KR102222627B1 - 소나무 담쟁이덩굴 추출물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 소나무 담쟁이덩굴 추출물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 소나무 담쟁이덩굴 추출물은 암세포의 생존율을 감소시키고 세포사멸을 유도하는 효과가 있으며 식물 유래로 안정성이 우수하므로, 암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 건강기능식품 조성물 및 약학 조성물로 용이하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

소나무 담쟁이덩굴 추출물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, improving or treating cancer comprising extract of Parthenocissus tricuspidata from Pinus densiflora as effective component}
본 발명은 소나무 담쟁이덩굴 추출물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 국내의 경우, 질병 사망원인 중 제1위의 질병으로서 연간 약 10만 명 이상이 진단되고, 약 6만 명 이상이 사망하고 있다. 이러한 암의 유발 인자인 발암물질로는 흡연, 자외선, 화학물질, 음식물, 기타 환경인자들이 있으나, 그 유발 원인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라, 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르다. 현재 치료제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있으며, 독성이 적고 효과적인 항암제의 개발이 절실히 필요하다.
담쟁이덩굴(Parthenocissus tricuspidata)은 쌍떡잎식물 갈매나무목 포도과에 속하는 낙엽활엽 덩굴식물로, 지금상춘등(地錦常春藤)이라고도 하며 돌담이나 바위 또는 나무줄기에 붙어서 자란다. 담쟁이덩굴의 줄기는 충분히 성장하면 10m 이상 자라며, 덩굴손은 잎과 마주나고 갈라지며 끝에 둥근 흡착근이 있어 담벽이나 암벽에 붙으면 쉽게 떨어지지 않는다. 잎은 어긋나고 폭 10~20cm의 넓은 달걀 모양으로, 잎 끝이 뾰족하고 3개로 갈라지며 앞면에는 털이 없고 뒷면 잎맥 위에 잔털이 있으며, 가장자리에 불규칙한 톱니가 있고 잎자루는 잎보다 길다. 잎은 가을에 지지만 줄기는 겨울에도 말라죽지 않고 살아있다. 흔히 덩굴식물은 다른 나무를 시계 방향이나 반시계 방향으로 감고 올라가는 것인 특징인데, 담쟁이덩굴은 나무의 껍질을 타고 마디마다 접착성이 있는 빨판의 잔뿌리를 내리면서 곧게 뻗어 올라간다. 바위나 벽을 타고 올라가는 담쟁이덩굴에는 독성이 있으므로, 약용으로 사용할 때에는 소나무나 참나무 등의 다른 나무를 타고 올라간 담쟁이덩굴을 사용하는 것이 좋으며, 주로 줄기를 사용하지만 뿌리, 잎, 열매 모두 사용 가능하다.
한편, 한국공개특허 제2010-0043521호에는 '담쟁이덩굴 추출물을 함유하는 모발생장 촉진용 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1751799호에는 '담쟁이덩굴 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 소나무 담쟁이덩굴 추출물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 소나무에서 채취한 담쟁이덩굴의 줄기를 대상으로 에탄올을 이용하여 추출물을 제조하여 A549 폐암세포에 처리한 결과, 암 세포의 세포생존율이 감소하고 세포사멸(apoptosis)이 유도되며, 암 세포 증식과 관련된 단백질(p-mTOR 및 p-Akt) 및 항-세포자살 단백질(anti-apoptotic protein; Bcl-2)의 발현량이 감소되고, 암 억제 단백질(p53) 및 세포자살 단백질(apoptotic protein; Bax)의 발현량이 증가되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 소나무 담쟁이덩굴 추출물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 소나무 담쟁이덩굴 추출물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 소나무 담쟁이덩굴 추출물은 천연에서 유래한 물질로 부작용이 발생할 가능성이 낮고 세포 독성이 없으므로, 암에 대한 예방, 개선 및 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 정상세포(Fibroblast) 및 폐암세포(A549)에 소나무 담쟁이덩굴 추출물(PTE)을 농도별(25, 50, 75, 100, 125, 150 ㎍/㎖)로 처리하고 세포생존율을 측정한 결과로, A는 Fibroblast 세포에 PTE를 처리하고 24시간 동안 배양한 후 세포생존율을 측정한 그래프이고, B와 C는 A549 세포에 PTE를 처리하고 각각 24시간, 48시간 동안 배양한 후 세포생존율을 측정한 그래프이다. N; PTE 무처리 대조군, N.S: not significant
도 2는 A549 폐암세포에 소나무 담쟁이덩굴 추출물(PTE)을 농도별(50, 75, 100 ㎍/㎖)로 처리한 후 세포의 형태학적 변화를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3은 A549 폐암세포에 대한 소나무 담쟁이덩굴 추출물(PTE)의 세포사멸 효과를 확인하기 위해, PTE가 처리된 A549 세포를 Annexin V 및 7-AAD(7-Aminoactinomycin D)로 염색한 후 유세포 분석기로 측정한 결과이다. Live; Annexin V(-)&7-AAD(-), Early Apop; Annexin V(+)&7-AAD(-), Late Apop/Dead; Annexin V(+)&7-AAD(+), Dead; Annexin V(-)&7-AAD(+).
