KR101144197B1

KR101144197B1 - 신생혈관형성 억제제 및 이를 이용한 천연산물 항비만제

Info

Publication number: KR101144197B1
Application number: KR1020090027470A
Authority: KR
Inventors: 김종덕
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2009-03-31
Publication date: 2012-05-11
Also published as: US8753694B2; US9649351B2; US20140234450A1; US20100247691A1; KR20100109073A

Abstract

본 발명은 혈관신생 억제작용을 기반으로 하는 천연산물 항비만제에 관한 것으로, 파고지(Psoraleae Semen) 추출물, 희첨(Siegesbeckiae Herba) 추출물 및 산수유(Corni Fructus) 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제제 및 비만억제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 추출물은 혈관신생 및 비만 억제 효과를 나타내므로 혈관신생 관련 질환 및 비만 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

신생혈관억제, 항비만, 천연산물, 파고지, 희첨, 산수유

Description

신생혈관형성 억제제 및 이를 이용한 천연산물 항비만제{Anti-Angiogenic agents and Anti-Obesity substances Applied with Anti-Angiogenesis from Natural Products}

본 발명은 혈관신생 억제작용을 갖는 천연산물 항비만제에 관한 것이다.

혈관신생(angiogenesis)은 기존의 혈관에서 새로운 혈관이 생성되는 일련의 과정을 일컫는 용어로서, 태아의 발생, 여성의 월경, 상처 치유과정 등의 정상적인 상황; 및 암세포 및 비만세포의 성장과 류머티즘 관절염, 당뇨성 실명증 등의 여러 질병에서도 필수적으로 요구되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이는 정상적인 조건하에서는 거의 일어나지 않는 매우 엄격히 조절되는 현상이다. 즉, 정상적인 상태에서 생체는 혈관신생을 유도하는 인자들과 억제하는 인자들이 평형을 이루고 있으나, 질환이 유발되는 상황에서는 혈관성장을 촉진하는 인자들이 증가하거나, 억제하는 인자가 제대로 작용하지 못하여 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하고 계속 성장함으로써 질환으로 발전한다.

혈관신생의 형성은 현재까지 20가지 이상의 혈관형성 촉진인자에 의해 촉진되는 것으로 알려졌으며, 그 중 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)는 많은 종류의 종양세포 및 비만세포에서 분비되며, 동시에 가장 강력한 혈관형성 촉진인자로 알려져 있다. 또한, VEGF는 혈관투과인자(vascular permeability factor)로도 알려져 있으며, 그의 수용체인 VEGFR-1(Flt-1), VEGFR-2(Flk-1/KDR)와 결합하여 내피세포의 증식을 유발하고 혈관 투과성을 증가시켜 종양 및 비만세포의 성장과 전이에 관여하는 것으로 알려져 있다(Leung DW et al ., Science 246:1306-1309, 1989; Ferrara N & Davis-Smyth T Endocr. Rev . 18:4-25, 1997; Liping Liu & Meydani Mohsen Nutrition Review, 61(11):384-387, 2003; Jaap G et al ., The FASEB Journal 10.1096/fj.03-1101fje. 2004; Hausman GJ & Tichardson RL, J. anim . Sci ., 82:925-934, 2004).

특히, 비만세포 형성에 중요한 역할을 하는 혈관신생은 비만 조직에 산소와 영양분을 신속히 공급함으로써 비만조직의 성장을 직접적으로 도와준다. 따라서, 신생혈관의 형성을 억제함으로써 어떠한 조직에 새로운 혈관의 형성을 억제함으로써 조직이 비대해지는 것을 막을 수 있다. Folkman(PNAS 99:10730-10735, 2002)은 혈관신생 억제제를 마우스에 투여했을 때, 체중의 감소를 보고하였으며, Nishimura 등(DIABETS, 56:1517-1526, 2007)은 신생혈관의 형성이 비만세포의 성장을 직접적으로 촉진하는 것을 보고하였다.

