WO2015147369A1 - Sirt2 억제제를 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

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김원
박성광
강경표
정유진
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising an SIRT2 inhibitor, and more particularly, to renal inflammation by relieving kidney damage by relieving nephritis by controlling an inflammation-inducing factor caused by sepsis through controlling the expression of the SIRT2 gene.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease, and a pharmaceutical composition for preventing or treating a cancer disease having an effect of improving renal toxicity while reducing kidney toxicity, which is a side effect of cisplatin when administered with cisplatin.
  • Cancer is a disease that causes about 7 million deaths per year worldwide. Especially in Korea, according to the Statistical Yearbook of Cause of Death of 2000 (analysis of 2000 death data), death from cancer 23.5% is the number one cause of death, and national cancer management measures are required. Currently, various methods such as surgery, radiation therapy, and gene therapy are used to treat cancer, but one of the most used treatment methods is chemotherapy for administering anticancer drugs.
  • Chemotherapy is a systemic treatment, most of which is given by injection or oral anticancer drugs and spreads throughout the bloodstream. Therefore, it is a treatment that acts on the microcommitment (micometastasis) spread throughout the body rather than a local effect. Therefore, there are many systemic side effects and the degree is very severe compared to surgery or radiation therapy.
  • the use of drug-sensitivity differences between normal cells and cancer cells to allow chemotherapy to act selectively on cancer cells results in dose-limiting toxicity because chemotherapy or most anticancer drugs do not distinguish between normal and cancer cells. There is a problem.
  • Korean Patent Publication No. 10-2013-0058631 (published: June 04, 2013) includes one or more selected from the group consisting of integrin ⁇ 3 neutralizing antibody, integrin ⁇ 3 siRNA, Src inhibitor, and Src siRNA. It describes a pharmaceutical composition for inhibiting target anticancer agent resistance comprising as an active ingredient.
  • target anticancer drugs have a problem in that they do not kill cancer cells. Instead, drugs that inhibit cancer cell proliferation and growth by inhibiting factors necessary for cancer cells to grow are common.
  • Cisplatinum cis-diammine-dichloroplatinum [II]
  • a representative anticancer agent is widely used in clinic as a chemotherapeutic agent for the treatment of ovarian cancer, bladder cancer, lung cancer, head and neck cancer and testicular cancer (Rosenberg B., Cancer, 55: pp 2303-2315, 1985).
  • Cisplatin is known to have an anticancer effect by generating reactive oxygen species to attack cancer cells, inducing inter-intrastrand cross-linking of DNA and formation of DNA adducts.
  • Sepsis is defined as a situation in which an infection is identified or suspected along with a systemic inflammatory response. Severe sepsis is defined as the case in which sepsis is accompanied by organ dysfunction (hypertension, hypoxia, periuria, metabolic acidosis, thrombocytopenia, consciousness disorder). Septic shock is defined as a case in which severe blood pressure is not normalized by administration of fluid therapy or blood pressure boosters. Sepsis can progress to the clinical stage of severe sepsis and ultimately septic shock. Clinical sepsis is broadly defined as a condition in which invasion by a microbial agent is associated with the clinical symptoms of an infection.
  • Clinical symptoms of sepsis include (1) body temperature> 38 ° C or ⁇ 36 ° C (2) heart rate> 90 times per minute (3) respiratory rate> 20 times per minute or PaC02 ⁇ 32 mmHg; (4) leukocyte count> 12000 / m 3, ⁇ 4,000 / cu m 3 or> 10% immature (band) form (5) organ dysfunction, hyperunification, or high blood pressure, but is not limited thereto.
  • TNF tumor necrosis factor
  • IL interleukin
  • TNF- ⁇ further triggers disseminated intravascular coagulation (blood coagulation) resulting in clot production and small consumption of blood clotting proteins in small blood vessels. Because the patient's ability to coagulate blood is lost, important organs such as the kidneys, liver, heart and lungs are damaged due to normal perfusion failure. The mortality rates of severe sepsis and septic shock are reported to be 25-30% and 40-70%, respectively.
  • E. coli In many cases of sepsis, E. coli is a pathogen, but other Gram-negative bacteria, such as, for example, Klebsiella-Enterobacter-Serratia and Pseudomonas This state can be initiated. Gram-positive microorganisms, such as Staphlococcus, systemic viruses and fungal infections also induce sepsis in some cases.
  • Sepsis is understood to occur as a result of complex interactions between the infecting organism and the host's immunity, inflammation and coagulation system. Both the degree of response of the host and the characteristics of the causative agent of infection have a significant effect on the prognosis of sepsis. Organ failure observed in sepsis occurs when the host's response to an infectious agent is inadequate, and if the host's response to the infecting agent is excessively amplified, it may cause organ damage to the host itself. Based on this concept, antagonists of proinflammatory cytokines, TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , and IL-6, which play a leading role in the host's inflammatory response, have been tried as treatments for sepsis.
  • SIRT2 (Sirtuin 2) is one of the sirtuin protein families and performs important cell survival functions under certain conditions.
  • SIRT2 is one of the sirtuin protein families and performs important cell survival functions under certain conditions.
  • the biological function of the SIRT2 protein in relation to inflammatory and oxidative stress is not clear.
  • Silent information regulator 2 (SIRT2), also known as sirtuin, is a NAD + -dependent diacetylase regulator in biological processes such as lifespan, aging, cancer development, neurodegeneration and metabolic diseases [Michan, S .; Sinclair, D. Biochem. J. 404: 1-13; 2007, Finkel, T. et al. Nature 460: 587-591; 2009, Donmez, Z .; Guarente, L. Aging Cell 9: 285-290; 20101-3].
  • the SIRT2 gene family is well conserved from bacteria to eukaryotes. Seven types of SIRTs have been identified in humans [Frye, R. A. Biochem. Biophys. Res. Comm. 272: 793-798; 2000].
  • SIRT1 Overexpression of SIRT1 increases cell survival under DNA damage and oxidative stress.
  • the neuroprotective role of SIRT1 is well established in Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis.
  • the biological functions and mechanisms of SIRT2 in inflammatory and oxidative stress are not well known.
  • chemotherapeutic agents including cisplatin
  • cisplatin are known to produce free radical species and attack cancer cells, and the produced free radical species are known to act on normal cells and cause damage.
  • substances with antioxidant effects are likely to reduce the toxicity caused by chemotherapeutic agents.
  • the present invention has been made to solve the above problems, the first problem to be solved of the present invention is to prevent the renal toxicity caused by an anticancer agent to suppress the renal toxicity by the anticancer agent while improving the anticancer efficacy when the anticancer agent and It provides a therapeutic pharmaceutical composition.
  • the second problem to be solved of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases.
  • the third object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of renal toxic diseases caused by anticancer agents that inhibit renal toxicity by anticancer agents while enhancing anticancer efficacy when the anticancer agent is administered.
  • a fourth object of the present invention is to provide an anticancer adjuvant having inhibitory activity against renal toxicity caused by an anticancer agent.
  • the fifth problem to be solved of the present invention is to provide a health functional food for the prevention and improvement of renal toxic diseases caused by anticancer drugs.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating renal toxic diseases caused by an anticancer agent comprising an SIRT2 inhibitor as an active ingredient.
  • the anticancer agent may be cisplatin.
  • the SIRT2 inhibitor may be an antisense oligonucleotide, siRNA, aptamer or antibody specific for the SIRT2 gene.
  • the SIRT2 inhibitor may be AGK2 or AK-1.
  • the pharmaceutical composition may be to inhibit kidney damage by inhibiting the expression of the molecules ICAM-1 and VCAM-1 associated with apoptosis and inflammatory response.
  • the present invention also provides an anticancer adjuvant comprising an SIRT2 inhibitor having an inhibitory activity against kidney toxicity caused by an anticancer agent as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food for the prevention and improvement of renal toxic diseases caused by an anticancer agent comprising an SIRT2 inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases comprising a SIRT2 inhibitor as an active ingredient.
  • the inflammatory disease may be renal inflammatory disease caused by sepsis.
  • the SIRT2 inhibitor may comprise one or more of the group consisting of antisense oligonucleotides, siRNA, aptamers or antibodies specific for the SIRT2 gene.