도 4는 PTE가 처리된 A549 세포에서 p-mTORSer2448, p-AMPKThr172, p-AktSer473, p53, PARP, cleaved-PARP, Bax, Bcl-2, pro caspase-3 및 β-actin 단백질의 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 분석 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소나무 담쟁이덩굴 추출물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에서, 상기 소나무 담쟁이덩굴 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 이용하여 추출한 것일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 이용하여 추출한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 소나무 담쟁이덩굴 추출물은 A549 폐암세포의 생존율을 감소시키고 폐암세포의 세포자살(apoptosis)을 유도하며, 암 세포 증식 단백질(p-mTOR 및 p-Akt) 및 항-세포자살 단백질(Bcl-2)의 발현량을 감소시키고, 암 억제 단백질(p53) 및 세포자살 단백질(Bax)의 발현량을 증가시키는 효과가 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 소나무 담쟁이덩굴 추출물은 소나무에서 채취한 담쟁이덩굴의 줄기를 분쇄한 후 상기 분말 100 g에 95% 에탄올 800 ㎖을 첨가하고 72시간 동안 상온에서 환류 추출하여 상층액만 회수한 후 여과하여 제조된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 "암(cancer)"이라는 용어는 고체 종양 및 혈액 종양(blood born tumor)을 포함하는 일반적인 암 질환을 말하며, 바람직하게는 폐암, 위암, 결장암, 유방암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 또는 섬유육종암일 수 있고, 바람직하게는 폐암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽, 발포정 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 건강기능식품 조성물은 항암 활성을 증가시키기 위해 섭취할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 소나무 담쟁이덩굴 추출물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 소나무 담쟁이덩굴 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 소나무 담쟁이덩굴 추출물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양의로 첨가된다. 그러나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 안전성 면에서 아무런 문제가 없는 범위의 양으로 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 상기 음료는 탄산음료, 기능성이온음료, 쥬스(예를 들어, 사과, 배,포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토쥬스 등), 식혜 등을 포함한다.
본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 저해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 또한, 소나무 담쟁이덩굴 추출물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 소나무 담쟁이덩굴 추출물은 전술한 것과 같다.
또한, 본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 암은 전술한 것과 같다.
본 발명의 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 소나무 담쟁이덩굴 추출물은 A549 폐암세포의 생존율을 감소시키고 폐암세포의 세포자살(apoptosis)을 유도하며, 암 세포 증식 단백질(p-mTOR 및 p-Akt) 및 항-세포자살 단백질(Bcl-2)의 발현량을 감소시키고, 암 억제 단백질(p53) 및 세포자살 단백질(Bax)의 발현량을 증가시키는 효과가 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 재료 및 추출
소나무 담쟁이덩굴의 줄기(지리산 한방식품 영농조합법인)를 분쇄한 후 상기 분쇄 분말 100 g에 95% 에탄올 800 ㎖을 가하여 72시간 동안 상온에서 환류 추출한 후 상기 추출물을 5 또는 6 ㎛ 필터지(Toyo Roshi Kaisha, 일본)로 여과하고 감압농축기(N-1200A, Tokyo Rikakikai Co., 일본)를 이용하여 감압 농축시킨 후 상기 농축된 추출물을 -86℃에서 보관하였다. 농축된 추출물은 DMSO(dimethyl sulfoxide, Samchun, 한국)를 이용하여 200 mg/㎖ stock으로 만들어 -20℃에 보관하여 사용하였다. 상기 방법으로 제조된 소나무 담쟁이덩굴 에탄올 추출물을 PTE로 명명하였다.
2. 세포배양
폐암세포(A549)와 인간 섬유아세포(Fibroblast)는 ATCC(American Type Culture Collection, 미국)에서 분양받아 사용하였다. A549 세포는 10% FBS(HyClone Laboratories Inc., 미국)와 1% 항생제(HyClone Laboratories Inc.)가 포함된 RPMI 1640 배지(HyClone Laboratories Inc.)를 사용하였고, Fibroblast 세포는 10% FBS와 1% 항생제가 포함된 DMEM(HyClone Laboratories Inc.) 배지를 사용하여 37℃의 5% CO2 조건의 인큐베이터(MCO-15AC, SANYO Electric Biomedical Co., 일본)에서 배양하였다. 배양 48시간마다 Trypsin-EDTA(HyClone Laboratories Inc.)를 이용하여 세포를 부유 상태로 만든 다음, 세포수 1×106 개/㎖로 분주하여 계대 배양하였다.
