KR20240063822A

KR20240063822A - 오갈피 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물 또는 이들로부터 분리한 화합물을 포함하는 비만 또는 당뇨의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20240063822A
Application number: KR1020240054106A
Authority: KR
Inventors: 이수의; 류형원; 김문옥; 오세량; 김두영; 장현재
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2020-09-03
Filing date: 2024-04-23
Publication date: 2024-05-10
Also published as: WO2022050601A1; US20230364170A1; CN116437936A

Abstract

본 발명은 오갈피 추출물, 가르시니아 캄보지아 추출물 또는 이들로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 당뇨의 예방 또는 치료용 약학 조성물과 비만 또는 당뇨를 예방하거나 개선하는 식품 조성물 및 사료 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 오갈피 추출물, 가르시니아 캄보지아 추출물 또는 이들로부터 분리된 화합물을 단독으로 사용한 경우 대비 상승적인(synergy) 항당뇨 및 항비만 활성을 갖는다. 따라서, 가르시니아 캄보지아 추출물 및 이로부터 분리한 물질의 과량 투여 또는 장기 투여에 의해 유발될 수 있는 임의의 부작용의 가능성을 낮출 수 있어 당뇨 또는 비만 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

오갈피 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물 또는 이들로부터 분리한 화합물을 포함하는 비만 또는 당뇨의 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OBESITY OR DIABETES COMPRISING EXTRACT OF ACANTHOPANAX AND EXTRACT OF GARCINIA CAMBOGIA OR COMPOUNDS ISOLATED THEREFROM}

본 발명은 오갈피 추출물, 가르시니아 캄보지아 추출물 또는 이들로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 당뇨의 예방 또는 치료용 약학 조성물과 비만 또는 당뇨를 예방하거나 개선하는 식품 조성물 및 사료 조성물에 관한 것이다.

생활방식과 경제성장의 변화는 사람들의 식습관을 변화시켰으며, 이에 따라 과체중 인구 또는 비만 인구를 증가시켰다. 현대인의 약 30~40%가 비만으로 알려져 있으며, 2025년까지 전세계 비만인구는 10억 명에 이를 것으로 예측되고 있다.

비만 개선을 위한 방법으로서 식이습관의 개선, 열량 제한 식품의 섭취, 운동요법, 지방 흡수 억제 약물의 복용과 같은 다양한 방법이 존재한다. 그러나 열량 제한 식품의 사용은 사용자의 음식에 대한 욕구를 증가시키는 한편, 영양소의 결핍/과다로 인한 질환이 발생하는 문제 등의 부작용을 갖는다.

또한, 지방 흡수 억제 약물의 복용은 설사, 위장관 부작용, 신장 질환 등의 부작용을 일으키는 것으로 알려져 있다.

더욱이 비만은 당뇨나 고혈압과 같은 성인병의 원인이기도 하다. 당뇨는 신체 내에서 혈당 조절에 필요한 인슐린의 분비나 기능 장애로 인하여 발생된 고혈당을 특징으로 하는 대사성 질환으로 알려져 있다. 당뇨는 망막, 신장, 신경에 나타나는 미세혈관 합병증, 동맥경화, 심혈관 질환 및 뇌혈관 질환과 같은 거대혈관 합병증을 유발하고, 이로 인한 사망률을 증가시킨다.

현재 사용되는 당뇨 치료 방법으로는 식이요법, 메트포르민, 설포닐우레아, 알파-글루코시다제 억제제, 티아졸리딘디온 등의 경구혈당강하제와 인슐린을 이용한 치료 방법, 운동 요법 등이 있다. 그러나, 식이요법은 그 복잡성으로 인하여 환자가 일상생활에서 시행하기 어렵다. 또한, 당뇨환자가 인슐린 농도가 낮은 상태에서 운동을 하게 되면 케토산증이 발생하는 것으로 알려져 있고, 반대로 인슐린 농도가 과다한 상태에서 운동하는 경우 저혈당이 유발된다. 나아가, 경구혈당강하제 및 인슐린을 이용한 치료는 베타세포 기능부전이 있는 당뇨 환자에서 혈당을 낮추는 효과가 미약하다.

이에, 비만 또는 당뇨에 대한 새로운 치료법으로서, 특히 천연 물질을 이용하여 부작용이 없는 효과적인 치료제에 대한 개발이 필요한 실정이다.

한국 출원번호 제10-2008-0084007호

이에, 본 발명자들은 천연 물질을 이용한 비만 치료제 및 당뇨 치료제를 개발하기 위해 연구한 결과, 오갈피 추출물, 가르시니아 캄보지아 추출물 또는 이들로부터 분리한 화합물이 소정의 비율로 혼합된 조성물이 우수한 항당뇨 및 항비만 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 측면은, 오갈피(Acanthopanax) 추출물 및 가르시니아 캄보지아(Garcinia cambogia) 추출물 또는 이들로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 또는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 오갈피 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물 또는 이들로부터 분리된 화합물을 포함하는, 당뇨 또는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 오갈피 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물 또는 이들로부터 분리된 화합물을 포함하는, 당뇨 또는 비만 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 오갈피 추출물, 가르시니아 캄보지아 추출물 또는 이들로부터 분리된 화합물의 특정 조합을 포함하는 조성물은 지방세포의 증식, 중성지방의 생성 및 체지방 합성을 효과적으로 억제하며, 근육세포에서의 포도당 흡수를 증가시킨다. 또한, 상기 조성물은 오갈피 추출물, 가르시니아 캄보지아 추출물 또는 이들로부터 분리된 화합물을 단독으로 사용한 경우 대비 상승적인(synergy) 항당뇨 및 항비만 활성을 갖는다. 따라서, 가르시니아 캄보지아 추출물 및 이로부터 분리한 물질의 과량 투여 또는 장기 투여에 의해 유발될 수 있는 임의의 부작용의 가능성을 낮출 수 있어 당뇨 또는 비만 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 에탄올 용매의 농도 및 온도 조건에 따른 오갈피 추출물의 키사노제닌 함량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 오갈피 추출물에서 키사노제닌을 분리하는 방법을 도식화한 것이다.
도 3은 오갈피 추출물에서 분리된 지표성분에 대한 분석결과를 나타낸 것이다.
도 4는 수확시기 별 오갈피 잎 추출물의 키사노제닌 함량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 음성 대조군, 가르시니아 캄보지아 추출물 양성 대조군, 오갈피 추출물 양성 대조군 및 가르시니아 캄보지아 추출물과 오갈피 추출물 혼합물의 처리에 따른 PPARγ 발현양을 나타낸 그래프이다.
도 6은 HCA와 키사노제닌의 병용에 따른 항당뇨 상승 효과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은, 오갈피 (Acanthopanax) 추출물, 키사노제닌, 또는 키사노제닌 유도체의 제1 성분과, 가르시니아 캄보지아 (Garcinia cambogia) 추출물 또는 히드록시 시트르산 (HCA, Hydroxycitric acid)의 제2 성분을 포함하는, 당뇨 또는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용한 용어, "추출물"이란, 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온, 저온 또는 고온 상태에서 일정 시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들을 건조하여 얻어지는 건조물, 분획물, 또는 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다.

상기 오갈피 추출물 또는 가르시니아 추출물을 추출하는 방법은 당업계에서 통상적으로 알려진 방법으로, 예를 들면 용매 추출, 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법 등의 추출장치를 이용한 방법 또는 흡착 수지를 이용하는 방법 등을 이용할 수 있다.

상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 또한, 상기 추출물을 수득하기 위한 방법은 추출물을 수득할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 목적하는 물질, 이의 건조물 및 가공물 등을 상기 용매에 침지하고, 상온에서 추출하는 냉침추출법, 가열추출법, 초음파를 가하여 추출하는 초음파추출법, 환류 냉각기를 이용한 환류추출법 등의 방법을 사용할 수 있다.

