KR101654977B1 - 키레놀 또는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물을 포함하는 항비만용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키레놀(kirenol) 또는 이를 함유하는 시게스벡키아 오리엔탈리스(Siegesbeckia orientalis L.) 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 키레놀(kirenol), 또는 이를 함유하는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 또는 이의 분획물은 지방세포 내에서 지방세포 분화에 관여하는 주요 전사인자(PPARγ, C/EBPα, 및 SREBP-1c)의 발현을 감소시킴에 따라, 비만에 우수한 효과가 있다. 또한, 본 발명은 천연물이므로 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있어, 의약품 또는 식품으로 사용될 수 있다.

Description

키레놀 또는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물을 포함하는 항비만용 조성물{Anti-obesitic composition comprising kirenol or extract of Sigesbeckia orientalis L.}

본 발명은 키레놀(kirenol) 또는 시게스벡키아 오리엔탈리스(Sigesbeckia spp.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 개선/치료용 조성물에 관한 것이다.

비만은 에너지 축적량과 소모량의 불균형으로 지방조직의 이상적 증가에 따라 발생하는 질환이다. 비만은 세계 각국에서 심각한 보건문제로 인식되고 있으며 인슐린혈증, 동맥경화증, 순환기계 질환, 암, 당뇨병 등과 같은 많은 질병의 원인으로도 작용할 수 있어 그 심각성이 더욱 고조되고 있는 실정이다(Nature 404: 635-643, 2000, Obes. Rev. 12: 1-13, 2011).

Wnt 단백질은 시스테인-리치-분비형 리간드(cystein-rich-secreted ligand)로서 수용체에 결합하여 Wnt 신호 경로를 활성화한다. 척추동물의 발생과정에서 Wnt 신호는 기관의 발달이나 세포의 증식, 형태, 운동성과 운명을 조절하는 작용을 한다. Wnt 단백질이 세포막 수용체에 결합했을 때 세포 내 어떤 신호경로를 활성화하는지에 따라 β-카테닌 의존성 경로와 비의존성 경로로 나뉜다. β-카테닌 의존성 Wnt 경로는 Wnt1, Wnt 2, Wnt 3a, Wnt 10a 등에 의해 활성화되며 canonical Wnt 경로라고 한다. β-카테닌 비의존성 Wnt 경로는 Wnt 4, Wnt 5a, Wnt 11에 의해 활성화 되며 non-canonical Wnt 경로라고 한다. Canonical Wnt 경로는 Wnt 단백질이 있는 경우 세포막에 있는 프리즐드(frizzled) 수용체와 LRP(low-density lipoprotein-receptor-related protein-5/6)에 결합하면서 세포내 신호 연쇄반응이 작동하여 GSK-3β(Glycogensynthase kinase-3β)가 억제된다. GSK-3β가 억제되면 β-카테닌의 인산화와 분해가 억제되면서 β-카테닌이 세포질 내에 축적되고 일정 농도가 되면 β-카테닌은 핵내로 들어가 Tcf/Lef전사인자에 결합하여 Cyclin D1(CCND1)등의 유전자 발현을 활성화시키게 된다. 이에 따라 Wnt/β-카테닌 신호의 활성화는 지방세포 분화에 주요 전사인자인 CEBPs(CCAAT/enhancer binding proteins)와 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma)을 억제함으로써 지방세포 특이 유전자가 발현되지 못해 지방세포 형성을 막는다(Science 289: 950-953, 2000, Trends Endocrin. Met. 20: 16-24, 2009).

한편, Wnt가 증가시키는 세포 내 β-카테닌 양과 PPARγ간의 균형 조절이 지방 세포 분화에 중요하다고 알려져 있으며 이 두 단백질간의 균형은 GSK-3β에 의한 β-카테닌의 인산화를 통한 단백질 분해에 의존적으로 조절된다(J. Biol. Chem. 279: 45020-45027, 2004, Biochem. J. 376: 607-613, 2003). 또한, 형질전환 마우스를 통한 in vivo 결과에서도 Wnt가 지방세포 형성을 억제하는 역할을 담당하고 있음이 보고되었다(J. Biol. Chem. 279: 45020-45027, 2004).

현재까지 개발된 대표적인 항비만 의약품 중에는 식욕을 저하시키는 리덕틸 (Reductil^TM, 애보트사, 미국)과 지방 흡수를 저해하는 제니칼(Xenical^TM, 로슈제약회사, 스위스)이 임상에서 사용되고 있으나 심장질환, 호흡기 질환, 혈압상승 및 불면증 등의 부작용과 함께 그 효능의 지속성이 낮다(Phytochem. 71: 1625-1641, 2010). 따라서 본 발명자는 이러한 화학적 합성품이 아닌 식물 추출물과 같이 부작용은 적으면서 안전성이 높은 천연물을 이용한 항비만 원료를 개발하고자 연구를 수행하였다.

J. Biol. Chem. 279: 45020-45027, 2004 Phytochem. 71: 1625-1641, 2010

이에 본 발명자들은 우수한 항비만 활성을 가지며 안전하게 적용될 수 있는 천연물질을 탐색하기 위하여 연구한 결과, 키레놀(kirenol) 또는 이를 함유하는 시게스벡키아 오리엔탈리스(Hui Chum, Siegesbeckia spp.) 추출물 또는 이의 분획물이 지방생성을 억제하는 효능이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은

시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은

하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

본 발명에 따른 키레놀(kirenol), 또는 이를 함유하는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 또는 이의 분획물은 지방생성을 억제하고, 지방분화에 관여하는 핵심 전사인자(PPARγ, C/EBPα, 및 SREBP-1c)발현을 감소시켜 비만에 우수한 효과가 있다. 또한, 본 발명은 천연물이므로 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있어, 의약품 또는 식품으로 사용될 수 있다.