3. MTT 어세이
A549 세포와 Fibroblast 세포를 12-웰 배양용기에 세포수 1×104 개/㎖로 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 상기 제조된 소나무 담쟁이덩굴 추출물(25, 50, 75, 100, 125, 150 ㎍/㎖)을 처리하고 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에 MTT 용액을 40 ㎕씩 처리하고, 37℃, 5% CO2의 조건에서 50분 동안 배양하였다. 이 후 각 웰의 배지를 제거하고 PBS(phosphate buffered saline) 1 ㎖씩 넣어 세척한 후 DMSO 150 ㎕를 처리하고, 96-웰 배양용기에 100 ㎕씩 옮겨서 흡광도 측정기(Bio-Rad Laboratories Inc., 일본)로 595 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 측정은 모두 3번 이상 수행하였다. MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)는 Sigma-Aldrich Co.(미국USA)에서 구입하여 5 mg/㎖ stock으로 만들어서 사용하였다.
4. A549 세포의 형태 관찰
A549 세포를 6-웰 배양용기에 세포수 1×106 개/㎖로 분주하고 24시간 동안 배양한 후 소나무 담쟁이덩굴 추출물(50, 75, 100 ㎍/㎖)을 처리하고 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 A549 세포의 형태 변화를 도립현미경(inverted microscope; Zeiss M, Carl Zeiss, 독일)으로 관찰하였다.
5. Annexin V 염색에 의한 세포사멸( apoptosis ) 측정
세포사멸을 정량적으로 분석하기 위해 MuseTM Annexin V & Dead Cell 키트(MCH100105, Merck Millipore Co., 미국)를 사용하였다. A549 세포는 RPMI 1640 배지 100 ㎕를 이용하여 1×105 개/㎖로 부유시키고, MuseTM Annexin V&Dead Cell Reagent 100 ㎕를 혼합하여 37℃, CO2 인큐베이터에서 20분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 MuseTM Cell Analyzer(PB4455ENEU, Merck Millipore Co.)를 이용하여 분석하였다.
6. 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석
A549 세포를 6-웰 배양용기에 세포수 1×106 개/㎖로 분주하고 24시간 동안 배양한 후 소나무 담쟁이덩굴 추출물(50, 75, 100 ㎍/㎖)을 처리하고 37℃, 5% CO2의 조건에서 6시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 RIPA 분해 완충용액(lysis buffer; 25 mM Tris-Cl(pH 7.4), 1% NP40, 0.5% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF)을 각 웰에 150 ㎕씩 첨가하여 단백질을 추출한 뒤 14,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 취하였다. 추출한 단백질은 흡광도 측정기를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 정량된 단백질을 8%, 12% 아크릴아마이드 겔에 로딩하여 전기영동을 실시한 후 NC(nitro-cellulose) 멤브레인에 트랜스퍼하였다. 트랜스퍼가 끝난 후 BSA(Bovine serum albumin)를 이용하여 상온에서 1시간 30분 동안 블로킹 과정을 수행한 후 1차 항체를 4℃에서 밤새 반응시키고, 2차 항체를 1시간 30분 동안 반응시킨 다음 Blue X-ray 필름에 감광하여 실험결과를 확인하였다. β-actin은 세포 내에서 항상 일정한 발현 정도를 나타내는 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)로 사용하였다.
7. 통계처리
통계 프로그램인 SPSS(22.0, IBM Corp., Armonk, 미국)를 사용하였고 실험설계에 대한 분산분석은 독립표본 t-test(independent sample t-test)을 통하여 검정하였다. 각 자료는 3번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻은 결과로 검정하였고, p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
실시예 1. 소나무 담쟁이덩굴 추출물이 정상세포(Fibroblast) 및 A549 폐암세포의 증식에 미치는 효과 확인
소나무 담쟁이덩굴 에탄올 추출물(PTE)이 Fibroblast 세포 및 A549 세포의 증식에 미치는 효과를 확인하기 위해 MTT 어세이를 수행한 결과, Fibroblast 세포에서는 PTE 무처리 대조군과 PTE 처리군 모두 세포 생존율이 90% 이상으로 유지되는 것을 확인하였고(도 1A), A549 세포에서는 PTE 처리 농도와 배양 시간에 의존적으로 세포 생존율이 무처리 대조군에 비해 PTE 처리군에서 현저하게 감소하는 것을 확인하였다(도 1B 및 1C).
