KR101584431B1

KR101584431B1 - 달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 미소중력하 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101584431B1
Application number: KR1020140043083A
Authority: KR
Inventors: 김택중; 김한성; 이용현; 서동현; 박지형
Original assignee: 연세대학교 원주산학협력단
Priority date: 2014-04-10
Filing date: 2014-04-10
Publication date: 2016-01-11
Also published as: WO2015156498A1; KR20150117514A

Abstract

본 발명은 달맞이꽃 추출물을 포함하는 미소중력 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 달맞이꽃 추출물은 우주상태를 가정한 무부하 상태나 비사용 근육에서 항산화 효과와 세포보호기능을 가진 열충격 단백질의 발현 증가를 통해 근육세포나 조직의 세포사멸을 억제함으로써 항근위축 효능을 나타내므로 미소중력 또는 신경손상으로 인한 근위축의 예방, 치료 또는 개선을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Description

달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 미소중력하 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition comprising Evening primrose extract for preventing or treating muscle atrophy in microgravity or nervous damage}

본 발명은 열충격 단백질(heat shock protein, HSP)의 발현을 촉진하고, 근육세포 괴사억제와 같은 항산화 효과를 통해 근위축을 억제하는 달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 미소중력 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

근위축은 무부하, 우주비행, 노화, 근육질환, 신경의 손상 등과 같은 여러 가지 요인에 의해 유도되는 근육 사용량의 감소로 발생한다(Booth FW., J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol., 1982). 특히 위와 같이 다양한 스트레스 요인들은 근위축 뿐만 아니라 여러 가지 질병의 원인으로써 전 세계적으로 큰 주목을 받고 있다(MCKinnell IW., and Rudnicki MA., Cell, 2004).

근육세포 내에서 열충격 단백질(Heat Shock Protein, HSP)은 생체 내 산화스트레스에 대항하여 근육세포 수준에서 세포를 보호하는 기능을 가지고 있는 것으로 밝혀지고 있고 이러한 기전은 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase 1, SOD1)와 같은 세포 내항산화 효소의 발현을 조절함으로써 이루어진다고 보고되고 있다(Arya R., et al., J Biosci., 2007).

현재까지 여러 가지 요인에 의해 발생하는 근위축의 생물학적 변화에 대한 체계적인 연구는 전무한 상태이다. 만약 신체가 미소중력 또는 무부하 상태에 있게 되면 지상에서는 중력에 대응하여 지속적으로 수축운동을 일으키던 근조직이 심각한 위축을 일으킨다. 예를 들어 17일간 우주비행을 마친 우주인의 가자미근은 단면적이 15%, 근력은 34% 감소하였다(Widrick JJ et al., J Appl Physiol., 2001). 한편 2주간의 하지현수 상태에서 비타민 E를 투여한 결과 흰쥐 가자미근위축증이 32% 정도 완화되었고, 산화물질 티오바르비툴산(thiobarbituric acid)은 증가하였으나, 슈퍼옥시드 디스뮤타아제(superoxide dismutase, SOD), 카탈라아제(catalse) 등 항산화효소 발현은 증가하지 않았으며, 대신 열충격 단백질의 발현은 유의하게 증가되었다(Servais S et al., Free RadicBiol Med., 2007). 이러한 현상은 비타민 E의 항산화 작용과 함께 단백질분해효소 활성을 억제함으로써 근위축을 억제하기 때문이다.

또한 하지현수 상태에서 재부하로 전환하기 직전에 체온을 41℃로 올려 60분 동안 열충격을 준 뒤 근위축의 회복률을 연구하였을 때 열충격을 주지 않은 동물보다 가자미근의 근질량 및 단백질량 회복이 유의하게 촉진되었고 열충격 단백질 70의 발현도 현저히 증가하였으며, 이에 따라 열충격 단백질 유도가 근위축 억제에 중요한 기전임을 증명하였다(Selsby JT et al., Am J Physiol RegulIntegr Comp Physiol., 2005).

