KR101964329B1 - 갈조류 또는 톳 유래 사링고스테롤 아세테이트를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

갈조류 또는 톳 유래 사링고스테롤 아세테이트를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사링고스테롤 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, Hep3B 인간 간암 세포주, Du145 인간 전립선암 세포주, A549 인간 폐암 세포주의 생존을 억제하는 바, 간암, 전립선, 폐암의 치료 또는 예방에 적용이 가능하다.

Description

갈조류 또는 톳 유래 사링고스테롤 아세테이트를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Composition for preventing or treating of cancer comprising saringosterol acetate from brown algae or Hizikia fusiformis}
본 발명은 갈조류 또는 톳 유래 사링고스테롤 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
암은 전세계 인간의 가장 무서운 질병의 한 종류이다. 암 세포는 보통 우리 몸의 정상 세포를 침범하고, 파괴함으로써 인간의 죽음을 초래할 수 있다(Hamid et al., 2014). 특히 폐암은 가장 악성인 암 중 하나이며 암 전이의 결과로 약 70 %의 환자가 사망한다. 비교적 독성이 없으며 고대부터 자연 요법으로 사용되어 왔기 때문에 천연 화합물의 항암 특성에 큰 관심이 있었다(Hamid et al., 2014; Rao et al., 2014).
갈색 해조류는 해양 생물의 하나로서 항산화제, 항고혈압제, 항균제, 항염증제로 다양한 생물학적 활성을 가지고 있다(Yang et al., 2011). 상기 활성은 플로로탄닌, 푸코산틴, 푸코이단, 스테롤과 같은 다양한 생체 활성 이차 대사 산물에서 비롯된다. 특히, 세계적으로 열대 및 아열대 지역에서 발견되는 매우 인기 있는 식용 해양 갈색 조류인 Hizikia fusiformis(톳)는 항산화 효과를 포함한 다양한 생물학적 활성을 가진 스테로이드 및 다당류와 같은 구조적 종류의 대사 산물을 생산한다고 보고되고 있다(Siriwardhana et al., 2005; Choi et al., 2009).
이에, 본 발명에서는 해양 조류에서 항암 활성을 보이는 화합물을 분리하고자, 고속원심 분배크로마토그래피(Centrifugal partition chromatography, CPC)를 적용하고자 하였다.
본 발명의 목적은 갈조류 또는 톳에서 분리된 사링고스테롤 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 톳(Hizikia fusiforme)를 이용한 사링고스테롤 아세테이트의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 제조방법에 의해 제조된 사링고스테롤 아세테이트를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서는 갈조류 또는 톳(Hizikia fusiforme)로부터 항암 활성 화합물을 분리하기 위해 톳의 추출물을 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올, 및 물을 포함하는 CPC 용매를 혼합하여 고속원심 분배크로마토그래피(Centrifugal partition chromatography, CPC) 시스템을 적용하여, 사링고스테롤 아세테이트(saringosterol acetate)를 분리하였으며, 상기 화합물이 간암, 전립선암, 폐암에 대한 항암활성을 가지는 것을 확인하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서, 갈조류 또는 톳에서 분리된 사링고스테롤 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "사링고스테롤 아세테이트"는 saringosterol acetate의 한글 명칭으로, 화학식 1의 화합물의 구조를 가진다.
[화학식 1]
Figure 112017021649093-pat00001
상기 "사링고스테롤 아세테이트"는 톳(Hizikia fusiforme)의 추출물에서 분리될 수 있다.
상기 "갈조류"는 영문명은 brown algae이며, 세계에 약 1,500종이 알려져 있지만, 그 대부분은 해산이고, 담수산은 불과 5속에 불과하다. 갈조류에는 단세포의 종류가 없고, 크기는 현미경적 크기 정도의 것부터 수십 m에 이르는 것까지 있다. 몸형성에는 단열적인 것과 다열적인 것이 있다. 전자에서는 가성유조직체가 생기며 Nemacystus 등이 그 예이다. 후자는 진정유조직체를 만드는데 다시마, 모자반 등이 있다.
갈조류는 생활환의 양식도 다양하다. 대별하면 단상체가 복상체보다도 큰 Cutleria type, 양쪽이 같은 모양의 Dictyota type, 복상체가 단상체보다 큰 다시마형(Laminaria type), 복상체만이 존재하는 Fucus type의 4형이 있다. 갈조류는 식용으로 미역, 다시마, 톳 등이 있고, 알긴산원료로는 Ecklonia, Ei-senia 등이 있다.