상기 오갈피 추출물에 적용될 수 있는 오갈피는 상업적으로 판매되는 것이나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 제한없이 사용할 수 있다. 또한, 상기 오갈피는 꽃, 잎, 열매, 씨앗, 뿌리 또는 줄기 등 부위에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한, 상기 오갈피는 5월 내지 6월에 수확된 것을 사용하는 것이 항당뇨 또는 항비만 효과의 향상 측면에서 가장 바람직하다.

오갈피는 두릅나무과에 속하는 관목식물로, 잎이 다섯 개로 갈라져 있다. 오갈피의 종류로는 가시오갈피 (Acanthopanax senticosus(RUPR. et MAX.) HARMS), 오갈피나무(Acanthopanax sessiliflorus(RUPR. et MAX.) SEEM.), 왕가시오갈피 (Acanthopanax senticosus var. subinermis KITAGAWA) 등 15종이 한국에 존재하며, 오래 전부터 한방에서는 독성과 부작용이 없다는 상약(上藥)으로 분류하여 뿌리와 목질부(가지)를 약재로 사용하여 왔고, 잎, 열매 및 꽃도 약용 부위로 사용할 수 있다. 오갈피의 잎에는 치사노사이드 (chiisanoside)가 함유되어 있으며, 뿌리에는 오갈피 배당체인 아칸토사이드 B, D (Acanthoside B, D) 뿐만 아니라 지링긴(sylrgin), 쿠마린 배당체 등이 함유되어 있다. 또한, 오갈피에는 면역성을 높여주는 수용성 다당체가 함유되어 있다. 오갈피는 맛이 맵고 쓰며 따뜻한 성질을 가지고 있고, 간경(肝經), 신경(神經)에 작용하여 풍습을 없애고 기를 돋우며 정수를 불러준다고 알려져 있다. 또한 오로(오장이 허약하여 생기는 허로병)와 칠상(남자가 허약해서 생기는 일곱 가지 증상)을 보해 주며, 다리를 잘 쓰지 못하는 데에 사용되고, 신체의 기(氣)를 높여주고, 정력을 좋게 해주며, 정신을 맑게 하고, 의지력을 높게 하며, 몸이 가벼워지고 늙는 것을 방지하고, 몸 안의 나쁜 피를 맑고 깨끗이 다스려 준다고 알려져 있으며, 허리 척추가 쑤시는 통증, 남자 음위증, 낭습, 여자음양증 등의 여러 가지 증상을 치료해준다고 알려져 있다.

본 발명에서 상기 오갈피는 오갈피속(Acanthopanax)의 식물이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 이의 비제한적인 예시로 오갈피나무(Acanthopanax sessiliflorus(RUPR. et MAX.) SEEM.), 가시오갈피나무(Acanthopanax senticosus(RUPR. et MAX.) HARMS), 왕가시오갈피나무(Acanthopanax senticosus var. subinermis KITAGAWA), 지리산오갈피나무(Acanthopanax chiisanense NAKAI), 섬오갈피나무 (Acanthopanax koreanum NAKAI), 털오갈피나무(Acanthopanax rufinerve NAKAI), 서울오갈피나무(Acanthopanax seoulense NAKAI), 당오갈피 (Acanthopanax sieboloians) 및 오가나무(Acanthopanax sieboldianum MAKINO)가 포함될 수 있다. 본 발명에서 상기 오갈피 추출물은 전술한 오갈피속 식물 단독 또는 이의 혼합 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 오갈피나무(Acanthopanax sessiliflorus(RUPR. et MAX.) SEEM) 추출물일 수 있다.

예를 들어, 상기 오갈피 추출물은, 오갈피 잎에 메탄올 또는 에탄올의 용매를 처리하여 수득할 수 있다. 상기 용매의 농도 범위는 20% 내지 100%, 30% 내지 90% 또는 50% 내지 70%일 수 있고, 상기 용매의 농도가 55% 내지 65%, 바람직하게는 60%일 때 추출 효율이 가장 좋다.

구체적으로, 상기 용매 처리는 1 내지 10 시간, 3 내지 7시간, 또는 4 내지 6 시간 동안 수행될 수 있고. 추출 온도는 30℃ 내지 90℃, 40℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 70℃이며, 바람직하게는 60℃이다. 용매처리 후 상온에서 15분 동안 초음파처리(sonication)하는 과정을 1회 내지 5회, 또는 3회 반복하여 추출할 수 있다. 이후, 4,500 rpm 조건에서 5분 동안 원심분리하고, 여과 및 감압 농축하는 과정을 거칠 수 있다.

상기 오갈피 추출물로부터 키사노제닌을 오픈 컬럼 크로마토그래피(N.P)를 수행하여 분리할 수 있다. 오픈 컬럼 크로마토그래피를 위하여 사용되는 용매는 헥산 및 아세톤을 포함하며, 헥산 및 아세톤의 비율은 4:1에서 1:1(W/V)로 할 수 있다. 이때, 분리된 키사노제닌의 순도는 90, 91, 92, 95 또는 97% 이상이다.

본 발명에서 상기 키사노제닌은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물이다:

[화학식 1]

본 발명에서 상기 키사노제닌은 오갈피속 식물 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.

본 발명에서 상기 키사노제닌은 상기 화학식 1이 화합물뿐만 아니라, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 라세미체 및 입체이성질체를 모두 포함한다.

본 발명에서의 용어 "키사노제닌의 유도체"란 키사노제닌과 동일한 모핵 구조를 갖는 화합물 또는 배당체로서 간 질환 개선 효과가 있는 화합물은 제한없이 포함되나, 그 예로 치사노사이드(chiisanoside), 22-alpha-하이드로치사노사이드, 22-alpha-하이드로키사노제닌 등이 포함될 수 있다.

한편, 가르시니아 캄보지아(Garcinia cambogia)는 인도와 남부 아시아 지역에서 수세기 동안 돼지고기 및 생선의 산미제(souring agent) 및 카레 등의 향신료로 사용되어 왔으며, 국내에서 가르시니아 캄보지아 추출물은 '식품공전'에 따라 체중조절용 조제식품에 부원료(최소량 5% 이하를 사용하여야 하나, 1일 섭취량 6 g을 초과할 수 없음)로 사용되고 있다. 또한, 미국 등 외국에서는 500~4500 ㎎/일의 섭취량 수준에서 식이보충제 또는 식품원료 등으로 판매되고 있다. 가르시니아 캄보지아 섭취는 일부 섭취자에게서 급성 간 독성을 유발한다는 보고가 있어 투여 용량 및 투여 주기에 각별한 주의가 요구되기도 한다(Case Reports in Gastrointestinal Medicine Volume 2018, Article ID 9606171, 4 pages).

본 발명의 일실시예에서는 전술한 가르시니아 캄보지아의 간 독성 위험은 낮추면서도 우수한 체중조절 효능은 활용하고자 오갈피 추출물과의 병용요법을 시도하였고, 그 결과 가르시니아 캄보지아 추출물과 오갈피 추출물의 병용요법에서 항당뇨 및 항비만 효과에 시너지 효과가 나타나는 것을 확인하였다.

상기 가르시니아 캄보지아 추출물에서, 가르시니아 캄보지아는 이의 다양한 기관(예: 잎, 뿌리, 줄기, 가지, 여린 가지, 껍질, 열매의 껍질 및 종자 등)을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 잎, 여린 가지, 줄기, 가지, 껍질, 열매의 껍질 또는 뿌리 등을 이용할 수 있다.

이때, 상기 가르시니아 캄보지아 추출물은 시판되는 가르시니아 캄보지아 추출물 원료를 사용할 수 있다. 예를 들어, 사빈사 코리아 코퍼레이션(Sabinsa Korea Corporation)에서 판매하는 가르시니아 캄보지아 추출물을 사용할 수 있다.

