KR101656726B1 - 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 중증혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 중증혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 라이소자임은 HMGB1(High mobility group box 1)의 분비를 억제 할뿐만 아니라 전염증성 시그날링(proinflammatory signaling)을 조절하여 혈관 염증성 반응을 억제하며, 실제로 질환동물모델에서 혈관염증질환의 예방 또는 치료효과가 현저하므로 산업상 이용가능성이 높다.

Description

라이소자임을 유효성분으로 포함하는 중증혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating of severe vascular inflammatory disease comprising lysozyme as an active ingredient}

본 발명은 라이소자임의 HMGB1-관련 매커니즘 억제 효과 및 이로 인한 신규한 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 중증혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

HMGB1(high mobility group box 1)은 높은 전기영동 이동성(electrophoretic mobility)을 가지는 비히스톤 염색체 단백질이다. HMGB1은 활성화된 대식세포, 수지상 세포 및 NK세포(natural killer cell)로부터 활발히 생성되며 부수적으로 괴저성 세포(necrotic cell)로부터 수동적 분비되고, 중요한 구조적 역할 및 유전자 전사 조절과 함께 내 핵 기능(intracellular nuclear function)하며, 그리고 세포 외 활성(extracellular activity)을 가진다. HMGB1은 인체내에서 흉선, 림프절, 고환, 태아의 간 등에서 높은 농도로 존재하며, 간세포와 뇌세포를 제외하면 대부분의 세포에서는 주로 핵 내에 존재하지만, 염증을 유발하는 물질에 의해 세포나 조직이 활성화되면 세포 밖으로 분비된다. HMGB1은 염증을 유발하는 사이토카인이고, HMGB1의 길항제가 항염증물질로 효과가 있다는 것이 보고되었다. 염증반응 초기에 다양한 종류의 물질, 예를 들어 각종 사이토카인들이 만들어져 염증을 더욱더 악화시킨다. 이러한 염증반응 매개물질에는 케모카인, 사이토카인, 혈장효소단백질, 지용성 염증매개물질 등을 들을 수 있다.

HMGB1의 전염증성(pro-inflammatory) 특징은 HMGB1이 세포로부터 분비되고 이로인한 리셉터의 자극을 통해 수득되며, 이는 다양한 인간 질병의 발병에 기여한다. HMGB1 분비의 kinetics는 TNF-α 및 IL-1β와 같은 고전적인 초기 사이토카인(classical early cytokine)에 비례하여 지연된다. HMGB1은 RAGE(receptor for advanced glycation end products), TLR (toll like receptor)-2, TLR-4와 같은 몇몇 막관통 리셉터에 결합하고, NF-κB와 ERK(extracellular regulated kinase) 1 및 ERK 2를 활성화한다. HMGB1에 의한 내피세포의 활성화는 VCAM(vascular cell-adhesion molecule), ICAM(intercellular adhesion molecule) 및 E-selectin과 같은 세포부착분자(cell-adhesion molecules, CAMs)들의 발현을 유도하며, 이는 백혈구의 소집(leukocyte recruitment)을 통하여 염증을 증가시킨다.

근래의 연구들에서 HMGB1은 중증 혈관염증질환(severe vascular inflammatory disease)의 중요한 세포외 매개자(extracellular mediator)인 것으로 밝혀졌다. 혈관 염증은 아테롬성 동맥경화증의 플라크 형성의 개시 및 진행에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이 외에도 혈관 염증과 관련하여 다양한 질병기전이 보고되고 있다.

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이에 본 발명자들은 중증 혈관염증질환에 대한 치료물질을 연구하던 중, 라이소자임이 HMGB1 및 이와 관련된 세포 시그날링의 분자적 매커니즘을 조절하여 HMGB1에 의해 매개된 혈관염증성 반응들을 억제할 뿐만아니라, 실제로 in vivo 혈관염증질환 동물 모델에 대하여 치료효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 중증혈관염증질환(severe vascular inflammatory disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 중증혈관염증질환(severe vascular inflammatory disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 상기 라이소자임(lysozyme, EC 3.2.1.17)은 일반적으로 박테리아 세포벽의 펩티도글리칸에서 N-아세틸뮤라믹산(NAM) 및 N-아세틸글루코사민(NAG) 사이의 β-1,4 글리코시드 결합을 절단하는 효소로서 정의되며, 뮤라미다제(muramidase) 또는 1,4-β-N-아세틸뮤라미다제(1,4-β-N-acetylmuramidase) 등으로 불린다. 이 효소는 1992년에 처음 발견된 이래 이제까지 많은 종류의 척추, 무척추동물 및 식물과 미생물들에서 광범위하게 발견되어져 왔다. 이제까지 발견된 lysozyme은 그들의 물리화학적 특성과 발현된 생물의 유형에 따라 크게 5종류 chicken type(c-type), goose type(g-type), phage, plant와 fungus type lysozymes로 분류된다.

본 발명의 라이소자임은 바람직하게 달걀 흰자(chicken egg white)로부터 유래되는 라이소자임일 수 있으며, 가장 바람직하게 EC Number 235-747-3의 lysozyme (CAS Number 12650-88-3 )일 수 있다.

본 발명자들은 혈관내피세포에서 라이소자임이 HMGB1(High mobility group box 1)의 분비 억제뿐만 아니라 전염증성 시그날링(proinflammatory signaling)을 억제한다는 사실을 처음으로 규명하였으며, 실제로 혈관염증질환 동물 모델에서 라이소자임이 예방 또는 치료효과가 있다는 사실을 확인하였다.

이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나 있다.

본 발명의 실시예에서는, 먼저 혈관 내피세포로서 HUVEC 세포를 이용하여 in vitro 상에서 라이소자임의 기능을 평가하였다. 라이소자임의 처리는 LPS에 의해 매개된 HMGB1의 분비를 억제하고, HMGB1에 의한 세포골격 재분배를 억제하였다. 또한 라이소자임은 HMGB1에 의해 매개된 혈관 내피세포의 과투과성(hyperpermeability) 및 백혈구 이동을 억제하였다. 게다가 HMGB1에 의해 유도되는 Akt, nuclear factor-κB (NF-κB) 및 extracellular regulated kinases 1/2(ERK1/2)의 활성화와 interleukin (IL)-1β, IL-6, tumor necrosis factor-α (TNF-α), 및 chemoattractant protein-1 (MCP-1)의 생산을 억제하였다. 상기 효과들을 in vivo 상에서 확인하기 위하여, 마우스에 CLP(cecal ligation and puncture) 수술을 하여 혈관염증질환 동물모델을 제작하고 이에 대한 라이소자임의 영향을 확인하였다. 그 결과 혈관염증질환 마우스 모델에서도, CLP 수술에 의한 HMGB1의 분비, 백혈구의 이동, 사망률 및 폐 손상이 억제되며 현저한 치료효과를 나타내었다.