더욱 구체적으로, 갈조류는 가시뼈대그물말, 감태, 검둥감태, 곰피, 괭생이모자반, 미역쇠, 바위두둑, 바위수염, 불레기말, 쌍발이모자반, 참가죽그물바탕말, 참그물바탕말, 다시마, 미역 및 패 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 갈조류일 수 있다.
상기 "톳(Hizikia fusiforme)"은 식용으로 알려져 있는 갈조류 모자반과의 해조류로 조간대 하부에서 큰 군락을 이룬다. 식물체는 섬유상의 뿌리를 가지고 직립하며 줄기는 원주상이고 1회 우상으로 가지가 갈라진다. 보통 10~60cm로 크지만 제주에서 나는 것은 1m 이상 자란다. 잎은 하부에서만 볼 수 있고 다육질이며 작고 가장자리에 톱니가 있다. 잎은 곧 떨어지는데, 가지 중 작은 것은 곤봉 모양을 하며 얼핏 보아 잎과 같이 느껴진다. 늦여름부터 초가을에 발아하여 가을의 중순경에는 육안으로 볼 수 있는 크기에 이르고 12월 말까지는 20cm 내외로 자라며 이듬해 3~4월에는 급격히 생장하며 기포도 생긴다. 4~5월에 생식기관이 형성되고 기부만 남긴 후 유실(流失)된다.
상기 톳(Hizikia fusiforme)은 칼슘, 요오드, 철 등의 무기염류가 많이 포함되어 있어, 혈액을 알카리성으로 전환시켜 혈관경화를 막아주고, 세포조직을 강화시킴으로써 노화를 방지하며 칼슘의 대사가 순조로운 식품이므로 질병에 대한 저항력을 높여줄 뿐만 아니라 모든 장기의 기능을 활발하게 해준다. 또한 톳에 들어 있는 알긴산은 장의 유동작용을 활발히 하여 장내의 노폐물을 배설시키므로 변비에도 좋다. 톳을 상용으로 먹으면 치아가 건강해지며 머리털이 윤택해지고, 임신부인 경우에는 태아의 뼈를 튼튼하게 해주는 등 예로부터 기호식품의 하나로서 특히 일본 사람들이 선호하는 것으로 알려져 있다.
상기 "톳(Hizikia fusiforme)의 추출물"은 톳을 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 상기 톳 추출물은 건조된 톳을 물, 유기용매, 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있다. 구체적으로, 톳 추출물은 건조된 톳 분말을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 8 내지 10배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 20 내지 100℃에서, 추출 기간은 약 1시간 내지 4일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출할 수 있으나, 암의 예방 또는 치료 활성이 있는 물질을 추출하는 방법이라면 제한없이 이용될 수 있다.
구체적으로는 에탄올로 1회 내지 5회 연속 추출하여 감압여과하고, 그 여과추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100℃에서 감압 농축하여 톳 조추출물을 수득한 결과물이 될 수 있으나, 본 발명의 암의 예방 또는 치료 활성을 나타낼 수 있는 한, 이에 제한되지는 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물을 모두 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 사링고스테롤 아세테이트는 톳(Hizikia fusiforme)의 추출물을 고속원심 분배크로마토그래피(Centrifugal partition chromatography, CPC) 용매를 이용한 고속원심 분배크로마토그리피 시스템에 적용하여, 얻은 스테롤 분획물에서 분리될 수 있다.
본 발명에서 상기 고속원심 분배크로마토그래피는 시료에 다양한 용매의 조성으로 이루어진 섞이지 않는 두 층의 용매를 가하여 용매에 대한 서로 다른 친화력을 이용하여 물질을 분리하거나 추출할 수 있는 기법이다. 고체의 고정상을 사용하지 않기 때문에 시료의 손실이 없고, 고가의 용매를 다량 사용하지 않아도 되기 때문에 경제적이며, 비교적 간단한 방법으로 활성 분획물의 대량 생산이 가능한 효율적인 방법으로, 본 발명에서는 이와 같은 고속원심 분배크로마토그래피의 장점을 톳 추출물로부터 항암 활성 성분의 분획에 활용하고자 한다.