상설한바와 같이 열충격 단백질 70은 여러 가지 스트레스(예를 들어, 산화 스트레스, 기계적 스트레스 등)에 대항해 근원섬유의 조직화 및 관리유지 역할을 담당하여 근육 수축 기능에 필수적으로 영향을 주어 근위축을 억제할 수 있다. 따라서 열충격 단백질 70의 발현을 유도할 수 있으면서 부작용이 없는 천연물질이 근위축 치료를 위해 반드시 요구되어진다.

한국공개특허공보 제2012-0097705호는 노박덩굴과(Celastraceae) 식물 유래의 퀴논 메타이드 트리터펜계(quinone methide triterpene) 화합물인 셀라스트롤(Celastrol, CEL)이 세포 보호기능을 가진 열충격 단백질의 발현을 증가시켜 근단백질 합성을 촉진시키는 한편 단백질 분해 요인을 억제함으로써 근위축에 대한 항위축 효능을 나타낸다는 점이 개시되어 있다.

또한 한국등록특허공보 제1,349,361호 및 한국공개특허공보 제2014-0000767호 에는 각각 등골나물 추출물과 치커리 추출물이 산화스트레스에 의한 근세포 손상, 괴사 및 세포자살(apoptosis)를 억제하여 결과적으로 근위축을 예방, 치료 또는 개선할 수 있다는 점이 개시되어 있다.

무중력, 신경손상 등과 같은 물리적 요인에 의한 근위축증 뿐만 아니라 퇴행성 근위축증과 연관된 근이영양증(Muscle dystrophy)은 미국 및 유럽에만 약 3만 명의 환자가 존재하는 희귀질환으로서 이 질병의 근본적 치료제로 현재 시장에 출시된 약물은 전무한 상태이다. 이러한 근위축 환자의 뚜렷한 치료법이 개발되지 않은 시점에서 경구용 제제로써 평생 복용하는 약물로는 천연물 추출물이 이상적이다. 또한 최첨단 기술을 기반으로 하는 고령화 시대와 우주시대가 도래함에 따라 근위축 질환의 경우 점진적으로 그 문제점이 크게 대두되고 있다. 따라서 본 발명에 따른 약학 조성물은 근위축과 신체적으로 장애가 있는 환자의 재활을 위해 유용하게 사용되어 지리라 생각되며 부작용이 없는 천연물을 통한 유효성분 물질의 규명은 연구에서의 높은 가치뿐만 아니라 의약학 발전에도 크게 도움이 되리라 생각된다.

달맞이꽃은 도금양목 바늘꽃과에 속하는 2년생 초본식물로, 남아메리카 칠레가 원산지인 귀화식물이며 중앙아메리카, 유럽, 아시아 등 널리 분포되어 있고 우리나라의 경우 전국 각지에 분포하고 있으며 주로 물가·길가·빈터에서 자란다. 달맞이꽃은 7월에 노란색으로 피고 잎겨드랑이에 1개씩 달리며 지름이 2∼3 cm이고 저녁에 피었다가 아침에 시든다. 꽃받침조각은 4개인데 2개씩 합쳐지고 꽃이 피면 뒤로 젖혀지고, 꽃잎은 4개로 끝이 파지고 수술은 8개, 암술은 1개이며 암술머리가 4개로 갈라진다. 씨방은 원뿔 모양이며 털이 있다. 열매는 삭과로 긴 타원 모양이고 길이가 2.5 cm이며 4개로 갈라지면서 종자가 나온다. 종자는 여러 개의 모서리각이 있으며 젖으면 점액이 생긴다. 어린 잎은 소가 먹지만 다 자란 잎은 먹지 않는다.