상기 in vitro 및 in vivo 실험을 통하여 보인 바와 같이, 라이소자임은 HMGB1에 의해 매개되는 염증성 반응들을 억제하며, 이러한 HMGB1 signaling pathway의 억제를 통해 혈관염증질환을 치료하는 효과가 있다.

따라서 본 발명은 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 중증혈관염증질환(severe vascular inflammatory disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 용어‘혈관염증질환’은, 혈관(또는 심혈관 시스템 조직)에서의 염증성 반응과 이에 따른 혈관 조직 손상을 특징으로 하는 혈관(또는 심혈관 시스템 조직) 병증을 의미하는 것으로, 염증성 심장혈관 질환 또는 장애, 염증성 뇌혈관 질환 또는 장애, 관상 동맥 또는 말초혈관 질환 또는 장애 등을 모두 포함하는 의미이다. 더욱 구체적으로는, 동맥경화증, 심근 경색증, 뇌졸중, 죽상동맥경화증, 동맥협착증(arterial stenosis), 혈관재협착증(restenosis), 패혈증(sepsis) 또는 혈관염(vasculitis) 등을 포함한다.

본 발명에서 용어‘중증 혈관염증질환’은 상기 혈관염증질환이 무거운 병태에 있는 것을 의미하는 것으로, 광범위한 호중구 백혈구의 침윤, 혈관주위 부종 형성, 조직구조의 광범위한 파괴 또는 농양(abscess) 형성 증상의 일부 또는 전부를 포함하는 의미다. 이는 경미한 병태 즉, 경증 혈관염증질환과 구분된다.

본 발명의 상기 중증혈관염증질환은 바람직하게 HMGB1(High mobility group box 1)에 의해 매개되는 혈관염증질환일 수 있고, 당업계에 HMGB1에 의해 매개되는 것으로 알려진 혈관염증질환이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나 예를 들어 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 동맥협착증(arterial stenosis), 혈관재협착증(restenosis), 패혈증(sepsis) 및 혈관염(vasculitis) 등을 포함한다. 이때 상기 동맥협착증 또는 혈관재협착증은 혈관성형술(angioplasty)에 의한 것일 수 있다.

상기 혈관염에서, 혈관 내강은 통상적으로 약화되는데, 이는 관련 혈관에 의해 공급되는 조직의 허혈과 관련된다. 이러한 과정으로부터 생기는 질환의 광범위는, 혈관(예: 동맥, 정맥, 세동맥, 세정맥, 모세혈관)의 모든 유형, 크기 및 위치가 관련될 수 있다는 사실로 인한 것이다. 혈관염은 일반적으로, 아래에 기술된 바와 같이, 감염된 혈관의 크기에 따라 분류된다. 대형 혈관 질환에는 거대 세포 동맥염(관자 동맥염 또는 두개 동맥염으로 지칭됨), 다발성 류마티스성 근육병 및 다카야수 동맥염(대동맥궁 증후군, 젊은 여성의 동맥염 및 무맥증 등으로 지칭됨)이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 중간 혈관 질환에는 전형적인 결절다발동맥염 및 가와사키(Kawasaki)병 (점막피부 림프절 증후군)이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 소형 혈관 질환의 예로는 베쳇 증후군, 베그너(Wegner) 육아종증, 현미경적 다발성혈관염(microscopic polyangitis), 과민성 혈관염 (피부 혈관염), 소형 혈관의 혈관염, 헤노크-숀레인(Henoch-Schonlein) 자반병, 처그 스트라우스(Churg Strauss) 증후군 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 기타 혈관염으로는 중추 신경계 혈관염, 혈전혈관염(Buerger 질환으로 공지됨)이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전통적인 결절다발동맥염(PAN), 현미경적 PAN, 및 처그 스트라우스(Churg Strauss) 증후군은 또한 종종 함께 분류되고, 전신성 괴사 혈관염으로 호칭된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 라이소자임을 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

라이소자임은 HMGB1(High mobility group box 1)의 분비를 억제 할뿐만 아니라 전염증성 시그날링(proinflammatory signaling)을 조절하여 혈관 염증성 반응을 억제하며, 실제로 질환동물모델에서 혈관염증질환의 예방 또는 치료효과가 현저하다.

도 1은 HUVEC 세포를 LPS(100 ng/mL)로 16시간동안 자극한 후, 표시된 각각의 농도로 라이소자임을 6시간 처리하였을 때 HMGB1 분비량을 나타낸 것으로, 상기 HMGB1 분비량은 ELISA에 의해 측정되었다(P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, LPS: lipopolysaccharide, *p < 0.05 versus LPS alone, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean± SEM으로서 나타냄).
도 2는 CLP를 수행한 수컷 C57BL/6 마우스들(n=5)에, CLP로부터 12시간 후에 라이소자임(0.57-5.72 ㎍ per mouse)을 정맥주사하고, CLP로부터 24시간 후에 상기 마우스를 안락사시키고 혈장 속 HMGB1 level을 측정한 결과를 나타낸 것으로, 상기 HMGB1 분비량은 ELISA에 의해 측정되었다(P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, *p < 0.05 versus CLP, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄).
도 3은 Confluent HUVEC 세포에 HMGB1(1 ㎍/mL)을 16시간 처리하고 표시된 각각의 농도로 라이소자임을 6시간 처리하였을 때, TLR-2, TLR-4 및 RAGE의 HMGB1 receptor들 발현을 나타낸 것으로, 상기 HMGB1 receptor들의 발현은 cell-based ELISA에 의하여 측정되었다(P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, *p < 0.05 versus HMGB1 alone, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄).
도 4는 MTT assay 방법으로 세포 생존성(cell viability)에 대한 라이소자임의 영향을 측정한 결과를 나타낸다(P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄).
도 5는 HUVEC 세포를 LPS (100 ng/mL, 4 h)로 자극시킨 후, 표시된 각각의 농도로 라이소자임을 6시간 처리하였을 때 세포의 투과성을 평가한 결과를 나타내는 것으로, 상기 투과성은 HUVEC 단일층을 가로지른 Evans blue-결합된 알부민의 유출정도 측정에 의해 모니터링되었다(P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, LPS: lipopolysaccharide, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄, *p < 0.05 versus LPS).
도 6은 HUVEC 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL, 16 h)로 자극시킨 후, 표시된 각각의 농도로 라이소자임을 6시간 처리하였을 때 세포의 투과성을 평가한 결과를 나타내는 것으로, 상기 투과성은 HUVEC 단일층을 가로지른 Evans blue-결합된 알부민의 유출정도 측정에 의해 모니터링되었다(P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄, *p < 0.05 versus HMGB1).
도 7은 HMGB1(H로 표시, 2 ㎍/mouse, i.v.) 또는 CLP(C로 표시, CLP 후 24h) 로 마우스에 혈관투과(vascular permeability)를 유도한 후 lysozyme (0.57- 5.72 ㎍ per mouse)을 주입하여 이의 효과를 확인한 결과를 나타내는 것으로서, 복강 세척액(peritoneal washes)에 포함된 Evans blue 염료의 양을 측정하여 투과성을 평가하였다(5마리의 마우스를 사용하였으며, 상기 투과된 염료의 양은 ㎍ per mouse로 표현된다. H/C는 CLP 또는 HMGB1 처리를 의미하는 것으로 'CLP/HMGB1'과 같은 의미. P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄, *p < 0.05 versus CLP/HMGB1).