한편, 비만(obesity)은 '건강을 해칠 정도로 체내 지방이 과도하게 축적된 상태'로 정의할 수 있으며, 고혈압, 동맥경화증, 관상동맥질환, 제2형 당뇨병, 지 방간, 고지혈증, 퇴행성관절염, 일부 암질환 등 다양한 만성퇴행성 질환들의 원인으로서 사망률과 이환율을 증가시킬 뿐 아니라 사회적, 정신적으로도 장애를 일으키는 원인으로 밝혀지면서 반드시 치료돼야 하는 '만성질환'이라는 인식이 확립되고 있다. 현재까지의 비만 치료제에는 식욕을 억제시켜 음식을 적게 먹게 하는 펜풀라민(fenfluramine), 시부트라민(sibutramine) 제제, 지방의 대사를 촉진하거나, 지방생성(lipogenesis)을 억제하거나, 대사활성을 증가시키는 에페드린(ephedrine), 오리스태트(orlistat) 등의 제제 등을 들 수 있다. 그러나 이런 약물들은 많은 부작용을(탈모) 일으키고 습관성의 문제도 대두하고 있다. 따라서, 부작용이 없는 천연산물 유래의 물질을 이용한 항비만제의 개발이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 여러 천연산물 추출물 중 신생혈관 억제 효과를 나타내는 발굴하고, 이들이 항비만 효과도 나타내는 것을 확인하여, 본 발명의 천연산물 추출물이 신생혈관 억제제 및 항비만 조성물로 사용될 수 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 천연산물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 천연산물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 천연산물을 유효성분으로 함유하는, 혈관신생 억제 활성을 갖는 비만억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 천연산물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 천연산물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 개선용 건강식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 파고지(Psoraleae Semen) 추출물, 희첨(Siegesbeckiae Herba) 추출물 및 산수유(Corni Fructus) 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 파고지 추출물, 희첨 추출물 및 산수유 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 파고지 추출물 또는 희첨 추출물을 유효성분으로 함유하는, 혈관신생 억제 활성을 갖는 비만억제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 파고지 추출물, 희첨 추출물 및 산수유 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련의 뇌혈관 질환, 심혈관계 질환, 안과 질환 또는 암 질환의 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.

아울러, 본 발명은 파고지 추출물 또는 희첨 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 혈관신생 관련 질환 또는 비만의 증상을 억제하거나 진행을 지연하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 혈관신생 관련 질환 또는 비만의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 조성물을 투여하여 혈관신생 관련 질환 또는 비만의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 파고지(Psoraleae Semen) 추출물, 희첨(Siegesbeckiae Herba) 추출물 및 산수유(Corni Fructus) 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제제를 제공한다.

본 발명의 파고지 추출물, 희첨 추출물 및 산수유 추출물은

1) 건조한 파고지, 희첨 및 산수유를 각각 분말로 만든 후 각각 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 각각 식힌 후 여과하는 단계; 및

3) 단계 2)의 추출물을 각각 증발농축한 후 동결건조하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 파고지, 희첨 및 산수유는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 파고지, 희첨 및 산수유 추출물은 다음과 같이 제조될 수 있다. 파고지, 희첨 및 산수유를 물로 깨끗이 세척한 후, 그늘 및 실온에서 건조하여 분쇄한 후, 추출 용기에 넣고, 추출용매로 적절한 온도에서 일 정 시간 추출한다. 상기 수득한 추출물을 거름종이 등을 이용하여 고형분을 제거하고, 현탁액을 원심분리시키고, 상층액을 감압 여과할 수 있다. 상기 추출 용매는 물, 알코올 또는 이의 혼합물, 바람직하게는 C₁ 내지 C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로부터 선택된 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 에탄올을 사용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출 용매의 양은 파고지, 희첨 및 산수유 건조 중량의 2 내지 10 배로 한다. 상기 추출 방법은 열수추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 추출 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 환류추출 방법으로 1회 내지 5회 추출될 수 있다. 추출시 온도는 50℃ 내지 100℃ 인 것이 바람직하며 50℃ 내지 60℃ 인 것이 더욱 바람직하다. 상기 추출 시간은 1 내지 7시간이며, 바람직하게는 5시간이다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 3)의 증발농축은 증발농축기를 이용하는 것이 바람직하고 회전진공농축기를 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 감압농축은 20 ~ 60℃에서 농축하는 것이 바람직하고 20 ~ 40℃에서 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 동결건조는 동결건조기를 이용하는 것이 바람직하고 진동동결건조기를 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 동결건조는 -50 ~ -100℃에서 건조하는 것이 바람직하고 -70℃에서 건조하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 파고지 추출물, 희첨 추출물 및 산수유의 각각의 추출물은 세포독성을 나타내지 않는 범위(도 1 참조)에서, 농도의존적으로 세포부착 촉진인자의 발현을 파고지>희첨>산수유의 순으로 억제하였다(표 1 내지 표 3 및 도 2 내지 4 참조). 또한, 본 발명의 각각의 추출물은 신호전달 분자인 베타카테닌(β-catenin) 및 VE-캐더린(vascular epithelium-cadherin); 및 하위 그룹인 Akt(Protein kinase B)의 발현을 농도의존적으로 억제하였고(도 6 내지 7 참조), 이로부터 신호 전달을 억제하여 NF-κB까지의 신호전달이 이루어지지 못함으로써(도 9 참조), 양성 대조군인 EGCG보다 현저히 뛰어난 혈관신생형성억제효과를 나타내었다(도 5 참조). 즉, 신호 전달을 억제하여 NF-κB가 활성화되지 못해서 신생혈관의 형성을 억제하는 것을 제안하였다. 이에, 본 발명의 파고지 추출물, 희첨 추출물 및 산수유의 각각의 추출물은 신생혈관 억제제 및 혈관신생 관련 질환의 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 파고지 추출물, 희첨 추출물 및 산수유 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련의 비만, 뇌혈관 질환, 심혈관계 질환, 안과 질환 또는 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