도 1은 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물의 분획물을 박층 크로마토그래피(TLC)를 이용하여 측정한 결과를 보여준다.
도 2는 지방전구세포인 3T3-L1에서 키레놀 처리에 의한 지방생성 억제활성을 측정한 결과를 보여준다.
도 3은 지방전구세포인 3T3-L1에서 키레놀 처리에 의한 지방세포 분화의 주요 전사인자(PPARγ, C/EBPα, 및 SREBP-1c)의 mRNA 발현량(왼쪽) 및 대조군 대비 상대적인 mRNA 발현량(오른쪽)을 측정한 결과를 보여준다.
도 4는 지방전구세포인 3T3-L1에서 키레놀 처리에 의한 지방생성 관련 유전자(FAS(fatty acid synthesis) 및 ACC(acetyl-CoA carboxylase))의 mRNA 발현량(왼쪽) 및 대조군 대비 상대적인 mRNA 발현량(오른쪽)을 측정한 결과를 보여준다.
도 5는 지방전구세포인 3T3-L1에서 키레놀 처리에 의한 지방세포 분화 시 발현되는 염증성 사이토카인(아디포넥틴(adiponectin) 및 렙틴(leptin))의 mRNA 발현량(왼쪽) 및 대조군 대비 상대적인 mRNA 발현량(오른쪽)을 측정한 결과를 보여준다.
도 6은 지방전구세포인 3T3-L1에서 키레놀 처리에 의한 Wnt/β-카테닌 신호전달계의 주요 유전자(LRP6, DVL2, β-카테닌, 및 CCND1)의 mRNA 발현량(왼쪽) 및 대조군 대비 상대적인 mRNA 발현량(오른쪽)을 측정한 결과를 보여준다.
도 7은 3T3-L1 지방전구세포에서 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물, 메탄올 추출물, 열수 추출물, 에틸아세테이트 추출물, 헥산 추출물 처리에 의한 지방세포 분화의 주요 전사인자(PPARγ 및 C/EBPα)의 mRNA 발현량을 측정한 결과를 보여준다.
도 8은 3T3-L1 지방전구세포에서 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물의 분획물 처리에 의한 지방세포 분화의 주요 전사인자(PPARγ 및 C/EBPα)의 mRNA 발현량를 측정한 결과를 보여준다.
도 9는 3T3-L1 지방전구세포에서 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물 처리에 의한 지방생성 억제활성을 측정한 결과를 보여준다.
도 10은 3T3-L1 지방전구세포에서 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물 처리에 의한 지방세포 분화의 주요 전사인자(PPARγ, C/EBPα, 및 SREBP-1c)의 mRNA 발현량(왼쪽) 및 대조군 대비 상대적인 mRNA 발현량(오른쪽)을 측정한 결과를 보여준다.
도 11은 지방전구세포인 3T3-L1에서 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물 처리에 의한 지방생성 관련 유전자(FAS 및 ACC)의 mRNA 발현량(왼쪽) 및 대조군 대비 상대적인 mRNA 발현량(오른쪽)을 측정한 결과를 보여준다.
도 12는 지방전구세포인 3T3-L1에서 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물 처리에 의한 지방세포 분화 시 발현되는 염증성 사이토카인 아디포넥틴 및 렙틴의 mRNA 발현량(왼쪽) 및 대조군 대비 상대적인 mRNA 발현량(오른쪽)을 측정한 결과를 보여준다.
도 13은 지방전구세포인 3T3-L1에서 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물 처리에 의한 Wnt/β-카테닌 신호전달계의 주요 유전자(LRP5, DVL2, β-카테닌, 및 CCND1)의 mRNA 발현량(왼쪽) 및 대조군 대비 상대적인 mRNA 발현량(오른쪽)을 측정한 결과를 보여준다.
도 14는 고지방 식이로 유도된 비만 마우스에서 키레놀 투여에 의한 체중감량 효과를 보여준다.
도 15는 고지방 식이로 유도된 비만 마우스에서 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 투여군의 식이량을 보여준다.
도 16은 고지방 식이로 유도된 비만 마우스에서 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 투여에 의한 체중감량 효과를 보여준다.
도 17은 고지방 식이로 유도된 비만 마우스에서 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 투여에 의한 혈중 총 콜레스테롤, 중성지방, 고밀도 콜레스테롤, 저밀도 콜레스테롤 농도를 측정한 결과를 보여준다.
도 18은 고지방 식이로 유도된 비만 마우스의 부고환지방조직에서 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 투여에 의한 지방세포 분화의 주요 전사인자(PPARγ 및 C/EBPα)의 단백질 발현량(왼쪽) 및 대조군 대비 상대적인 단백질 발현량(오른쪽)을 측정한 결과를 보여준다.
도 19는 고지방 식이로 유도된 비만 마우스의 부고환지방조직에서 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 투여에 의한 Wnt/β-카테닌 신호전달계의 주요 유전자(β-카테닌 및 p-Gsk3β)의 단백질 발현량(왼쪽) 및 대조군 대비 상대적인 단백질 발현량(오른쪽)을 측정한 결과를 보여준다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 또는 이의 분획물, 또는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 비만 예방, 개선 또는 치료 용도; 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 또는 이의 분획물, 또는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 비만 예방, 개선 또는 치료용 조성물; 또는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 또는 이의 분획물, 또는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 인간을 포함한 포유동물에 적용하는 것을 포함하는 비만 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.

[화학식 1]

본 명세서에서 '시게스벡키아 오리엔탈리스 (Siegesbeckia orientalis L.)'는 국화과의 시게스벡키아속 식물(Siegesbeckia spp.)의 하나로 제주도 및 남부지방에 서식하며, 제주진득찰이라고도 한다.

본 명세서에서 '시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물'은 당업계에 공지된 통상의 추출방법을 제한 없이 이용하여 제조될 수 있고, 예를 들어, 시게스벡키아 오리엔탈리스 식물 또는 식물의 일부 (잎 또는 뿌리)로부터 물, 탄소수 1 내지 6의 유기용매 및 아임계 또는 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출하여 수득할 수 있다.

본 명세서에서 '분획물'은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 용매 분획, 실리카 겔 크로마토그라피(silica gel chromatography), prep-HPLC 등의 기술을 이용하여 활성물질이 농축된 특정 분획물을 제조할 수 있다.

본 명세서에서, '항비만용 조성물'은 '비만 예방, 개선 또는 치료용 조성물'과 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 용어 '예방'은 비만의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 용어 '개선 또는 치료'는 비만의 증상을 경감, 완화, 또는 없애거나, 비만의 진행을 지연, 중단 또는 역전시키는 등, 비만과 관련하여 이롭게 변경시키는 모든 행위를 포함한다. '항비만용 조성물' 또는 '비만 예방, 개선 또는 치료용 조성물'은 약학 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.

본 발명의 비만 예방, 개선 또는 치료용 조성물은, 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 또는 이의 분획물 이외에, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 예컨대, 비만에 효과가 있는 공지의 성분을 포함할 수 있다. 추가적인 성분을 포함하게 되면 본 발명의 조성물의 비만에 대한 예방, 개선 또는 치료 효과가 더욱 증진될 수 있을 것이다. 상기 성분 추가 시에는 복합 사용에 따른 피부 안전성, 제형화의 용이성, 유효성분들의 안정성을 고려할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 상기 조성물은 당업계에 공지된 비만 치료 성분으로서, 외톨개모자반(Myagropsis myagroides) 추출물, 참모자반(Sargassum fulvellum) 추출물, 괭생이모자반(Sargassum horneri)의 추출물, 산유자 잎 추출물, 경단구슬모자반 추출물, 붉가시나무 잎 추출물, 인삼 종자 추출물, 인삼의 누룩균 발효물, 인삼의 홍국균 발효물, 홍삼의 누룩균 발효물 또는 홍삼의 홍국균 발효물, 남가새 추출물 및 마늘종 추출물(Allium sativum L. stem extract) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 성분은 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 중량% 이상 내지 10 중량% 이하로 포함될 수 있다. 예를 들어, 0.0001 중량% 이상 내지 1 중량% 이하, 0.0001중량% 이상 내지 0.1중량% 이하, 0.0001 중량% 이상 내지 0.001 중량% 이하, 0.001중량% 이상 내지 10중량% 이하, 0.001중량% 이상 내지 1중량% 이하, 0.001 중량% 이상 내지 0.1중량% 이하, 0.01 중량% 이상 내지 10중량% 이하, 0.01중량% 이상 내지 1 중량% 이하일 수 있다. 상기 함량 범위는 피부 안전성, 상기 화학식 1의 화합물의 제형화 시의 용이성 등의 요건에 따라 조절될 수 있을 것이다.

본 발명은 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방, 또는 치료용 약학 조성물, 또는 비만 예방, 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

한 구체예에서, 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물은 건조시킨 시게스벡키아 오리엔탈리스를 식품가공에 적합한 정제수, 에탄올 및 아임계수 또는 초임계 이산화탄소를 이용하여 추출, 정제하여 얻을 수 있거나, 초고압 추출 장치를 이용하여 추출, 정제하여 얻을 수 있으며, 또는 시게스벡키아 오리엔탈리스 식물을 직접 압착하여 얻은 오일로부터 분리 정제하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 100 MPa 이상의 초고압 조건 하에서 시게스벡키아 오리엔탈리스를 추출하여 추출물을 수득할 수 있다.