상기 톳 추출물로부터 스테롤 분획물을 효율적으로 얻기 위한 고속원심 분배크로마토그래피 시스템은, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 에탄올, 메탄올, 및 물을 포함하는 CPC 용매를 적용한다.
고속원심 분배크로마토그래피(CPC) 적용시 톳 추출물내 사링고스테롤 아세테이트의 최적 분리를 위한 섞이지 않는 두층간의 용매 조성에서 상층이 이동상이 되고, 하층이 고정상이 될 수 있고, 반대로 상층이 고정상, 하층이 이동상으로 적용될 수도 있다. 이는 사링고스테롤 아세테이트의 최적 분리 조건에 따라 달리 적용될 수 있다. 또한, 고속원심 분배크로마토그래피의 설정은 이동상 및 고정상의 설정에 따라 어센딩(Ascending) 또는 디센딩(Descending)이 될 수 있다.
상기 CPC 용매는 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올, 및 물의 혼합 용매일 수 있다. 상기 용매의 혼합 비율(v/v)은 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올, 및 물의 비율(v/v)이 2 내지 7 : 2 내지 5 : 5 내지 10 : 1일 수 있으며, 보다 구체적으로, 5 : 3 : 7 : 1의 비율일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 상층 유기 상(upper organic phase)을 이동상으로 사용하고, 하층 수성상(lower aqueous phase)을 고정상으로 사용하여, 디센딩 모두를 사용하였다. 상기 사링고스테롤 아세테이트는 상기 톳(Hizikia fusiforme)의 에탄올 추출물을 고속원심 분배크로마토그래피(Centrifugal partition chromatography, CPC) 용매인 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올, 및 물의 비율(v/v)이 5 : 3 : 7 : 1의 혼합용매를 이용한 고속원심 분배크로마토그래피를 수행하여 얻은 스테롤 분획물에서 분리되었다.
본 발명에서, 용어 "암"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. "암"이란 세포의 정상적인 분열, 분화 및 사멸의 조절 기능에 문제가 발생하여 비정상적으로 과다 증식하여 주위 조직 및 장기에 침윤하여 덩어리를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는 상태를 의미한다.
본 발명에서 상기 암은 전립선암, 폐암, 및 간암에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 톳 유래 사링고스테롤 아세테이트를 이용하여 Hep3B 인간 간암 세포주, Du145 인간 전립선암 세포주, A549 인간 폐암 세포주에서의 세포독성을 분석한 결과, 암세포주 중에서 폐암 세포에 대한 가장 강력한 항암효능을 보이는 것을 확인하였다. 또한, 폐암 세포주인 A549 세포에 대한 사링고스테롤 아세테이트(saringosterol acetate)의 항암 활성과 정상세포주인 원숭이 신장 세포(vero cell)에 대한 세포 독성을 비교한 결과, 정상세포주인 vero cell에서는 세포독성이 없는 것을 확인하였다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 상기 화합물의 원하는 생물학적 및/또는 생리학적 활성을 보유하고 있고, 원하지 않는 독물학적 효과는 최소한으로 나타내는 모든 염을 의미한다. 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 제조된 염을 의미하며, 이러한 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 구체적으로, 상기 약학적으로 허용되는 염은 약리학적 또는 생리학적으로 허용되는 무기산과 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 암의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 조성물에 의해 암에 의한 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명의 사링고스테롤 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 사링고스테롤 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 99 중량%로, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 50 중량%를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 암 치료 또는 예방을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 인간, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서, 사링고스테롤 아세테이트 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 사링고스테롤 아세테이트, 암, 예방에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명에서의 용어, "개선"은 사링고스테롤 아세테이트 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 개체에 투여하여 암의 증세가 호전되거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 사링고스테롤 아세테이트 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 암의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 사링고스테롤 아세테이트 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 사링고스테롤 아세테이트 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용되는 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식품학적으로 허용되는 염은 식품학적으로 허용되는 유리산(free acid)에 의해 형성되는 산부가염 또는 염기에 의해 형성되는 금속염일 수 있다. 상기 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다. 무기산으로는 염산, 황산, 브롬산, 아황산 또는 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레인산, 푸마산, 글루콘산, 메탄술폰산 등을 사용할 수 있다. 또한, 금속염으로는 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 사용할 수 있다. 그러나 반드시 이로 제한되지는 않는다.