도 8은 HUVEC 세포들을 HMGB1(1 ㎍/mL, 16 h)으로 활성화시키고 서로다른 농도의 라이소자임으로 6시간동안 처리한 후, HMGB1에 의해 매개된 phospho-p38 발현에 대한 라이소자임의 영향을 ELISA로 측정한 결과이다(P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄, *p < 0.05 versus HMGB1).
도 9는 glass coverslip 위에서 배양한 HUVEC 세포 단일층을 HMGB1(1㎍/mL)으로 1시간동안 자극하고 lysozyme(50 또는 100 nM)을 6시간동안 처리한 후, 형광표지된 F-actin으로 형광염색한 모습을 나타낸다. 화살표는 세포사이의 틈(intercellular gap)을 나타낸다.
도 10은 HUVEC 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간(VCAM-1 및 ICAM-1에 대한 실험) 또는 22시간(E-selectin에 대한 실험)동안 자극하고 다양한 농도의 라이소자임으로 6시간동안 처리한 후, HMGB1-매개 VCAM-1, ICAM-1 및 E-selectin의 발현 정도를 나타낸 것이다(P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄, *p < 0.05 versus HMGB1).
도 11은 HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 다양한 농도의 라이소자임으로 6시간동안 처리한 후, HUVEC monolayer에 대한 인간 호중구의 부착정도를 나타낸 것이다(P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄, *p < 0.05 versus HMGB1).
도 12는 HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 다양한 농도의 라이소자임으로 6시간동안 처리한 후, HUVEC monolayer를 통한 인간 호중구의 이동(migration)을 분석한 결과를 나타낸 것이다(P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄, *p < 0.05 versus HMGB1).
도 13은 C57BL/6 수컷 마우스를 HMGB1(H로 표시, 2㎍ per mouse, i.v.) 또는 CLP-수술(C로 표시, CLP 수술 후 24h)로 자극하고 lysozyme(0.57-5.72 ㎍ per mouse, i.v.)을 주입하여, 상기 HMGB1 또는 CLP에 의해 매개된 백혈구의 복망강으로의 이동성을 분석한 결과를 나타낸다( H/C는 CLP 또는 HMGB1 처리를 의미하는 것으로 'CLP/HMGB1'과 같은 의미.P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄, *p < 0.05 versus CLP/HMGB1).
도 14는 HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 다양한 농도의 라이소자임으로 6시간동안 처리한 후, HMGB1-매개 NF-κB p65의 활성화 정도를 분석한 결과를 나타낸다(P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄, *p < 0.05 versus HMGB1)
도 15는 HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 다양한 농도의 라이소자임으로 6시간동안 처리한 후, HMGB1-매개 ERK1/2의 활성화 정도를 분석한 결과를 나타낸다(P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄, *p < 0.05 versus HMGB1)
도 16은 HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 다양한 농도의 라이소자임으로 6시간동안 처리한 후, HMGB1-매개 Akt의 활성화 정도를 분석한 결과를 나타낸다(P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄, *p < 0.05 versus HMGB1)
도 17은 HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 다양한 농도의 라이소자임으로 6시간동안 처리한 후, HMGB1-매개 TNF-α생성 정도를 측정한 결과를 나타낸다(P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄, *p < 0.05 versus HMGB1)
도 18은 HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 다양한 농도의 라이소자임으로 6시간동안 처리한 후, HMGB1-매개 IL-1β 생성 정도를 측정한 결과를 나타낸다(P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄, *p < 0.05 versus HMGB1)
도 19는 HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 다양한 농도의 라이소자임으로 6시간동안 처리한 후, HMGB1-매개 IL-6 생성 정도를 측정한 결과를 나타낸다(P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄, *p < 0.05 versus HMGB1)
도 20는 HUVECs 세포를 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 자극하고 다양한 농도의 라이소자임으로 6시간동안 처리한 후, HMGB1-매개 MCP-1 생성 정도를 측정한 결과를 나타낸다(P: PBS vehicle control, LZM: lysozyme, 결과는 5회의 독립적 실험의 mean ± SEM으로서 나타냄, *p < 0.05 versus HMGB1)
도 21은 수컷 C57BL/6 마우스들(n=20)에 CLP 후 12시간째 및 50시간째에 라이소자임(2.86 또는 5.72 ㎍ per mouse)을 정맥투여하고, CLP 후 132시간까지 6시간마다 실험동물의 생존을 모니터링한 결과를 나타낸다. Control CLP mice(●로 표시) 및sham-operated mice (○로 표시)들에는 살균한 식염수가 투여되었다. CLP군에 대비한(versus) 전체 생존률을 조사하기 위하여 Kaplan-Meier survival analysis 방법이 사용되었다(LZM: lysozyme, □는 CLP 후 12시간 및 50시간째에 2.86㎍씩 라이소자임 투여군을 의미, ■는 CLP 후 12시간 및 50시간째에 5.72㎍씩 라이소자임 투여군을 의미).

도 22는 CLP 받은 수컷 C57BL/6 마우스(n=5)들에 CLP 후 12 및 50시간째에 라이소자임(2.86 또는 5.72 ㎍ per mouse)을 정맥투여하고, CLP 후 96시간째에 안락사시켜 관찰한 폐조직의 조직병리학적 스코어(Histopathological score)를 나타낸다(LZM: lysozyme).
도 23은 CLP 받은 수컷 C57BL/6 마우스(n=5)들에 CLP 후 12 및 50시간째에 라이소자임(2.86 또는 5.72 ㎍ per mouse)을 정맥투여하고, CLP 후 96시간째에 안락사시켜 수득한 폐조직을 H&E staining한 현미경사진(200x)이다. 이미지들은 세 번의 독립적 실험을 대표하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험준비>

1. 시약

달걀 흰자위(chicken egg white) 유래 라이소자임(L7651), 박테리아 lipopolysaccharide (LPS; serotype: 0111:B4, L5293), Evans blue 염료, 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 염료 및 항생제(페니실리린 G 및 스트렙토마이신)는 Sigma(St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 인간 재조합 HMGB1은 Abnova (Taipei City, Taiwan)로부터 구입하였으며, FBS(Fetal bovine serum) 및 Vybrant DiD는 Invitrogen (Carlsbad, CA)으로부터 구입하였다.