한 구체예에서, 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 유기용매, 아임계 유체 및 초임계 유체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 시게스벡키아 오리엔탈리스를 추출하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 추출 용매로서, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산, 시클로헥산, 석유에테르 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 필요한 경우에는 당업계에 공지된 방법에 따라 여과 및 농축 단계를 추가적으로 포함하여 제조할 수 있다.

한 구체예에서, 탄소수 1 내지 6의 유기용매는 탄소수 1 내지 6의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌 클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane) 및 석유에테르(petroleum ether)로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

한 구체예에서, 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 또는 이의 분획물은 키레놀을 유효성분으로 함유할 수 있다.

한 구체예에서 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 또는 이의 분획물은 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물; 또는 상기 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물을 헥산으로 분획한 헥산 분획물일 수 있다. 또한, 상기 헥산 분획물을 헥산 및 에틸아세테이트의 혼합 용매로 분획한 헥산-에틸아세테이트 분획물; 상기 헥산-에틸아세테이트 분획물을 에틸아세테이트로 분획한 에틸아세테이트 분획물; 또는 상기 에틸아세테이트 분획물을 에탄올로 분획한 에탄올 분획물일 수 있다. 헥산-에틸아세테이트 분획물은 헥산 및 에틸아세테이트를 9:1 내지 8:2의 부피 비율로 혼합한 혼합 용매로 분획한 제1 헥산-에틸아세테이트 분획물; 또는 상기 제1 헥산-에틸아세테이트 분획물을 헥산 및 에틸아세테이트를 7:3 내지 6:4의 부피 비율로 혼합한 혼합 용매로 분획한 제2 헥산-에틸아세테이트 분획물일 수 있다. 상기 에틸아세테이트 분획물에 유효성분인 키레놀이 가장 많이 함유되어 있어, 항 비만 효과가 우수하다.

본 발명은 또한, 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방, 또는 치료용 약학 조성물, 또는 비만 예방, 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1의 화합물은 가능한 모든 이성질체를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 하기 화학식 2의 화합물을 포함할 수 있다.

[화학식 2]

상기 화학식 2의 화합물은 일명 키레놀(kirenol)이라 한다.

키레놀(kirenol)은 시게스벡키아 오리엔탈리스(Siegesbeckia orientalis L.), 시게스벡키아 푸베센스(Siegesbeckia pubescens Mak.), 시게스벡키아 글라브레센스 (Siegesbeckia glabrescens Mak.)에 함유되어 있는 물질로 제주도 및 남부지방에 서식하는 시게스벡키아 속(Siegesbeckia spp.) 식물의 유효성분이다.

키레놀 또는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물은 항염효과 및 진통효과(J. Ethnopharmacol. 137: 1089-1094, 2011), 항균효과(Pharmacogn. Mag. 8: 149-155, 2012), 관절염효과(Phytomedicine 19: 882-889, 2012)를 갖는 것으로 보고되었으나, 본 발명의 이전에는 비만 예방 및 치료효과에 관해서는 알려진 바 없었다.

키레놀은 건조시킨 시게스벡키아 오리엔탈리스를 식품가공에 적합한 정제수, 에탄올 및 아임계수 또는 초임계 이산화탄소를 이용하여 추출, 정제하거나, 초고압 추출 장치를 이용하여 추출, 정제하여 얻을 수 있으며, 또는 시게스벡키아 오리엔탈리스 식물을 직접 압착하여 얻은 오일로부터 분리 정제하여 얻을 수 있다. 시게스벡키아 오리엔탈리스의 추출물로부터 키레놀의 분리 및 정제는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그라피 및 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있으나, 키레놀의 추출 및 분리정제 방법이 반드시 상기 방법에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 화학식 1의 화합물 또는 상기 화학식 2의 화합물은 식물 추출물로부터 분리 또는 합성하여 이용하거나, 시판되고 있는 화합물을 이용할 수 있다.

한 구체예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 화학식 2로 표시되는 화합물은 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물로부터 분리된 것일 수 있다.

본 발명의 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물은 키레놀의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어 '약학적으로 허용 가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약제학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다.

상기 키레놀의 약제학적으로 허용 가능한 염은 유기산 또는 무기산을 이용하여 형성된 산 부가염일 수 있으며, 상기 유기산은 예를 들면 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 부티르산, 이소부티르산, 트리플루오로아세트산, 말산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 숙신산 모노아미드, 글루탐산, 타르타르산, 옥살산, 시트르산, 글리콜산, 글루쿠론산, 아스코르브산, 벤조산, 프탈산, 살리실산, 안트라닐산, 디클로로아세트산, 아미노옥시 아세트산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 또는 메탄술폰산을 포함한다. 무기산은 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 인산, 질산, 탄산 또는 붕산을 포함한다. 산 부가염은 바람직하게는 염산염 또는 아세트산염 형태일 수 있으며, 보다 바람직하게는 염산염 형태일 수 있다.

상기 언급된 산 부가염은 a) 키레놀 및 산을 직접 혼합하거나, b) 이들 중 한 가지를 용매 또는 함수 용매 중에 용해시키고 혼합시키거나, 또는 c) 키레놀을 용매 또는 수하 용매 중의 산에 위치시키고 이들을 혼합하는 일반적인 염 제조방법으로 제조된다.

위와는 별도로 추가적으로 염이 가능한 형태는 가바염, 가바펜틴염, 프레가발린염, 니코틴산염, 아디페이트염, 헤미말론산염, 시스테인염, 아세틸시스테인염, 메티오닌염, 아르기닌염, 라이신염, 오르니틴염 또는 아스파르트산염 등이 있다.

또한, 본 발명의 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있다. 또한, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 약학 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들어, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구적인 투여방법으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다. 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이드레이트(예를 들어, 글루코스, 만노스, 수크로스, 또는 덱스트란 등), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 또는 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다.

단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 또는 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.

또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 '경피 투여'는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.

흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토오스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다. 비경구 투여용 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 약학 조성물은 키레놀 또는, 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 또는 이의 분획물을 유효량으로 포함할 때 바람직한 비만 예방, 개선 또는 치료 효과를 제공할 수 있다. 본 명세서에서, '유효량'이라 함은 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 비만을 예방, 개선 또는 치료하기에 충분한 양을 말한다. 본 발명의 약학적 조성물에 키레놀 또는 이를 함유하는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물이 0.01 내지 99.99% 포함될 수 있으며, 잔량은 약학적으로 허용 가능한 담체가 차지할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 키레놀 또는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 또는 이의 분획물의 유효량은 조성물이 제품화되는 형태 등에 따라 달라질 것이다.

본 발명의 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 예를 들어, 키레놀 또는 이를 함유하는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.001 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.01 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 상기 키레놀 또는 이를 함유하는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 키레놀 또는 이를 함유하는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물을 운동수행능력 증강을 위한 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 또는 생물학적 반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물은 또한 키레놀 또는, 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 외용제의 제형으로 제공할 수 있다.

본 발명의 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물이 피부 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.

본 발명의 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food), 식품 첨가제(food additives) 및 사료 등의 모든 형태를 포함하며, 인간 또는 가축을 비롯한 동물을 취식대상으로 한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 상기 키레놀 또는 이를 함유하는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 영양보조제로는 이에 한정되지 않지만 캡슐, 타블렛, 환 등에 상기 키레놀 또는 이를 함유하는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 건강기능식품으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 상기 키레놀 또는 이를 함유하는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용(건강음료)할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 상기 키레놀 또는 이를 함유하는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 키레놀 또는 이를 함유하는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물과 운동수행능력 증강 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물이 건강음료 조성물로 이용되는 경우, 상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ∼ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ∼ 0.03 g 이다.