본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능성 식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능성 식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 사링고스테롤 아세테이트 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염은 원료 조성물 중 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능성 식품을 모두 포함한다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서, 톳(Hizikia fusiforme)의 추출물을 제조하는 추출단계(1); 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올, 및 물의 비율(v/v)이 2 내지 7 : 2 내지 5 : 5 내지 10 : 1인 고속원심 분배크로마토그래피(Centrifugal partition chromatography, CPC) 용매를 제조하는 단계(2); 상기 톳(Hizikia fusiforme) 추출물을 상기 CPC 용매를 이용하는 고속원심 분배크로마토그래피 시스템에 적용하여, 스테롤 분획물을 얻는 단계(3); 및 상기 스테롤 분획물에서 사링고스테롤 아세테이트를 분리하는 단계(4)를 포함하는, 톳(Hizikia fusiforme)을 이용한 사링고스테롤 아세테이트의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 톳(Hizikia fusiforme)의 추출물을 제조하는 추출단계(1)를 포함한다. 상기 "톳(Hizikia fusiforme)의 추출물"은 톳을 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 상기 톳 추출물은 건조된 톳을 물, 유기용매, 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있다.
본 발명은 상기 톳(Hizikia fusiforme) 추출물과 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올, 및 물의 비율(v/v)이 2 내지 7 : 2 내지 5 : 5 내지 10 : 1인 고속원심 분배크로마토그래피(Centrifugal partition chromatography, CPC) 용매를 제조하는 단계(2)를 포함한다.
상기 톳 추출물로부터 스테롤 분획물을 효율적으로 얻기 위한 고속원심 분배크로마토그래피 시스템은, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 에탄올, 메탄올, 및 물을 포함하는 CPC 용매를 적용할 수 있다
구체적으로, 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올, 및 물의 비율(v/v)이 2 내지 7 : 2 내지 5 : 5 내지 10 : 1인 CPC 용매를 제조할 수 있다.
본 발명은 상기 톳(Hizikia fusiforme) 추출물을 상기 CPC 용매를 이용하는 고속원심 분배크로마토그래피 시스템에 적용하여, 스테롤 분획물을 얻는 단계(3)를 포함한다.
상기 2단계에서 CPC에 적용할 두층간의 섞이지 않는 용매를 혼합한 혼합용매를 방치하여 상층과 하층 두 층으로 나뉘게 되면, 상기 톳(Hizikia fusiforme) 추출물을 상기 상층과 하층의 용매를 이용하는고속원심 분배크로마토그래피 시스템에 적용할 수 있다. 톳 추출물내 사링고스테롤 아세테이트의 분리 조건에 따라 상기 상층이 이동상이 되고, 하층이 고정상이 될 수 있고, 반대로 상층이 고정상으로 하층이 이동상으로 적용될 수도 있다. 또한, 고속원심 분배크로마토그래피의 설정은 이동상 및 고정상의 상태에 따른 어센딩(Ascending) 또는 디센딩(Descending)이 될 수 있다.
본 발명은 톳의 추출물을 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올, 및 물의 비율(v/v)이 2 내지 7 : 2 내지 5 : 5 내지 10 : 1인 CPC 용매를 이용하는 고속원심 분배크로마토그래피에 적용하여, 톳(Hizikia fusiforme) 추출물에서 스테롤 분획물을 얻을 수 있다.
본 발명은 상기 스테롤 분획물에서 사링고스테롤 아세테이트를 분리하는 단계(4)를 포함한다.
구체적으로, 상기 톳 추출물을 CPC 용매를 이용하는 고속원심 분배크로마토그래피(Centrifugal partition chromatography, CPC) 시스템에 적용하여 얻은 스테롤 분획물에서 사링고스테롤 아세테이트를 분리할 수 있다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서, 상기 사링고스테롤 아세테이트의 제조방법에 의해 제조된 사링고스테롤 아세테이트를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 용어 사링고스테롤 아세테이트, 암, 치료, 예방에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명은 사링고스테롤 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, Hep3B 인간 간암 세포주, Du145 인간 전립선암 세포주, A549 인간 폐암 세포주 A549의 생존을 억제하는 바, 간암, 전립선, 폐암의 치료 또는 예방에 적용이 가능하다.