또한, 통상적인 추출 방법에 의하여 가르시니아 캄보지아 추출물로부터 HCA를 분리하거나, 시판되는 HCA를 사용할 수 있다. 예를 들어, 크로마덱스 사에서 판매하는 HCA를 사용할 수 있다. 이때, HCA의 순도는 90, 91, 92, 95 또는 97% 이상이다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 조성물이 가르시니아 캄보지아 추출물 및 오갈피 추출물을 유효성분으로 포함할 경우 가르시니아 캄보지아 추출물과 오갈피 추출물을 각각 제조한 후 혼합하여 상기 조성물이 제조될 수 있고, 또는 가르시니아 캄보지아와 오갈피를 혼합한 후 추출물을 제조하여 상기 조성물이 제조될 수도 있다.

본 발명에서 사용한 용어, "당뇨"란 인슐린의 분비량이 부족하거나 인슐린의 작용 및 기능이 충분히 이루어지지 않을 때 나타나는 질병을 의미한다. 이 병에 걸릴 경우 글리코겐, 단백질 및 지방질의 과도한 분해로 간 또는 혈액 중 글루코스 농도의 비정상적인 증가를 일으켜 당뇨 및 케톤뇨를 초래하고, 수분 및 전해질 대사의 이상으로 전해질 상실에 의한 혈액 농축 상태와 함께 순환장애, 신장장애 등의 병적 상태를 가져오게 된다. 당뇨는 인슐린 의존형 당뇨병(I형)과 인슐린 비의존성 당뇨병(II형)으로 구분된다. 당뇨 진단은 일반적으로 혈중 글루코스 농도 측정을 통해서 가능한데, 기준에 따라서 차이를 나타낸다. 인간에게서는 일반적으로 혈중에서 글루코스가 평소 200 mg/dl 이상, 공복시 140 mg/dl 이상일 때 당뇨로 진단한다.

본 발명에서 사용한 용어, "비만"이란 체내 지방이 과도하게 축적된 상태를 말한다. 비만의 기준은 상기 체내 지방이 체중의 25% 이상, 여자는 30~35% 이상이면 비만이라고 할 수 있는데, 일반적 측정방법으로는 체중(kg)/신장(m)²으로 나타내는 체질량지수(BMI; Body Mass Index)가 널리 쓰이고 있다. 서양인 체질량지수가 30 kg/m²이 초과되면 비만, 25 ~ 30 kg/m²인 경우에는 과체중으로 정의하며, 동양인의 경우에는 이보다 2 정도 낮은 28 kg/m²이 초과되면 비만, 23~28 kg/m²은 과체중이라고 할 수 있다. 이외에도 허리대비 엉덩이 둘레비(WHR; Waist to Hip Ratio) 또는 복부지방량을 기준으로 비만을 정의할 수 있으며, 본 발명에서는 상기한 기준을 포함하여 이외의 통상적인 기준으로 정의된 비만의 모든 경우를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 오갈피 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물을 포함하는 조성물, 오갈피 추출물 및 HCA를 포함하는 조성물, 키사노제닌 및 가르시니아 캄보지아 추출물을 포함하는 조성물 또는 키사노제닌 및 HCA를 포함하는 조성물은, 우수한 항당뇨 활성 및 항비만 활성을 가지는바, 당뇨 및 비만의 예방 및 치료용 약학적 조성물 뿐만 아니라, 기능성 식품 및 사료의 소재로 널리 적용될 수 있다.

특히, 가르시니아 캄보지아 추출물이 간 독성을 유발할 수 있다는 것을 고려한다면, 본 발명의 조성물은 가르시니아 캄보지아 추출물에 오갈피 추출물 또는 키사노제닌을 병용함으로써 각각의 물질이 부작용을 나타내지 않거나 부작용의 발생 가능성이 매우 낮은 용량의 투여로도 목적하는 비만 또는 당뇨 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

구체적으로, 상기 제1 성분 및 제2 성분은 5 : 1 내지 1 : 20의 중량비로 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, 4.5 : 1 내지 1 : 18, 4 : 1 내지 1 : 15, 3 : 1 내지 1 : 9, 3 : 1 내지 1 : 6, 2 : 1 내지 1 : 4, 또는 1 : 1 내지 3 : 1의 중량비로 포함할 수 있다. 상기 범위의 중량비로 혼합하여 사용하는 경우, 항당뇨 및 항비만 효과에 있어서 단독 사용 대비 뚜렷한 상승 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 상기 제1 성분은 키사노제닌이고, 상기 제2성분은 가르시니아 캄보지아 추출물일 수 있다. 이때, 상기 제1 성분 및 제2 성분은 1 : 1 내지 1 : 9, 1 : 1 내지 1 : 5 또는 약 1 : 3의 중량비로 포함될 수 있다.

또한, 상기 제1 성분은 오갈피 추출물이고, 상기 제2 성분은 HCA일 수 있다. 이때, 상기 제1 성분 및 제2 성분은 5 : 1 내지 1 : 1, 4 : 1 내지 1 : 1 또는 4 : 1 내지 3 : 1의 의 중량비로 포함될 수 있다. 상기 범위 내로 두 성분을 조합하여 사용하는 경우 각각의 성분을 단독으로 처리한 경우보다 우수한 항당뇨 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

또한, 상기 가르시니아 캄보지아 추출물은 40 내지 90%, 50 내지 80% 또는 60% 내지 70%의 HCA를 포함하는 가르시니아 캄보지아 추출물을 사용할 수 있다.

또한, 상기 제1 성분은 키사노제닌이고, 상기 제2 성분은 HCA일 수 있다. 이때, 상기 제1 성분 및 제2 성분은 1:50 내지 50:1, 1:45 내지 45:1, 1:40 내지 40:1, 1:35 내지 35:1, 1:30 내지 30:1, 1:25 내지 25:1, 1:20 내지 20:1, 1:15 내지 15:1, 1:10 내지 10:1, 1:9 내지 9:1, 1:8 내지 9:1, 1:7 내지 9:1, 1:6 내지 9:1, 1:5 내지 9:1, 1:4 내지 9:1, 1:3 내지 9:1 또는 2:3 내지 9:1의 중량비로 포함될 수 있다.

바람직하게는, 상기 약학 조성물은 키사노제닌 및 HCA를 1:6 내지 1:1의 중량비로 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 약학 조성물은 키사노제닌 및 HCA를 1:4 내지 1:1의 중량비로 포함할 수 있다.

또한, 상기 제1 성분은 오갈피 추출물이고, 상기 제2 성분은 가르시니아 캄보지아 추출물일 수 있다. 이때, 상기 제1 성분 및 제2 성분은 2:1 내지 1:2의 중량비로 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 키사노제닌 및 HCA를 4:6 내지 6:4의 중량비로 혼합시켜 각각의 성분을 단독으로 처리한 경우보다 우수한 항비만 및 항당뇨 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 제1 성분과 제2 성분은 동시에(simultaneous), 개별적(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물에 포함된 각 성분이 단일 조성물(single composition)로 되어 있는 경우에는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 조성물로 되어 있지 않을 경우에는 한 성분을, 다른 성분이 투여되기 전, 후 및/또는 다른 성분과 함께 동시에 투여될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 순서 즉, 어떤 것을 어느 시점에서, 동시에, 개별적 또는 순차적으로 투여할 것인지의 여부는 의사나 전문가에 의해 결정될 수 있다. 이러한 투여 순서는 많은 인자에 따라 달라질 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

또한, 상기 약학 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 외용제, 좌제 및 주사제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

구체적으로, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면은, 오갈피 추출물, 키사노제닌, 또는 키사노제닌 유도체의 제1 성분과, 가르시니아 캄보지아 추출물 또는 HCA의 제2 성분을 포함하는, 당뇨 또는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 조성물은, 상기 제1 성분 및 제2 성분이 인체에 안전한 물질이고, 이를 섭취한 경우에도 당뇨나 비만 예방 또는 개선에 효과가 있으므로 식품으로 사용될 수 있다. 이때 식품 조성물에 포함되는 상기 오갈피 추출물, 키사노제닌, 가르시니아 캄보지아 추출물 및 HCA에 대해서는 앞서 약학 조성물에서 설명한 내용을 참조한다.