2. 세포 배양

인간 탯줄 정맥 내피세포(Primary human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)는 Cambrex Bioscience(Charles City, IA)로부터 수득하였고, 10% FBS(fetal bovine serum, HyClone Laboratories, Logan, UT)가 포함된 endothelial cell growth medium (EGM; Cambrex Bioscience)에서 배양되었다. HUVEC 세포는 Lee W et al., 2013 연구에서 묘사된 바와 같이 3-5계대(passage) 배양하고 사용하였다. 인간 호중구(neutrophil)는 다섯명의 건강한 지원자로부터 정맥천자(venipuncture)에 의해 수득된 15 mL의 전혈로부터 분리되었고, Hofbauer R et al., 1998의 연구에서 묘사된 바와 같이 유지되었다.

3. 실험동물 및 사육

몸무게가 18-20g인 6 내지 7주령 C57BL/6 수컷 마우스들을 Orient Bio Co. (Sungnam, KyungKiDo, Republic of Korea)로부터 구입하였고, 12일의 적응기간(acclimatization period) 후에 본 연구에 이용하였다. 실험동물들은 polycarbonate cage 당 5마리씩, 20-25℃의 온도, 40%-45%의 습도 및 12시간 주기의 낮/밤 순환 조건에서 사육되었다. 상기 적응기간 동안, 실험동물들은 일반 설치류 펠렛 사료(rodent pellet diet) 및 물을 자유식이(ad libitum)하였다. 모든 동물 실험은 한국 Institutional Animal Care and Use Committee of Kyungpook National University 의 승인 하에 수행되었다(IRB approval number, KNU2012-13).

4. CLP(Cecal ligation and puncture)

심각한 혈관염증을 유발하기 위하여, 수컷 마우스들은 small rodent gas anesthesia machine(RC2, Vetequip, Pleasanton, CA)을 통하여 주입된 2% isoflurane(Forane, JW Pharmaceutical, South Korea)이 포함된 산소로 마취되었고, 최초에는 breathing chamber에서 마취하고 그 후에는 facemask를 사용하여 실험과정동안 자연스럽게 호흡할 수 있도록 하였다. CLP-유도 중증 혈관염증질환 모델은 Bae JS et al., 2014의 이전 연구에서 묘사된 바와 같이 수행되었다. 간략하게, 2cm의 정중절개(midline incision)를 수행하여 맹장 및 인접한 소장을 노출시켰다. 그 후 맹장 끝부분(cecal tip)으로부터 5.0mm 떨어진 부분을 3.0-비단봉합사(silk suture)로 단단히 묶고, 높은 수준의 혈관염증을 유발하기 위하여 22-게이지의 바늘로 맹장에 구멍을 냈다. 그 후, 상기 구멍 부위로부터 배설물을 압출시키기 위하여 맹장을 부드럽게 짜내었고(squeezed), 상기 맹장을 다시 복막강(peritoneal cavity)으로 복귀시켰다. 마지막으로 개복 부위(laparotomy site)를 4.0-silk로 봉합하였다. sham control 군의 실험동물은 맹장을 노출시킨 후 봉합 또는 구멍을 내는 과정 없이 복강으로 복귀시켰다. 상기 실험 프로토콜은 실험 전 the Animal Care Committee at Kyungpook National University(IRB No. KNU 2012-13)에의해 승인 받았다.

5. ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)

세포배양 배지 또는 마우스 혈장에 포함되어 있는 HMGB1의 농도를 조사하기 위하여, Lee W et al., 2012의 연구에서 묘사된 바와 같이 경쟁적 ELISA를 수행하였다. 구체적으로 in vitro 실험에서 HUVEC 단일층(HUVEC monolayer)은 LPS (100 ng/mL)로 16시간 동안 처리되었으며, 그 후 0 내지 200nM의 라이소자임으로 6시간동안 처리되었다. 그 다음에, HMGB1의 농도를 조사하기 위하여 세포배양액을 수집하였다. ELISA를 수행하기 위하여, 96-well flat plastic microtiter plates (Corning Inc., Corning, NY)를 HMGB1 단백질과 함께 4℃에서 오버나잇(overnight)하여 코팅하였으며, 이때 0.02% sodium azide가 포함된 20 mM carbonate-bicarbonate buffer(pH 9.6)를 사용하였다. 상기 plate를 0.05% Tween 20이 포함된 PBS 용액(PBS-T)으로 3회 세척한 뒤, 4℃에서 보관하였다. 상기 수집된 세포배양액은 동결건조(Lyophilization)시킨 후, 이를 anti-HMGB1 antibody(PBS-T에 1:1000로 희석됨, Abnova, Taipei City, Taiwan)와 함께 96-well round plastic microtiter plate에서 37 ℃, 90분 동안 사전-배양(pre-incubate)하였고, 이를 상기 HMGB1으로 코팅된 플레이트에 옮긴 후, 30분동안 실온에서 배양하였다. 그리고나서 상기 플레이트를 PBS-T 용액으로 3회 세척하고, peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG antibody(PBS-T에 1:2000로 희석됨, GE Healthcare Life Science, Pittsburgh)와 함께 실온에서 90분동안 배양하였으며, 다시 PBS-T 용액으로 3회 세척하고, 200㎕의 기질용액(100 μg/mL o-phenylenediamine 및 0.003% H₂O₂)을 첨가하여 암실에서 상온으로 60분 동안 배양하였다. 반응은 8N H₂SO₄를 50㎕ 처리하여 종료되었다.

in vivo 실험에서는 CLP를 수행한 수컷 C57BL/6 마우스들(n=5)에 CLP로부터 12시간 후 라이소자임(0.57-5.72 ㎍ per mouse)을 정맥주사하고, CLP로부터 24시간 후에 상기 마우스를 안락사시키고 수득한 혈액을 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 여기에 상기 경쟁적 ELISA를 수행하여 마우스 혈장 속에 포함된 HMGB1 농도를 조사하였다.

VCAM-1, ICAM-1 및 E-selectin과 같은 CAM들의 농도를 조사하기 위하여, Che W et al., 2002 및 Bae JW et al., 2011의 연구에서 기술된 바와 같이 전세포 ELISA(whole cell ELISA) 방법이 적용되었다. 간략하게, HUVEC 세포의 융합된 단층(confluent monolayer)에 HMGB1(1 ㎍/mL)을 16시간(VCAM-1 및 ICAM-1에 대한 실험) 또는 22시간(E-selectin에 대한 실험) 동안 처리하고, 그 후 0 내지 200nM 의 라이소자임을 6시간 처리한 후 1% paraformaldehyde로 고정하였다. 3회 세척 후, mouse anti-human monoclonal antibody (VCAM-1, ICAM-1 및 E-selectin 각각에 대한 항체를 의미, PBS-T에 1:50으로 희석됨, Temecula, CA)를 첨가하고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 1시간동안 배양하였다. 상기 배양된 세포들을 세척한 후, peroxidase-conjugated anti-mouse IgG antibody (Sigma)를 1시간동안 처리하였으며, 3회 세척한 후 o-phenylenediamine substrate(Sigma)를 이용하여 상기한 바와 같이 실험을 전개하였다.