한방에서 달맞이꽃의 뿌리를 월견초(月見草)라는 약재로 쓰는데, 감기로 열이 높고 인후염이 있을 때 물에 넣고 달여서 복용하고, 종자를 월견자(月見子)라고 하여 고지혈증에 사용한다. 일반적으로 해열과 소염 효능을 가지고 있어 감기, 인후염, 기관지염, 피부염 등에 치료 효과가 있다고 알려져 있다. 달맞이꽃의 종자유는 옛날부터 인디언들이 염증과 발진에 바른 민간약 이였으며 백인들에게는 천식 특효약으로 전해졌고 영국에서는 ‘왕의 만병통치약’으로 불리며 국민 의약품으로 선정하기도 하였다. 최근에는 달맞이꽃 종자유가 의약품 및 건강식품으로 각광을 받고 있는데 이는 달맞이꽃 종자유에 풍부하게 함유된 감마 리놀렌산이라는 불포화 지방산이 프로스타글란딘이라는 생리적 활성 물질의 모체가 된다는 사실이 밝혀졌기 때문이다. 프로스타글란딘은 인체에서 혈관의 수축 확장, 기관지 근육 수축과 이완, 위액 분비의 억제, 자궁근육 수축, 수분 배설, 혈소판 응집 유도 또는 저해 등 여러 가지 생리작용에 광범위하게 작용한다. 달맞이꽃 종자유는 콜레스테롤의 양을 크게 떨어뜨려 심근경색, 동맥경화, 고혈압, 협심증 등 순환기계 장애나 심장질환을 개선해 준다. 또한 달맞이꽃 종자유를 투여에 의해 체중감소 효과가 컸다는 보고가 많이 나오고 있고 그밖에 류머티스성 관절염, 월경불순, 알코올 중독, 당뇨병 등에 탁월한 효능이 인정되고 있다. 또한 알레르기성 피부질환에 효과가 있는데, 특히 아토피성피부염 아동 및 아토피성습진 환자를 대상으로 한 실험에서는 섭취군에서 뚜렷한 증상개선 효과가 확인됐으며 최근 피부노화 예방과 미백 등에 효과가 있는 것으로 알려져 의약품 뿐만 아니라 화장품과 비누 등 미용용품에도 널리 이용되고 있다.

그러나 근위축 예방, 치료 또는 재활을 위한 용도를 위해 달맞이꽃 추출물을 사용한 예는 여태껏 보고된 바 없다. 따라서 본 발명은 달맞이꽃 추출물의 무부하, 미소중력, 또는 신경손상 및 근육의 비사용에 의한 근위축 예방, 치료 또는 개선을 위한 신규용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기한 목적 달성을 위해 예의 연구를 거듭하는 과정에서, 달맞이꽃 추출물이 우주상태를 가정한 미소중력 하에 진행된 세포실험과 궁둥신경 절제술 모델과 같은 동물실험에서 현저하게 저해된 열충격 단백질의 발현을 촉진시켜 근위축 예방 또는 치료에 크게 기여하는 것을 확인함으로써, 달맞이꽃 추출물을 미소중력 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 개선용 식품의 주성분으로 활용할 수 있는바, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

한국공개특허공보 제2012-0097705호 한국등록특허공보 제1,349,361호 한국공개특허공보 제2014-0000767호

Booth FW. (1982). "Effect of limb immobilization on skeletal muscle", J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol., 52(5):1113-8. Iain W. McKinnell & Michael A. Rudnick (2004). "Molecular Mechanisms of Muscle Atrophy", Cell, 19(7):907-910. Arya R1, Mallik M, Lakhotia SC. (2007). "Heat shock genes - integrating cell survival and death", J Biosci., 32(3):595-610. Fitts RH., Riley DR., Widrick JJ. (2001). "Functional and structural adaptations of skeletal muscle to microgravity", J Exp Biol., 204(Pt 18):3201-8. Servais S., Letexier D., Favier R., Duchamp C., Desplanches D. (2007). "Prevention of unloading-induced atrophy by vitamin E supplementation: links between oxidative stress and soleus muscle proteolysis?", Free Radic Biol Med., 42(5):627-35. Selsby JT. & Dodd SL. (2005). "Heat treatment reduces oxidative stress and protects muscle mass during immobilization", Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol., 289(1):R134-9.

본 발명의 목적은 미소중력 또는 신경손상으로 인해 근육을 사용하지 않음으로써 발생하는 근육조직의 손실 또는 근육 자체의 위축을 달맞이꽃 추출물의 열충격 단백질의 발현촉진, 항산화 활성을 입증하여 예방, 치료 또는 개선을 위한 새로운 소재를 발굴하고 이의 신규용도를 제공하는데 있다.