본 발명에 따른 식품은 본 발명의 복합 추출물을 그대로 첨가하거나, 다른 종류의 식품, 건강기능식품 또는 음료에 통상의 향미제, 보존제와 같은 첨가제 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 식품은 공지의 제조 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 캡슐, 환 또는 액상의 용액인 형태로 제조되어 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류로 이용될 수 있으며, 본 발명에 따른 추출물의 함량은 제형에 따라 식품 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 100중량%로 조절할 수 있다. 본 발명에 의한 추출물을 유효성분으로 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은, 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 오갈피 추출물, 키사노제닌, 또는 키사노제닌 유도체의 제1 성분과, 가르시니아 캄보지아 추출물 또는 HCA의 제2 성분을 포함하는, 당뇨 또는 비만의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 사료 조성물은 본 발명의 복합 추출물을 그대로 첨가하거나, 다른 유형의 사료 조성물에 첨가제 등과 함께 더 포함될 수 있다. 이때 식품 조성물에 포함되는 상기 오갈피 추출물, 키사노제닌, 가르시니아 캄보지아 추출물 및 HCA에 대해서는 앞서 약학 조성물에서 설명한 내용을 참조한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 오갈피 추출물 및 이로부터 분리한 키사노제닌의 준비

실시예 1.1. 오갈피 추출물 제조

분쇄된 오갈피 잎(학명: Eleutherococcus sessiliflorus (Rupr. & Maxim.), 바우처번호: KRIB 0079085-0079086, 입수처: 충남 천안시 수신면) 3 g을 병에 넣고 상기 용매 조건에 해당하는 용매 100 mL을 넣고 워터 배스(water bath) 내 하기 온도조건으로 5시간 추출 후 상온에서 한 시간 식혔다. 필터페이퍼(advantec NO.2, 5 μm)에서 필터 후 농축하고 50%(30, 60℃ 샘플), 100% MeOH (90℃ 샘플) 용매 30 mL을 정밀하게 측정하여 추출물을 완전히 녹이고 동일한 방법으로 1회 반복 추출하여 시린지 필터(advantec, 0.2 μm)후 UPLC로 분석하였다. 수득한 추출물(30 mg/mL)을 이용하여 반응표면분석법을 실시하였다.

에탄올 농도(30%, 60%, 90%) 및 추출 온도(30℃, 60℃, 90℃)를 달리하여 9종의 추출물을 최종 수득하였고, 이의 키사노제닌 함량을 건조원물에 대해 확인하여 도 1에 나타내었다.

도 1을 참조하면, 특정 추출 조건에서 원물의 키사노제닌의 함량이 높게 나타나는 것을 알 수 있다. 특히, 모든 농도의 에탄올 용매에서 60℃ 추출 온도 조건이 키사노제닌 함량을 가장 높이는 것을 확인할 수 있다. 또한, 미니탭 18(minitab 18 (Eretec Inc))을 이용하여 반응표변분석법 통계 분석한 결과 60℃에서 60% 에탄올이 최적의 조건임을 확인하였다.

실시예 1.2. 오갈피 추출물의 지표성분 키사노제닌 분리

오갈피 잎 15.0 kg에 대하여 80% 메탄올을 이용하여 30℃의 온도에서 3일 동안 3회 반복하여 용매 추출을 하였다. 상기 추출물 2.9 kg에 대하여 오픈 컬럼 크로마토그래피(N.P.)를 수행하여 4개의 분획물을 얻었다(fr1 내지 fr4). 이 때 사용된 용매는 헥산: 아세톤을 4:1에서 1:1(W/V)의 비율로 하였다. 4개의 분획물 중 fr.2(28.38g)을 헥산: 아세톤을 4:1(W/V) 용매로 오픈 컬럼 크로마토그래피 를 실시하여, 2개의 소분획물을 얻었다.

상기 분획물을 분석하기 위하여, ACQUITY^TM UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography) 및 CAD(Charged Aerosol Detector) 검출기를 이용하여 상기 분획물들의 성분을 분석하였다. 이때, 용매 A는 0.1% FA(Formic acid)/D.W를 사용하였으며, 용매 B는 0.1% FA/ACN(acetonitrile) 용매를 이용하였으며, 하기 표 1과 같은 구배(Gradient) 조건으로 분석하였다. 또한, 하기 표 2와 같은 CAD 조건으로 분석하였다.

컬럼은 ACQUITY UPLC^® BEH C18 1.7 ㎛, 2.1 X 100 ㎜를 사용하였다. 상기 추출물은 1 ㎎/㎖ 농도로 5 ㎕을 사용하였다.

실시예 2. 수확 시기에 따른 오갈피 잎 추출물의 키사노제닌 함량 확인

키사노제닌 함량이 가장 높은 오갈피 잎의 수확 시기를 결정하기 위하여 2016년 7월부터 2019년 6월에 수확된 오갈피 잎으로부터 상기 실시예 1.2에서 사용한 추출 방법을 사용하여 키사노제닌을 분리하여 비교 분석하였다. 각 수확 시기 별 오갈피 잎 추출물의 키사노제닌의 함량을 도 4에 나타내었다.

도 4의 결과를 참조하면, 키사노제닌의 함량은 5월 또는 6월에 수확한 오갈피 잎에서 가장 높은 것으로 나타났다.

실시예 3. 가르시니아 캄보지아 추출물의 준비

가르시니아 캄보지아 추출물(Garcinia Cambogia extract)은 사빈사 코리아 코퍼레이션이 유통하는 원료(Batch No. C150292E)를, HCA는 크로마덱스(ASB-00008387-250)에서 구매하여 이용하였다.

실시예 4. 오갈피 추출물, 키사노제닌, 가르시니아 캄보지아 추출물 및 히드록시 시트르산 (HCA)의 세포 독성 확인

쥐의 지방전구세포인 3T3-L1 세포를 배양하기 위해 소 혈청(Bovine Calf Serum) 10%와 Penicillin-streptomycin 1%를 첨가한 DMEM 배지(Gibco)를 성장배지(GM, growth media)로 사용하여 2Х10³ cells/㎖의 농도로 현탁하여 100 ㎕씩 96 웰-플레이트에 접종하여 3일 동안 세포가 가득차게 배양하였다. 지방분화를 유도하기 위해 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에 인슐린(insulin), 덱사메타손(dexamethasone) 및 3-이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX, 3-isobutyl-1-methylanthin)이 첨가된 분화유도배지(DM, differentiation media)로 교환하여 2일 동안 배양하였다. 2일 후 인슐린이 함유된 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 기존배지에 첨가하였다. 지방분화 과정 중 약물의 효과를 확인하기 위하여 배지를 교환시 약물을 함께 처리하였다. 이때 사용한 약물은 가르시니아 추출물(고시형원료, 60% HCA), Ca-HCA 오갈피 추출물 및 오갈피 추출물에서 분리한 키사노제닌 화합물이다. 세포 수를 셀 수 있는 CCK-8(Dojindo) 키트에서 설명한 대로, 배지 90 ㎕에 CCK-8 용액을 10 ㎕ 혼합하여 웰 당 100 ㎕씩 첨가하였고, 최소 30분에서 1시간까지 반응시킨 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포생존율은 DMSO를 0.1% 처리한 음성 대조군을 100%로 하여 하기 수학식 1에 따라 계산하였고, 그 결과는 하기 표 3 내지 5에 나타낸 바와 같다.