  • the SIRT2 inhibitor may be AGK2 or AK-1.
  • the pharmaceutical composition may be to suppress kidney damage by alleviating renal inflammation by inhibiting the expression of LPS-induced inflammation factors CXCL2 and CCL2.
  • the present invention provides a dietary supplement for the prevention and improvement of inflammatory diseases comprising a SIRT2 inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for protecting the kidney comprising a SIRT2 inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides a dietary supplement for kidney protection comprising a SIRT2 inhibitor as an active ingredient.
  • SIRT2 inhibitor of the present invention inhibits the expression of LPS-induced inflammation-inducing factors CXCL2 and CCL2 to alleviate nephritis and inhibit kidney damage to prevent and treat kidney inflammatory diseases caused by sepsis and health functional food It can be usefully used as.
  • the SIRT2 inhibitor according to the present invention inhibits apoptosis and regulates expression of inflammatory response factors ICAM-1 and VCAM-1, thereby inhibiting kidney damage by cisplatin, an anticancer agent, and reducing kidney toxicity. While having an excellent effect of enhancing the anticancer efficacy, and when used in combination with an anticancer agent to confirm that it enhances the anticancer effect of the anticancer agent, useful as a pharmaceutical composition or health functional food for the prevention and treatment of renal toxic diseases caused by the anticancer agent Can be used.
  • 1 to 4 is a result confirming the effect on the regulation of CXCL2 expression by LPS in SIRT2 gene-deficient mice (SIRT2 + / +: experimental group present with SIRT2, experimental group lacking SIRT2-/-: SIRT2, CB: control buffer administered, LPS: control administered LPS).
  • 1 is a photograph confirming the expression of CXCL2 in the mouse kidney through immunochemical staining
  • Figure 2 is a graph confirming the density of CXCL2 positive cells confirmed by staining through an image analysis program
  • Figure 3 is the content of CXCL2 in mouse serum This is a graph confirmed through the enzyme-linked immunosorbent assay
  • Figure 4 is a graph confirming the content of CXCL2 in the mouse kidney tissue through enzyme-linked immunosorbent assay.
  • 5 to 8 is a result confirming the effect on the expression regulation of CCL2 by LPS in the SIRT2 gene-deficient mouse (SIRT2 + / +: experimental group present with SIRT2, experimental group lacking SIRT2- /-: SIRT2, CB: control buffer administered, LPS: control administered LPS).
  • 5 is a photograph confirming the expression of CCL2 in the mouse kidney through immunochemical staining
  • Figure 6 is a graph confirming the density of CCL2 positive cells confirmed through staining through an image analysis program
  • Figure 7 is the content of CCL2 in mouse serum Is a graph confirmed by the enzyme-linked immunosorbent assay
  • Figure 8 is a graph confirming the content of CCL2 in the mouse kidney tissue through the enzyme-linked immunosorbent assay.
  • 9 to 14 are results of confirming the expression pattern of CXCL2 according to the expression control of SIRT2 gene in kidney cells (SIRT2 siRNA: experimental group treated with SIRT2 siRNA, ContsiRNA: siRNA control group, Ad-SIRT2: experimental group treated with SIRT2 recombinant-adenovirus, ad-cont: control virus treated control group, CB: control buffer administered control group, LPS: control group administered LPS).
  • 9 is a graph confirming the expression of CXCL2 mRNA by qRT-PCR when SIRT2 lacks SIRT2 in mouse proximal tubule cells using siRNA
  • FIG. 10 shows CXCL2 in enzyme-linked immunosorbent assay in cell culture.
  • Figure 11 is a graph confirming the CXCL2 in the cell through the enzyme-linked immunosorbent assay
  • Figure 12 shows the expression of the mRNA expression of CXCL2 when the SIRT2 increased SIRT2 in the mouse proximal tubule cells using adenovirus qRT-PCR Checked through the graph.
  • FIG. 13 is a graph confirming CXCL2 through an enzyme-linked immunosorbent assay in cell culture
  • FIG. 14 is a graph confirming CXCL2 through an enzyme-linked immunosorbent assay in cells.
  • 15 to 20 is a result of confirming the expression pattern of CCL2 according to the expression regulation of SIRT2 gene in renal cells (SIRT2 siRNA: experimental group treated with SIRT2 siRNA, ContsiRNA: siRNA control group, Ad-SIRT2: experimental group treated with SIRT2 recombinant-adenovirus, ad-cont: control virus treated control group, CB: control buffer administered control group, LPS: control group administered LPS).
  • 15 is a graph confirming the mRNA expression of CCL2 by qRT-PCR when SIRT2 lacks SIRT2 in mouse proximal tubule cells using siRNA
  • FIG. 16 confirms CCL2 through enzyme-linked immunosorbent assay in cell culture medium.
  • Figure 17 is a graph confirming the CCL2 in the cell through the enzyme-linked immunosorbent assay
  • Figure 18 shows the expression of the mRNA expression of CCL2 when the SIRT2 increased by using adenovirus SIRT2 in mouse proximal tubule cells qRT-PCR Checked through the graph.
  • FIG. 19 is a graph confirming CCL2 through an enzyme-linked immunosorbent assay in cell culture
  • FIG. 20 is a graph confirming CCL2 through an enzyme-linked immunosorbent assay in cells.
  • 21 to 22 are graphs confirming the expression of CXCL2 (FIG. 22) and CCL2 (FIG. 23) by SIRT2 inhibitors in renal cells through qRT-PCR.
  • FIG. 25 is a graph of BUN measurements to confirm the function of kidney by cisplatin in SIRT2 gene-deficient mice.
  • Figure 26 is a graph measuring creatinine to confirm the function of cisplatin-induced kidney in SIRT2 gene-deficient mice.
  • 27 is a photograph confirming the histological damage of the kidney due to cisplatin administration through PAS staining.
  • WT shown in FIG. 29 means a control group having SIRT2 and KO means a control group lacking SIRT2.
  • the first lane handles the vehicle on the mouse with SIRT2
  • the second lane handles the vehicle on the mouse without SIRT2
  • the third to sixth lanes have cisplatin on the mouse with SIRT2
  • the seventh to tenth lanes have SIRT2.
  • Mice lacking were treated with cisplatin. It was confirmed that the active form of caspase-3, which was not expressed in the vehicle-only control group, was increased when cisplatin was treated in mice with SIRT2 and significantly decreased in mice lacking SIRT2.
  • Figure 31 shows the results of Western blot confirming the inflammatory molecule regulatory effect by the expression of SIRT2 gene through ICAM-1 and VCAM-1 expression.
  • Lanes 1 and 2 did not express ICAM-1 and VCAM-1 when vehicle was treated with or without SIRT2.
  • Lanes 3 to 5 showed increased expression of ICAM-1 and VCAM-1 when cisplatin was treated in mice with SIRT2.
  • ICAM-1 and VCAM-1 were found to be reduced when cisplatin was treated compared to the control group containing SIRT2.
  • Fig. 32 is a cell photograph showing the effect of SIRT2 inhibitors inhibiting cell damage by cisplatin. 33 is a graph quantifying the results of FIG. 32.
  • 34 is a graph showing the results of confirming the cell proliferation effect of the SIRT2 inhibitor through the cell proliferation test by XTT.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases comprising an SIRT2 inhibitor as an active ingredient, and a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of renal toxic diseases caused by an anticancer agent comprising an SIRT2 inhibitor as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of renal toxic diseases caused by an anticancer agent comprising an SIRT2 inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention includes a SIRT2 inhibitor as an active ingredient.
  • SIRT2 (Sirtuin 2) of the present invention is one of the sirtuin protein families and performs important cell survival functions under certain conditions.
  • Silent information regulator 2 (SIRT2), also known as sirtuin, is a NAD + -dependent diacetylase regulator in biological processes such as lifespan, aging, cancer development, neurodegeneration and metabolic diseases [Michan, S .; Sinclair, D. Biochem. J. 404: 1-13; 2007, Finkel, T. et al. Nature 460: 587-591; 2009, Donmez, Z .; Guarente, L. Aging Cell 9: 285-290; 20101-3].