도 1(a)는 CPC에 의한 H. fusiformis(톳)의 70% EtOH 추출물로부터 분리된 각 분획의 TLC 및 분리된 saringosterol acetate의 구조 및 ESI-MS 데이터를 나타낸다. 도 1(b)는 CPC producer: 고정상(stationary phase): 상층 유기상(upper organic phase); 이동상(mobile phase): 하층 수성상(lower aqueous phase); 유속(flow rate): 2 mL/min; 회전 속도(rotation speed): 1000 rpm; sample: (하층)lower phase와 (상층)upper phase(1:1, v/v)인 용매 시스템의 6 mL의 혼합물에 용해된 500 mg.
도 2는 H. fusiformis 유래 Saringosterol acetate를 이용한 Hep3B 인간 간암 세포주, Du145 인간 전립선암 세포주, A549 인간 폐암 세포주에서의 세포독성을 나타낸다.
도 3은 H. fusiformis 유래 saringosterol acetate의 A549(A) 및 Vero 세포 (B)에 대한 세포 독성을 나타낸다. 세포는 사링고스테롤 아세테이트로 처리하고 MTT 분석으로 측정하였다. *는 무처리 A549 세포와 유의한 차이가 있음(P<0.05); **는 무처리 A549 세포와 유의한 차이가 있음(P<0.01); ***는 무처리 A549 세포와 유의한 차이가 있음을 의미한다 (P<0.001).
도 4는 A549 세포에서 saringosterol acetate가 apoptotic bodies의 유도(a)와 sub G1 단계의 DNA 함량(b)에 미치는 영향을 나타낸다. 세포를 DTCP의 농도를 나타내도록 처리하고 PI로 염색하여 DNA 형광 및 세포주기 위상 분포를 결정하였다. DNA 손상을 나타내는 세포주기의 sub-G1 분획을 DNA 세포주기 분석의 hypo diploid fraction으로부터 분석하였다. 데이터는 세 가지 유사한 실험 중 대표적인 것이다. *는 무처리 A549 세포와 유의한 차이가 있음(P<0.05); **는 무처리 A549 세포와 유의적인 차이가 있음을 의미한다(P<0.01)
도 5는 A549 세포에서 saringosterol acetate가 세포 사멸 관련 단백질에 미치는 영향을 나타낸 것이다. saringosterol acetate로 24 시간 동안 세포를 처리하였다. 전체 세포 용해물을 항-Bax, -Bcl-xL, -cleaved caspase-3, -cleaved caspase-8 및 -bid 단일클론 항체의 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. GAPDH는 내부 대조군으로 사용되었다. 각 실험을 3회 반복하여 유사한 결과를 얻었다. *는 무처리 A549 세포와 유의한 차이가 있음(P<0.05); **는 무처리 A549 세포와 유의한 차이가 있음(P<0.01); ***는 무처리 A549 세포와 유의한 차이가 있음을 의미한다(P<0.001).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<재료 및 실험방법>
1. 재료
H. fusiformis(톳)는 2011년 6월 제주도에 위치한 태림(Taerim)에서 얻었다. 동결 건조기로 건조한 후, 50 메쉬 표준 시험 체로 옮겨 갈았으며, 이후 건조된 H. fusiformis 분말은 사용전에 냉장고에 보관하였다. 조 시료 제조 및 CPC 분리에 사용된 모든 용매는 분석용이었다(㈜대정 화학 공업, 서울). HPLC 분석 용매(grade solvents)는 Burdick & Jackson (MI, USA)에서 구입했다. RPMI-1640 배지, fetal bovine serum(FBS) penicillin-strptomycin과 trypsine-EDTA는 Gibco/BRL(Grand Island, NY, USA)에서 입수하였다. M-MuLV 역전사 효소는 Promega(Madison, WI, USA)로부터 구입하였다. Protein assay kit와 ECL detection reagent는 Bio-Rad (Richmond, CA, USA)와 Amercham Biosciences(Piscataway, NJ, USA)에서 각각 구입했다. RNase A는 Biosesang(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), ethidium bromide(EtBr), dimethyl sulfoxide(DMSO), 및 Hoechst 33342는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. DNA 사다리 크기 마커는 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입했다. Bax, Bcl-xL, p53 및 GAPDH에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc.(CA, USA)에서 구입했다. cleaved Bid, cleaved caspase-3 및 cleaved caspase-8에 대한 항체는 Cell Signaling Technology(Bedford, Massachusetts, USA)에서 구입했다. 다른 모든 화학 물질, 시약 및 용매는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입했다.