Folkman(PNAS 99:10730-10735, 2002)은 혈관신생 억제제를 마우스에 투여했을 때, 체중의 감소를 보고하였으며, 최근 Nishimura등(DIABETS, 56:1517-1526, 2007)은 레이저 공초점 현미경 기술을 통하여 직접적으로 비만 조직에 있어 신생혈관의 형성과 아지방세포의 분화는 직접적인 관련이 있는 것을 3차원 화상분석법으로 규명하였다. 이전까지는 아지방세포가 다양한 아디포카인(adipokine; VEGF, Leptin, TNF-a 및 IL-6)을 분비하여 신생 혈관 형성을 주도하는 것으로 주장되어 왔으나, Nishimura등은 VEGF가 지방조직에서 신생혈관의 형성을 주도하는 것으로 밝혔다. 따라서 신생혈관의 형성을 억제함으로써 비만세포의 분화 및 거대화를 막을 수 있는 이론이 확실한 것으로 나타났다. 이에, 본 발명의 혈관신생 억제효과를 갖는 추출물은 비만 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

혈관 성숙은 더 이상의 혈관 생성이 억제되는 반면 형성된 혈관은 기능적으로 성숙되는 것을 의미하는 것으로, 뇌혈관 성숙은 뇌혈관 장벽이 발생하며 선택적 투과성을 유도하게 되는 과정으로 요약된다. 뇌혈관 장벽이 발생하는 동안 뇌의 혈관 신생은 멈추고 뇌의 모세혈관은 점차 뇌혈관 장벽으로 분화된다(Plate, K. H., J. Neuropathol . Exp . Neurol., 58, 313-320, 1999; Breier, G. et al ., Development 114, 521-532, 1992). 본 발명의 추출물은 혈관신생을 억제함으로써 뇌혈관의 장벽의 생성을 통한 기능적 성숙을 가능하게 함으로 뇌혈관 장벽 장애와 관련된 질환의 치료 및 예방제로 유용하게 이용될 수 있다. 상기 혈관신생 관련의 뇌혈관 질환으로는 다발성 경화증(multiple sclerosis; Rosenberg GA, Neuroscientist, 8(6):586-595, 2002), 실험적 알레르기성 뇌척수염(experimental allergic encephalomyelitis; Proescholdt MA et al ., J Neuropathol Exp Neurol., 61(10):914-925, 2002), 세균성 수막염(bacterial meningitis; Infect Dis Clin North Am., 13(3): 527-548, v-vi. Review., 1999), 허혈(ischemia; Gashe Y et al ., J Cereb Blood Flow Metab., 21(12):1393-1400, 2001), 뇌 부종(brain edema; Dempsey RJ et al ., Neurosurgery . 47(2):399-404; discussion 404-406, 2000), 알 츠하이머병(Alzheimer's disease; Banks WA et al ., Peptides, 23(12):2223-2226, 2002), 후천성 면역 결핍 증후군 치매 합병증(Acquired immune deficiency syndrome dementia complex; Krebs FC et al ., Adv Pharmacol ., 49:315-385, 2000), 뇌종양(brain tumor; Davies DC et al ., J Anat ., 200(6):639-646, 2002), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury; Esen F et al ., J Neurosurg Anesthesiol ., 15(2):119-125, 2003) 또는 고혈압(hypertension; Kucuk M et al ., Life Sci . 71(8):937-946 2002) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 심혈관계 질환은 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증(O'Brien KD et al., Circulation 93(4):672-682, 1996) 등으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으며, 또한 상기 안과 질환은 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 퇴화반(macular degeneration), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막 질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 후수정체 섬유 증식증 및 과립성 결막염(D'Amato RJ et al ., Ophthalmol ., 102:1261-1262, 1995; Adamis AP et al ., Angiogenesis , 3:9-14, 1999) 등으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 