  • the SIRT2 gene family is well conserved from bacteria to eukaryotes. Seven types of SIRTs have been identified in humans [Frye, R. A. Biochem. Biophys. Res. Comm. 272: 793-798; 2000].
  • SIRT1 Overexpression of SIRT1 increases cell survival under DNA damage and oxidative stress [Oberdoerffer, P. et al. Cell 135: 907-918; 2008.].
  • the neuroprotective role of SIRT1 is also well established in Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis [Chen, J. et al. J. Biol. Chem. 280: 40364-40374; 2005, Kim, D. et al. EMBO J. 26: 3169-3179; 2007].
  • the biological functions and mechanisms of SIRT2 in inflammatory and oxidative stress are not well known.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of renal inflammatory diseases caused by sepsis by elucidating molecular mechanisms related to intracellular interactions and signaling and regulatory mechanisms of renal inflammatory diseases caused by sepsis and SIRT2. to provide.
  • the anticancer agent of the present invention may be cisplatin.
  • Cis-diammine-dichloroplatinum [II] a representative anticancer agent, is widely used in clinic as a chemotherapeutic agent for the treatment of ovarian cancer, bladder cancer, lung cancer, head and neck cancer and testicular cancer (Rosenberg B., Cancer, 55: pp2303-). 2315, 1985). Cisplatin is known to have an anticancer effect by generating reactive oxygen species to attack cancer cells, inducing inter-intrastrand cross-linking of DNA and formation of DNA adducts. However, there are side effects such as hearing loss, neurotoxicity, and kidney toxicity above the limited amount of drug during treatment (Mollman et al., 1998; Screnci and McKeage, 1999). Toxicity is also known to be frequently observed.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of renal toxic diseases caused by anticancer agents by identifying the molecular mechanisms related to the intracellular interactions and signaling and regulatory mechanisms of renal toxic diseases caused by anticancer agents and SIRT2. to provide.
  • Example 10 in order to confirm the effect of SIRT2 gene expression on the renal toxicity caused by cisplatin, cisplatin was administered to SIRT2 gene-deficient mice to confirm the renal function and the degree of damage. When administered, it was confirmed that the kidney damage caused by the increase in the BUN and creatinine, a measure of renal damage. In addition, SIRT2 gene-deficient mice were found to significantly decrease BUN and creatinine increased by cisplatin (see FIGS. 25-26).
  • the treatment refers to reversing, alleviating, inhibiting, or preventing the disease or condition to which the term applies, or one or more symptoms of the disease or condition, unless otherwise stated.
  • the term treatment refers to the act of treating when the treatment is defined as above.
  • the SIRT2 inhibitor according to the present invention inhibits the expression of CXCL2 and CCL2 induced by LPS-induced inflammation in SIRT2 gene-deficient mice, thereby relieving kidney inflammation to prevent kidney damage, thereby preventing renal inflammatory diseases caused by sepsis. And it can be usefully used as a therapeutic pharmaceutical composition.
  • SIRT2 gene affects the expression of CXCL2 and CCL2, which are increased inflammation-induced factors by LPS treatment.
  • the SIRT2 inhibitor according to the present invention inhibits apoptosis through the p53 acetylation pathway and decreases the expression of ICAM-1 and VCAM-1, which are factors related to inflammatory response increased by cisplatin, By inhibiting kidney damage and reducing the renal toxicity, it has an excellent effect to enhance the anti-cancer effect, and when used in combination with the anti-cancer agent to enhance the anti-cancer effect of the anti-cancer agent, for the prevention and treatment of renal toxic diseases caused by the anti-cancer agent It can be usefully used as a pharmaceutical composition.
  • cisplatin damage to the kidney is generally affected by apoptosis, when the absence of the SIRT2 gene, to determine the effect on the control of apoptosis by cisplatin caspase-3 And p53 acetylation was confirmed by performing Western blot.
  • the cleaved caspase-3 increased in the group in which cisplatin was administered to the WT mice was significantly reduced in the SIRT2 gene-deficient mice, and the expression of acetyl p53 was also reduced (FIGS. 29 to 30). Reference).
  • Example 12 it was confirmed that the expression of ICAM-1 and VCAM-1 genes, which are related to the inflammatory response by cisplatin, is regulated by the SIRT2 gene, resulting in increased ICAM- when cisplatin was administered to WT mice. Expression of 1 and VCAM-1 genes was reduced when cisplatin was administered to SIRT2 gene-deficient mice (see FIG. 31).
  • the pharmaceutical composition according to the invention may comprise a pharmaceutically effective amount of an SIRT inhibitor alone or may comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the pharmaceutically effective amount herein refers to an amount sufficient to prevent, ameliorate, and treat the symptoms of an inflammatory disease, or an amount sufficient to prevent, ameliorate, and treat symptoms of a renal toxic disease caused by an anticancer agent.
  • the pharmaceutically effective amount of the SIRT2 inhibitor according to the present invention is 0.5 to 100 mg / (day body weight kg), preferably 0.5 to 5 mg / day body weight kg.
  • the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed depending on the extent of symptoms of renal toxic disease, the age, weight, health condition, sex, route of administration and duration of treatment of the patient.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and does not normally cause an allergic reaction, such as gastrointestinal disorders, dizziness, or the like when administered to a human.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular, and the dosage of the active ingredient is determined by the route of administration, age, sex, weight and severity of the patient. It may be appropriately selected according to various factors such as, the composition for preventing or treating inflammatory diseases according to the present invention can be administered in parallel with known compounds having the effect of preventing, ameliorating or treating the symptoms of inflammatory diseases.
  • the SIRT2 inhibitor includes antisense oligonucleotides, RNAi, siRNA, shRNA, aptamers, antibodies, single chain variable region fragments, low molecular weight compounds or natural extracts specific for SIRT2, but is not limited thereto. Or, preferably AGK2 or AK-1, more preferably AK-1.
  • the AK-1 may include a compound represented by Formula 1 below.
  • AGK2 may include a compound represented by Formula 2 below.
  • the AK-1 and / or AGK2 may target SIRT2 nicotinamide binding site through cell permeation of benzylsulfonamide to inhibit SIRT2 activity.
  • the SIRT2 inhibitor of the present invention provides an inhibitory effect of renal inflammatory response and renal function impairment by sepsis induced by LPS.
  • Example 7 in order to confirm the expression patterns of CXCL2 and CCL2, the inflammation-inducing factors by SIRT2 inhibitors in renal cells, mouse proximal tubule cells AK-1 (SIRT2 inhibitors AK-1 (30 minutes before treatment) 10 ⁇ M), and then treated with LPS (10 ⁇ g / mL) for 1 hour and harvested the cells by performing qRT-PCR mRNA levels of CXCL2 and CCL2, when treated with SIRT2 inhibitor AK-1, It was confirmed that the expression of CXCL2 and CCL2 increased by LPS was decreased (see FIGS. 21 to 22).
  • SIRT2 inhibitors AK-1 SIRT2 inhibitors AK-1 (30 minutes before treatment) 10 ⁇ M
  • mice were treated with LPS, and urine was harvested through the bladder after 3 hours. The harvested urine was measured for the content of NGAL and KIM-1 by enzyme-linked immunosorbent assay.
  • the SIRT2 gene affects the kidney damage induced by LPS, and it was confirmed that the SIRT2 gene has an effect of suppressing the kidney damage caused by LPS.
  • the SIRT2 inhibitor of the present invention provides an effect of inhibiting cell damage and a cell proliferation effect by cisplatin, an anticancer agent.
  • Example 13 of the present invention when the SIRT2 inhibitor was treated with cisplatin in mouse proximal tubule cells in order to confirm the effect of inhibiting cell damage caused by cisplatin, the effects of the SIRT2 inhibitor AGK2 and AK-1 were confirmed. As a result, it was confirmed that the cells attached to cisplatin was decreased, but in the control group using the SIRT2 inhibitor, the cells attached were significantly increased (see FIGS. 32 to 33).
  • SIRT2 gene when SIRT2 gene is lacking, it was confirmed that there is renal protective effect by inhibiting kidney damage caused by cisplatin, and it was confirmed that the regulation of SIRT2 gene expression was effective in treating acute kidney injury.