2. H. fusiformis로부터의 조 추출물의 제조
건조된 H. fusiformis(600g)를 실온에서 초음파 처리하에 70 % EtOH로 3 시간 동안 3 회 추출하였다. 추출액을 회전식 진공 증발기에서 농축한 후, 농축 추출물을 CPC 분리를 위해 냉장고에 저장하였다.
3. CPC 프로세스
CPC 실험은 이전 프로토콜(Lee et al., 2014b)을 수정하여 수행하였다. 2 개의 상은 n-헥산 : 에틸아세테이트(EtOAc) : 메탄올(MeOH) : 물을 5 : 3 : 7 : 1의 비율(v/v)로 구성했다. 상층 유기 상(upper organic phase)을 이동상으로 사용하고, 하층 수성상(lower aqueous phase)을 고정상으로 사용하였다. CPC로부터의 용출액(effluent)을 CHCl3 : MeOH가 20 : 1의 비율(v/v)로 구성된 이동상을 이용하여, TLC 분석에 의해 모니터링하였으며, CPC 용출액에서 유효성분을 정제하였다.
4. 정제된 화합물의 ESI /MS 분석
Finnigan electrospray source가 장착되어 있고 m/z 2000까지 이온을 분석할 수 있는 Finnigan MAT LCQ 이온 트랩 질량 분석기(Finnigan MAT, San Jose, CA, USA)를 사용하여 ESI/MS 분석을 수행했다. Xcalibur 소프트웨어(Finnigan MAT)를 사용하였다. 칼럼 용출액(eluate)의 음이온 질량 스펙트럼은 m/z 100-2000의 범위로 기록되었다. 전원 전압은 4.5 kV로, 모세관 온도는 250℃로 설정 하였다. 다른 조건은 다음과 같다 : 모세관 전압(capillary voltage), -36.5 V; 인터-옥 폴 렌즈 전압(inter-octapole lens voltage), 10V; 시스 가스(sheath gas), 80psi (551.6 kPa); 보조 가스(auxiliary gas), 20 psi(137.9 kPa).
5. 정제된 화합물의 1 H-NMR 및 13 C-NMR 분석
1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼은 JEOL JNM-LA 300 분광기로 측정하였다. 질량 스펙트럼(FAB-MS 및 EIMS)을 JEOL JMS 700 분광기에 기록하였다.
6. 항암 효과 및 세포 독성
Hep3B 인간 간암 세포주, Du145 인간 전립선암 세포주, A549 인간 폐암 세포주를 10%(v/v) 열-불활성화 FBS, 페니실린(100U/ ml) 및 스트렙토마이신(100㎍/ml)이 보충된 RPMI-1640 배지에서 성장시켰다. 배양은 5% CO2 배양기에서 37℃로 유지하였다. 다양한 농도의 사링고스테롤 아세테이트로 A549 세포(1x 105세포/ml)를 24 시간 동안 예비 배양한 후, MTT 스톡 용액 (50㎕; PBS내 2mg/ml)을 각 웰에 첨가하여 총 반응 부피 250 ㎕로 맞추었다. 그리고 4 시간 동안 배양 한 후, 플레이트를 2,000 rpm에서 10분간 원심 분리하고 상등액을 흡인하였다. 각 웰의 포르마잔 결정을 DMSO에 용해시켰다. 보라색 포르마잔의 양은 540 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.
7. 세포 자살 분석
세포의 핵 형태는 세포 침투성 DNA 염료 Hoechst 33342를 사용하여 분석하였다. 균질하게 염색된 핵을 가진 세포는 생존 가능한 것으로 간주되었지만 염색질 응축 및/또는 단편화의 존재는 세포 자멸의 지표였다(Gschwind and Huber, 1995; Lizard et al., 1995). 다양한 농도의 사링고스테롤 아세테이트를 처리 한 후, Hoechst 33342 염료를 배양 배지에 최종 농도 10㎍/ml로 첨가하였다. 염색된 세포를 CollSNAP-Pro 컬러 디지털 카메라가 장착된 형광 현미경으로 관찰하여 핵 응축의 정도를 조사하였다.