상기 목적 달성을 위하여, 본 발명은 달맞이꽃 추출물이 항산화 활성을 통해 근세포손상, 괴사를 억제하고 열충격 단백질(HSP70)의 발현을 증가시킨다는 것을 확인함으로써 달맞이꽃 추출물을 미소중력 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방, 치료 또는 개선 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물로 제공할 수 있다.

달맞이꽃 추출물은 근세포손상, 괴사를 억제하고 세포보호 기능을 가진 열충격 단백질의 발현증가를 통해 항위축 효능을 나타내므로 달맞이꽃 추출물을 미소중력 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방, 치료 또는 개선하기 위한 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물로 제공할 수 있다.

도 1은 달맞이꽃 추출물을 0, 5, 10, 25, 50, 및 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 후 근육세포에서 배양하였을 때 나타나는 세포독성을 보여주는 그래프이다.
도 2는 클리노스타트(clinostat)로 미소중력에 노출시켜 근육세포 괴사를 유도한 뒤 달맞이꽃 추출물이 근육세포의 괴사를 농도 의존적으로 예방하고 회복하는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 클리노스타트(clinostat)를 이용한 미소중력이 근육세포의 열충격 단백질 70 발현에 미치는 영향과 이에 대한 달맞이꽃 추출물의 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 궁둥신경 절제술로 인위적으로 근위축을 유도한 소동물 모델에서 생체 마이크로-CT를 이용하여 근위축에 대한 달맞이꽃 추출물의 효과를 관찰한 것이다.
도 5는 궁둥신경 절제술로 인위적으로 근위축을 유도한 소동물 모델에서 달맞이꽃 추출물을 처치하였을 경우 근위축을 예방하는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 궁둥신경 절제술로 인위적으로 근위축을 유도한 소동물 모델에서 달맞이꽃 추출물이 열충격 단백질 70 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

본 발명은 달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 미소중력 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 달맞이꽃 추출물은 달맞이꽃의 꽃, 잎, 가지, 뿌리, 줄기, 열매, 껍질 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 달맞이꽃의 뿌리를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 달맞이꽃 추출물은 물, 유기용매 및 이들의 혼합용매로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 용매로 추출한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 5의 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤 등의 극성용매와 에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산, 디클로로메탄 등의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소프로판올 등으로부터 선택될 수 있으며 보다 구체적으로는 메탄올 또는 에탄올일 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 알코올은 메탄올 또는 에탄올일 수 있고, 구체적으로 달맞이꽃 추출물은 달맞이꽃 뿌리의 에탄올 추출물일 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 달맞이꽃 추출물은 상기 추출용매를 이용하여 추출된 1차 추출물을 극성이 다른 추출용매를 이용하여 다시 분획한 분획물을 포함한다. 예를 들어, 달맞이꽃 추출물은 탄소수 1 내지 5의 알코올로 추출한 후, 에테르, 벤젠, 헥산 등의 극성이 다른 용매로 다시 분획한 분획물일 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 분획 시 용매는 2종 이상 사용할 수 있으며, 용매의 극성에 따라 순차적으로 사용하거나 혼합하여 사용하여, 각 용매 추출물을 제조할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 제조된 추출물 또는 상기 분획과정을 수행하여 수득한 분획물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압농축기, 일 예로 회전증발기를 이용하여 감압 농축할 수 있으며, 상기 건조는 일예로 동결건조법으로 수행 할 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 약학 조성물은 천연물 추출물로부터 분리된 성분 또는 이의 유도체를 유효성분으로 하기 때문에 거의 독성을 가지지 않으며, 인체에 무해하다.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 약학 조성물 중 달맞이꽃 추출물은 총 조성물 중량의 0.001 내지 30 중량%이고, 상세하게는 0.01 내지 20 중량%이고, 보다 상세하게는 0.1 내지 10 중량%의 양으로 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 달맞이꽃 추출은 0.001 내지 10 ㎎/㎏의 농도로 상기 약학 조성물에 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 약학 조성물은 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여 시, 0.01 내지 500 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 100 mg/kg, 보다 더 구체적으로 0.1 내지 20 mg/kg, 보다 더 구체적으로 1 내지 10 mg/kg의 용량으로 일일 1 내지 3회 투여될 수 있고 제형화 된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 일정시간 간격으로 수회 투여될 수 있다.