  • antisense oligonucleotide refers to DNA or RNA or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to a sequence of a specific mRNA, and binds to a complementary sequence in the mRNA and translates the mRNA into a protein. It acts to inhibit.
  • Antisense sequence of the present invention refers to a DNA or RNA sequence that is complementary to the mRNA of the gene and capable of binding to the mRNA, the translation of the mRNA, translocation into the cytoplasm, maturation or any other overall biological May inhibit the essential activity for the function.
  • the antisense nucleic acid may be modified at the position of one or more bases, sugars or backbones to enhance efficacy (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995 ).
  • the nucleic acid backbone can be modified with phosphorothioate, phosphoroester, methyl phosphonate, short chain alkyl, cycloalkyl, short chain heteroatomic, heterocyclic intersaccharide linkages and the like.
  • antisense nucleic acids may comprise one or more substituted sugar moieties. Antisense nucleic acids can include modified bases.
  • Modified bases include hypoxanthine, 6-methyladenine, 5-methylpyrimidine (particularly 5-methylcytosine), 5-hydroxymethylcytosine (HMC), glycosyl HMC, gentobiosil HMC, 2-aminoadenine, 2 Thiouracil, 2-thiothymine, 5-bromouracil, 5-hydroxymethyluracil, 8-azaguanine, 7-deazaguanine, N6 (6-aminohexyl) adenine, 2,6-diaminopurine, etc. There is this.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may be chemically bound to one or more moieties or conjugates that enhance the activity and cellular adsorption of the antisense nucleic acids.
  • Antisense oligonucleotides can be synthesized in vitro in conventional manner to be administered in vivo or to allow antisense oligonucleotides to be synthesized in vivo.
  • One example of synthesizing antisense oligonucleotides in vitro is to use RNA polymerase I.
  • One example of allowing antisense RNA to be synthesized in vivo is to allow the antisense RNA to be transcribed using a vector whose origin is in the opposite direction of the recognition site (MCS). Such antisense RNA is desirable to ensure that there is a translation stop codon in the sequence so that it is not translated into the peptide sequence.
  • RNA interference refers to the RNA Interference, in Korean, it means the meaning of RNA interference.
  • RNA interference is a specific gene suppression phenomenon that is well conserved among most organisms. It is thought to be a type of gene monitoring mechanism used by cells to defend against viral infections, to suppress transposons, or to remove abnormal mRNAs.
  • gene suppression by small RNA is called RNA interference in a broad sense, and RNA interference in a narrow sense means mRNA degradation by siRNA.
  • RNA interference may refer to a technique for inhibiting genes using siRNA.
  • RNA refers to a nucleic acid molecule capable of mediating RNA interference or gene silencing (International Patent Nos. 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409, and 00 SiRNA is provided as an efficient gene knock-down method or gene therapy method because it can inhibit the expression of a target gene.
  • the siRNA molecule of the present invention may have a structure in which a sense strand (a sequence corresponding to the mRNA sequence of the marker gene) and an antisense strand (a sequence complementary to the mRNA sequence) are positioned opposite to each other to form a double chain.
  • the siRNA molecules of the present invention may have a single chain structure with self-complementary sense and antisense strands.
  • siRNAs are not limited to completely paired double-stranded RNA moieties paired with RNA, but can be paired by mismatches (the corresponding bases are not complementary), bulges (there are no bases corresponding to one chain), and the like. Parts that do not achieve may be included.
  • the siRNA terminal structure can be either blunt or cohesive, as long as the expression of the marker gene can be suppressed by the RNAi effect, and the adhesive terminal structure has a 3'-terminal protrusion structure and a 5'- end. Both terminal protruding structures are possible.
  • the siRNA molecules of the present invention may have a form in which a short nucleotide sequence is inserted between self-complementary sense and antisense strands, in which case the siRNA molecule formed by expression of the nucleotide sequence is subjected to intramolecular hybridization.
  • a hairpin structure is formed, and as a whole, a stem-and-loop structure is formed.
  • This stem-and-loop structure is processed in vitro or in vivo to produce an active siRNA molecule capable of mediating RNAi.
  • the method for preparing siRNA is to directly synthesize siRNA in vitro and then introduce it into the cell through a transformation process, and to siRNA expression vector or PCR-derived siRNA expression cassette prepared to express siRNA in the cell. There is a method of conversion or infection.
  • aptamer in the present invention refers to an oligonucleotide molecule having binding activity to a given target molecule. Aptamers can inhibit the activity of a given target molecule by binding to the given target molecule.
  • the aptamers of the invention can be RNA, DNA, modified oligonucleotides or mixtures thereof.
  • the aptamers of the invention may also be in linear or cyclic form.
  • the length of the aptamer of the present invention is not particularly limited, and may be usually 15 to 200 nucleotides, for example 15 to 100 nucleotides, preferably 15 to 80 nucleotides, more preferably 18 to 60 nucleotides, most preferably Preferably 20 to 45 nucleotides or less. Smaller total number of nucleotides is advantageous for easier chemical synthesis, chemical formula and mass production, economical, high in vivo stability and low toxicity.
  • the SIRT inhibitor of the present invention includes an SIRT2 protein activity inhibitor, and as such a protein activity inhibitor, preferably an antibody, a single chain variable region fragment, a peptide, a low molecular weight compound or a natural extract that specifically binds to SIRT2 Can be illustrated.
  • Antibodies that specifically bind to and inhibit activity by the SIRT2 protein that can be used in the present invention are polyclonal or monoclonal antibodies.
  • Antibodies to SIRT2 protein can be prepared by methods commonly practiced in the art, such as fusion methods (Kohler et al., European Journal of Immunology, 6: 511-519 (1976)), recombinant DNA methods (US Pat. 4,816,56) or phage antibody library methods (Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 (1991)).
  • Can be prepared by General procedures for antibody preparation are described in Harlow, E.
  • the antibody may include a single chain variable region fragment (scFv).
  • the single chain variable region fragment may be composed of "variable region (VL) -linker-heavy chain variable region (VH) of light chain".
  • the linker means an amino acid sequence of a certain length that serves to artificially link the variable regions of the heavy and light chains.
  • a dietary supplement for the prevention and improvement of inflammatory diseases comprising a SIRT2 inhibitor as an active ingredient to seek to solve the above-mentioned problems.
  • an anticancer adjuvant comprising an SIRT2 inhibitor having an inhibitory activity against renal toxicity induced by an anticancer agent as an active ingredient was sought to solve the above problems.
  • the present invention provides a dietary supplement for the prevention and improvement of an inflammatory disease, including an SIRT2 inhibitor and a foodstuff acceptable food additive.
  • the present invention provides a health functional food for the prevention and improvement of renal toxic diseases caused by an anticancer agent comprising a SIRT2 inhibitor as an active ingredient.
  • Examples of the food to which the SIRT2 inhibitor of the present invention can be added include various foods, beverages, gums, teas, vitamin complexes, and health functional foods.
  • Health functional food as defined in the present invention means a food manufactured and processed using raw materials or ingredients having functional properties useful for the human body according to the Health Functional Food Act No. 6767, and "functional” means a human body It means the ingestion for the purpose of obtaining a useful effect in health use such as nutrient control or physiological action on the structure and function of.
  • the amount of the extract in the food or beverage may be added in 0.01 to 15% by weight of the total food weight
  • the health beverage composition may be added in a ratio of 0.02 to 5 g, preferably 0.3 to 1 g based on 100 ml. have.
  • Health functional food of the present invention includes the form of tablets, capsules, pills, liquids and the like.
  • the health functional food in the form of tablets may be prepared in granules in a suitable manner as it is or mixed with an excipient, a binder, a disintegrating agent or other additives, and then compressed by molding with a lubricant or the like in a tablet form. It is prepared by direct compression molding of the nutraceutical as it is or by adding excipients, binders, disintegrants or other suitable additives. The excipient, binder or other suitable additives are added to the functional food, and the powder mixed evenly is wetted with a solvent, the wet powder is molded into a mold at low pressure, and then dried and prepared by a suitable method.
  • the nutraceutical can be added to the health functional food in the form of tablets, if necessary, can be avoided with a suitable skin coating.