키레놀 또는 이를 함유하는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물은 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있는데, 그 양은 비만 예방, 개선 효과를 얻기에 유효한 양으로 특별히 한정되는 것은 아니나, 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%인 것이 바람직하다. 본 발명의 식품 조성물은 키레놀 또는 이를 함유하는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물과 함께 비만에 효과가 있는 것으로 알려진 다른 활성 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다. 하기 실시예의 실험 결과는 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 통계적 분석은 t 검정 또는 ANOVA 분석법(Scheff test)을 사용하여 p value가 0.05 이하이면 유의성이 있는 것으로 평가하였다.

참조예 1: 키레놀(kirenol)물질 정보

명칭: Kirenol; Kirel; (1R,3S,4aS,4bS,7S,10aS)-1,2,3,4,4a,4b,5,6,7,9,10,10a-Dodecahydro-3-hydroxy-7-[(R)-1,2-dihydroxyethyl]-1,4a,7-trimethylphenanthrene-1-methanol

CAS No.: 52659-56-0

[ 실시예 1] 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물의 제조

[실시예 1-1] 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물의 제조

건조시킨 시게스벡키아 오리엔탈리스를 믹서로 분쇄한 다음, 분쇄한 시게스벡키아 오리엔탈리스 시료 100 g을 에탄올 1 L에 넣고 48시간 상온에서 추출하였다. 추출된 시료는 와트만 (Whatman) 2번 여과지로 여과하고, 여과된 추출액을 진공 회전 농축기로 농축하여 용매성분을 제거한 후, 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물을 얻었다.

[실시예 1-2] 시게스벡키아 오리엔탈리스 메탄올 추출물의 제조

건조시킨 시게스벡키아 오리엔탈리스의 잎과 줄기를 믹서로 분쇄한 다음, 분쇄한 시게스벡키아 오리엔탈리스 시료 100 g을 메탄올 1 L에 넣고 50 ℃에서 60분간 교반하면서 추출하였다. 추출된 시료는 와트만 2번 여과지로 여과하고, 여과된 추출액을 진공 회전 농축기로 농축하여 용매성분을 제거함으로써 시게스벡키아 오리엔탈리스 메탄올 추출물을 얻었다.

[실시예 1-3] 시게스벡키아 오리엔탈리스 열수 추출물의 제조

건조시킨 시게스벡키아 오리엔탈리스의 잎과 줄기를 믹서로 분쇄한 다음, 분쇄한 시게스벡키아 오리엔탈리스 시료 100 g을 물 1 L에 넣고 100 ℃에서 4시간 교반하면서 추출하였다. 추출된 시료는 와트만 2번 여과지로 여과하고, 여과된 추출액을 진공 회전 농축기로 농축하여 용매성분을 제거함으로써 시게스벡키아 오리엔탈리스 열수 추출물을 얻었다.

[실시예 1-4] 시게스벡키아 오리엔탈리스 에틸아세테이트 추출물의 제조

건조시킨 시게스벡키아 오리엔탈리스의 잎과 줄기를 믹서로 분쇄한 다음, 분쇄한 시게스벡키아 오리엔탈리스 시료 100 g을 에틸아세테이트 1 L에 넣고 50 ℃에서 60분간 교반하면서 추출하였다. 추출된 시료는 와트만 2번 여과지로 여과하고, 여과된 추출액을 진공 회전 농축기로 농축하여 용매성분을 제거함으로써 시게스벡키아 오리엔탈리스 에틸아세테이트 추출물을 얻었다.

[실시예 1-5] 시게스벡키아 오리엔탈리스 헥산 추출물의 제조

건조시킨 시게스벡키아 오리엔탈리스의 잎과 줄기를 믹서로 분쇄한 다음, 분쇄한 시게스벡키아 오리엔탈리스 시료 100 g을 헥산 1 L에 넣고 50 ℃에서 60분간 교반하면서 추출하였다. 추출된 시료는 와트만 2번 여과지로 여과하고, 여과된 추출액을 진공 회전 농축기로 농축하여 용매성분을 제거함으로써 시게스벡키아 오리엔탈리스 헥산 추출물을 얻었다.

[실시예 1-6] 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물의 제조

건조시킨 시게스벡키아 오리엔탈리스의 잎과 줄기를 믹서로 분쇄한 다음, 분쇄한 시게스벡키아 오리엔탈리스 시료 1 g과 18% 에탄올 76 mL을 폴리에틸렌(polyethylene) 팩에 넣고 밀봉한 후 초고압 추출장치(Frescal MFP-7000; Mitsubishi Heavy Industries, Tokyo, Japan)를 이용하여 추출하였다. 초고압 추출 조건은 추출압력이 320 MPa, 추출시간은 5 min 이였다. 추출된 시료는 와트만 2번 여과지로 여과하고, 여과된 추출액을 진공 회전 농축기로 농축하여 용매성분을 제거함으로써 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물을 얻었다.

[ 실시예 2] 키레놀의 분리 및 구조결정

[실시예 2-1] 키레놀의 분리

상기 실시예 1-1에서 얻은 농축된 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물을 실리카겔이 충진된 컬럼에 적재하고 에틸아세테이트, 메탄올을 10:0.5(v/v)의 비율로 혼합한 용매시스템을 이용하여 분취하였다. 상기 분취 순서에 따라서 총 7개의 분획으로 나누어 각각의 분획을 농축 건조하였다. 7개의 분획 중 6번 분획(분획 6)을 RP-18 역상컬럼 크로마토그래피(Lichroprep RP-18 25~40um, Merck&Co., Whitehouse Station, NJ, USA)를 이용하여 전개 용매 10% 에틸아세테이트로 분취하였다. 상기 분취 순서에 따라서 총 2개의 분획으로 나누어 각각의 분획을 농축 건조하였다. 상기 2개의 분획 중 2번 분획(분획 6-2)을 농축 건조하고 다시 Rp-18 역상컬럼 크로마토그래피 이용하여 전개 용매 20% 에틸아세테이트로 분취하였다. 상기 분취 순서에 따라서 총 3개의 분획으로 나누어 각각의 분획을 농축 건조하였다. 최종적으로 3개의 분획 중 2번 분획(분획 6-2-2)을 농축 건조시켜 순수한 단일 활성 물질을 분리하였다.

[실시예 2-2] 키레놀의 구조결정

상기 실시예 2-1에서 분리된 단일 활성물질의 구조결정을 위하여 ¹H-NMR 스펙트럼과 ¹³C-NMR 스펙트럼을 각각 500 MHz 와 125 MHz(용매: MeOH)에서 측정하였다. 수득된 ¹H-NMR 스펙트럼과 ¹³C-NMR 스펙트럼의 결과를 토대로 ¹H¹H의 상관관계와 ¹H¹³C의 상관관계를 측정하기 위하여 ¹H¹H COSY 스펙트럼과 ¹H¹³C HSQC 스펙트럼을 측정하고, 탄소공명을 통해 나오는 파장으로 각각의 탄소 신호를 구별하여 그 결과를 측정하였다.

또한 상기 분리된 단일물질의 질량분석을 위해 측정한 FAB-MS를 측정하였다. 본 화합물은 FAB-MS에서 [M]가 m/z 338.48에서 관측되어 분자량이 338.48로 판명되었고, 분자식 C₂₀H₃₄O₄였다.

이상의 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, 및 FAB-MS에 대한 결과와 기존에 발표된 연구보고(Wang J.P. et al., Pharmacogn. Mag., 8:149-155, 2012)를 비교 분석하여 동정한 결과, 상기에서 분리된 단일물질은 하기 화학식 2로 표시되는 키레놀(kirenol) 화합물로 확인되었다.