상기와 같은 실험과정이 TLR2, TLR4 및 RAGE와 같은 HMGB1 리셉터들의 세포표면 발현을 모니터링하기 위해 이용되었으며, 이때 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA)로부터 수득한 상기 리셉터별 특수항체(각각 A-9, H-80 및 A-9)들을 사용하였다.

인산화된 p38 MAPK, nuclear factor (NF)-κB, MCP-1, Akt, TNF-α, ERK 1/2, IL-1β 및 IL-6의 농도를 조사하기 위하여, 상업용 ELISA kit를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였다; MCP-1, IL-1β, IL-6, 전체(total) 및 인산화된 ERK 1/2, TNF-α를 조사하는 데는 R&D Systems(Minneapolis, MN)로부터 구입한 ELISA kit를 사용하였고, 전체(total) 및 인산화된 Akt, 인산화된 p38, 전체(total) 및 인산화된 p65 NF-κB를 조사하는데는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, Catalog NO. #7170, #7252)로 부터의 ELISA kit를 사용하였다. ELISA plate reader (Tecan, Austria GmbH, Austria)를 이용하여 값을 측정하였다.

6. 세포 생존 에세이(Cell viability assay)

세포 생존의 지표로서 MTT assay 방법을 이용하였다. 세포들은 96-well plates에서 5 × 10³ cells/well 의 밀도로 배양되었다. 24시간 후에, 세포들을 새 배지(fresh medium)로 세척하였으며, 0 내지 200nM의 라이소자임을 처리하였다. 48시간의 배양 후에, 세포들을 세척하고 100㎕의 MTT(1 mg/mL)를 첨가하여 4시간 배양하였다. 마지막으로 dimethyl sulfoxide(DMSO) 150㎕를 첨가하고, 생성된 formazan salt의 양을 microplate reader(Tecan Austria GmbH, Austria)를 사용하여 540 nm에서 OD(optical density)를 측정함으로서 조사하였다.

7. in vitro 투과성 에세이 (Permeability assay)

0 내지 200nM의 라이소자임으로 처리된 내피세포의 투과성(Endothelial cell permeability)은 Bae JS et al., 2007에 기술된 two-compartment chamber model을 이용하여 기능적 세포 단일층(functional cell monolayer)을 가로지른 Evans blue-결합된 알부민의 유출을 분광광도 측정(spectrophotometric measurement)하는 방법에 의해 정량하였다. HUVEC 세포들은 3μm pore size, 12mm 직경의 transwell 에 5 X10⁴/well 로 분주되었고, 3일 동안 배양되었다. 이렇게 생성된 HUVEC 융합 단층(Confluent monolayers of HUVEC)에 LPS(100 ng/mL, 4 h) 또는 HMGB1(1㎍/mL, 16h)을 처리하고, 그리고 나서 라이소자임을 6시간동안 처리하였다.

8. In vitro 이동성 에세이(migration assay)

세포 이동성 에세이는 8μm pore size filter를 포함하는 6.5mm직경의 transwell plate에서 수행되었다. HUVEC 세포(6 X 10⁴)들을 3일동안 배양하여, 융합된 내피세포 단일층을 수득하였다. 상기 세포 단층을 HMGB1(1㎍/mL)으로 16시간 처리하고 0 내지 200nM의 라이소자임을 6시간동안 처리한 후, transwell plate의 상부(upper compartment)에 인간 호중구를 첨가하였다. 그 후 상기 Transwell plate 는 37℃, 5% CO₂ 조건에서 2시간동안 배양되었다. 그 후 upper chamber의 세포들은 흡인되었으며(aspirated), 필터의 윗부분에 위치한 비이동성 세포들은 면봉을 이용하여 제거되었다. 필터의 아랫부분에 위치한 인간 호중구 세포들은 8% glutaraldehyde로 고정된 후, 0.25% crystal violet을 포함하는 20% methanol(w/v)을 첨가하여 염색되었다. 각각의 실험은 duplicate well에서 두 번 반복되었으며, 무작위로 선택된 9개의 high power microscopic field(HPF; 200× )들에서 이동성 세포의 개수가 카운팅(counting)되었다. 이러한 결과는 이동 지표(migration index)로서 나타내어진다.

9. In vivo 투과성 및 백혈구 이동성 에세이

in vivo 실험을 위하여, 수컷 마우스들을 zoletil (tiletamine and zolazepam 1:1 mixture, 30 mg/kg) 및 rompun (xylazine, 10 mg/kg)으로 마취시켰다. CLP-받은 마우스(CLP-operated mice) 또는 HMGB1(2㎍/mouse)을 정맥주사(i.v.)하여 16시간동안 전 처리된 마우스들에 라이소자임을 주입하였다(각 마우스 당 0.57, 1.43, 2.86 또는 5.72 ㎍, i.v.). 6시간 후에, 1% Evans blue dye solution(in normal saline)을 각 마우스에 정맥주사하였다. 30분 후에, 각 마우스들을 희생시켰으며, 5mL의 일반 식염수로 복막강을 세척하여 복막삼출물(peritoneal exudate)들을 수집하고 10분동안 200Xg으로 원심분리하였다. 상등액의 흡광도는 650nm에서 측정되었다. 혈관 투과성은 Bae JS et al., 2012의 연구에서 기술된 바와 같이, Evans blue dye의 표준 곡선에 따른 복막강(peritoneal cavity)으로 누설(leak)된 염료의 양(㎍ per mouse)으로서 나타내었다.

백혈구 이동을 평가하기 위하여, CLP-받은 마우스 및 HMGB1(2㎍/mouse, in normal saline)을 정맥주사(i.v.)하여 16시간동안 전 처리된 마우스들에 라이소자임(각 마우스 당 0.57, 1.43, 2.86 또는 5.72 ㎍, i.v.)을 처리하였다. 라이소자임 처리 6시간 후에, 상기 마우스들을 희생시키고 복막강을 5 mL의 일반 식염수로 세척하였다. 20㎕의 상기 복막액(peritoneal fluid)을 0.38 mL Turk’s solution(0.01% crystal violet in 3% acetic acid)과 혼합하고, 광학현미경을 이용하여 백혈구의 수를 카운팅(counting)하였다.