상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 및 비히클을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스 또는 양모지 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

약학적으로 허용 가능한 담체 및 비히클을 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로즈(Sucrose)또는 락토오스(Lactose), 탄산칼슘, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 피복정, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 즙, 멸균된 수용액, 비수성용제, 주사제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 투여 목적, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명은 달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 미소중력 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 달맞이꽃은 달맞이꽃의 꽃, 잎, 가지, 뿌리, 줄기, 열매, 껍질, 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 달맞이꽃은 달맞이꽃의 뿌리를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 5의 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤 등의 극성용매와 에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산, 디클로로메탄 등의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있다. 본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소프로판올 등으로부터 선택될 수 있으며 보다 구체적으로는 메탄올 또는 에탄올일 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압농축기, 일예로 회전증발기를 이용하여 감압 농축할 수 있으며, 상기 건조는 일예로 동결건조법으로 수행 할 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물은 우주 생활로 인한 근육 노화 억제 또는 운동기능 향상을 위한 우주식품에 포함되는 것인 근위축 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물일 수 있다.

상기 건강기능식품은 정제, 캅셀제, 환제, 산제, 과립제, 액상음료, 농축액 등의 형태로 제품화될 수 있다.

상기 과립, 정제 또는 캡슐형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.0001 내지 100 중량%, 보다 구체적으로 0.01 내지 80 중량%, 보다 더 구체적으로 0.1 내지 50 중량%, 보다 더 구체적으로 1 내지 20 중량%의 범위에서 달맞이꽃 추출물이 첨가될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 또 다른 일 양태에서, 달맞이꽃 추출물은 식품으로 제품화될 수 있다. 예를 들어 상기 식품에는 음료수, 육류, 초코렛, 과자, 피자. 라면, 면류, 껌, 아이스크림, 비타민 복합제, 알코올 음료, 유제품, 주스, 환, 과립, 차용 티백 및 스틱 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품이 모두 포함 될 수 있다.

상기 식품에는 통상 0.0001 내지 100 중량%, 보다 구체적으로 0.001 내지 80 중량%, 보다 더 구체적으로 0.01 내지 60 중량%, 보다 더 구체적으로 0.1 내지 50 중량%, 보다 더 구체적으로 1 내지 20 중량%의 범위에서 달맞이꽃 추출물이 첨가될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위 내에서 첨가 될 수 있다.

본 발명의 식품 보조 첨가제는 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스 등과 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 솔비톨, 에르트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

이하, 하기 실험예 및 제조예를 통하여 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만 이는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것이지, 본 발명의 권리범위를 이로 한정하려는 의도는 아니다.

[실시예]

실시예 1: 달맞이꽃 추출물의 제조

달맞이꽃은 농촌진흥청(Rural Development Administration, RDA)의 우수농산물관리제도(Good Agricultural Practice, GAP)에 의해 재배되었으며, 2009년 충청북도 음성(GPS: E 128° 62´ N 36° 56´)에서 수확되었다. 시료의 추출은 다음과 같이 추출하였다. 달맞이꽃 뿌리 시료 50 g에 99% 에탄올 150 ml을 첨가하여 150 rpm으로 48시간 동안 반응하여 여과한 후, 감압 농축하여 동결건조 한 분말을 본 실험의 시료로 사용하였다.

[실험예] 생리활성 확인 실험

실험예 1: 근육세포 배양계에서 달맞이꽃 추출물의 항산화를 통한 근위축 기전 예방효과

(1) 세포배양

정상 근육세포(C2C12)를 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS)이 5% 함유된 DMEM 배지에서 배양하였다. 즉, 75 ㎠ 플라스틱 플라스크 (Falcon Co., England)에 정상 골격근육세포를 10% FBS, 7.5% NaHCO₃ 150 ㎍/㎖, 글루타민 58.4 ㎍/㎖ 및 항생제(antibiotics)/항진균제(antimycotics) 4.4 ㎕/㎖ 가 함유된 DMEM 배지에서 37 ℃, 5% CO₂의 조건하에서 배양하였다. 2∼3일마다 한번씩 2차 배양하여 세포주를 유지하였다.