상기 암 질환은 성상세포종, 신경교종(glioma), 폐암, 비소세포성폐암, 간암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추 신경계(CNS: central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌하수체 선종(Hanahan D et al ., Cell , 86:353-364, 1996) 등으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으며, 본 발명의 조성물을 혈관신생과 관련된 암 질환 및 전이 치료에 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 혈관 관련 질환 예방용 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여 할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 추출물의 일일 투여량은 0.01 ~ 5000 ㎎/㎏ 이며, 바람직하게는 0.01 ~ 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 파고지 추출물 또는 희첨 추출물은 농도의존적으로 지방세포를 감소시켰으며(도 11 및 12 참조), 고지방식이와 함께 섭취시 체중을 감소시켰다(도 14 참조). 이에, 본 발명의 추출물은 혈관신생 억제 활성을 갖는 비만억제용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 파고지 추출물, 희첨 추출물 및 산수유 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 파고지 추출물 또는 희첨 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 위생)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 상기 파고지 추출물 또는 희첨 추출물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

또한, 상기 건강식품의 형태 및 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 파고지 추출물 또는 희첨 추출물을 첨가할 수 있는 건강식품의 형태는 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등일 수 있고, 건강식품의 종류는 버터, 요구르트, 치즈를 포함한 유제품, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강식품은 통상의 건강식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 파고지 추출물 또는 희첨 추출물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g이다.

상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 파고지 추출물 또는 희첨 추출물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 파고지(Psoraleae Semen) 추출물, 희첨(Siegesbeckiae Herba) 추출물 및 산수유(Corni Fructus) 추출물은 혈관신생 및 비만 억제 효과를 나타내므로 혈관신생 관련 질환 및 비만 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 파고지( Psoraleae Semen ), 희첨 ( Siegesbeckiae Herba ) 및 산수유( Corni Fructus ) 추출물의 제조

한약건재당(대전소재)에서 구입한 파고지(Psoraleae Semen), 희첨(Siegesbeckiae Herba) 및 산수유(Corni Fructus)를 한국한의학연구원 한약품질검사팀에서 외부형태의 비교검사를 통해 확인한 후 실험에 사용하였다. 상기 파고지, 희첨 및 산수유를 세척하고, 건조기를 이용해 완전히 건조시킨 후, 잘게 잘라서 사용하였다.

<1-1> 물 추출물의 제조

상기 잘게 자른 각 천연산물 600 g을 물 5배에 침지하여 5시간 동안 열수추출하였다. 추출액을 식혀서, 여과 과정을 거친 후 얻어진 상등액의 용매를 증발농축기에서 농축하여 동결건조시켜 추출물을 농축하였다. 120 g(20%)의 추출물을 얻었다.

<1-2> 에탄올 추출물의 제조

상기 잘게 자른 각 천연산물 600 g을 70% 에탄올 5배(3,000 ㎖)에 침지하여 가열하면서 5시간 동안 환류시켜 추출하였다. 상기 추출과정을 2회 반복하고, 추출액을 식혀서, 여과 과정을 거친 후 얻어진 상등액을 증발농축기에서 농축하여 동결건조하여 추출물을 농축하였다. 90 g의 추출물을 얻었다

<1-3> 메탄올 추출물의 제조

100% 메탄올을 이용하여 실시예 1-2의 방법으로 추출물 100 g을 수득하였다.