  • excipients binders, disintegrants, lubricants, copulation agents, flavoring agents, etc. of the present invention are those described in the literature known in the art and include those having the same or similar functions (Korean Pharmacopoeia, Munseongsa) , Korean College of Pharmacy, 5th Edition, p33-48, 1989).
  • the health functional beverage composition of the present invention is not particularly limited to other ingredients except for containing the SIRT2 inhibitor as an essential ingredient in the indicated ratio, and may contain various flavors or natural carbohydrates, etc. as additional ingredients, like ordinary drinks.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and other disaccharides such as maltose, sucrose and the like, and conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, And sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents such as, tauumatin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used.
  • the proportion of said natural carbohydrates is generally about 1-20 g, preferably about 5-12 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the SIRT2 inhibitors of the present invention include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic and natural flavoring agents, colorants and neutralizing agents (such as cheese, chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid and Salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like.
  • the compounds of the present invention may contain flesh for the production of natural fruit juices and fruit juice beverages and vegetable beverages. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not so critical but is generally selected in the range of 0.01 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the compound of the present invention.
  • it may be a method to prevent and treat renal inflammatory diseases caused by sepsis by identifying molecular mechanisms related to intracellular interactions and signaling and regulatory mechanisms of renal inflammatory diseases caused by sepsis and SIRT2. .
  • the SIRT2 inhibitor according to the present invention when combined with cisplatin, reduces the renal toxicity, which is a side effect of cisplatin, and enhances anticancer efficacy.
  • medicines for the prevention and treatment of cancer diseases and for the prevention and improvement of cancer diseases can be used as a dietary supplement.
  • SIRT2-/-mice Jackson laboratory, USA
  • SIRT2 + / + mice C57BL / 6, Orient, Korea
  • the laboratory animals were randomly provided with standard laboratory food and water, and maintained according to a protocol approved by the Animal Experimental Ethics Committee of Chonbuk National University.
  • control group administered control buffer (CB) to the normal experimental animals (SIRT2 + / +), 2) Lipopolysaccharide (LPS, 10 ⁇ g / kg) to the normal experimental animals (SIRT2 + / +) Control group, 3) SIRT2 gene-deficient mice (SIRT2-/-), and control group administered CB and 4) SIRT2 gene-deficient mice (SIRT2-/-), LPS (10 ⁇ g / kg) The control group was divided. The control buffer and LPS were intraperitoneally injected in sterile saline solution (100 ⁇ l of 0.9% NaCl).
  • the experimental animals to which the CB or LPS was administered were collected for 3 hours and 6 hours after the anesthesia with ketamine (ketamine, 100 mg / kg) and xyazine (xylazine, 10 mg / kg) to collect blood, urine, and kidney tissue. .
  • the blood sample was anesthetized with 100 mg / kg ketamine and 10 mg / kg xyazine, and blood was collected by cardiacpuncture.
  • the kidney tissues were divided into 4 parts after collection, 2 parts were fixed with 4% paraformaldehyde, and stained using antibodies specifically stained with CXCL2 and CCL2 to confirm expression of CXCL2 and CCL2. The remaining two portions were extracted from RNA and used for the experiment.
  • Proximal tubule cells from mice were provided by Dr Lloyd G. Cantley (Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA), at humid conditions of 5% CO 2 and 95% air, and at 37 ° C. 10% (vol / vol) fetal bovine serum (fetal bovine serum) was added to incubation in ⁇ -MEM medium was prepared.
  • Lipopolysaccharide is a sigma aldrich (St Louis, MO, USA) is a SIRT2 inhibitor AK-1 (including the structure of formula 1) is a calbiochem (San Diego, CA, USA) It was purchased and used.
  • Dilute siRNA 100 pmol, Dharmacon ON-TARGETplus SMART pool, Dharmacon Inc., CO, USA
  • 10 ⁇ l Lipofectamine TM 2000 10 ⁇ l Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in Opti-MEM medium to remove the SIRT2 gene from cells. After 7 hours of treatment, the cells were changed to culture medium and cultured. After 2 days of culture, the cells were harvested and the SIRT2 protein decreased.
  • RNA and protein were subjected to Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and enzyme-linked immunosorbent assay.
  • recombinant adenoviruses (Ad-CMVeGFP-SIRT2; ad-SIRT2 or AD-CMVeGFP; ad-cont) were purchased from ViraQuest, INC. (IA, USA). After diluting the virus in ⁇ -MEM medium containing 2% serum, the cells were treated for 24 hours, and then cultured for 48 hours. Intracellular viral infection efficiency was confirmed through expression of GFP.
  • RNA, protein was obtained qRT-PCR and enzyme-linked immunosorbent assay.
  • the immunochemical staining was performed by visualizing the proximal tubules stained with CXCL2 using a Zeiss Z1 microscope. Ten random, non-overlapping fields per slide at each site were selected to confirm CXCL2 expression patterns (FIG. 1).
  • Density and area of CXCL2 positive cells in renal tissue identified through FIG. 1 were calculated using an image analysis program (AnalySIS, Soft Imaging System, Munster, Germany). The results are shown in FIG. In addition, expression of CXCL2 in blood (FIG. 3) and kidney tissue (FIG. 4) was measured using enzyme-linked immunosorbent assay (Abcam, Cambridge, MA, USA).
  • the immunochemical staining was performed by visualizing the proximal tubules stained with CCL2 using a Zeiss Z1 microscope. Ten random, non-overlapping fields per slide at each site were selected to confirm the CCL2 expression pattern (FIG. 5). Density and area of CCL2 positive cells in renal tissue confirmed through FIG. 5 were calculated using an image analysis program (AnalySIS, Soft Imaging System, Munster, Germany). The results are shown in FIG. In addition, expression of CCL2 in blood (FIG. 7) and kidney tissue (FIG. 8) was measured using enzyme-linked immunosorbent assay (Abcam, Cambridge, MA, USA).
  • qRT-PCR was performed to determine whether the SIRT2 gene in the proximal tubule cells of the mouse has an effect on increasing CXCL2 mRNA expression by LPS when lacking the siRT2 gene.
  • TRI Reagent MRC, Cincinnati, OH, USA
  • SYBR® Green PCR Master Mix Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA
  • CXCL2 was confirmed by performing PCR using a 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA). The results are shown in FIG.
  • the increased expression of CCL2 was significantly decreased in SIRT2 gene-deficient cells when the cells were treated with LPS, and the expression of CCL2 was more expressed in cells overexpressing the SIRT2 gene by adenovirus. It could be confirmed that the increase.
  • Mouse proximal tubule cells were treated with AK-1 (10 ⁇ M), a SIRT2 inhibitor, 30 minutes before LPS treatment, and then treated with LPS (10 ⁇ g / ml) for 1 hour and harvested to obtain mRNA levels of CXCL2 and CCL2. Confirmation via qRT-PCR. The results are shown in FIGS. 21 to 22.
  • Example 8 Determination of renal function impairment by measuring NGAL and KIM-1 content
  • mice When the mice were treated with LPS, anesthesia was anesthetized by the method of Example 1 three hours after LPS treatment, and urine was harvested through the bladder. The harvested urine was measured for the content of NGAL and KIM-1 (R & D system, Minneapolis, MN, USA) by enzyme-linked immunosorbent assay. The results are shown in FIGS. 23 to 24.
  • the experimental animals used in the present invention are SIRT2-/-mice (Jackson laboratory, USA), which lacks the male SIRT2 protein of 8 to 10 weeks old, and SIRT2 + / + mice (C57BL / 6, which are mice containing the SIRT2 protein). Orient, Korea), the standard laboratory feed and water for the experimental animals were provided at random and maintained according to the protocol approved by the Animal Experimental Ethics Committee of Chonbuk National University.
  • mice were divided into a control group in which the vehicle was administered (KO) and 8) a control group in which cisplatin (20 ⁇ g / kg) was administered to the mouse (KO) lacking the SIRT2 protein.
  • the control buffer and cistratin were intraperitoneally injected in sterile saline solution (100 ⁇ l of 0.9% NaCl).