8. Cytometric ( FACs ) 분석
세포주기 분석을 수행하여 아폽토시스 sub-G1 hypodiploid 세포의 비율을 결정하였다(Nicoletti et al., 1991). A549 세포(1×105cells/ml)를 5cm의 petridishes에 넣은 다음 24 시간 동안 사링고스테롤 아세테이트로 처리하였다. 4℃에서 30 분간 70 % EtOH 1ml로 고정후 PI/RNase A 100㎍/ml와 함께 30 분간 배양하였다. 유동세포계측분석은 FACs Calibur 유동세포계측기(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)로 수행되었다.
9. 웨스턴블랏 분석
1×105 세포/ml의 A549 세포를 사링고스테롤 아세테이트로 처리하고 수확하였다. 상기 세포 용해물은 용해 완충액(50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4), 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, 0.1 % SDS 및 1 mmol/L EDTA)을 이용하여 제조하였다. 세포 용해물을 원심 분리를 통해 세척하고, 용해물 중의 단백질 농도를 BCA ™ 단백질 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 30㎍의 단백질을 포함하는 용해물을 10% 또는 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide 겔에서 전기 영동하고 겔을 니트로셀룰로오스 멤브레인(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 옮겼다. 0.5% non-fat dry milk를 함유하는 TTBS(25 mmol/L Tris-HCl, 137 mmol/L NaCl, 0.1% Tween 20, pH7.4)내에 Bax, p53, 절단된 capase 3, 8, Bcl-xl, 절단된 Bid 및 GAPDH에 대한 1 차 항체로 멤브레인을 배양하였다. 이어서, 멤브레인을 TTBS로 세척하고 2차 항체로 배양하였다. 신호는 ECL Western blotting 검출키트를 사용하여, X 선 필름에 노출시켰다.
10. 통계처리
실험의 결과는 최소한 3회 이상의 반복 실험을 하여 평가되었으며 모든 값은 평균±표준 오차로 나타냈다. Turkey test를 사용하여 variance (ANOVA) 분석을 통해 결과를 분석하였다. p<0.05의 값은 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주되었다.
<실험 결과>
1. 2 상 용매 시스템의 최적화
적절한 2 상 용매 시스템을 선택하기 위한 분배 계수(Partition coefficient, K)는 CPC에 의한 표본 시료의 성공적인 분리에 가장 중요하다(Lee et al., 2013). 효율적인 분리를 위해, n-헥산 : EtOAc : MeOH : 물 (v/v)과 같은 두 가지 혼합되지 않은 용매의 다른 조성 및 부피비를 이용하여 몇 가지 2 상 용매 비율을 채택한 다음 TLC에서 밴드의 크기에 따라 다음 TLC에서 밴드의 크기에 따라 K 값을 결정하였다. 그 결과, 5 : 3 : 7 : 1 (n-헥산 : EtOAc : MeOH : 물, v/v)로 구성된 2 상 용매 시스템은 H. fusiformis로부터 스테롤을 가장 효율적으로 분리하는 밴드 크기를 나타냈다.
2. CPC에 의한 스테롤의 분리와 구조적 동정
CPC는 디센딩 모드(descending mode) (상부 상 : 고정상 및 하부 상 : 이동상)로 조작하였다. 코일에서 고정상의 유지는 50%를 유지하였고, 압력은 360분 동안 3.3MPa를 나타냈다. CPC로부터 각각의 분획물의 TLC 분석을 도 1a에 나타내었다. 그 결과 분획물 3(fraction 3)이 H2SO4와 반응하여 보라색을 나타내어 스테롤을 함유하고 있는 분획물임을 알 수 있었다. TLC에 의해 분획물 3에서 스테롤을 정제한 후, HPLC-DAD-ESI/MS, 1H, 13C, 2D NMR 데이터를 사용하여 스테롤의 화학 구조를 분석(Kurata et al., 1990; Permeh et al., 2012)한 결과, 분자량이 m/z 469(ESI-MS)인 사링고스테롤 아세테이트(saringosterol acetate)로 확인되었다(도 1b). 순수한 사링고스테롤 아세테이트 11mg을 70% EtOH 추출물 500mg으로부터 분리되었으며, 그 수율은 2.2%를 나타내었다.