< 시험예 1> 세포부착 억제효과 확인

<1-1> 세포독성 확인

HUVEC(Young Science, 한국)을 96웰에 1×10⁴개/웰로 분주한 후, 2% FBS를 첨가한 EBM-2 배지(Cambrex, 미국)를 사용하여 37℃ 및 5% CO₂-인큐베이터에서 배양하여 최고조에 도달할 때까지 배양하였다. 이후, 실시예 1의 추출물을 농도별로 첨가한 후 48시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액의 배지를 버리고 (0.1 mM의 MTT 1 ㎖을 첨가한 후, 추가로 4시간 배양시킨 후 배지를 제거하였고 DMSO를 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하고 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 파고지는 10 ppm, 희첨은 25 ppm 및 산수유는 25 ppm까지 세포독성을 나타내지 않았다.

<1-2> 세포부착 인자 확인

HUVEC을 96웰에 5×10³개/웰로 분주한 후, 2% FBS를 첨가한 EBM-2 배지를 사용하여 37℃ 및 5% CO₂-인큐베이터에서 배양하여 최고조에 도달할 때까지 배양하였다. 이후, 실시예 1의 추출물을 독성을 나타내지 않는 범위에서, 농도별로 첨가한 후 20시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액을 PBS로 세척한 후 세포부착 인자를 유도하기 위하여 IL-1β(Endogen, 미국)를 5 ng/㎖의 농도로 첨가하여 6시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 1% 파라포름알데히드를 첨가하고 실온에서 30분간 반응시켜 세포를 고정했다. 30분 후 PBS+0.5% Tween 20으로 두 번 세척하였고, 10% FBS로 1시간 동안 차단한 다음, 단일 클론 항체(VCAM-1, ICAM-1 및 E-셀렉틴 : BD Bioscience, 미국)를 10% FBS가 첨가된 PBS에 각각 2, 5, 5 ㎍/㎖ 씩 녹여 2시간 동안 37℃에서 반응시킨 후 PBS+0.5% Tween 20으로 세척하였고, 이차항체(Donkey anti-mouse IgG-HRP: Bio-Rad, 미국)를 10% FBS의 PBS에 1000배 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응하였고, 발색시약(western blotting luminol reagent: Bio-Rad, 미국)을 첨가하고 1시간 동안 반응한 후 플레이트 리더기(UVM 340, ASYS, 호주)를 사용하여 405 ㎚에서 측정하였다.

그 결과, 표 1 내지 표 3에서 나타난 바와 같이 상기 각각의 물, 에탄올 및 메탄올 추출물 중 에탄올 추출물이 세포부착 촉진인자인 VCAM-1, ICAM-1 및 E-셀렉틴을 충분하게 억제하는 것으로 나타났다. 이에, 이후 실험은 에탄올 추출물로 진행하였다.

VCAM-1의 파고지, 희첨 및 산수유에 의한 억제율

시료	농도(ppm)	물 추출물	에탄올 추출물	메탄올 추출물
음성대조군(생리식염수)	-	-	-	-
파고지	1	98.2%	100.0%	95.0%
희첨	5	110.0%	114%	102.0%
산수유	5	100.0%	111.8%	98.7%

ICAM-1의 파고지, 희첨 및 산수유에 의한 억제율

시료	농도(ppm)	물 추출물	에탄올 추출물	메탄올 추출물
음성대조군(생리식염수)	-	-	-	-
파고지		98.0%	100%	95%
희첨	5	128%	136%	110%
산수유	5	65.0%	66.7%	63.2%

E-셀렉틴의 파고지, 희첨 및 산수유에 의한 억제율

시료	농도(ppm)	물 추출물	에탄올 추출물	메탄올 추출물
음성대조군(생리식염수)	-	-	-	-
파고지	1	120%	128.0%	105%
희첨	5	115%	120.0%	100%
산수유	5	97.5%	100.7%	96.0%