[수학식 1]

상기 표 3 내지 표 5를 참조하면, 본 발명의 유효성분인 가르시니아 추출물, 오갈피 추출물, 히드록시 시트르산 (HCA) 및 키사노제닌은 세포 생존율에 큰 영향을 미치지 못하는바 세포 독성이 없는 것을 알 수 있다.

실시예 5. 가르시니아 추출물과, 오갈피 추출물 또는 키사노제닌의 병합처리에 따른 지방 축적 억제 효과 확인

쥐의 지방전구세포인 3T3-L1 세포에 소 혈청(Bovine Calf Serum)을 10% 첨가한 Dulbecco's Modified EaDCRT Media(DMEM, Gibco)를 성장배지(GM, growth media)로 사용하여 2Х10⁴ cells/㎖의 농도로 현탁하여 1 ㎖씩 24 웰-플레이트에 접종하여 지방세포를 confluent 상태가 되도록 3일 동안 배양하였다. 지방분화를 유도하기 위해 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에 insulin, dexamethasone 및 3-isobutyl-1-methylanthin (IBMX)이 첨가된 분화유도배지(DM, differentiation media)로 교체하여 2일 동안 배양하였다. 2일 후 insulin이 함유된 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 기존배지에 첨가하였다. 지방분화 과정 중 약물의 효과를 확인하기 위하여 배지를 교체 시 약물을 함께 처리하였다. 지방세포 분화를 유도한 후 지방축적(Lipid accumulation)을 측정하기 위하여 오일 레드 오(Oil red O) 염색 분석(Sigma-aldrich사)를 이용하여 측정하였다. 세포를 고정하기 위해 1% 포름알데하이드(증류수를 기초로 함)를 넣어 4℃에서 1시간 반응시켜 증류수로 세척 후 500㎕의 필터 된 오일 레드 오 용액을 넣어 상온에서 1시간 동안 염색시킨다. 그 후 증류수로 세척 후 100% 아이소프로필 알코올 300 ㎕를 넣어 세포내 오일 레드 오를 추출하여 마이크로플레이트 측정기로 492 nm에서 발색 정도를 측정하였다. 억제율은 양성 대조군을 100%로 하여 하기 수학식 2에 따라 계산하였고, 그 결과는 하기 표 6 및 7에 나타낸 바와 같다.

각 그룹간의 통계학적 유의성 있는 분산을 결정하기 위하여 일원분산 분석법(one-way ANOVA)을 이용하여 분석하고, 표기되는 결과 값은 GM군과의 비교를 통해 #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001로, DM군과의 비교를 통해 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 기준의 통계적 유의성으로 표기하였다.

[수학식 2]

표 6 및 표 7을 참조하면, 가르시니아 추출물과 키사노제닌을 혼합하여 처리한 경우, 단독 물질 처리 경우 대비 지방 축적율이 통계적으로 유의성있게 줄어드는 것을 확인할 수 있다. 특히, 약 3 : 1의 중량비로 혼합하여 사용한 경우 지방 축적 억제효과가 가장 높은 것을 알 수 있다.

실시예 6. 가르시니아 추출물, 오갈피 추출물, HCA 및 키사노제닌의 트리글리세리드 생성 억제 효과 확인

쥐의 지방전구세포인 3T3-L1 세포에 소 혈청(Bovine Calf Serum)을 10% 첨가한 Dulbecco's Modified EaDCRT Media(DMEM, Gibco)를 성장배지(GM, growth media)로 사용하여 2Х10⁴ cells/㎖의 농도로 현탁하여 1 ㎖씩 24 웰-플레이트에 접종하여 지방세포를 confluent 상태가 되도록 3일 동안 배양하였다. 지방분화를 유도하기 위해 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에 insulin, dexamethasone 및 3-isobutyl-1-methylanthin (IBMX)이 첨가된 분화유도배지(DM, differentiation media)로 교체하여 2일 동안 배양하였다. 2일 후 insulin이 함유된 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 기존배지에 첨가하였다. 지방분화 과정 중 약물의 효과를 확인하기 위하여 배지를 교체 시 약물을 함께 처리하였다. 위와 동일한 조건으로 분화를 유도한 후 생성된 트리글리세리드(Triglyceride, TG)를 측정하기 위하여 지방생성 색도계 (Adipogenesis Colorimetric Assay, Biovision사) 키트를 이용하여 측정하였다. 제공된 키트 내 프로토콜에 따라서, 세포를 PBS로 한번 세척한 후 지방 추출물 용액 (Lipid Extract solution)을 100㎕를 넣어 세포를 긁어 모은 후 30분 동안 90도에 두었다. 그 후 뿌옇게 변한 상층액이 투명해질 때까지 상온에 둔 후 50 ㎕의 상층액을 얻어 96 웰- 플레이트에 옮겨주었다. 그리고 2 ㎕의 리파아제를 넣어 10분 동안 반응시킨 후 프로브(probe)와 효소 믹스(enzyme mix)가 함유된 반응 혼합액을 50 ㎕를 넣어 처리하여 반응시킨 후 마이크로플레이트 측정기로 570 nm에서 발색 정도를 측정하였다. 키트 내 포함된 트리글리세리드 샘플에 따른 농도별 표준곡선을 이용하여 세포에 생성된 트리글리세리드 농도를 결정하였다. 억제율은 양성대조군을 100%로 하여 하기 수학식 3에 따라 계산하였고, 그 결과는 하기 표 8 및 9에 나타낸 바와 같다.

각 그룹간의 통계학적 유의성 있는 분산을 결정하기 위하여 student t-test를 이용하여 분석하고, 표기되는 결과 값은 GM군과의 비교를 통해 #p < 0.001로, DM군과의 비교를 통해 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 기준의 통계적 유의성으로 표기하였다.

[수학식 3]

가르시니아 추출물, 오갈피 추출물, HCA 또는 키사노제닌을 단독으로 투여한 경우보다 가르시니아 추출물과 오갈피 추출물을 혼합하거나 HCA와 키사노제닌을 혼합하여 사용한 경우에 중성지방 억제 효과가 더 높은 것을 알 수 있다.

실시예 7. 오갈피 추출물 및 가르시니아 추출물의 체지방 합성 mRNA 발현 억제 효과 확인

쥐의 지방전구세포인 3T3-L1 세포에 소 혈청(Bovine Calf Serum)을 10% 첨가한 Dulbecco's Modified EaDCRT Media(DMEM, Gibco)를 성장배지(GM, growth media)로 사용하여 2Х10⁴ cells/㎖의 농도로 현탁하여 1 ㎖씩 24 웰-플레이트에 접종하여 지방세포를 confluent 상태가 되도록 3일 동안 배양하였다. 지방분화를 유도하기 위해 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에 insulin, dexamethasone 및 3-isobutyl-1-methylanthin (IBMX)이 첨가된 분화유도배지(DM, differentiation media)로 교체하여 2일 동안 배양하였다. 2일 후 insulin이 함유된 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 기존배지에 첨가하였다. 지방분화 과정 중 약물의 효과를 확인하기 위하여 배지를 교체 시 약물을 함께 처리하였다. 위와 동일한 조건으로 분화를 유도한 후 TRizol 시약(Ambion)의 권장 방법에 따라 전체 RNA를 분리했다. 전체 RNA의 양과 순도는 NanoDrop 2000(Waltham, MA)을 이용하여 정량 한 후 실험에 이용하였다. cDNA 합성은 전체 RNA 1 μg과 10 몰 올리고-dT18프라이머를 가지고 옴니스크립트 (Omniscript) 역전사효소 (Qiagen, Valencia, CA)을 이용해 합성되었다. RT-PCR 합성은 SYBR 그린 마스터 믹스(바이오래드 및 캐나다 헤르큘레스 사)의 권장 실험 방법에 따라 수행하였다. 실험에 사용한 유전자에 대한 프라이머는 하기 표 10에 나타내었다. 억제율은 양성대조군을 100%로 하여 하기 수학식 4에 따라 계산하였고, 그 결과는 하기 표 11 에 나타낸 바와 같다.