3. 사링고스테롤 아세테이트( saringosterol acetate)의 상대적인 세포 독성
종양 세포에 대한 saringosterol acetate의 상대적 세포 독성을 Hep3B 인간 간암 세포주, Du145 인간 전립선암 세포주, A549 인간 폐암 세포주에서 세포 독성을 MTT 분석을 통해 측정되었다. 도 2는 H. fusiformis 유래 Saringosterol acetate를 이용한 Hep3B 인간 간암 세포주, Du145 인간 전립선암 세포주, A549 인간 폐암 세포주에서의 세포독성을 나타낸다. 그 결과, 암세포주 중에서 폐암 세포에 대한 가장 강력한 항암효능을 보이는 것을 확인하였다.
또한, 종양 세포에 대한 saringosterol acetate의 상대적 세포 독성을 인간 폐암 A549 세포와 정상세포주인 vero cell에서 MTT 분석을 통해 측정하였다. 도 3a와 b는 A549 세포에 대한 saringosterol acetate의 항암 활성과 원숭이 신장 세포(vero cell)에 대한 세포 독성을 보여준다. 그 결과, 정상세포주인 vero cell에서는 세포독성이 없는 것을 확인하였으며, 폐암 세포주에서는 IC50 값 3㎍/ml임을 확인하였다(도 3).
4. A549 세포에서 사링고스테롤 아세테이트에 의한 세포 사멸( apoptosis )
A549 세포에 대한 saringosterol acetate의 잠재적인 세포 독성 효과는 Hochest 3334 assay에 의해 조사되었고, 또한 flow cytometric assay로 확인되었다. 사링고스테롤 아세테이트로 24 시간 동안 처리된 세포에서 유도된 세포 사멸체는 화살표로 표시하여 도 4a에 나타내었다. 이러한 결과에서, 사링고스테롤 아세테이트로 처리된 세포는 대조군에 비해 더 이질적인 형태를 보였다. 세포주기 및 sub-G1 phase의 각 구획에 있는 세포의 수는 총 세포 수의 백분율로 표시되었다. 데이터는 사링고스테롤 아세테이트가 농도 의존적으로 세포 사멸(sub-G1 phase)을 유도하였고(도 4b), 12.5㎍/ml의 농도에서 가장 강한 apoptosis가 관찰되었다.
5. A549 세포에서 사링고스테롤 아세테이트가 세포 사멸 관련 단백질의 수준에 미치는 영향
사링고스테롤 아세테이트 유도된 세포사멸 메커니즘을 연구하기 위해 Bax, Bcl-xL, cleaved caspase-3, cleaved caspase-8, p53 및 cleaved bid와 같은 단백질의 발현을 Western blot analysis로 평가하였다. anti-apoptosis 단백질인 Bcl-xL의 수준은 감소하였고, Bax와 cleaved caspase-3를 포함한 pro-apoptosis 단백질의 수준은 사링고스테롤 아세테이트로 처리한 A549 세포에서 증가하였다. 또한, 다른 세포 사멸을 위한 경로인 caspase-8과 Bid의 발현 수준도 농도 의존적 방식으로 증가되었다. 그러나 p53은 변화되지 않았는데, 이는 세포의 DNA 손상에 의한 세포 사멸에 기여할 수 있다(도 5).

Claims (9)

  1. 갈조류 또는 톳에서 분리된 사링고스테롤 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 전립선암, 폐암, 및 간암에서 선택되는 하나 이상의 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 사링고스테롤 아세테이트는 톳(Hizikia fusiforme)의 추출물에서 분리된 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것인 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 사링고스테롤 아세테이트는 톳(Hizikia fusiforme)의 추출물을 고속원심 분배크로마토그래피(Centrifugal partition chromatography, CPC) 용매를 이용한 고속원심 분배크로마토그리피 시스템에 적용하여 얻은 스테롤 분획물에서 분리된 것인, 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 CPC 용매는 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올, 및 물의 비율(v/v)이 2 내지 7 : 2 내지 5 : 5 내지 10 : 1인 것인, 약학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 사링고스테롤 아세테이트 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 전립선암, 폐암, 및 간암에서 선택되는 하나 이상의 암 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
KR1020170027645A 2017-03-03 2017-03-03 갈조류 또는 톳 유래 사링고스테롤 아세테이트를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 KR101964329B1 (ko)

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CN102861023A (zh) * 2012-08-24 2013-01-09 中国海洋大学 一种马尾藻甾醇的用途

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CN102861023A (zh) * 2012-08-24 2013-01-09 中国海洋大学 一种马尾藻甾醇的用途

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Phytochemistry, 1990, 제29권, 제11호, 페이지 3678-3680*

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