결과, 도 2 내지 4에서 나타난 바와 같이 파고지, 희첨 및 산수유의 각각의 추출물은 농도의 증가에 따라 세포부착 촉진인자인 VCAM-1, ICAM-1 및 E-셀렉틴의 발현을 농도의존적으로 억제하였다. 구체적으로, VCAM-1의 경우, 파고지는 1.0 ppm, 희첨 및 산수유는 5.0 ppm에서 대조군 보다 유의하게 낮은 저해 효과를 보였고, 파고지(0.5 ppm, 100%)>희첨(5.0 ppm, 114%)>산수유(5.0 ppm, 111.8%)의 순으로 저해의 강도가 높은 것으로 확인되었다. 또한, ICAM의 경우 파고지(0.5 ppm, 100%)>희첨(5.0 ppm, 138%)>산수유(5.0 ppm, 66.7%)의 순으로 저해의 강도가 높은 것으로 나타났으며, E-셀렉틴의 경우는 파고지(1.0 ppm, 128%)>희첨(5.0 ppm, 120%)>산수유(5.0 ppm, 100.7%)의 순으로 저해의 강도가 높은 것으로 나타났다. 종합적으로, 희첨(5.0 ppm)>파고지(0.5 ppm)>산수유(5.0 ppm)의 순으로 저해의 강도가 높은 것으로 확인되었다.

< 시험예 2> 혈관신생 억제효과 확인

24웰 플레이트(Becton Dickinson Labware, 미국)에 150 ㎕의 매트리겔(matrigel)로 가하여 표면을 코팅한 후, 고체화를 위하여 37℃에서 1시간 동안 방치하였다. 상기 웰 플레이트에 트립신-EDTA를 사용하여 웰로부터 분리한 2.5×10⁴개/웰의 세포를 분주한 후, 실시예 1의 추출물을 농도별로 투여한 후, 37℃ 및 5% CO₂의 조건에서 4시간 동안 배양하였다. 이후, 형성된 튜브 망이 형성되면, 불규칙적으로 5면을 선택하여 디지털 카메라(Coolpix; Nikon, 일본)로 촬영하여 이미지를 수득하였고, NIH 이미지 프로그램으로 튜브 길이를 측정하였다.

그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 파고지, 희첨 및 산수유의 추출물의 혈관신생형성억제효과가 양성 대조군인 EGCG보다 현저히 뛰어난 것을 확인하였다.

< 시험예 3> 신생혈관의 억제 기전 확인

본 발명자들은 파고지, 희첨 및 산수유 추출물의 혈관신생 억제 효과 기전을 알아보기 위해, 신호전달 분자인 베타카테닌(β-catenin) 및 VE-캐더린(vascular epithelium-cadherin); 및 하위 그룹인 Akt(Protein kinase B)를 대상으로 상기 추출물들의 작용을 조사하였다.

<3-1> 추출물 처리 및 VEGF 자극

구체적으로, 100 ㎜ 페트리 접시에 HUVEC을 1×10⁵으로 접종하여 배양한 후 최고조에 도달하면 실시예 1의 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양한 후, 무혈청 EBM-2 배지로 세척하였고, 처리군을 혈청을 첨가하지 않은 채 밤새 배양한 후 VEGF(BD Science, 미국)를 50 ng/㎖의 최종농도로 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다.

<3-2> 단백질 분리 및 면역침강

인산화를 방지하기 위하여 세포를 용해시키기 전, 바나데이트(vanadate; 100 μM)과 과산화수소(200 μM)을 7분간 첨가하였다. 그 후 세포를 즉시 냉각시킨 PBS+0.1 mM Na₃VO₄로 세척하였고, 냉각시킨 용해 완충용액[150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl(pH 7.4), 1% Triton X-100, 1 mM vanadate, 1 mM EDTA, 1 mM FGTA, 0.2 mM PMSF, 0.5% NP-40]를 첨가한 후 20분간 4℃에서 반응하였다. 이후, 스크립퍼(scripper)로 세포를 회수하여 미세튜브(micro ependrof tube)로 옮겨서 4℃, 14,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상등액에 포함된 단백질은 BCA 단백질 검사 키트(Pierce, 미국)를 사용하여 농도를 정량하였고, 항-VE-캐더린(VE-Cadherin) 항체(BD Bioscience, 미국)를 사용해 면역침강하였다. 500 ㎕의 면역침강 완충용액(0.2 mM sodium vanadate 첨가)에 단백질 50 ㎍과 10 ㎕의 항체를 첨가한 후, 전체 양을 1 ㎖이 되도록 H₂O를 첨가하였다. 상기 반응액을 볼텍싱한 후 4℃에서 12 시간 동안 반응한 후, 20 ㎕의 Protein A/G-아가로스(Amersham Science, 스웨덴)를 첨가하였다. 4℃에서 30 분간 반응한 후, 14,000 rpm에서 3 분간 4℃에서 원심분리하여 상등액을 제거하였고, 세척완충용액 500 ㎕를 사용하여 세척한 후 원심분리 한 후, 상등액을 제거하였다.