[화학식 2]

[ 실시예 3] 시게스벡키아 오리엔탈리스 분획물 제조

상기 실시예 1-1에서 얻은 농축된 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물을 에탄올로 완전히 용해시킨 후 실리카겔을 넣고 농축 건조하여 실리카겔 표면에 코팅하였다. 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물이 코팅된 실리카겔에 100% 헥산을 이용하여 1번 분획물을 용출하여 농축 건조하였다. 1번 분획물을 얻은 후 남아있는 추출물에 헥산, 에틸아세테이트를 9:1(v/v)의 비율로 혼합한 용매를 이용하여 2번 분획물을 용출하여 농축 건조하였다. 2번 분획물을 얻은 후 남아있는 추출물에 헥산, 에틸아세테이트를 7:3(v/v)의 비율로 혼합한 용매를 이용하여 3번 분획물을 용출하여 농축 건조하였다. 3번 분획물을 얻은 후 남아있는 추출물에 100% 에틸아세테이트를 이용하여 4번 분획물을 용출하여 농축 건조하였다. 마지막으로 4번 분획물을 얻은 후 남아있는 추출물에 100% 에탄올을 이용하여 5번 분획물을 용출하여 농축 건조하였다. 총 5개의 분획물 각각을 박층 크로마토그래피 (TLC)를 이용하여 측정한 결과 도1에 나타낸 바와 같이 4번 분획물에 키레놀이 농축된 것을 알 수 있었다.

[ 실시예 4] 키레놀의 항비만 효과

[실시예 4-1] 키레놀의 지방 생성 억제 활성 효과

3T3-L1 지방전구세포(American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA)를 10%의 송아지 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지에서 배양한 후, 24-웰 평판배양기(24-well microtiter plate)에 1,00,000 세포/ 웰(well)이 되도록 넣었다. 90%까지 자란 후 2일 더 방치한 뒤 지방전구세포의 밀도가 100% 가량 되었을 때, dexamethasone, IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine), 인슐린이 든 배양액에 녹인 키레놀을 각각 10, 20, 그리고 40 μM농도로 지방전구세포에 처리하여 지방세포분화를 유도하였다. 이어 매 2일마다 세포 배양액을 10% 우태아 혈청과 0.1% 인슐린이 든 배양액에 상기와 마찬가지로 키레놀을 각각 10, 20, 그리고 40 μM농도로 처리하여 키레놀을 처리하지 않은 대조군과 비교하였다. 분화유도 10일째 분화가 완료된 지방세포에 오일 레드 오(Oil Red O)염색액(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 처리하여 염색하였으며, 염색된 지방방울(lipid droplets)을 100% 아이소프로판올(isopropanol)로 추출한 후 분광광도계를 이용하여 500nm에서 흡광도를 측정하였다. 지방축적률은 지방세포 분화 유도 동안 시료를 처리하지 않은 군과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 키레놀이 3T3-L1 지방세포에서 지방생성을 효과적으로 억제시키는 것을 알 수 있었다.

[실시예 4-2] 키레놀의 지방세포 분화에 주요 전사인자 감소 효과

키레놀을 이용하여 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포 분화에 주요 전사인자의 mRNA 발현량을 알아보기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 분화한 3T3-L1 지방세포로부터 TRIzol시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 수확하여 역전사 시킨 후, RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction) 분석을 다음과 같이 수행하였다. 먼저 cDNA 합성을 위해 상기 RNA를 역전사효소로 역전사 시켰다. 다음의 프라이머로 RT-PCR을 수행하였다:

β-액틴:

서열번호 1: 5‘-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’(Forward primer)

서열번호 2: 5‘-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3’(Reverse primer)

PPARr:

서열번호 3: 5‘-CCTGTTGACCCAGAGCATGG-3’ (Forward primer)

서열번호 4: 5‘-CGAGTGGTCTTCCATCACGC-3’ (Reverse primer)

C/EBPα:

서열번호 5: 5‘-CTGCCCCTCAGTCCCTGTC-3’ (Forward primer)

서열번호 6: 5‘-GTTCCTTCAGCAACAGCGG-3’ (Reverse primer)

SREBP-1c:

서열번호 7: 5‘-GCGCTACCGGTCTTCTATCA-3’ (Forward primer)

서열번호 8: 5‘-TGCTGCCAAAAGACAAGGG-3’ (Reverse primer)

또한, RT-PCR에 의하여 측정된 mRNA 발현량을 토대로, 대조군 대비 키레놀 처리에 의한 상대적인 mRNA 발현량을 계산하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 키레놀 처리에 의해 지방세포 분화의 주요 전사인자(PPARγ, C/EBPα, 및 SREBP-1c)의 mRNA 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이는 키레놀 처리에 의해 3T3-L1 지방세포 내에서 지방세포 분화에 주요 전사인자를 감소시킴으로써 지방생성의 신호전달이 억제됨을 의미한다.

[실시예 4-3] 키레놀의 지방생성 관련 유전자 감소 효과

키레놀을 이용하여 3T3-L1 지방전구세포에서 지방생성 관련 유전자의 mRNA 발현량을 알아보기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 상기 실시예 4-1와 동일한 방법으로 분화한 3T3-L1 지방세포로부터 TRIzol시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 수확하여 역전사 시킨 후, RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction) 분석을 다음과 같이 수행하였다. 먼저 cDNA 합성을 위해 상기 RNA를 역전사효소로 역전사시켰다. 다음의 프라이머로 RT-PCR을 수행하였다:

β-액틴:

서열번호 1: 5‘-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’ (Forward primer)

서열번호 2: 5‘-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3’(Reverse primer)

FAS:

서열번호 9: 5‘-GGTTCGGAATGCTATCCAGG-3’(Forward primer)

서열번호 10: 5‘-CTGCGGAAACTTCAGGAAAT-3’(Reverse primer)

ACC:

서열번호 11: 5‘-TGACCGTGGGCACAAAGTT-3’ (Forword primer)

서열번호 12: 5‘-AGGAGGAACCGCATTTATCGA-3’ (Reverse primer)

또한, RT-PCR에 의하여 측정된 mRNA 발현량을 토대로, 대조군 대비 키레놀 처리에 의한 상대적인 mRNA 발현량을 계산하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 키레놀 처리에 의해 지방생성 관련 유전자(FAS 및 ACC)의 mRNA 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 키레놀 처리에 의해 3T3-L1 지방세포 내에서 지방생성 관련 유전자를 감소시킴으로써 지방생성의 신호전달이 억제됨을 확인하였다.

[실시예 4-4] 키레놀의 지방세포 분화 시 발현되는 염증성 사이토카인 감소 효과

키레놀을 이용하여 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포 분화 시 발현되는 염증성 사이토카인의 mRNA 발현량을 알아보기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 분화한 3T3-L1 지방세포로부터 TRIzol시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 수확하여 역전사 시킨 후, RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction) 분석을 다음과 같이 수행하였다. 먼저 cDNA 합성을 위해 상기 RNA를 역전사효소로 역전사 시켰다. RT-PCR은 다음의 특정 프라이머로 수행하였다:

β-액틴:

서열번호 1: 5‘-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’(Forward primer)

서열번호 2: 5‘-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3’(Reverse primer)

아디포넥틴:

서열번호 13: 5‘-TGTGCAGGTTGGATGGCAGG-3’(Forward primer)

서열번호 14: 5‘-CTCCAGCCCCACACTGAACG-3’(Reverse primer)

렙틴:

서열번호 15: 5‘-CCAAAACCCTCATCAAGACC-3’ (Forword primer)

서열번호 16: 5‘-CTCAAAGCCACCACCTCTGT-3’ (Reverse primer)

또한, RT-PCR에 의하여 측정된 mRNA 발현량을 토대로, 대조군 대비 키레놀 처리에 의한 상대적인 mRNA 발현량을 계산하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 키레놀 처리에 의해 지방세포 분화 시 발현되는 염증성 사이토카인(아디포넥틴 및 렙틴)의 mRNA 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 키레놀 처리에 의해 3T3-L1 지방세포 내에서 지방세포 분화 시 발현되는 염증성 사이토카인를 감소시킴으로써 지방생성의 신호전달이 억제됨을 확인하였다.