10. 세포-세포 부착 어세이

HUVEC세포에 대한 인간 호중구 세포의 부착정도는 Lee W et al., 2013에서 기술된 바와 같이 호중구의 형광표지방법에 의해 평가되었다. 간략하게, 호중구(1.5 × 10⁶/mL, 200㎕/well)세포들을 Vybrant DiD dye로 표지하고, 세척 및 자극된 HUVEC 세포들에 상기 호중구 세포들을 첨가하였다. 상기 자극된 HUVEC 세포는, HUVEC 세포 단층을 HMGB1 (1 ㎍/mL)으로 16시간동안 처리하고 다시 6시간동안 라이소자임(0 내지 200nM) 처리한 것을 의미한다.

11. 헤마톡실린 & 에오신 염색 및 병리조직학적 시험

5 마리의 수컷 C57BL/6 마우스들에 CLP 를 수행하고 각각 12시간 및 50시간 후에, 라이소자임(2.86 또는 5.72 ㎍ per mouse)을 정맥주사하였다. 마우스들은 CLP 후 96시간째에 안락사되었다. 상기 마우스들에서 폐조직의 표현형 변화를 분석하기 위하여 각 마우스로부터 폐 샘플들을 적출하였고, 잔류 혈액을 제거하기 위하여 PBS(pH 7.4)로 3회 세척한 후 4% formaldehyde solution(in PBS (pH 7.4), Junsei, Tokyo, Japan)으로 4℃에서 20시간동안 고정하였다. 상기 고정 후, 각 샘플들은 일련의 증가되는 농도의 에탄올 수용액(ethanol series)으로 탈수되었고, 파라핀 포매된 후, 4μm두께로 절편화되어 슬라이드(slide)에 올려 놓았다. 상기 슬라이드들은 60℃ 오븐에서 탈파라핀화(deparaffinize)되었고, 재수화(rehydrate)된후, hematoxylin (Sigma)으로 염색되었다. 과도한 염색을 제거하기 위하여 각 슬라이드들을 0.3% acid alcohol에 3회 급속침지(quick-dip)시켰으며, eosin (Sigma)으로 대비염색하였다. 그리고나서 커버슬립(coverslip)으로 상기 슬라이드를 마운팅(mounting)하기 전에, 일련의 증가되는 농도의 에탄올 수용액(ethanol series) 및 자일렌(xylene)을 이용하여 과도한 염색을 제거하였다. 폐 조직구조(pulmonary architecture), 조직 부종(tissue edema) 및 염증성 세포의 침윤(infiltration of inflammatory cell)을 평가하기 위한 폐 표본에 대한 광학현미경분석은, 블라인드 관찰자(blinded observation)에 의해 수행되었다. 상기 관찰 결과는 하기의 4 등급으로 분류되었다: 등급 1은 정상 조직병리(normal histopathology)를 나타내고, 등급 2는 소량의 호중구 백혈구 침윤을 나타내며, 등급 3은 중간정도의 호중구 백혈구 침윤, 혈관주위 부종(perivascular edema) 형성 및 폐 조직구조의 부분적 파괴를 나타내고, 등급 4는 밀도 높은 호중구 백혈구 침윤, 농양(abscess) 형성 및 완전한 폐 조직구조 파괴를 포함하는 의미이다.

12. 면역형광염색

10% FBS를 포함하는 완전배지(complete media)에서 0.05% Poly-L-Lysine으로 코팅된 glass cover slip 위에 HUVEC 세포들을 융합(confluence) 상태까지 배양하여, 48시간동안 유지하였다. 세포들을 HMGB1(1μg/mL)으로 1시간동안 자극시킨 후, 6시간동안 라이소자임(50 또는 100 nM)을 처리 또는 비처리하였다. 세포골격 염색을 위하여, 세포들을 4% formaldehyde용액(in PBS, v/v)으로 실온에서 15분동안 고정하고, 0.05% Triton X-100 용액(in PBS)을 15분 처리하여 투과화(permeabilize) 시킨 후, 상기 투과화된 세포에 blocking buffer(5% BSA in PBS)를 4℃에서 오버나잇 처리하여 블로킹(blocking)하였다. 그리고나서 세포들을 fluorescein phalloidin(F 432; Molecular Probes, Invitrogen)으로 표지된 F-actin과 함께 4℃에서 오버나잇 배양한 후, 630x magnification에서 confocal microscopy(TCS-Sp5, Leica microsystem, Germany)로 시각화하였다.

13. 통계적 분석

각 실험은 적어도 3회씩 독립적으로 반복되었다. 모든 데이터들은 평균± 평균의 표준오차(mean± standard error of the mean (SEM))로 나타내었다. 통계적 분석은 SPSS for Windows, version 16.0(SPSS, Chicago, IL)을 이용하여 수행되었다. 그룹간의 유의적인 차이는 one-way analysis of variance (ANOVA) 및 Tukey’s post-hoc test에 의하여 산정되었다. 0.05 미만의 P-값은 통계학적으로 유의미한 것으로 생각되었다. CLP에 의해 유도된 중증혈관염증질환에 대한 생존 분석은 KaplanpMeier method를 이용하여 수행되었다.

<실시예 1>

LPS- 또는 CLP-매개(mediated) HMGB1 분비에 있어서, 라이소자임의 영향

이전의 연구들은 쥐 대식세포 및 인간 내피세포에서 LPS가 HMGB1의 분비를 자극함을 밝혔다. 이러한 이전연구결과들과 일치하게, LPS(100 ng/mL)는 HUVEC 세포로부터 HMGB1의 분비를 자극하였다(도 1). LPS-매개 HMGB1 분비에 대한 라이소자임의 영향을 조사하기 위하여, 내피세포들을 100ng/mL LPS로 16시간동안 처리하여 자극하고, 0 내지 200nM 농도의 라이소자임을 6시간동안 처리하였다. 도 1에서 보는 바와 같이, 라이소자임은 내피세포로부터 LPS에 의해 유도된 HMGB1 분비를 억제하였으며, 20nM 이상의 농도에서는 현저한 억제효과 관찰되었다. 이때, 라이소자임 단독 처리는 HMGB1 분비에 영향을 주지 않았다(도 1 참조). in vivo상에서 상기 효과를 확인하기 위하여, CLP에 의해 중증혈관염증질환을 유발시킨 마우스모델을 사용하였다. 도 2에서 보는 바와 같이, 라이소자임 처리는 마우스에서 CLP에 의해 유도된 HMGB1 분비를 억제하였다. 이때, 실험에 사용된 마우스들의 평균 몸무게가 20g, 평균 혈액량(blood volume)이 2 mL인 것을 고려하여, 말초혈액에서 최대농도가 20, 50, 100 또는 200 nM 인 범위로 라이소자임의 투여량(0.57, 1.43, 2.86 또는 5.72 ㎍ per mouse)이 산정되었다.