<3-3> 웨스턴 블랏팅

정제된 단백질에 50 ㎕의 4× Laemmli 시료 로딩 완충용액을 첨가하여 95℃에서 5 분간 끓인 후 시료를 7.5% SDS-PAGE 겔로 전기영동한 후에 0.2 ㎛ 니트로셀룰로오스 막(Bio-Rad Lab. 미국)으로 전이시켰다. 막으로 전이된 단백질을 Ponceau-S(Markham, 캐나다) 시약으로 확인한 후, 실온에서 1 시간 동안 5%-NFDM(non-fat dry milk)으로 차단한 후, 항-β-카테닌, 항-Akt, 항-VE-캐더린 및 항-β-액틴(BD Bioscience, 미국)등의 일차항체를 각각 처리한 후, 이차 항체인 당나귀 염소 HRP를 1:7000의 비율로 반응시킨 후 형광물질인 ECL(Santa Cruz Biotechnology, 미국)을 이용해 필름에 노출시켰다.

그 결과, 도 6 내지 7에서 나타난 바와 같이 추출물의 농도가 증가함에 따라 상기 항체들의 검출신호가 약해지는 것을 확인하였다. 이로부터 상기 추출물이 농도의존적으로 신호전달 분자의 발현을 억제하였고, 이로부터 신호 전달을 억제하여 NF-κB까지의 신호전달이 이루어지지 못함으로써(도 9 참조), NF-κB가 활성화되지 못하여 신생혈관의 형성을 억제하는 것을 제안하였다.

< 시험예 4> CAM ( chorioallantoic membrane ) 검사에 의한 in vivo 에서 천연산물의 신생혈관 저해 효과 확인

수정란을 70% 이상의 습도가 유지되는 37℃ 배양기에서 3일간 성장시킨 후, 구멍을 내어 주사기로 알부민 4 ㎖를 뽑았다. 4일째 배가 되면 수정란의 공기주머니가 있는 윗부분에 원형 창을 내고 그 부위는 투명테이프로 막았다. 그리고 혈관신생 억제 효과를 알아보기 위하여 직경 13 ㎜의 터마톡스 커버슬립(thermatox coverslip)에 파고지, 희첨 및 산수유 추출물을 각각 10, 25 및 25 ppm의 농도 200 ㎕ 씩을 도포한 후, 건조하였다. 4.5일 배가 되면 유리테이프를 떼어낸 후, 이 커버슬립을 발생 중인 융모요막(CAM)의 표면에 놓고, 다시 유리테이프로 창을 막았다. 이때 대조군으로서 터마톡스 커버슬립만을 계태자융모요막(Chorioallantoic membrane; CAM)에 부착시켰다. 이를 배양기에서 2일 동안 배양시킨 후, 10% 지방 에멀젼(fat emulsion)을 융모요막(CAM) 안쪽에 주사기로 주입하여, 혈관형성 억제 정도를 관찰하였다. 각 실험군 당 60개 이상의 계태자융모요막을 사용하였으며, 디지털 카메라로 촬영하여 이미지를 수득하였다.

그 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이 본 발명의 추출물이 in vivo에서 뚜렷이 신생혈관이 저해되는 것을 확인하였다.

< 시험예 5> 지방세포의 저해 효과 확인

3T3-L1 아지방세포(preadipocyte)를 DMEM/10% FBS 배지에서 플라스크 바닥을 완전히 덮을 때까지 배양한 후, 2일간 더 배양한 후에 유도배지(MDI, 0.5 mM 3-isobuty-1-methylxanthine, 0.5 μM dexamethasone, 10 ㎍/㎖ insulin)를 넣어 배양하여 아지방세포가 지방세포가 되도록 분화를 유도하였다. 3일째에 정상적인 DMEM/10% FBS 배지로 교환하였고, 이후 2일에 한 번씩 배지를 교환하면서 7-10일 동안 파고지, 희첨 및 산수유의 추출물을 농도별로 처리하였다.