[수학식 4]

표 11을 참조하면, 가르시니아 추출물(40 ug/mL)을 단독으로 사용한 경우에 비하여 가르시니아 추출물과 키사노제닌을 3:1의 혼합비로 사용한 경우에 체지방 합성 mRNA의 발현이 감소하는 것으로 나타났다.

실시예 8. 오갈피 추출물 및 가르시니아 추출물의 체지방 합성 단백질 발현 억제 효과 확인

쥐의 지방전구세포인 3T3-L1 세포에 소 혈청(Bovine Calf Serum)을 10% 첨가한 Dulbecco's Modified EaDCRT Media(DMEM, Gibco)를 성장배지(GM, growth media)로 사용하여 2Х10⁴ cells/㎖의 농도로 현탁하여 1 ㎖씩 24 웰-플레이트에 접종하여 지방세포를 confluent 상태가 되도록 3일 동안 배양하였다. 지방분화를 유도하기 위해 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에 insulin, dexamethasone 및 3-isobutyl-1-methylanthin (IBMX)이 첨가된 분화유도배지(DM, differentiation media)로 교체하여 2일 동안 배양하였다. 2일 후 insulin이 함유된 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 기존배지에 첨가하였다. 지방분화 과정 중 약물의 효과를 확인하기 위하여 배지를 교체 시 약물을 함께 처리하였다. 위와 동일한 조건으로 분화를 유도한 후 배양 후 스크래퍼로 세포를 모은 후 인산완충 식염수(Hyclone, SH30258.01)로 세척하였다. 단백질 추출 용액인 RIPA 완충액(Elpis Biotech, Daejeon, South Korea)에 단백질 분해효소 억제제 칵테일 정제를 첨가 한 뒤 세포를 균질화 시켰다. 30분 동안 얼음에서 반응시키고 13000rpm, 4℃, 15분 원심분리 후 상등액을 새 튜브에 옮겼다. 단백질을 BCA 단백질 분석 키트(Thermo, 23227)를 이용해 BCA 방법으로 정량 후 농도를 일정하게 샘플을 만들었다. SDS-PAGE 겔에 로딩 하여 100 V에서 120 분간 전기영동을 진행했다. 진행이 끝난 겔을 100% 메탄올에 활성화시킨 PDVF 멤브레인에 400 mA에서 60분간 트랜스퍼한 후 5Х무단백질 일반 블록용액(General block Solution, Translab, TLP-115.1G)과 DW를 이용해 1Х 블록킹 용액을 만들어 60분 동안 블록킹했다. 확인하고자 하는 단백질에 대한 1차 항체를 넣고 4℃에서 16시간 반응시켰다. PBS-T로 세척을 한 후 2차 항체를 넣고 60분 동안 반응시킨 뒤 PBS-T로 세척했다. ECL 용액(Thermo, 34580)을 이용해 밴드를 탐지했다. 단백질 밴드는 Amersham Imager 680으로 감지하고 Amersham Imager 680 Analysis Software(Version 2.0.0)를 이용해 시각화 했다. a-튜블린(tubulin)은 세포내 단백질의 로딩 대조군으로 사용하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5를 참조하면, 비만 관련 유전자를 조절하는 전사인자인 PPARγ 발현양을 웨스턴 블롯(western blot)으로 확인한 결과, 가르시니아 추출물(40 ug/mL) 또는 키사노제닌 (10 ug/mL) 단독 투여한 것에 비해 가르시니아 추출물(30 ug/mL)와 키사노제닌(10 ug/mL) 또는 가르시니아 추출물(60 ug/mL) 또는 키사노제닌(20 ug/mL) 처리한 것이 억제효과가 상승하였다.

실시예 9. 가르시니아 추출물 및 오갈피 추출물의 근육세포에서의 포도당 흡수능 촉진 효과 확인

레트의 근아세포(myoblast)인 L6 세포를 근관세포(myotube)로 분화시키기 위해 소 혈청(Fetal Bovine Serum) 10%와 항생제(antibiotic antimycotic) 1%를 첨가한 MEM 배지(Welgene)에 1Х10⁴ 세포/㎖의 농도로 현탁 하여 500 ㎕씩 24 웰-플레이트에 접종하여 2일 동안 세포가 가득 차게 배양하였다. 이후, 2% 소혈청이 함유된 MEM 배지로 2일에 한 번씩 배지를 교체해주면서 7일간 배양하였다. 분화가 완료된 근관세포는 실험 전 혈청이 없는 배지로 교환한 후 6시간 두었다. 근관세포에 100 nM 돼지 유래 인슐린 및 20 μM의 사이토칼신(cytochalacin) B를 15분간, 다른 시료들은 30분간 전처리하였다. 이후, 0.2 μCi/mL 2-디옥시-D-[14C]-글루코스 (2-DG)을 처리하고 5분간 37℃에 배양하였다. 반응이 끝나면 크렙스-링거 완충액으로(20 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 및 0.5 mM EGTA, pH 7.4) 2회 씻어내고, 0.5N NaOH로 세포를 융해시켜 섬광 칵테일(scintillation cocktail)과 섞었다. 세포 내 2-DG의 방사선량을 액체 섬광 계수기(Tri-Carb 2900TR liquid scintillation analyzer, Perkin Elmer)를 이용해 측정하였다. 세포 내 포도당 흡수율은 하기 수학식 5에 따라 계산하였고, 이후 계산된 값을 대조군 0% 인슐린 처리군을 100%로 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 값을 보정하였다. 결과는 하기 표 12 에 나타내었다.

[수학식 5]

근육세포가 높은 포도당 흡수율을 가질수록 증가된 혈당 수치를 낮추는 것을 의미한다. 표 12를 참조하면, 오갈피 추출물, 가르시니아 추출물, HCA 또는 키사노제닌을 단독으로 사용한 경우보다 오갈피 추출물과 가르시니아 추출물을 혼합하여 사용한 경우 HCA 및 키사노제닌을 혼합하여 사용한 경우에 근육세포로의 포도당 흡수가 높은 것을 알 수 있다.

실시예 10. 키사노제닌과 Ca-HCA 화합물 병합처리에 의한 항당뇨 시너지 효과 검증

키사노제닌과 HCA의 조합에 따른 상승효과를 확인하기 위해 Isobologram 분석을 이용하였다. 분화시킨 L6 근관세포를 실시예 9와 동일한 방법으로 포도당 흡수능을 측정하였으며, 키사노제닌의 EC₅₀은 23.32 μM, Ca-HCA의 EC50는 27.6 μM로 확인되었다. 다음으로, 키사노제닌 EC₅₀값의 1/2에 해당하는 농도 12 μM을 고정하고 다양한 농도 범위의 Ca-HCA와 병합처리하여 Ca-HCA의 EC₅₀ 값을 산정하였다. 반대로 Ca-HCA EC₅₀값의 1/2에 해당하는 농도 14 μM을 고정하고 다양한 농도 범위의 키사노제닌과 병합처리하여 키사노제닌의 EC₅₀ 값을 산정하였다. 각 값을 아래의 수학식 6에 대입하여 CI 값을 계산하여, CI > 1 인 경우 두 화합물은 길항작용, CI = 1 인 경우 첨가효과, CI < 1 인 경우 상승작용으로 판단하였다.

[수학식 6]

이에 따른 CI 값을 계산하고 이를 도 6에 나타내었다.

계산 결과는 도 6 에 나타내었다.