다음으로 HUVEC에서 HMGB1 receptor들(구체적으로 TLR2, TLR4 및 RAGE) 발현에 대한 라이소자임의 영향을 조사하였다. 도 3에서 보는 바와 같이, HMGB1(1㎍/mL, 16h)의 처리는 HUVEC에서 TLR2, TLR4 및 RAGE의 발현을 4배 증가시켰다. 여기에 라이소자임의 처리는 TLR2, TLR4 및 RAGE의 발현을 현저하게 억제하였다. 세포 생존성(cellular viability)에 대한 라이소자임의 영향을 테스트하기 위하여, 라이소자임으로 24시간 처리된 HUVEC 세포에 대한 MTT assay가 수행되었다. 도 4에서 보는 바와 같이, 본 실험에서 사용된 0 내지 200nM 농도의 라이소자임은 세포 생존에 영향을 주지 않았다.

염증성 질환의 환자에서 HMGB1의 높은 혈장 농도는 나쁜 예후 및 높은 사망률과 관계된 것으로 알려져있다. 게다가 HMGB1의 약학적 억제는 엔도톡신(endotoxin challenge)에 대한 반응으로 유발된 급성 염증 동물모델에서 생존을 향상시키는 것으로 알려져있다. 그러므로 LPS- 또는 CLP-에 의해 유도된 HMGB1의 분비가 라이소자임에 의해 억제되는 것은 라이소자임이 혈관염증질환(vascular inflammatory disease)의 치료에 사용될 수 있음을 시사한다.

<실시예 2>

LPS-, HMGB1- 또는 CLP-매개 세포장벽(barrier) 붕괴에 있어서, 라이소자임의 효과

HUVEC세포의 장벽 온전성(barrier integrity, 장벽 통합성)에 대한 라이소자임의 효과를 조사하기 위하여 투과 에세이(permeability assay)가 수행되었다. 라이소자임(200 nM)의 단독처리는 장벽 온전성(barrier integrity)을 변화시키지 못했다(도 5참조). 대조적으로, LPS는 내피세포의 세포막장벽(endothelial membrane barriers)의 분열 및 붕괴를 유도하는 것으로 알려져있다. HUVEC 세포들은 LPS(100 ng/mL)첨가 4시간 후에, 다양한 농도의 라이소자임으로 6시간동안 처리되었다. 도 5에서 보는 바와 같이, 라이소자임은 LPS-매개 세포막 붕괴를 농도의존적으로 억제하였다. 또한 HMGB1은 장벽 온전성(barrier integrity)의 분열 및 붕괴를 유도하는 것으로 알려져있다. 라이소자임의 처리는 HMGB1-매개 세포막 붕괴를 농도-의존적으로 감소시키는 결과를 보였다(도 6 참조).

in vivo상에서 상기 효과를 확인하기 위하여, 마우스에서 HMGB1- 또는 CLP-에 의해 유도된 혈관 투과성(vascular permeability)을 평가하였다. 도 7에서 보는 바와 같이, 라이소자임은 HMGB1- 또는 CLP-에 의해 유도되는 evans blue 염료의 복막 누설(peritoneal leakage)을 현저하게 억제하였다.

HMGB1은 p38 MAPK의 인산화를 촉진하는 것에 의해 전염증성(proinflammatory) 반응을 유도하는 것으로 알려져있다. HUVEC세포에서 HMGB1에 의해 유도된 p38 MAPK의 활성화를 라이소자임이 억제하는지를 알아보기 위하여, 상기 세포들은 HMGB1으로 활성화된 후 라이소자임과 함께 배양되었고, 그 후에 인산화된 p38 MAPK의 수준(level)을 산정하였다. 도 8에서 보는 바와 같이, HMGB1은 인산화된 p38의 발현을 증가시켰으며, 이는 라이소자임 처리에 의하여 현저히 억제되었다. 이러한 결과는 라이소자임 처리가 마우스에서 HMGB1-매개 내피세포 붕괴를 억제하고, 인간 내피세포의 장벽 온전성(barrier integrity)을 유지한다는 것을 증명한다.

세포골격 단백질(Cytoskeletal protein)은 세포의 온전성(integrity) 및 모양을 유지하기위해 중요하다. 게다가, 사이토카인 자극(cytokine stimulation)에 기인하는 액틴(actin) 세포골격의 재분배, 세포의 분리 및 세포-세포 접촉의 상실(loss of cell-cell contact)은 내피세포 단층 투과성(endothelial monolayer permeability) 증가와 관계되어있다. 그러므로, HUVEC세포 단층(HUVEC monolayer)을 F-actin-labeled fluorescein phalloidin으로 면역형광 염색하는 방법에 의해 HUVEC 세포에서 액틴 세포골격 배치(actin cytoskeletal arrangement)에 대한 라이소자임의 영향을 조사하였다. Control군의 HUVEC세포들은 몇몇 액틴 필라멘트 다발들(actin filament bundles)이 세포 경계에 위치함과 함께, 세포 전체적으로 F-actin의 무작위 분포를 나타내었다(도 9 참조). HUVEC 세포에서 HMGB1(1μg/mL) 처리에 의하여 유도된 장벽의 붕괴(Barrier disruption)는 세포 사이의 틈(paracellular gap) 생성을 동반하였다(도 9에서 화살표로 표시). 유사한 세포골격 배치가 LPS(100 ng/mL)처리시에도 유도되었다(데이터 미도시). 라이소자임(50 또는 100nM)의 처리는 밀집한(dense) F-actin ring들의 생성과 함께 HMGB1에 의해 유도된 세포 사이의 틈(paracellular gap) 생성을 억제하였다(도 9). 이러한 결과는 라이소자임 처리가 내피세포에서 F-actin 재분배와 관련되어 HMGB1-매개 형태학적 변화 및 틈(gap) 형성을 억제함을 제시하며, 그렇게 함으로서 혈관 장벽의 온전성(vascular barrier integrity)을 증가시킨다.

<실시예3>

CAM(cell-adhesion molecule)들의 발현 및 전염증성 반응(proinflammatory response)에 대한 라이소자임의 억제효과