(2) 세포정량

세포가 자란 75 ㎠ 플라스틱 플라스크에서 배지액을 제거하고, CMF-PBS (calcium magnesium free-phosphatebuffered saline, pH 7.2)로 세척한 후, 0.25% 트립신/EDTA를 처리하여 세포를 플라스크 바닥으로부터 떼어낸 후 세포배양액으로 중화시켜서 원심분리(1200 rpm, 3min) 하였다. 남은 세포의 펠렛(pellet)에 배양액을 가한 다음, 멸균피펫으로 반복 흡입하여 단일세포 부유액을 만든 후 트립판블루(trypan blue)를 세포부유액과 9:1의 비율로 혼합하여 광학현미경 상에서 혈구계산판(hemocytometer)을 이용하여 측정하였다.

(3) 세포독성 측정

달맞이꽃 추출물의 독성측정은 Ez-Cytox 키트를 이용하였다. 즉, 정상 근육세포(C2C12)를 96웰 플레이트에 2×10⁴cells/well 되도록 분주하였다. 이를 37 ℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양한 후, 0, 5, 10, 25, 50, 100 ㎍/㎖의 다양한 농도의 달맞이꽃 추출물을 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 세포생존율을 24시간 동안 배양한 정상 근육세포를 대상으로 Ez-Cytox 키트를 이용하여 달맞이꽃 추출물의 세포독성을 결정하였다.

달맞이꽃 추출물이 첨가된 배양 정상 근육세포에서 세포독성을 측정한 결과를 도 1에 나타내었다. 달맞이꽃 추출물을 첨가하지 않았을 경우는 100%의 생존율을 보였고, 달맞이꽃 추출물을 첨가한 첨가군에서는 첨가하지않은 군과 비슷한 생존율을 보였다. 따라서 본 실험에 사용한 달맞이꽃 추출물은 배양 근육세포에 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.

(4) 클리노스타트(clinostat)로 미소중력에 노출시켜 유도된 근육세포 괴사에 대한 달맞이꽃 추출물의 농도별 효과

클리노스타트로 미소중력에 노출된 근육세포에 대한 달맞이꽃 추출물의 농도별 효과를 관찰하기 위하여, 먼저 96웰 플레이트에 근육세포를 2×10⁴cells/well이 되도록 넣고 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 그 다음, 달맞이꽃 추출물을 0, 25, 50 ㎍/㎖의 농도로 각각 첨가하여 웰을 가득채운 뒤 5% CO₂의 조건에서 클리노스타트에 24시간 배양하였다. 배양 후, Ez-Cytox kit 10 ㎕를 첨가하고, 1시간 후 흡광도를 측정하여 그 효과를 결정하였다.

도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 클리노스타트에 의해 유도된 근육세포 괴사에 대한 달맞이꽃 추출물의 농도별 근육세포 생존율을 측정한 결과, 달맞이꽃 추출물의 농도가 0 ㎍/㎖로부터 50 ㎍/㎖로 증가됨에 따라 세포생존율이 회복됨을 확인할 수 있었다. 이에 따라 달맞이꽃 추출물에 농도 의존적으로 미소중력에 의한 근육세포 괴사 예방 효과가 증가됨을 입증할 수 있었다.

(5) 클리노스타트(clinostat)를 이용한 미소중력이 근육세포의 열충격 단백질 70(heat shcok protein 70, HSP 70) 발현에 미치는 영향과 이에 대한 달맞이꽃 추출물의 효과