실시예 11. 오갈피 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물 병합처리에 의한 시너지 효과 in vivo 검증

8주령 수컷 C57bl/6J 마우스를 2주간 기본사료(AIN-76A diet)로 적응시킨 후 10주령부터 Diet Induced Obesity Diet Formulas (D12451) 60 kcal% HFD식이를 2주간 섭취하여 평균 체중이 28g 이상이 될 때 시험 약물을 투여하였다. 마우스의 동물 사육실 환경은 항온(25± 2℃항습(50± 5%) 및 12시간 간격의 광주기(light on 07:00 ~19:00)로 명암이 조절되는 SPF 환경을 유지하였다. 실험군은 단독 시료(가르시니아 추출물, 오갈피 추출물) 및 이의 복합 시료 (가르시니아 추출물 + 오갈피 추출물), 양성대조군 (Metformin)으로 설정하고, 군당 10마리씩 구분하여 HFD식이와 매일 1회 10주간 병행하여 투여하였다. 시험약물은 0.5% CMC (Carboxymethyl cellulose)에 분산시켜 0.2ml 용량으로 투여하고, 약물투여는 경구투여용 금속제 존대(Zonde)를 이용하여 위 내로 강제 경구투여 하였다.

11-1. 체중 변화, 식이효율 및 장기무게 변화

체중 및 식이섭취량은 매주 일정한 시간에 측정하여 기록하였다.

① 총 체중 증가량: 실험종료 시 체중 - 실험시작 시 체중

② 식이섭취량 (food intake) = 1일 평균 식이섭취량 - 총 사료 섭취량/days

③ 식이효율 (food efficiency ratio, FER) = [total weight gain/ total food intake] Ⅹ 100

하기 표 13에 나타낸 바와 같이, 오갈피 추출물과 가르시니아 캄보지아 추출물의 병용처리군에서는 각각의 추출물 단독처리군과 비교하여 식이효율에 현저한 감소가 나타나는 것으로 확인되었다. 식이효율의 감소는 체지방 감소에 도움이 될 수 있다.

또한, 신장과 비장의 무게에 변화가 없는 것은 실험물질이 대사와 면역에 관련된 장기에 독성이 없다는 것을 의미한다.

11-2. 체지방 감소

각 실험동물의 복막주변 백색지방(retroperitoneal adipose tissue)과 백색내장지방 (intestines white adipose tissue)을 적출 후 지방조직의 중량을 산출하였다.

하기 표 14에 나타낸 바와 같이, 오갈피 추출물과 가르시니아 캄보지아 추출물의 병용처리군에서는 각각의 추출물 단독처리군과 비교하여 체내 백색지방의 감소율이 크게 향상된 것으로 확인되었다.

11-3. 경구 포도당 부하 검사

시험약물 10주간 투여 후 부검 1일전에 마우스를 12시간 절식시킨 후 혈당을 측정하고 곧 바로 포도당(1g/kg)을 복강투여 (i.p) 한 후 0 및 30분에 혈당을 측정하였다. 혈당 측정에 사용할 혈액은 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당을 혈청분석기(Accutrend plus GCTL Cobas Roche, Germany)로 측정하였다.

하기 표 15에 나타낸 바와 같이, 오갈피 추출물과 가르시니아 캄보지아 추출물의 병용처리군에서는 각각의 추출물 단독처리군과 비교하여 경구 포도당 부하 저해율이 현저히 높은 것으로 확인되었다.

11-4. 혈청검사

최종 실험 종료 후 심장천자법으로 채혈하여 혈액생화학적 검사를 실시하기 위하여 채혈 후 30분 이내 3,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 혈장(plasma)을 분리하여 -74℃에 보관하다가 blood chemistry, ELISA 분석을 진행하였다. 지질함량의 지표인 총콜레스테롤 (total cholesterol), HDL (High-density lipoprotein), LDL (Low-density lipoprotein), 중성지방(triglyceride), FFA, glucose, LDH의 함량을 생화학자동 분석기 (Hitachi-720, Hitachi Medical, Japan)를 이용하여 측정하였다. IGF-1과 Creatine은 각 항체를 코팅 완충용액에 희석하여 마이크로웰에 코팅한 후 4℃에서 밤새 방치하고, 각 웰을 3회 완충용액으로 세척한 후, 혈청 (10배 희석)을 100 ㎕씩 분주하고, 1시간 동안 실온에서 방치한 후 2회 완충용액으로 세척했다. 이후, 항체 아비딘-HRP 접합체 100 ㎕를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척했다. TMB 기질을 100 ㎕씩 분주하여 암소에서 30분간 방치한 후 50 ㎕의 스톱 용액을 처리하고, ELISA 판독기로 450 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정했다.

하기 표 16에 나타낸 바와 같이, 오갈피 추출물과 가르시니아 캄보지아 추출물의 병용처리군에서는 각각의 추출물 단독처리군과 비교하여 IGF-1 저해율이 현저히 높은 것으로 확인되었다. IGF-1의 증가는 렙틴의 증가와 관련이 되어 있고, 체지방이 증가하면 혈중 렙틴이 증가하기 때문에, IGF-1의 발현이 현저히 저해되었다는 것은 체지방이 감소되었다는 것을 의미한다.

또한, 오갈피 추출물과 가르시니아 캄보지아 추출물의 병용처리군에서는 각각의 추출물 단독처리군과 비교하여 크레아틴(creatine) 저해율이 현저히 우수한 것으로 확인되었다. 크레아틴의 증가는 심혈관 질환, 비만, 고혈압 등 대사증후군의 위험 증가와 관련이 있기 때문에(Korean J clin Lab Sci 2019;51:42-49), 병용처리군의 비만 등 예방 또는 치료 효과는 각각의 단독 처리군보다 현저히 우수하다는 것으로 해석될 수 있다.

11-5. 지방조직 C/EBP-α mRNA 분석

RNAsolB (Tel-Test) 용액을 사용하여 조직으로부터 RNA를 추출한 뒤 One-step SYBR Green PCR kit(AB science)를 사용하여 cDNA 및 real-time PCR 분석을 하였다. 지방조직에 RNAzolB 500 ㎕를 넣고 homogenizer로 조직을 분쇄하여 여기에 chloroform 50 ㎕를 첨가한 후 15초 간 다시 혼합한다. 이를 얼음에 15 분간 방치한 후 13,000 rpm에서 원심 분리한 후 약 200 ㎕의 상층액을 회수하여 2-propanol 200 ㎕와 동량 혼합 후 천천히 흔들고 얼음에서 15 분간 방치하였다. 이를 다시 13,000 rpm에서 원심 분리한 후 80% EtOH로 수세하고 3분간 vaccum pump에서 건조하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 diethyl pyrocarbonate (DEPC)를 처리한 20 ㎕의 증류수에 녹여 heating block 75℃에서 불활성화 시킨 후 first strand cDNA합성에 사용하였다. 역전사 (reverse transcription) 반응은 준비된 total RNA 3 ㎍을 DNase I (10U/㎕) 2U/tube를 37℃ lock에서 30분간 반응한 후 75℃에서 10분 동안 변성시키고, 이에 2.5 ㎕ 10 mM dNTPs mix, 1 ㎕ random sequence hexanucleotides (25 pmole/ 25 ㎕), RNA inhibitor로서 1 ㎕ RNase inhibitor (20 U/㎕), 1 ㎕ 100 mM DTT, 4.5 ㎕ 5ХRT buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2)를 가한 후, 1 ㎕의 M-MLV RT (200 U/㎕)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 하였다. 이 20 ㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에서 5초간 원심침강하여 37℃ lock에서 45분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction (PCR)에 사용한다. C/EBP-α mRNA 증폭을 위해 forward 5'-TGGACAAGAACAGCAACGAGTAC-3'와 reverse 5'-CGGTCATTGTCACTGGTCAACT-3', intra control인 GAPDH mRNA 증폭을 위해 5'-TGCATCCTGCACCACCAACTGCTTAG-3' 서열의 VIC probe를 사용하였다. Real time quantitative PCR은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다.