이전의 연구들은 HMGB1이 내피세포의 표면에서 ICAM-1, VCAM-1 및 E-selectin과 같은 CAM들의 세포표면 발현을 증가시킴으로서 염증성 반응을 매개하고, 그 때문에 내피(endothelium)를 가로질러 염증 부위에 백혈구의 이동 및 부착을 촉진한다는 것을 밝혔다. HMGB1으로 자극된 내피세포에서 CAM들의 발현에 대한 라이소자임의 영향을 조사하기위하여, HMGB1으로 자극된 후 라이소자임으로 처리된 HUVEC 세포에서 VCAM-1, ICAM-1 및 E-selectin의 발현을 모니터링하였다. 도 10에서 보는 바와 같이, 라이소자임은 VCAM-1, ICAM-1 및 E-selectin의 발현을 억제하였다. 내피세포에 백혈구의 부착 및 백혈구의 내피세포 투과 이동(transendothelial migration, TEM)은 전염증성 반응에 있어서 중요한 단계이다. 그러므로, CAM들의 발현이 향상된 백혈구 부착과 부합하는지 및 라이소자임이 HMGB1으로 자극된 HUVEC세포에 대하여 단핵구(monocyte)의 부착을 억제할 수 있는지를 조사하였다. 그 결과 도 11에서 보는 바와 같이, 라이소자임은 HMGB1으로 자극된 HUVEC세포에 대한 인간 호중구의 부착을 효과적으로 억제하였다. 추가 연구에서 HUVEC 세포에 호중구의 부착과 차후의(subsequent) 호중구 TEM 사이에 관계가 있음을 밝혔고, 라이소자임은 이러한 단계를 효과적으로 억제함을 보여주었다(도 12 참조). in vivo상에서 상기 효과를 확인하기 위하여, 마우스에서 라이소자임의 처리 하에 HMGB1- 또는 CLP-에 의해 유도된 백혈구 이동을 조사하였다. HMGB1 및 CLP는 마우스의 복막강(peritoneal cavity)으로 백혈구의 이동을 상당히 촉진하였다. 20-200nM 농도에서의 라이소자임은 이러한 이동을 현저히 억제하였다(도 13 참조). 이러한 결과는 라이소자임이 내피세포로부터 내독소-매개(endotoxin-mediated) HMGB1의 분비를 억제하는 것뿐만 아니라 분비된 HMGB1의 전염증성 시그날링 효과(proinflammatory signaling effect)를 억제하며, 그 때문에 HMGB1에 의해 유도된 CAM들의 증가, 백혈구 부착 및 이동과 같은 염증성 경로(inflammatory pathway)에서 증폭과정을 억제한다는 것을 나타낸다.

<실시예 4>

HMGB1에 의해 자극된 NF-κB, ERK 및 Akt의 활성화 및 HMGB1에 의해 자극된 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 MCP-1의 생성에 대한 라이소자임의 억제 효과

HMGB1 및 LPS는 모두 인간 내피세포에서 NF-κB의 핵 전좌(nuclear translocation), Akt와 p38 MAPK의 인산화가 상당히 증가되도록 유도한다. NF-κB 및 ERK1/2의 활성화는 전염증성 반응을 위해 필요하다. 이전의 연구들은 혈관 염증성 반응에 있어서 HMGB1에 의한 NF-κB 및 ERK 1/2의 활성화를 보고하였다. 그러므로, HMGB1에 의해 활성화된 HUVEC 세포에서 염증성 시그널 분자들의 활성화 및 TNF-α및 IL-1β의 생산에 대한 라이소자임의 잠재적 영향을 조사하기 위하여, 세포들에 HMGB1을 16시간 처리하여 활성화시키고, 그리고나서 6시간동안 라이소자임으로 인큐베이션하였다. 도 14 내지 도 18에서 보는 바와 같이, NF-κB(도 14), ERK1/2(도 15) 및 Akt(도 16)의 인산화와 TNF-α(도 17) 및 IL-1β(도 18)의 생성은 HMGB1 처리에 의해 증가되었지만, 상기 증가는 20nM 이상의 라이소자임 처리에 의하여 현저히 감소되었다. 도 19 및 도 20에서 보는 바와 같이, 또한 라이소자임은 IL-6 및 MCP-1과 같은 다른 염증성 마커들도 억제한다. 이러한 결과는 라이소자임이 인간 내피세포에서 전염증성 반응의 유도와 관련된 중요한 시그널들에 영향을 준다는 것을 나타낸다.

<실시예 5>

CLP-유도 혈관염증질환의 사망률에 있어서 라이소자임의 보호 효과

라이소자임이 CLP-유도 혈관염증질환 치사(lethality)로부터 마우스를 보호할 수 있을지 조사하기 위하여, 20 마리의 마우스들을 대상으로, CLP 수술 후, 라이소자임을 주입하였다. CLP 수술 24시간 후에, 실험동물들은 떨림(shivering), 거친 털(bristled hair) 및 쇄약(weakness) 등을 포함하여 중증 혈관염증질환의 증상을 나타냈다. 두 개의 다른 농도(각각 2.86 또는 5.72 ㎍ per mouse, CLP 수술 12시간 후)로 라이소자임을 한번 주입하는 것은 CLP에 의해 유도된 죽음을 막지 못하였다(데이터 미도시). 그리고 그 다음의 실험에서, 라이소자임은 CLP후 12시간 및 50시간 후에 두 번에 걸쳐 주입되었으며, Kaplan-Meier survival analysis 는 상기 라이소자임 처리 그룹에서 생존률의 현저한 상승을 나타내었다(p < 0.0001, 도 21). CLP 수술 132시간 후에 마지막 생존률은, 마우스 한마리당 2.86㎍씩 주입한 군에서 20%, 마우스 한 마리당 5.72㎍을 처리한 군에서 40%였다. HMGB1 분비의 억제 및 HMGB1 매개 염증성 반응의 억제를 포함하여 이러한 라이소자임 주입의 효과는, 혈관염증질환의 관리를 위한 치료적 전략을 제공한다.

<실시예 6>

CLP-유도 폐 손상에 대한 라이소자임의 보호효과

CLP-유도성 죽음에 대한 라이소자임의 보호효과를 확인하기 위하여, CLP-유도 폐 손상에 대한 라이소자임의 효과를 조사하였다. CLP 받은 수컷 C57BL/6 마우스(n=5)들에 CLP 후 12시간 및 50시간째에 라이소자임(2.86 또는 5.72 ㎍ per mouse)을 정맥투여하고, CLP 후 96시간째에 안락사시켜 폐조직을 관찰하였다. 광학현미경을 통한 관찰에서 sham 및 sham + lysozyme 군의 폐 사이에는 유의적인 차이가 없었다(데이터 미도시). CLP 군에서, 간질조직(interstitium) 및 허파꽈리(alveolar spaces)로 염증성 세포들의 광범위한 침윤(massive infiltration)과 함께 간질성 부종(interstitial edema)이 관찰되었으며, 폐 구조가 심각하게 손상되었다(도 22 및 도 23참조). CLP + lysozyme군에서는 CLP군과 비교하여, 형태학적인 변화가 적게 나타났으며 폐구조가 보존되고 폐손상 스코어(lung injury score)가 감소되었다(도 22 및 도 23참조).

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 중증혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 라이소자임은 HMGB1(High mobility group box 1)의 분비를 억제 할뿐만 아니라 전염증성 시그날링(proinflammatory signaling)을 조절하여 혈관 염증성 반응을 억제하며, 실제로 질환동물모델에서 혈관염증질환의 예방 또는 치료효과가 현저하므로 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (4)

1. 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 HMGB1(High mobility group box 1)에 의해 매개되는 패혈증(sepsis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
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