[실시예 4-5] 키레놀의 Wnt/β-카테닌 신호전달계 활성 촉진 효과

키레놀을 이용하여 3T3-L1 지방전구세포에서 Wnt/β-카테닌 신호전달계의 주요 유전자의 mRNA 발현량을 알아보기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 상기 실시예 4-1와 동일한 방법으로 분화한 3T3-L1 지방세포로부터 TRIzol시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 수확하여 역전사 시킨 후, RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction) 분석을 다음과 같이 수행하였다. 먼저 cDNA 합성을 위해 상기 RNA를 역전사효소로 역전사 시켰다. RT-PCR은 다음의 특정 프라이머로 수행하였다:

β-액틴:

서열번호 1: 5‘-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’(Forward primer)

서열번호 2: 5‘-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3’(Reverse primer)

LRP5:

서열번호 17: 5‘ -AAGGGTGCTGTGTACTGGAC-3’ (Forward primer)

서열번호 18: 5‘ -AGAAGAGAACCTTACGGGACG-3’ (Reverse primer)

LRP6:

서열번호 19: 5‘-ACCTCAATGCGATTTGTTCC-3’ (Forward primer)

서열번호 20: 5‘-GGTGTCAAAGAAGCCTCTGC-3’ (Reverse primer)

β-카테닌:

서열번호 21: 5‘ -GCCAAGTGGGTGGTATAGAG-3’ (Forward primer)

서열번호 22: 5‘ -CTGGGTATCCTGATGTGC-3’ (Reverse primer)

DVL2:

서열번호 23: 5'-GCTTCCACATGGCCATGGGC-3' (Forward primer)

서열번호 24:5'-TGGCACTGCTGGTGAGAGTCACAG-3'(Reverse primer)

CCND1:

서열번호 25: 5‘-AAAATCGTGGCCACCTGGAT-3’ (Forward primer)

서열번호 26: 5‘-CATCCGCCTCTGGCATTTTG-3’ (Reverse primer)

또한, RT-PCR에 의하여 측정된 mRNA 발현량을 토대로, 대조군 대비 키레놀 처리에 의한 상대적인 mRNA 발현량을 계산하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 키레놀 처리에 의해 Wnt/β-카테닌 신호전달계의 주요 유전자인 LRP6, DVL2, β-카테닌, 및 CCND1의 mRNA 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 키레놀 처리에 의해 3T3-L1 지방세포 내에서 Wnt/β-카테닌 신호전달계 활성이 촉진됨을 확인하였다.

[ 실시예 5] 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물의 항비만 효과

[실시예 5-1] 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물, 메탄올 추출물, 열수 추출물, 에틸아세테이트 추출물, 및 헥산 추출물의 지방세포 분화에 주요 전사인자의 mRNA 감소 효과

상기 실시예 1-1내지 1-5에서 제조한 시게스벡키아 오리엔탈리스의 에탄올 추출물, 메탄올 추출물, 열수 추출물, 에틸아세테이트 추출물, 및 헥산 추출물을 각각 10 ppm 농도로 처리하여 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포 분화에 주요 전사인자의 mRNA 발현량을 알아보기 위해 상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 분화 후 RT-PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 시게스벡키아 오리엔탈리스의 에탄올 추출물, 메탄올 추출물, 열수 추출물, 에틸아세테이트 추출물, 및 헥산 추출물 처리에 의해 지방생성과정의 핵심 전사인자 PPARγ 및 C/EBPα의 mRNA 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 처리에 의해 3T3-L1 지방세포 내에서 지방세포 분화에 주요 전사인자를 감소시킴으로써 지방생성의 신호전달이 억제됨을 확인하였다.

[실시예 5-2] 시게스벡키아 오리엔탈리스 분획물의 지방세포 분화에 주요 전사인자 감소 효과

상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 실시예 3에서 제조한 시게스벡키아 오리엔탈리스의 1번 분획물, 2번 분획물, 3번 분획물, 4번 분획물, 5번 분획물을 각각 10 ppm 농도로 각각 처리하였다. 그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 시게스벡키아 오리엔탈리스 5개의 분획물중 가장 많은 키레놀이 포함되어 있었던 4번 분획물에서 지방세포 분화에 주요 전사인자 PPARγ 및 C/EBPα를 가장 많이 감소시켰으며 그 다음으로 5번 분획물이 지방세포 분화에 주요 전사인자를 감소시켰다. 1번 분획물, 2번 분획물, 3번 분획물은 지방세포 분화에 주요 전사인자 감소효과를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물에 함유되어 있는 활성물질 중 키레놀이 지방생성을 억제하는 효능이 가장 우수함을 알 수 있었다.

[실시예 5-3] 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물의 지방생성 억제활성 측정

상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 실시예 1-6의 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물 10, 20, 그리고 40 ppm 농도로 각각 처리하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물 처리에 의해 지방세포 내에서 지방생성을 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.

[실시예 5-4] 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물의 지방세포 분화에 주요 전사인자의 mRNA 발현 감소 효과

상기 실시예 4-2과 동일한 방법으로 실시예 1-6의 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물 10, 20, 그리고 40 ppm 농도로 각각 처리하였다. 그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물 처리에 의해 지방세포 내에서 지방세포 분화에 주요 전사인자 PPARγ, C/EBPα, 및 SREBP-1c를 감소시킴으로써 지방생성의 신호전달이 억제됨을 확인하였다.

[실시예 5-5] 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물의 지방생성 관련 유전자의 mRNA 발현 감소 효과

상기 실시예 4-3과 동일한 방법으로 실시예 1-6의 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물 10, 20, 그리고 40 ppm 농도로 각각 처리하였다. 그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물 처리에 의해 지방세포 내에서 지방생성 관련 유전자 FAS 및 ACC를 감소시킴으로써 지방생성의 신호전달이 억제됨을 확인하였다.

[실시예 5-6] 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물의 지방세포 분화 시 발현되는 염증성 사이토카인의 mRNA 발현 감소 효과

상기 실시예 4-4와 동일한 방법으로 실시예 1-6의 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물 10, 20, 그리고 40 ppm 농도로 각각 처리하였다. 그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물 처리에 의해 지방세포 내에서 지방세포 분화 시 발현되는 염증성 사이토카인 아디포넥틴 및 렙틴을 감소시킴으로써 지방생성의 신호전달이 억제됨을 확인하였다.

[실시예 5-7] Wnt/β-카테닌 신호전달계 활성 촉진 효과

상기 실시예 4-5와 동일한 방법으로 실시예 1-6의 시게스벡키아 오리엔탈리스 초고압 추출물 10, 20, 그리고 40 ppm 농도로 각각 처리하였다. 그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이 Wnt/β-카테닌 신호전달계의 주요 유전자인 LRP5, DVL2, β-카테닌, 및 CCND1의 mRNA 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 처리에 의해 3T3-L1 지방세포 내에서 Wnt/β-카테닌 신호전달계 활성이 촉진됨을 확인하였다.