웨스턴블롯(western blot)을 이용하여 열충격 단백질 70의 발현 변화를 분석하였다. 근육세포를 라이시스 버퍼(lysis buffer)[50 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 20 mM 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 0.2 mM Na₃VO₄, 50 mM NaF, 프로테아제억제인자 컴플리트 미니(proteaseinhibitor Complete Mini), 포스파타아제 억제제 칵테일(phosphatase inhibitor cocktail)]에서 균질화시켜 용해물(lysate)을 만든 후 브래드포드 분석(Bradford assay)으로 단백질을 정량하였다. 이후 단백질 20 ㎍씩 SDS-폴리아크릴아마이드 겔(SDS-polyacrylamide gel) 상에서 전기영동 하였다. 전개된 젤을 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 옮긴 뒤 5% 스킴밀크(skim milk)로 1시간 블로킹(blocking) 하였다. 이어 단백질 1차 항체를 4 ℃에서 12시간 정도 붙인 다음 홀스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP)가 결합된 2차 항체를 2시간 동안 인큐베이션 시켰다. 이후 고감도 화학발광(enhanced chemi luminescence, ECL) 키트로 발색 반응을 유도하여 X-선 필름에 감광시킨 뒤 밴드를 확인하였다. 베타액틴(β-actin)을 표준화 지표물질로 사용하며, 검출된 단백질양은 농도계(densitometer(Gel Document, Bio-Rad.))로 측정하였다.

도 3A에 보는 바와 같이 근육세포를 클리노스타트에 시간 별로 배양하였을 때 24 시간에서 열충격 단백질 70 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다. 그러나 도 3B에 보는 바와 같이 달맞이꽃 추출물 50 ㎍/㎖을 처리했을 때는 열충격 단백질 70 발현이 대조군에 비해 확연하게 증가하였다. 상기 추출물은 열충격 단백질 70 유도제 역할을 한다는 점이 확인되었다.

실험예 2: 궁둥신경 절제술에 의해 근위축을 유도한 소동물 모델에서 달맞이꽃 추출물의 효과

실험동물 준비

C57BL6 마우스(수컷, 5주령, 중량 약 25 g)를 일주일간 예비 사육시킨 후 수술에 사용하였다. 좌골신경을 절제하여 뒷다리 근육에 위축증 모델을 제작하였다. 근위축 유발 모델은 5회/7일 정도 달맞이꽃 추출물을 마우스 마다 서로 다른 투여량(0, 1, 2 mg/kg)으로 뒷다리 근육 내에 접종하였다.

(1) 궁둥신경 절제술로 인위적 근위축을 유도한 소동물 모델에서 생체 마이크로- CT 를 이용해 관찰한 달맞이꽃 추출물의 효과

수술 2주 후 각 마우스의 경골에서 35 ㎛의 해상도의 생체 마이크로 시티(micro computed tomography, micro-CT)로 근육의 전산화 단층 이미지를 촬영하였다(N =5, 100 kV, 100 mA, 790 ms, and a rotation step of 1.2°). 근위축을 유도한 마우스는 마취 후 촬영을 진행하였으며 근육 양의 평가를 위해, 경골의 3 차원 모델은 CT-분석기 1.11 (CT-1.11, Bruker, 독일)을 사용하여 재구성 하였다.

도 4에서 보는 바와 같이 정상 마우스(대조군)와 좌골신경을 절제한 후 달맞이꽃 추출물을 각각 0, 1, 2 mg/kg 용량으로 뒷다리 근육내로 접종한 마우스의 생체 마이크로-CT 이미지를 비교하였을 때, 정상 마우스의 뒷다리 근육에 비해 신경절제 후 달맞이꽃 추출물이 접종되지 않은 마우스의 뒷다리 근육이 확연히 위축되었음을 확인하였고, 투여용량이 0, 1, 2 mg/kg으로 증가될수록 근위축 유도가 더 저해되었음을 확인 하였다.

(2) 궁둥신경 절제술에 의해 유도된 근위축증이 소동물에 미치는 영향과 이에 대한 달맞이꽃 추출물의 효과

수술 2주 후 제거된 뒷다리의 비복근(Gastrocnemius)과 가자미근(Soleus muscle)의 중량과 부피를 소동물용 micro-CT로 측정하고, 정상의 다리의 것에 대하여 위축시킨 다리 근육비로 나타내었다. 도 5A에서 보는 바와 같이 신경이 절제된 마우스의 근육 부피는 정상 마우스(대조군)에 비해 거의 절반 정도로 줄어든 것을 확인하였다. 그러나 도 5B 에서 보는 바와 같이, 신경절제 후 달맞이꽃 추출물을 근육내로 접종시킨 그룹은 투여용량이 0, 1, 2 mg/kg으로 증가될수록 근육 부피의 소실 정도가 낮아지는 것을 확인하였다.