  • the experimental animal group administered the vehicle or cisplatin was anesthetized with ketamine (ketamine, 100 mg / kg) and xylazine (xylazine, 10 mg / kg) after 3 days of administration to collect blood and kidney tissue.
  • the blood sample was anesthetized with 100 mg / kg ketamine and 10 mg / kg xyazine, and blood was collected by cardiac puncture.
  • the kidney tissue was divided into 4 parts after collection and the second part was fixed in 4% paraformaldehyde, and then Periodic acid-Schiff (PAS) was confirmed.
  • PAS Periodic acid-Schiff
  • cisplatin was administered to SIRT2 gene-deficient mice to confirm the effect of SIRT2 gene expression on cisplatin-induced kidney toxicity.
  • BUN and creatinine are collected in the blood from the mouse as shown in Example 9-2, and only serum is separated using a centrifuge, using an automatic analyzer (Hitachi 7180; Tokyo, Japan). Measured. The results are shown in FIGS. 25 to 26.
  • PAS staining was performed to confirm the histological damage of the kidney due to cisplatin administration.
  • the kidney tissue damaged through the PAS staining was performed by using a Zeiss Z1 microscope. The results are shown in FIG. 27.
  • tissue damages such as epithelial cell detachment, brush border loss, and tubular cast formation were observed in the kidneys of the control group treated with cisplatin in SIRT2 gene WT (SIRT2 + / +) mice.
  • SIRT2 + / + mice In mice lacking (SIRT2 ⁇ / ⁇ ), this kidney injury was found to be significantly reduced.
  • kidney damage caused by cisplatin is affected by apoptosis.
  • the acetylation of caspase-3 and p53 was confirmed by Western blot to determine the effect on the regulation of apoptosis by cisplatin.
  • Example 9-2 After obtaining the kidney tissue by the method of Example 9-2, homogenizing it to extract the protein and the expression of caspase-3 and acetylp53 protein using caspase-3 and acetyl p53 antibody (Cell Signaling Technology, Denvers, MA. USA) The aspect was confirmed. The same blot was peeled off to confirm the quantification of the protein and confirmed using Actin (Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) and p53 (Cell Signaling Technology). The results are shown in FIGS. 29 and 30.
  • Example 12 Inflammatory molecule regulatory effect by SIRT2 gene expression
  • the cell proliferation test confirmed the cell proliferation effect of the SIRT2 inhibitor.
  • the cell proliferation test after trypsin treatment of the mouse proximal tubule cells, put 1 ⁇ 10 3 cells in 96-well plate, and after 24 hours incubation at 37 °C remove the culture medium, and the culture medium with 1% FBS AGK2, AK-1, Cisplatin, Cisplatin together with AGK2 and AK-1 were treated. After incubation at 37 ° C. for 24 hours, the proliferation of the cells was measured using Cell Proliferation Kit II (Cell proliferation Kit II, XTT, Roche, Mannheim, Germany). As cells proliferate, the absorbance increases due to the increase in the color of mitochondria in the cells. Thus, the proliferation of mouse proximal tubule cells was measured by absorbance, and the results are shown in FIG. 34.
  • Cell Proliferation Kit II Cell proliferation Kit II, XTT, Roche, Mannheim, Germany
  • the SIRT2 inhibitor according to the present invention inhibits apoptosis and regulates the expression of ICAM-1 and VCAM-1, which are inflammation-related factors, thereby causing kidney damage by cisplatin, an anticancer agent.
  • Pharmaceutical composition for the prevention and treatment of renal toxic diseases caused by anticancer agents by confirming that it has an excellent effect of improving anticancer efficacy while inhibiting and reducing nephrotoxicity, and in combination with anticancer agents. Or it can be usefully used as a dietary supplement.
  • the pharmaceutical composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases of the present invention is induced by sepsis by identifying the molecular mechanisms related to intracellular interactions and signaling and regulatory mechanisms of SIRT2 and renal inflammatory diseases caused by sepsis. It may be a method for preventing and treating renal inflammatory diseases.

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Abstract

본 발명은 SIRT2 억제제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 SIRT2유전자의 발현 조절을 통해 패혈증에 의한 염증유발인자를 조절함으로써 신장염증을 완화시켜 신장손상을 억제하여 패혈증에 의한 신장 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 시스플라틴과 함께 투여하였을 때 시스플라틴의 부작용인 신장 독성은 감소시키면서 항암 효능은 증진시키는 효과가 있는 암질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

SIRT2 억제제를 포함하는 약학적 조성물
본 발명은 SIRT2 억제제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 SIRT2유전자의 발현 조절을 통해 패혈증에 의한 염증유발인자를 조절함으로써 신장염증을 완화시켜 신장손상을 억제하여 패혈증에 의한 신장 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 시스플라틴과 함께 투여하였을 때 시스플라틴의 부작용인 신장 독성은 감소시키면서 항암 효능은 증진시키는 효과가 있는 암질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
암(cancer)은 전 세계적으로 연간 약 700만 명의 사망 원인이 되는 질병이며, 특히 우리나라에서는 지난 통계청의 『2000년 사망원인 통계연보』(2000년 사망 자료 분석 결과)에 의하면, 암으로 인한 사망은 23.5%로 전체 사망원인 중 1위를 차지하고 있어 국가차원의 암관리 대책이 요구되고 있다. 현재 암을 치료하는 방법으로 수술, 방사선 치료, 유전자 치료 등 여러 방법이 사용되고 있으나, 가장 많이 사용되고 있는 치료방법 중의 하나가 항암제를 투여하는 화학요법이다.
항암 화학요법은 전신 치료로, 대부분 주사나 경구로 항암제를 투여하면 혈류를 따라 전신에 퍼진다. 그러므로 국소적인 효과보다는 전신에 퍼져있는 미세전이(micometastasis)에 작용하는 치료이다. 따라서 전신적인 부작용이 많으며 수술이나 방사선치료에 비해서 그 정도가 매우 심한 편이다. 정상세포와 암세포 간의 약물에 대한 감수성 차를 이용하여 항암제가 암세포에 대해 선택적으로 작용하도록 하는 것이 화학요법이나 대부분의 항암제가 정상세포와 암세포를 구별하지 못하여 용량 제한적 특성(dose-limiting toxicity)을 나타내는데 그 문제점이 있다.
상술한 문제점으로 인해, 표적항암제에 대한 연구가 활발하다. 상기 표적항암제에 대한 종래 기술로 공개특허 10-2013-0058631(공개일자: 2013년06월04일)에는 인테그린 β3 중화항체, 인테그린 β3 siRNA, Src 억제제 및 Src siRNA로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 표적 항암제 내성 억제용 약학적 조성물에 관해 기재하고 있다. 그러나, 표적항암제는 암세포를 죽이지는 못하는 문제점이 있으며, 대신 암세포가 자라는데 필요한 요소를 저해하여 암세포의 증식과 성장을 방해하는 약물이 통상적이다.
한편, 대표적인 항암제인 시스플라틴(cis-diammine-dichloroplatinum [II])은 난소암, 방광암, 폐암, 두경부암, 고환암 등의 치료를 위한 화학요법제로 임상에서 널리 사용되고 있다(Rosenberg B., Cancer, 55: pp2303-2315, 1985). 시스플라틴은 활성산소종을 생성하여 암세포를 공격하고, 암세포에서 DNA의 인터-인트라스트랜드 교차결합(inter-intrastrand cross-linking), DNA 부가체 형성을 유도하여 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 치료과정 중 약물의 제한된 함량 이상에서는 청각의 상실, 신경 독성, 신장 독성과 같은 부작용이 나타나며(Mollman et al., 1998; Screnci and McKeage, 1999), 고농도의 시스플라틴의 투여 시에는 간 독성 및 신장 독성 또한 빈번하게 관찰되는 것으로 알려져 있다(Cerosimo R. J., Ann. Pharm., 27: pp438-441, 1993; Cavalli F.et al., Cancer Treat. Rep., 62: pp2125-2126, 1978). 시스플라틴에 의한 이러한 부작용은 시스플라틴에 의해 생성된 활성산소종으로 인한 지질 과산화의 증가(Matsushima H. et al., J. Lab. Clin. Med., 131: pp518-526, 1998; Koc A. et al., Mol. Cell Biochem., 278(1-2): pp79-84, 2005), 조직에 존재하는 항산화 효소 활성의 억제(Sadzuka Y. et al., Biochem. Pharmacol., 43: pp1873-1875, 1992), 글루타시온(glutathione)의 고갈(Zhang J. G. and Lindup W. E., Biochem. Pharmcol., 45: pp2215-2222, 1993) 및 세포내 칼슘 항상성의 붕괴(Zhang J.G. and Lindup W.E., Toxicology in Vitro, 10: pp205-209, 1996)와 밀접한 관련이 있다.