[ 실시예 6] 고지방식이로 유도된 비만 마우스에서 키레놀 투여에 의한 체중감량 효과

4주령된 C57BL/6마우스를 1주일간 적응시키고 비만을 유도하기 위해 고지방 식이(Research Diets D12492, 60% kcal from fat, New Brunswick, NJ, USA)를 6주간 공급하여 비만을 유도시킨 다음, 대조군과 실험군으로 각각 5마리씩 총 2군으로 임의적으로 나누어 실험에 이용하였다. 실험군으로는 상기 실시예 2-2에서 제조된 키레놀을 0.25% 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymetylcellulose)에 현탁하여 20 mg/kg체중의 투여농도로 1일 1회씩 6주간 동안 일정한 시간에 경구투여 하였고, 대조군은 동일량의 0.25% 카르복시메틸셀룰로오스만을 경구투여 하였다. 시료를 투여한 마우스의 식이량과 개체의 무게를 1주일 마다 측정하였다. 시료 투여후 6주 동안 실험군과 대조군의 식이량을 측정한 결과 실험군과 대조군 간에 차이가 없었다.

6주 후 실험군과 대조군간의 체중 증가율을 측정할 결과, 도 14에 나타낸 것과 같이 키레놀 실험군의 체중 증가율이 대조군에 비해 모두 유의적으로 낮게 나타났다(*p<0.05). 이러한 결과는 키레놀이 체중감량에 효과가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 7] 고지방식이로 유도된 비만 마우스에서 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 투여에 의한 체중감량 효과

4주령된 C57BL/6 수컷 마우스를 1주일간 적응시키고 정상식이(Research Diets D12450B, 10% kcal from fat)와 비만을 유도하기 위해 고지방식이(Research Diets D12492, 60% kcal from fat)를 6주간 공급한 다음, 각각 5마리씩 총 4군으로 임의적으로 나누어 실험에 이용하였다. 실험군으로는 정상식이 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 투여군과 고지방식이 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 투여군으로 상기 실시예 1-1에서 제조한 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물을 0.25% 카르복시메틸셀룰로오스에 현탁하여 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 250 mg/day/kg체중의 투여농도로 1일 1회씩 6주간 동안 일정한 시간에 경구투여 하였다. 대조군으로는 정상식이군과 고지방식이군으로 실험군이 섭취하는 동일한 양의 0.25% 카르복시메틸셀룰로오스만을 경구투여 하였다. 시료를 투여한 마우스의 식이량과 개체의 무게를 1주일 마다 측정하였다.

시료 투여 후 6주 동안 실험군과 대조군의 식이량를 측정한 결과 도 15에서 보는 바와 같이 실험군과 대조군 간에 식이량은 통계학적으로 유의한 차이가 없었다. 또한 시료 투여 후 6주 동안 실험군과 대조군의 체중변화를 측정한 결과 도 16에서 나타난 바와 같이 고지방식이에 의해 정상식이 대조군과 고지방식이 대조군간의 유의한 차이를 보였다 (##p<0.01). 또한, 정상식이 대조군과 정상식이 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 실험군간의 통계학적으로 유의한 차이가 없었으나, 고지방식이 대조군과 고지방식이 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 실험군간의 통계학적으로 유의한 차이를 보였다 (**p<0.01). 고지방식이 대조군과 비교하여 고지방식이 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 실험군의 체중이 12.1% 감소하였다. 이러한 결과는 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물이 체중감량 효과가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 8] 고지방식이로 유도된 비만 마우스에서 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 투여에 의한 혈중 중성지방, 총콜레스테롤, 고밀도 콜레스테롤 및 저밀도 콜레스테롤 농도 변화

상기 실시예 7의 정상식이 마우스와 고지방식이 마우스의 심장에서 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액은 4,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하고 분리된 혈청은 -70℃에 보관하였다. 혈청의 중성지방, 총 콜레스테롤, 저밀도 콜레스테롤, 고밀도 콜레스테롤 농도는 자동혈액분석기(automated biochemical analyzer; Mindray, Nanshan, Shenzhen, China)를 이용하여 분석하였다. 그 결과 도 17에서 나타난 바와 같이 혈청의 중성지방, 총 콜레스테롤, 저밀도 콜레스테롤 함량은 고지방식이에 의해 정상식이 대조군과 고지방식이 대조군간의 유의한 차이를 보였다 (##p<0.01). 또한, 정상식이 대조군과 정상식이 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 실험군간의 통계학적으로 유의한 차이는 없었으나, 고지방식이 대조군과 고지방식이 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 실험군간의 통계학적으로 유의한 차이를 보였다 (*p<0.05, **p<0.01). 고지방식이 대조군과 비교하여 고지방식이 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 실험군의 혈청 중성지방, 총 콜레스테롤, 저밀도 콜레스테롤 함량은 각각 45.1%, 27.6%, 33.8% 감소하였다. 혈청의 고밀도 콜레스테롤 함량은 대조군과 실험군간의 통계학적으로 유의한 차이는 없었다. 따라서 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물은 혈중 지질의 개선효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 9] 동물모델의 지방조직에서 지방세포분화 관련 전사인자 감소 효과

상기 실시예 7의 정상식이 마우스와 고지방식이 마우스로부터 부고환 지방(epididymal fat)을 적출한 후, 웨스턴 블랏(western blot)을 통해 PPARγ, C/EBPα 및 SREBP-1c의 단백질 발현을 확인하였으며, α-튜불린으로 단백질 로딩량이 일정함을 나타내었다. 또한, 웨스턴 블랏에 의하여 측정된 단백질 발현량을 토대로, 대조군 대비 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 처리에 의한 상대적인 단백질 발현량을 계산하였다.

그 결과 도 18에서와 같이 지방분화과정의 핵심 전사인자의 단백질 발현량이 정상식이 대조군과 비교하여 고지방식이 대조군에서 유의하게 증가하였다 (##p<0.01). 또한, 고지방식이 대조군과 비교하여 고지방식이 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 실험군에서 지방세포 분화과정의 핵심 전사인자인 PPARγ, C/EBPα, SREBP-1c의 단백질 발현량이 통계학적으로 유의하게 감소하였다 (**p<0.01). 따라서 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물이 지방세포 분화과정의 핵심 전사인자를 감소시켜 지방조직 내에서 지방생성의 신호전달이 억제됨을 확인하였다.

[ 실시예 10] 동물모델의 지방조직에서 Wnt /β- 카테닌 신호전달계 활성 촉진효과

상기 실시예 7의 정상식이 마우스와 고지방식이 마우스로부터 부고환 지방(epididymal fat)을 적출한 후, 웨스턴 블랏(western blot)을 통해 β-카테닌 및 p-Gsk3β의 단백질 발현을 확인하였으며, α-튜불린 으로 단백질 로딩량이 일정함을 나타내었다. 또한, 웨스턴 블랏에 의하여 측정된 단백질 발현량을 토대로, 대조군 대비 시게스벡키아 오리엔탈리스 에탄올 추출물 처리에 의한 상대적인 단백질 발현량을 계산하였다.

그 결과 도 19에서와 같이 Wnt/β-카테닌 신호전달계의 주요 유전자의 단백질 발현량이 정상식이 대조군과 비교하여 고지방식이 대조군에서 유의하게 감소하였다 (##p<0.01). 또한, 고지방식이 대조군과 비교하여 고지방식이 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 실험군에서 Wnt/β-카테닌 신호전달계의 주요 유전자인 β-카테닌 및 p-Gsk3β의 단백질 발현량이 통계학적으로 유의하게 감소하였다 (**p<0.01). 따라서 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물이 지방조직 내에서 Wnt/β-카테닌 신호전달계 활성이 촉진됨을 확인하였다.