(3) 소동물에서 궁둥신경 절제술에 의해 유도된 근위축증이 열충격 단백질 70 발현에 미치는 영향과 이에 대한 달맞이꽃 추출물의 효과

수술 2주 후 제거된 뒷다리의 비복근(Gastrocnemius)에서 웨스턴블롯(western blot)을 이용하여 열충격 단백질 70의 발현 변화를 분석하였다. 근육세포를 라이시스 버퍼(lysis buffer)[50 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 20 mM 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 0.2 mM Na₃VO₄, 50 mM NaF, 프로테아제억제인자 컴플리트 미니(proteaseinhibitor Complete Mini), 포스파타아제 억제제 칵테일(phosphatase inhibitor cocktail)]에서 호모게나이즈로 균질화시켜 용해물(lysate)을 만든 후 브래드포드 분석(Bradford assay)으로 단백질을 정량 하였다. 이후 단백질 40 ㎍씩 SDS-폴리아크릴아마이드 겔(SDS-polyacrylamide gel) 상에서 전기영동 하였다. 전개된 젤을 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 옮긴 뒤 5% 스킴밀크(skim milk)로 1시간 블로킹(blocking) 하였다. 이어 단백질 1차 항체를 4 ℃에서 12시간 정도 붙인 다음 홀스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP)가 결합된 2차 항체를 2시간 동안 인큐베이션 시켰다. 이후 고감도 화학발광(enhanced chemi luminescence, ECL) 키트로 발색 반응을 유도하여 X-선 필름에 감광시킨 뒤 밴드를 확인하였다. 베타액틴(β-actin)을 표준화지표 물질로 사용하며, 검출된 단백질양은 농도계(densitometer(Gel Document, Bio-Rad.))로 측정하였다.

도 6에서 보는 바와 같이 근위축을 유도한 동물모델에서 열충격 단백질 70 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다. 그러나 달맞이꽃 추출물을 접종하지 않은 군에 비해 달맞이꽃 추출물을 접종한 군에서는 열충격 단백질 70 발현이 확연하게 증가됨을 확인하였다.

Claims

달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 미소중력하 근위축 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 달맞이꽃 추출물은 달맞이꽃의 꽃, 잎, 가지, 뿌리, 열매, 껍질, 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 추출물인 것을 특징으로 하는 미소중력하 근위축 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 달맞이꽃 추출물은 달맞이꽃의 뿌리 추출물인 것을 특징으로 하는 미소중력하 근위축 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 달맞이꽃 추출물은 물, 유기용매 및 이들의 혼합용매로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 미소중력하 근위축 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 유기용매는 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는 미소중력하 근위축 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 달맞이꽃 추출물의 투여량은 0.001 내지 10 ㎎/㎏ 인 것을 특징으로 하는 미소중력하 근위축 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 미소중력하 근위축 또는 신경손상으로 인한 근위축 개선용 건강기능식품 조성물.
제8항에 있어서,
상기 달맞이꽃 추출물은 달맞이꽃의 꽃, 잎, 가지, 뿌리, 열매, 껍질, 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 추출물인 것을 특징으로 하는 미소중력하 근위축 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제8항에 있어서,
상기 달맞이꽃 추출물은 달맞이꽃의 뿌리 추출물인 것을 특징으로 하는 미소중력하 근위축 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제8항에 있어서,
상기 달맞이꽃 추출물은 물, 유기용매 및 이들의 혼합용매로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 미소중력하 근위축 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제11항에 있어서,
상기 유기용매는 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는 미소중력하 근위축 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제8항에 있어서,
상기 건강기능식품 조성물은 우주 생활로 인한 근육 노화 억제 또는 운동기능 향상을 위한 우주식품에 포함되는 것을 특징으로 하는 미소중력하 근위축 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제8항에 있어서,
상기 달맞이꽃 추출물은 건강기능식품 중에 0.0001 중량% 이상 100 중량% 이하의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 미소중력하 근위축 또는 신경손상으로 인한 근위축 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.