최근 시스플라틴과 글루타시온 에스테르(glutathione ester)를 같이 투여하였을 때 시스플라틴으로 인한 신장 독성이 효과적으로 억제된다는 것을 관찰하였으며(Babu E. et al., Mol. Cell Biochem., 144: pp7-11, 1995) 식이를 통해 항산화물질을 섭취함으로써 시스플라틴으로 인한 독성을 억제하는데 많은 관심이 집중되고 있다(Appenroth D. et al., Arch. Toxicol., 71: pp677-683, 1997).
반면, 패혈증은 전신염증반응과 더불어 감염이 확인되거나 의심되는 상황으로 정의된다. 중증 패혈증(severe sepsis)은 패혈증에서 장기기능부전(organ dysfunction: 저혈압, 저산소증, 핍뇨증, 대사성산증, 혈소판 감소증, 의식장애)이 동반되는 경우로 정의된다. 패혈증 쇼크(septic shock)는 중증 패혈증에서 수액요법이나 혈압상승제를 투여하여도 혈압이 정상화되지 않는 경우로 정의한다. 패혈증은 중증 패혈증 및 궁극적으로는 패혈성 쇼크의 임상적 단계로 진행될 수 있다. 임상적 패혈증은 넓은 의미에서 미생물성 작용제에 의한 침윤이 감염의 임상적 증상과 관련이 있는 상태로 정의된다. 패혈증의 임상적 증상으로는 (1) 체온 > 38℃ 또는 < 36℃ (2) 심박수 > 1분 당 90회 (3) 호흡수 > 1분 당 20회 또는 PaC02 < 32 mmHg; (4) 백혈구 수 > 12000/㎥, < 4,000/cu ㎥ 또는 > 10％ 비성숙 (밴드) 형태 (5) 기관기능부전, 과유합, 또는 고혈압 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
감염이 발생하면, 감염 부위의 대식세포가 활성화되어 tumor necrosis factor(TNF)-α 및 interleukin(IL)-1을 분비함으로써, 조직으로의 혈장 단백질 방출량이 증가되고, 조직으로의 식세포와 림프구의 이동 증가 및 혈관벽에 대한 혈소판의 부착 증가를 초래한다. 이러한 방식으로, 국소 혈관이 폐색되고 병원체가 감염 부위에 집중된다. 특히, 패혈증은 전신성 감염이 일어나며 TNF-α에 의해 유도된 심각한 혈관 폐색이 수반된다. 또한 TNF-α의 전신적 방출은 혈관확장 및 혈관의 투과성 증가로 인한 혈장 체적의 손실을 초래하여 쇼크를 야기한다. 패혈성 쇼크에서, TNF-α는 파종성 혈관 내 응고(혈액 응고)를 더욱 촉발하여 작은 혈관에서의 혈병 생성 및 혈액 응고 단백질들의 대량 소모를 초래한다. 환자의 혈액 응고 능력이 상실되기 때문에, 예컨대 신장, 간, 심장 및 폐 등과 같은 중요한 기관들이 정상적인 관류의 부전으로 인해 손상된다. 중증 패혈증과 패혈증 쇼크의 사망률은 각각 25 ~ 30%, 40 ~ 70% 에 달하는 것으로 보고되어 있다.
여러 경우의 패혈증에서는 대장균(E.coli)이 병원체이지만, 예를 들어 클렙시엘라 (Klebsiella)-엔테로박터(Enterobacter)-세라티아(Serratia)군 및 슈도모나스 (Pseudomonas) 와 같은 다른 그람-음성 박테리아도 이러한 상태를 개시할 수 있다. 포도알균(Staphlococcus) 등의 그람-양성 미생물, 전신적 바이러스 및 진균 감염도 일부 경우에서 패혈증을 개시한다.
패혈증은 감염 원인균과 숙주의 면역, 염증 그리고 응고계통 사이의 복잡한 상호작용의 결과로 발생하는 것으로 이해되고 있다. 숙주의 반응 정도와 감염 원인균의 특성 모두 패혈증의 예후에 중대한 영향을 미친다. 패혈증에서 관찰되는 장기부전은 숙주의 감염 원인균에 반응이 부적절한 경우에 발생하며, 만일 숙주의 감염 원인균에 대한 반응이 지나치게 증폭된다면 숙주 자체의 장기손상을 유발할 수 있다. 이러한 개념을 바탕으로 숙주의 염증 반응에 주도적인 역할을 수행하는 전염증사이토카인(proinflammatory cytokines)인 TNF-α, IL-1β, IL-6 등에 대한 길항 물질이 패혈증의 치료제로 시도되었으나 대부분 실패하였으며, 기계환기치료, 활성단백질 C(activated protein C) 투여, 글루코코르티코이드 치료 등이 현재 시도되고 있으나 여러 가지 한계점이 지적되고 있다. 또한, 높은 사망률을 보임에도 아직까지 뚜렷한 치료제가 개발되지 않은 패혈증 및 패혈증에 의한 염증성 질환들에 대한 연구 및 치료방법이 부족하다는 문제점이 있었다.
한편, SIRT2(Sirtuin 2)는 써투인(sirtuin) 단백질 패밀리 중 하나이며, 어떤 조건 하에서 중요한 세포 생존 기능을 수행한다. 그렇지만, 염증 및 산화 스트레스와 관련한 SIRT2 단백질의 생물학적 기능은 명확하지 않다.
써투인(sirtuin)으로 알려진 SIRT2(silent information regulator 2)는 수명, 노화, 암발생, 신경퇴화 및 물질대사 질환과 같은 생물학적 과정에서 NAD+-의존적 디아세틸레이즈 조절자이다[Michan, S.; Sinclair, D. Biochem. J. 404: 1-13; 2007, Finkel, T. et al. Nature 460: 587-591; 2009, Donmez, Z.; Guarente, L. Aging Cell 9: 285-290; 20101-3]. SIRT2 유전자 패밀리는 세균에서 진핵생물까지 잘 보존되어 있다. 인간에서는 일곱 개 타입의 SIRT가 밝혀졌다[Frye, R. A. Biochem. Biophys. Res. Comm. 272: 793-798; 2000]. 인간의 일곱 가지 SIRT 중 대부분의 연구는 SIRT1에 촛점을 맞추었다. SIRT1의 과다발현은 DNA 손상 및 산화 스트레스하에서 세포의 생존율을 증가시킨다. 또, SIRT1의 신경보호 역할은 알츠하이머 병과 근위축성 측색경화증(amyotrophic lateral sclerosis)에서 잘 정립되어 있다. 그렇지만, 염증 및 산화 스트레스에서 SIRT2의 생물학적 기능과 메카니즘은 잘 알려지지 않았다.
한편, 시스플라틴을 비롯한 많은 화학요법제들이 활성 산소종을 생성하여 암세포를 공격하는 것으로 알려져 있고, 생성된 활성 산소종들은 정상세포에도 작용하여 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다. 따라서 항산화효과를 가지는 물질들은 화학요법제에 의해 유발된 독성을 감소시킬 가능성이 크다. 또한 활성산소종이나 라디칼을 생성하는 외부 유해물질에 의한 간 독성 및 신장 독성도 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 생각되지만, 이에 대한 연구가 부족하다는 문제점이 있었다.
또한, 상술한 바와 같이, 염증 및 산화 스트레스에서 SIRT2의 생물학적 기능과 메카니즘에 대한 연구가 부족한 문제점이 있으며, 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환과 SIRT2의 세포내 상호작용 및 신호전달과 조절기작에 연관된 분자적 기전에 대한 연구가 매우 부족하여 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환의 예방 및 치료를 할 수 있는 방법이 매우 부족하다는 문제점이 있었다.
