCCAGAC-3 ' (서열번호 7 )
55> Reverse primer: 5 ' -CAGCCCAGCCACTGGCATCA-3 ' (서열번호 8)
36> MyoD
57> Forward primer: 5' -GGATGGTGCCCCTGGGTCCT-3 ' (서열번호 9 )
?8> Reverse primer: 5 ' -TGGCCTTCGCTGTGAGTCGC-3 ' (서열번호 10)
59>
ι> 각각의 상대적인 mRNA 발현량 값은 β -act in 값으로 표준화하였다. 도 2에 나타난 바와 같이， 유전자 전사의 수준에서， 5，7-디메록시플라본이 근육 분화 조절 인자인 myogenin과 myoD의 mRNA 수준을 증가시킴을 알 수 있다. 또한， 도 4에서도 캠페리아 파비플로라 추출물이 myogenin과 myoD의 mRNA 수준을 증가시킴을 확인할 수 있다.
<2-2>근육세포 단백질 동화작용증가효과
상기 실험예 1과 같은 방법으로 처리된 L6세포를 proteinase inhibitor cocktail이 포함된 RIPA 완층용액으로 용해시켰다. 상기시료를 5분간 끓인 후, 동 량의 단백질 (20 yg)을 10% SDS-PAGE로 전기영동하여 분리하였다. 전기영동 후 분 리된 단백질들을 니트로셀롤로스 막으로 전달하고 웨스턴 블롯을 수행하였다. 1차 항체에 반응시킨 다음 TBST를 이용하여 10분간 3회 세척하였다. 이때, 본 발명에서 사용된 1차 항체의 종류와 회석률은 1:1000이다. 2차 항체반웅은 상기 1차 항체반 웅올 수행한 막에 2차 항체 (ant i -rabbit horseradish)를 넣고 상온에서 2시간 동안 반응하였다. 이때 2차 항체의 회석률은 1:5000으로 하였다. Protein band는 ECL western blotting detection r eagent s ( Amer sham , Tokyo , Japan)를 사용하여 발색하 였다. 근육 내 단백질 동화 작용에 관여하는 PI3K, p-AKT, p-mTOR의 단백질 발현을 확인하였으며， a-tubulin으로 단백질 로딩량이 일정함을 나타내었다. 상기 방법과 동일하게 진행하되， 처리물질을 5, 7-디메록시플라본 외에도 캠페리아 파비플로라 추출물 (1， 10 g/ml)로 하여 진행하였고， 5, 7-디메록시플라본 처리 결과는 도 3， 캠페리아 파비플로라 추출물 처리 결과는 도 5에 표시하였다.
도 3 및 도 5에 나타난 바와 같이， 5，7-디메톡시플라본과 캠페리아 파비플로 라 추출물이 PI3K, p-AKT, p-mTOR의 단백질 발현량 증가를 알 수 있었다. 이러한 결과는 처리물질들이 근육량을 증가시키고 운동능력을 향상시키는 것을 의미한다.
<실험예 3>
동물모델에서 근육량증가효과확인
5주령된 Wi star rat을 1주간 적응시키고 TNF- α 100 ng/g을 2주간 공급하여 근위축을 유도시킨 다음， 체중을 기초로 무작위적으로 군을 배치하여 각각 8마리씩 총 4군으로 나누어 실험에 이용하였다. 실험군으로는 캠페리아 파비플로라 추출물 을 500 mg/kg체중， 5，7-디메특시플라본, 5，7，4、-트리메특시플라본, 3，5，7，3、4、-펜 타메특시플라본을 300 mg/kg체중의 농도로 0.25% 카르복시메틸셀를로오스 (carboxymethylcelhilose)에 현탁하여 1일 1회씩 8주간 일정한 시간에 투여하였다. 이때, 대조군으로는 실험군이 섭취하는 .동일한 양의 0.25% 카르복시메틸셀를로오스 에 TNF-α를 투여한 군을사용하였다.
8주간 시료를 투여한후 오른쪽 종아리 아래 근육을 절제하여 microbalance (Mettler PE160, USA)로 무게를 측정하였다, 그 결과， 표 1에 나타난 바와 같이， 대조군과 비교하여 캠페리아 파비플로라 추출물， 5,7-디메톡시플라본, 5，7，4、-트리 메특시플라본， 3，5，7，3、4、-펜타메록시플라본을 투여한 군에서 근육의 무게가 각각 유의적 (p<0.01)으로 125%, 126%, 118%, 120% 증가하였다. 이와 같은 결과로 본 발 명의 캠페리아 파비플로라 추출물과 이로부터 분리된 플라본계 화합물이 근육량 증 대에 효율적으로 작용하고 있음을 의미한다.
[표 1】
처리물질 별 종아리 근육 무게
Figure imgf000018_0001
【산업상 이용가능성】 본 발명의 캠페리아 파비플로라추출물과 이로부터 분리된 플라본계 화합물 은 근육 내 단백 ¾와 이화 작용을 감소시키고 근육 세포 분화 및 동화 작용을 증가 시키므로， 근육 질환 치료용 약학적 조성물 또는 근 기능 개선용 식품 조성물을 제 조할 수 있어， 산업상 이용가능성이 높다.

Claims

：【청^의 범:위】 / .
' 【청구항.1】;.::':' ' '
캠페리아 파비폴로라 ae¾2/er/a parviflora) 추출물을 유효성분으로 포함하 는 근육 질환 예방또는 .치료용 약학적 조상물. 【.청,구항 2】 ： .
제 1항에 있어서， 상기 추출물은 탄소수 1:내지 6개의 알콜 수용액으로 추출 한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
；':【청구항 3】.
캠페리아 파비플로라 ( aemp/er/a parviflora) 추출물^ 근육 질환 예 또^ 치료제 제조를 위현: 용도. 【청구항 4】 . . : 一 . ： _ . J.',.-. ,·■
캠페리아：파비폴로라 aempfer/a parviflora) 추출물훌 이를 필요로 하는 개 체에 유효량으로 투여하 것을 특징으로 하는 근육 질환의 예방또는 치료 방법 .
Figure imgf000020_0001
제 5항에 있어서, 상기 화합물은 5，7-디메톡시플라본， 5,7, 4、-트리메톡시플라 본 및 3，5,7，3、4、-펜타메록시플라본으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물인 것을 특징으로하는 약학적 조성물.
[청구항 7】
상기 화학식 4의 화합물 또는 이의 염의 근육 질환 예방 또는 치료제 제조를 위한용도.
【청구항 8】
상기 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 이를 필요로 하는 개체에 유효량으 로 투여하는 것을 특징으로 하는 근육 질환의 예방 또는 치료 방법.
【청구항 9】
제 1항, 제 3항， 제 5항 및 제 7항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 근육 질환은 긴장감퇴증 (atony), 근위축증 (muscular atrophy), 근이영양증 (muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근무력증 및 근육감소증 (Sacopenia)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는약학적 조성물.
[청구항 10】
캠페리아 파비플로라 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 기능 개선용 식품 조성물. 【청구항 11】
하기 화학식 4의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 근 기능 개 선용 식품 조성물;
[화학식 4]
Figure imgf000021_0001
상기 화학식 4에서 ， ¾ 및 는 각각 수소 또는 메톡시기 (methoxy)를 의미 한다.： . - , .
【청구항 12】
제 11항에 있어서 , 상기 화합물은 5，7-다메특시플라본, 5，7，4、-트리데록시플 라본 및 3，5,7，3、4、-펜타메록시플라본으로 미루어잔 군에서 선택되는 화합물안 것 을 특징으로 하는 식품 조성물 /
Figure imgf000022_0001
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