하기 표 17에 나타낸 바와 같이, 오갈피 추출물과 가르시니아 캄보지아 추출물의 병용처리군에서는 각각의 추출물 단독처리군과 비교하여 지방조직의 C/EBP-α mRNA 발현 저해율이 현저히 높은 것으로 확인되었다. C/EBP-α는 지방세포 분화에 관여하는 전사인자이므로, 이의 발현을 억제하는 효과가 우수하다는 것은 체지방 감소에 도움이 될 수 있다는 것을 의미한다.

11-6. 통계처리

다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean±standard error of mean(SEM)로 기록하고, 유의성 검증은 student's T-test 분석방법을 이용하여 결정한다. 상기 데이타는 측정된 개개 최종 포인트(point)에 대한 각 그룹간의 통계학적 유의성 있는 분산을 결정하기 위하여 일원분산 분석법(one-way ANOVA)을 이용하여 분석하고 각 군간의 통계적 유의성은 비모수적 검정법(nonparametric Mann-Whitney test) 및 다중분석 비교법 (Dunnett's multiple comparison test; IBM SPSS statistics version 19.0 statistic software, Inc, IBM, USA)을 이용하였다. 표기되는 결과 값은 정상대조군과의 비교를 통해 ##p < 0.01, ###p < 0.001로, HFD군과 비교를 통해 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 기준의 통계적 유의성으로 표기하였다.

실시예 12. 키사노제닌 및 가르시니아 캄보지아 추출물 병합처리에 의한 시너지 효과 in vivo 검증

8주령 수컷 C57bl/6J 마우스를 2주간 기본사료(AIN-76A diet)로 적응시킨 후 10주령부터 Diet Induced Obesity Diet Formulas (D12451) 60 kcal% HFD식이를 2주간 섭취하여 평균 체중이 28g 이상이 될 때 시험 약물을 투여하였다. 마우스의 동물 사육실 환경은 항온(25± 2℃항습(50± 5%) 및 12시간 간격의 광주기(light on 07:00 ~19:00)로 명암이 조절되는 SPF 환경을 유지하였다. 실험군은 단독 시료(가르시니아 추출물 또는 키사노제닌) 및 이의 복합 시료 (가르시니아 추출물 + 키사노제닌), 양성대조군 (Metformin)으로 설정하고, 군당 10마리씩 구분하여 HFD식이와 매일 1회 10주간 병행하여 투여하였다. 시험약물은 0.5% CMC (Carboxymethyl cellulose)에 분산시켜 0.2ml 용량으로 투여하고, 약물투여는 경구투여용 금속제 존대(Zonde)를 이용하여 위내로 강제 경구투여 하였다.

12-1. 경구 포도당 부하 검사

하기 표 18에 나타낸 바와 같이, 키사노제닌과 가르시니아 캄보지아 추출물의 병용처리군에서는 각각의 단독처리군과 비교하여 경구 포도당 부하 저해율이 현저히 높은 것으로 확인되었다.

12-2. 혈청검사

최종 실험 종료 후 심장천자법으로 채혈하여 혈액생화학적 검사를 실시하기 위하여 채혈 후 30분 이내 3,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 혈장(plasma)을 분리하여 -74℃에 보관하다가 ELISA 분석을 진행하였다. Creatine 항체를 코팅 완충용액에 희석하여 마이크로웰에 코팅한 후 4℃에서 밤새 방치하고, 각 웰을 3회 완충용액으로 세척한 후, 혈청 (10배 희석)을 100 ㎕씩 분주하고, 1시간 동안 실온에서 방치한 후 2회 완충용액으로 세척했다. 이후, 항체 아비딘-HRP 접합체 100 ㎕를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척했다. TMB 기질을 100 ㎕씩 분주하여 암소에서 30분간 방치한 후 50 ㎕의 스톱 용액을 처리하고, ELISA 판독기로 450 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정했다.

하기 표 19에 나타낸 바와 같이, 키사노제닌과 가르시니아 캄보지아 추출물의 병용처리군에서는 각각의 단독처리군과 비교하여 크레아틴(creatine) 저해율이 현저히 우수한 것으로 확인되었다. 크레아틴의 증가는 심혈관 질환, 비만, 고혈압 등 대사증후군의 위험 증가와 관련이 있기 때문에(Korean J clin Lab Sci 2019;51:42-49), 병용처리군의 비만 등 예방 또는 치료 효과는 각각의 단독 처리군보다 현저히 우수하다는 것으로 해석될 수 있다.

12-3. 지방조직 PPAR-gamma mRNA 분석

RNAsolB (Tel-Test) 용액을 사용하여 조직으로부터 RNA를 추출한 뒤 One-step SYBR Green PCR kit(AB science)를 사용하여 cDNA 및 real-time PCR 분석을 하였다. 만들어진 cDNA로부터 PPAR-gamma mRNA 증폭을 위해 5'-TCGGAATCAGCTCTGTGGACCTCTCC-3' 서열의 FAM probe, intra control인 GAPDH mRNA 증폭을 위해 5'-TGCATCCTGCACCACCAACTGCTTAG-3' 서열의 VIC probe를 사용하였다. Real time quantitative PCR은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다.

하기 표 20에 나타낸 바와 같이, 키사노제닌과 가르시니아 캄보지아 추출물의 병용처리군에서는 각각의 단독처리군과 비교하여 PPAR-gamma mRNA의 발현 저해율이 현저히 향상된 것으로 확인이 되었다.

12-4. 통계처리

Claims

(i) 제1 성분으로 키사노제닌과 제2 성분으로 가르시니아 캄보지아 추출물을 1 : 1 내지 1 : 9의 중량비로 포함하거나;
(ii) 제1 성분으로 오갈피 추출물과 제2 성분으로 히드록시 시트르산(HCA)을 1 : 1의 중량비로 포함하거나;
(iii) 제1 성분으로 키사노제닌과 제2 성분으로 HCA를 1 : 1의 중량비, 2.55 : 14의 몰비 또는 12 : 2.54의 몰비로 포함하거나, 또는
(iv) 제1 성분으로 오갈피 추출물과 제2 성분으로 가르시니아 캄보지아 추출물을 1 : 1의 중량비로 포함하는,
당뇨 또는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
(i) 제1 성분으로 키사노제닌과 제2 성분으로 가르시니아 캄보지아 추출물을 1 : 1 내지 1 : 9의 중량비로 포함하거나;
(ii) 제1 성분으로 오갈피 추출물과 제2 성분으로 히드록시 시트르산(HCA)을 1 : 1의 중량비로 포함하거나;
(iii) 제1 성분으로 키사노제닌과 제2 성분으로 HCA를 1 : 1의 중량비, 2.55 : 14의 몰비 또는 12 : 2.54의 몰비로 포함하거나, 또는
(iv) 제1 성분으로 오갈피 추출물과 제2 성분으로 가르시니아 캄보지아 추출물을 1 : 1의 중량비로 포함하는,
당뇨, 비만 또는 당뇨 및 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
(i) 제1 성분으로 키사노제닌과 제2 성분으로 가르시니아 캄보지아 추출물을 1 : 1 내지 1 : 9의 중량비로 포함하거나;
(ii) 제1 성분으로 오갈피 추출물과 제2 성분으로 히드록시 시트르산(HCA)을 1 : 1의 중량비로 포함하거나;
(iii) 제1 성분으로 키사노제닌과 제2 성분으로 HCA를 1 : 1의 중량비, 2.55 : 14의 몰비 또는 12 : 2.54의 몰비로 포함하거나, 또는
(iv) 제1 성분으로 오갈피 추출물과 제2 성분으로 가르시니아 캄보지아 추출물을 1 : 1의 중량비로 포함하는,
당뇨 또는 비만의 예방 또는 개선용 사료 조성물.