이를 통해, 본 발명의 소나무 담쟁이덩굴 에탄올 추출물이 정상세포에는 영향을 주지 않으면서 폐암세포의 증식을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 2. 소나무 담쟁이덩굴 추출물 처리에 따른 A549 폐암세포의 형태학적 변화 관찰
A549 세포에 PTE를 농도별로 처리하여 세포의 형태를 관찰한 결과, 무처리 대조군에서는 일정한 모양의 세포들이 배양용 플레이트에 부착되어 있었으나, PTE의 농도가 증가할수록 일정했던 세포의 모양이 불규칙적으로 변하였고, 세포가 배양용 플레이트에 부착하지 못하고 떨어짐으로써 세포 밀도가 감소하는 것을 확인하였다(도 2). 이를 통해, PTE 처리가 A549 폐암세포에서 세포 증식을 억제하고 세포독성 효과를 보이며 세포의 형태학적 변화를 유도하는 것을 알 수 있었다.
실시예 3. 소나무 담쟁이덩굴 추출물에 의한 A549 폐암세포의 세포사멸( apoptosis ) 효과 확인
A549 폐암세포의 증식 억제 효과가 PTE 처리에 의한 세포사멸에 의한 것인지 확인하기 위해, PTE가 처리된 A549 세포를 Annexin V/7-AAD(7-Aminoactinomycin D)로 염색한 후 유세포 분석기(MuseTM Cell Analyzer)로 측정하였으며, 세포사멸률은 Late Apop/Dead 값(%)과 Early Apop 값(%)을 합산하여 나타내었다. Annexin V는 포스파티딜세린(PS)에 친화적으로 결합하는 물질로서 세포사멸이 일어난 세포의 조기 표식자로 많이 사용되고 있으며, 7-AAD는 죽어서 손상된 세포막을 투과 염색하므로, Annexin V 및 7-AAD의 염색으로 세포사멸의 유발 여부를 확인할 수 있다.
그 결과, PTE 무처리 대조군은 약 9.6%, PTE 50 ㎍/㎖ 처리군은 약 46.7%, PTE 75 ㎍/㎖ 처리군은 약 59.2%, PTE 100 ㎍/㎖ 처리군은 약 74.8%에 해당하는 세포에서 세포사멸이 유도된 것을 확인하였다(도 3). 이를 통해, PTE 처리에 따른 A549 폐암세포의 증식 억제는 세포사멸에 의한 것임을 알 수 있었다.
실시예 4. 소나무 담쟁이덩굴 추출물에 의한 내인성 경로(intrinsic pathway)를 통한 세포사멸 관련 단백질 발현 확인
A549 폐암세포에 PTE를 농도별로 처리하여 세포사멸과 관련된 단백질들의 발현량을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과, PTE 처리 농도의존적으로 세포 증식에 관여하는 단백질인 p-mTORSer2448 및 p-AktSer473와 항-세포자살 단백질(anti-apoptotic protein)인 Bcl-2의 발현량이 감소하고, 세포내 에너지 균형 유지와 관련된 단백질인 p-AMPKThr172, 암 억제 단백질인 p53 및 세포자살 단백질(apoptotic protein)인 Bax의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다(도 4).
또한, 프로효소(proenzyme)의 형태로 존재하여 단백질가수분해(proteolysis)를 통해 활성화되는 caspase와 활성화된 caspase에 의해 절단되는 PARP(poly ADP ribose polymerase) 단백질은 손상된 세포를 인지하고 복구할 수 있는 능력을 소실하여 세포사멸을 유도하는데, 도 4를 살펴보면, PTE 처리에 의해 pro caspase-3의 발현이 농도의존적으로 감소되고, 절단된 PARP(clevead-PARP) 단백질의 발현이 증가되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 소나무 담쟁이덩굴 추출물(PTE)은 폐암세포에서 p-mTOR, p-AMPK, p-Akt, p53, cleaved-PARP, Bax, Bcl-2 및 pro caspase-3 단백질의 발현을 조절함으로써, 내인성 경로에 의한 세포사멸을 유도하여 우수한 항암 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

Claims (7)

  1. 소나무 담쟁이덩굴 줄기의 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 폐암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 소나무 담쟁이덩굴 줄기의 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 소나무 담쟁이덩굴 줄기의 에탄올 추출물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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KUNDAKOVIĆ et al., Cytotoxic, antioxidant, and antimicrobial activities of Ampelopsis brevipedunculata and Parthenocissus tricuspidata(VITACEAE). Arch. Biol. Sci., Vol. 60, No. 4, pp. 641-647, 2008 1부.*

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