지방세포로의 분화를 분석하기 위하여 배양된 세포를 포르말린으로 고정한 후, 포르말린을 제거하고 60% 이소프로판올로 씻은 후 흰 알갱이가 보일 때까지 말렸다. Oil-red 및 반응용액(working solution)으로 염색한 후, 염색액을 제거하고 증류수로 4회 정도 세척하였다. 100% 이소프로판올로 비지방 부분의 염색액을 세척한 후, 염색된 세포내 지방질을 현미경하에서 관찰하였다.

그 결과, 도 11 내지 13에 나타난 바와 같이 파고지, 희첨 및 산수유 추출물의 농도의존적으로 지방세포가 현저히 감소하는 것을 볼 수 있었다.

< 시험예 6> 체중감소 효과 확인

스프래그-돌리(Sprague-Dawley) 계열의 쥐에 고지방식이를 16일간 섭취하게 한 후, 파고지는 2 ㎎/200 g(10 ㎎/kg), 희첨 및 산수유는 5 ㎎/200 g(10 ㎎/kg)의 추출물을 1 ㎖ 씩 15일간 경구투여 하면서 고지방식이를 섭취하게 하여 체중의 변화를 관찰하였다. 대조군으로는 추출물을 투여하지 않고 고지방식이만 하였다.

그 결과, 도 14에서 나타난 바와 같이 고지방식이와 파고지, 희첨 및 산수유의 추출물을 15일간 병행 투여시 파고지 27.1%, 희첨 34.1% 및 산수유 23.5%의 체중 감소를 확인하였다.

상기 내용을 종합한 결과, 본 발명의 추출물은 항혈관신생(Anti-angiogenesis) 효과를 나타내고, 상기 효과에 의해 짧은 시간 내에 체중을 감소시키는 것을 의미하며, 따라서 본 발명의 파고지, 희첨 및 산수유 각각의 추출물은 항비만제로서 유용하게 이용될 수 있다.

< 제조예 1> 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

본 발명의 추출물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

본 발명의 추출물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

본 발명의 추출물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

4. 환의 제조

본 발명의 추출물 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

5. 과립의 제조

본 발명의 추출물 150 ㎎

대두 추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

<제조예 2> 식품의 제조

본 발명의 추출물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 추출물 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

2. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 추출물 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

< 제조예 3> 음료의 제조

본 발명의 추출물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강식품 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

도 1은 HUVEC 세포에 대한 본 발명의 파고지, 희첨 및 산수유 각각의 추출물의 세포독성을 확인한 도이다.

도 2는 본 발명의 각각의 추출물의 세포부착촉진인자 VACM-1의 억제효과를 나타낸 도이다.

도 3은 본 발명의 각각의 추출물의 세포부착촉진인자 IACM-1의 억제효과를 나타낸 도이다.

도 4는 본 발명의 각각의 추출물의 세포부착촉진인자 E-셀렉틴의 억제효과를 나타낸 도이다.

도 5는 본 발명의 각각의 추출물의 혈관신생 억제효과를 나타낸 도이다.

도 6 내지 8은 본 발명의 각각의 추출물의 신호전달분자의 발현억제효과를 나타낸 도이다:

6: 파고지;

7: 희첨; 및,

8: 산수유.

도 9는 신호전달 분자의 NF-kB까지의 신호전달 경로를 나타낸 도이다.

도 10은 in vivo에서 본 발명의 각각의 추출물이 혈관신생 억제효과를 나타낸 도이다.

도 11 내지 13은 본 발명의 각각의 추출물의 지방세포 억제효과를 나타낸 도이다:

10: 파고지;

11: 희첨; 및,

12: 산수유.

도 14는 본 발명의 각각의 추출물의 체중감소 효과를 나타낸 도이다.

Claims

파고지(Psoraleae Semen) 추출물, 희첨(Siegesbeckiae Herba) 추출물 및 산수유(Corni Fructus) 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제제.
제 1항에 있어서, 상기 추출은 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출하는 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제제.
제 2항에 있어서, 상기 알코올은 C₁ 내지 C₄ 저급 알코올인 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제제.
제 3항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제제.
삭제
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파고지 추출물 또는 희첨 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만억제용 약학적 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 추출은 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 알코올은 C₁ 내지 C₄ 저급 알코올인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 12항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
파고지 추출물 또는 희첨 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 개선용 건강식품.