이하, 본 발명에 따른 키레놀 또는 이를 함유하는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방, 치료 또는 개선용 식품류 및 의약품의 제조예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다. 상기 비만 예방, 치료 또는 개선 효과가 우수한 키레놀 또는 이를 함유하는 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물을 가지고 하기와 같은 조성성분 및 조성비에 따라 제조예 1 내지 2의 비만 예방, 개선 또는 치료용 식품 및 의약품 조성물을 통상적인 방법에 따라서 제조하였다.

[제조예 1] 식품의 제조

[제조예 1-1] 건강식품의 제조

상기 실시예 1 의 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물, 실시예 4의 시게스벡키아 오리엔탈리스 분획물 또는 키레놀 1000 mg, 비타민 A 아세테이트 70 ug, 비타민 E 1.0 mg, 비타민 B1 0.13 mg, 비타민 B2 0.15 mg, 비타민 B6 0.5 mg, 비타민 B12 0.2 ug, 비타민 C 10 mg, 비오틴 10 ug, 니코틴산아미드 1.7 mg, 엽산 50 ug, 판토텐산 칼슘 0.5 mg, 황산제1철 1.75 mg, 산화아연 0.82 mg, 탄산마그네슘 25.3 mg, 제1인산칼륨 15 mg, 제2인산칼슘 55 mg, 구연산칼륨 90 mg, 탄산칼슘 100 mg, 염화마그네슘 24.8 mg를 혼합하여 제조할 수 있으며, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

[제조예 1-2] 건강음료의 제조

상기 실시예 1 의 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물, 실시예 4의 시게스벡키아 오리엔탈리스 분획물 또는 키레놀 1000 mg, 구연산 1000 mg, 올리고당 100 g, 매실농축액 2 g, 타우린 1 g에 정제수를 가하여 전체 900 ml 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강음료 조성물 제조에 사용할 수 있다.

[제조예 1-3] 츄잉껌

껌 베이스 20 중량%, 설탕 76.9 중량%, 향료 1 중량% 및 물 2 중량% 와 상기 실시예 1 의 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물, 실시예 4의 시게스벡키아 오리엔탈리스 분획물 또는 키레놀 0.1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 츄잉껌을 제조하였다.

[제조예 1-4] 캔디

설탕 60 중량%, 물엿 39.8 중량% 및 향료 0.1 중량%와 상기 실시예 1의 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물, 실시예 4의 시게스벡키아 오리엔탈리스 분획물 또는 키레놀 0.1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 캔디를 제조하였다.

[제조예 1-5] 비스켓

박력 1급 25.59 중량%, 중력 1급 22.22 중량%, 정백당 4.80 중량%, 식염 0.73 중량%, 포도당 0.78 중량%, 팜쇼트닝 11.78 중량%, 암모늄 1.54 중량%, 중조 0.17 중량%, 중아황산나트륨 0.16 중량%, 쌀가루 1.45 중량%, 비타민 B 0.0001 중량%, 밀크향 0.04 중량%, 물 20.6998 중량%, 전지분유 1.16 중량%, 대용분유 0.29 중량%, 제1인산칼슘 0.03 중량%, 살포염 0.29 중량% 및 분무유 7.27 중량%와 상기 실시예 1 의 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물, 실시예 4의 시게스벡키아 오리엔탈리스 분획물 또는 키레놀 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 비스켓을 제조하였다.

[제조예 2 - 의약품]

[제조예 2-1] 산제

상기 실시예 1 의 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물, 실시예 4의 시게스벡키아 오리엔탈리스 분획물 또는 키레놀 50 mg, 결정셀룰로오즈 2 g을 혼합한 후 통상의 산제 제조방법에 따라서 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

[제조예 2-2] 정제

상기 실시예 1 의 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물, 실시예 4의 시게스벡키아 오리엔탈리스 분획물 또는 키레놀 50 mg, 결정셀룰로오즈 400 mg, 스테아린산 마그네슘 5 mg을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

[제조예 2-3] 캡슐제

상기 실시예 1 의 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물, 실시예 4의 시게스벡키아 오리엔탈리스 분획물 또는 키레놀 30 mg, 유청단백질 100 mg, 결정셀룰로오즈 400 mg, 스테아린산 마그네슘 6 mg을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

[제조예 2-4] 주사제

통상의 주사제 제조방법에 따라 활성성분을 주사용 증류수에 용해하고 pH를 약 7.5로 조절한 다음 상기 실시예 1의 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물, 실시예 4의 시게스벡키아 오리엔탈리스 분획물 또는 키레놀 100 mg, 주사용 증류수, pH 조절제를 혼합하여 2 ml 용량의 앰플에 충진하고 멸균시켜서 주사제를 제조하였다.

<110> University-Industry Foundation, Yonsei University <120> Anti-obesitic composition comprising kirenol or extract of Sigesbeckia orientalis L. <130> P14U16C0905 <150> 2013-0084953 <151> 2013-07-18 <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 1 agccatgtac gtagccatcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse primer <400> 2 ctctcagctg tggtggtgaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARr forward primer <400> 3 cctgttgacc cagagcatgg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARr reverse primer <400> 4 cgagtggtct tccatcacgc 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEBP alpha forward primer <400> 5 ctgcccctca gtccctgtc 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEBP alpha reverse primer <400> 6 gttccttcag caacagcgg 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBP 1c forward primer <400> 7 gcgctaccgg tcttctatca 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBP 1c reverse primer <400> 8 tgctgccaaa agacaaggg 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS forward primer <400> 9 ggttcggaat gctatccagg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS reverse primer <400> 10 ctgcggaaac ttcaggaaat 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC forward primer <400> 11 tgaccgtggg cacaaagtt 19 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC reverse primer <400> 12 aggaggaacc gcatttatcg a 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adiponectin forward primer <400> 13 tgtgcaggtt ggatggcagg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adiponectin reverse primer <400> 14 ctccagcccc acactgaacg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> leptin forward primer <400> 15 ccaaaaccct catcaagacc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> leptin reverse primer <400> 16 ctcaaagcca ccacctctgt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRP5 forward primer <400> 17 aagggtgctg tgtactggac 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRP5 reverse primer <400> 18 agaagagaac cttacgggac g 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRP6 forward primer <400> 19 acctcaatgc gatttgttcc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRP6 reverse primer <400> 20 ggtgtcaaag aagcctctgc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta catenin forward primer <400> 21 gccaagtggg tggtatagag 20 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta catenin reverse primer <400> 22 ctgggtatcc tgatgtgc 18 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DVL2 forward primer <400> 23 gcttccacat ggccatgggc 20 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DVL2 reverse primer <400> 24 tggcactgct ggtgagagtc acag 24 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCND1 forward primer <400> 25 aaaatcgtgg ccacctggat 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCND1 reverse primer <400> 26 catccgcctc tggcattttg 20

Claims (20)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물:
   [화학식 1]
   

   
2. 제1항에 있어서, 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 키레놀인 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   [화학식 2]
   

   

   
   
3. 제1항에 있어서, 화학식 1로 표시되는 화합물은 시게스벡키아 오리엔탈리스 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 것인 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물:
   [화학식 1]
   

   
5. 제4항에 있어서, 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 키레놀인 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   [화학식 2]
   

   
6. 삭제
7. 제4항에 있어서, 화학식 1로 표시되는 화합물은 시게스벡키아 오리엔탈리스의 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 것인 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
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18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제

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