본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫 번째 해결하려는 과제는 항암제 투여 시 항암 효능을 증진시키면서 항암제에 의한 신장 독성을 억제하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 해결하려는 과제는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째 해결하려는 과제는 항암제 투여 시 항암 효능을 증진시키면서 항암제에 의한 신장 독성을 억제하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 네 번째 해결하려는 과제는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성에 대한 억제 활성을 갖는 항암보조제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다섯 번째 해결하려는 과제는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명은 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 항암제는 시스플라틴(cisplatin)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 SIRT2억제제는 상기 SIRT2유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 앱타머 또는 항체일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 SIRT2억제제는 AGK2 또는 AK-1일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 세포사멸(apoptosis) 및 염증반응과 관련된 분자 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 억제함으로써 신장 손상을 억제하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 항암제에 의해 유발되는 신장 독성에 대한 억제 활성을 갖는 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다.
나아가, 본 발명은 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
더불어, 본 발명은 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 염증성 질환은 패혈증에 의한 신장 염증성 질환일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 SIRT2억제제는 상기 SIRT2유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 앱타머 또는 항체로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 SIRT2억제제는 AGK2 또는 AK-1일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 LPS-유도된 염증유발인자인 CXCL2 및 CCL2의 발현을 억제함으로써 신장염증을 완화시켜 신장손상을 억제하는 것일 수 있다.
게다가, 본 발명은 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
더불어, 본 발명은 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 신장 보호용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 신장 보호용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 SIRT2억제제는 LPS-유도된 염증유발인자인 CXCL2 및 CCL2의 발현을 억제함으로써 신장염증을 완화시켜 신장손상을 억제하여 패혈증에 의한 신장 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품으로서 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 SIRT2억제제는 세포사멸(apoptosis)을 억제하고, 염증반응 관련 인자인 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 조절함으로써, 항암제인 시스플라틴에 의한 신장손상을 억제하고 신장독성을 감소시키면서 항암 효능을 증진시키는 우수한 효과가 있고, 항암제와 병용하였을 경우 항암제의 항암효능을 증진시킴을 확인함으로써, 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물 또는 건강기능식품으로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1 내지 4는 SIRT2유전자-결여된 마우스에서 LPS에 의한 CXCL2의 발현 조절에 미치는 효과를 확인한 결과이다(SIRT2+/+:SIRT2가 존재하는 실험군, SIRT2-/-:SIRT2가 결여된 실험군, CB: control buffer를 투여한 대조군, LPS: LPS를 투여한 대조군). 도 1은 마우스 신장에서 CXCL2의 발현을 면역화학염색을 통해 확인한 사진이며, 도 2는 염색을 통해 확인한 CXCL2 양성 세포의 밀도를 이미지 분석 프로그램을 통해 확인한 그래프이고, 도 3은 마우스 혈청에서 CXCL2의 함량을 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이며, 도 4는 마우스신장조직에서 CXCL2의 함량을 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이다.
도 5 내지 8는 SIRT2유전자-결여된 마우스에서 LPS에 의한 CCL2의 발현 조절에 미치는 효과를 확인한 결과이다(SIRT2+/+:SIRT2가 존재하는 실험군, SIRT2-/-:SIRT2가 결여된 실험군, CB: control buffer를 투여한 대조군, LPS: LPS를 투여한 대조군). 도 5는 마우스 신장에서 CCL2의 발현을 면역화학염색을 통해 확인한 사진이고, 도 6은 염색을 통해 확인한 CCL2 양성 세포의 밀도를 이미지 분석 프로그램을 통해 확인한 그래프이며, 도 7은 마우스 혈청에서 CCL2의 함량을 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이고, 도 8는 마우스 신장조직에서 CCL2의 함량을 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이다.
도 9 내지 14는 신장세포에서 SIRT2유전자의 발현 조절에 따른 CXCL2의 발현양상 확인한 결과이다(SIRT2 siRNA: SIRT2 siRNA 처리한 실험군, ContsiRNA: siRNA 대조군, Ad-SIRT2: SIRT2 재조합-아데노바이러스 처리한 실험군, ad-cont: control virus 처리한 대조군, CB: control buffer를 투여한 대조군, LPS: LPS를 투여한 대조군). 도 9는 마우스 근위세뇨관세포에 SIRT2를 siRNA를 이용하여 SIRT2를 결여시켰을 때 CXCL2의 mRNA 발현 양상을 qRT-PCR을 통해 확인한 그래프이고, 도 10은 세포 배양액에서 CXCL2를 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이며, 도 11는 세포에서 CXCL2를 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이고, 도 12은 마우스 근위세뇨관세포에 SIRT2를 아데노바이러스를 이용하여 SIRT2를 증가시켰을 때 CXCL2의 mRNA 발현 양상을 qRT-PCR을 통해 확인한 그래프이다.
도 13은 세포 배양액에서 CXCL2를 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이고, 도 14는 세포에서 CXCL2를 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이다.
도 15 내지 20은 신장세포에서 SIRT2유전자의 발현 조절에 따른 CCL2의 발현양상 확인한 결과이다(SIRT2 siRNA: SIRT2 siRNA 처리한 실험군, ContsiRNA: siRNA 대조군, Ad-SIRT2: SIRT2 재조합-아데노바이러스 처리한 실험군, ad-cont: control virus 처리한 대조군, CB: control buffer를 투여한 대조군, LPS: LPS를 투여한 대조군). 도 15는 마우스 근위세뇨관세포에 SIRT2를 siRNA를 이용하여 SIRT2를 결여시켰을 때 CCL2의 mRNA 발현 양상을 qRT-PCR을 통해 확인한 그래프이며, 도 16은 세포 배양액에서 CCL2를 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이고, 도 17은 세포에서 CCL2를 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이며, 도 18은 마우스 근위세뇨관세포에 SIRT2를 아데노바이러스를 이용하여 SIRT2를 증가시켰을 때 CCL2의 mRNA 발현 양상을 qRT-PCR을 통해 확인한 그래프이다.
도 19는 세포 배양액에서 CCL2를 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이고, 도 20는 세포에서 CCL2를 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이다.
도 21 내지 22은 신장세포에서 SIRT2억제제에 의한 CXCL2(도 22) 및 CCL2(도 23)의 발현 양상을 qRT-PCR을 통해 확인한 그래프이다.
도 23 내지 24는 SIRT2유전자의 발현에 따른 LPS 투여 시 신장 손상도을 neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL)(도 23) 및 kidney injury molecule (KIM-1)(도 24) 함량을 효소결합면역흡착분석법 측정을 통해 확인한 그래프이다.
도 25은 SIRT2유전자-결여된 마우스에서의 시스플라틴에 의한 신장의 기능을 확인하기 위하여 BUN을 측정한 그래프이다.
도 26은 SIRT2유전자-결여된 마우스에서의 시스플라틴에 의한 신장의 기능을 확인하기 위하여 크레아티닌(creatinine)을 측정한 그래프이다
도 27은 시스플라틴 투여로 인한 신장의 조직학적인 손상을 PAS 염색을 통해 확인한 사진이다.
도 28은 시스플라틴 투여로 인한 생존율을 확인한 그래프이다.
도 29는 SIRT2유전자 발현에 의한 세포사멸(apoptosis) 조절 효과를 caspase-3 발현 양상을 통해 확인한 웨스턴블랏의 결과이다. 도 29에 나타낸 WT은 SIRT2가 존재하는 대조군을 의미하고 KO은 SIRT2가 결여된 대조군을 의미한다. 첫 번째 레인은 SIRT2가 존재하는 마우스에 vehicle을 두 번째 레인은 SIRT2가 결여된 마우스에 vehicle을 처리하였고 세 번째에서 여섯 번째 레인은 SIRT2가 존재하는 마우스에 cisplatin을 일곱 번째에서 열 번째 레인은 SIRT2가 결여된 마우스에 cisplatin을 처리하였다. vehicle만 처리한 대조군에서는 발현하지 않았던 caspase-3의 active한 form이 SIRT2가 존재하는 마우스에 cisplatin을 처리하였을 때 증가 발현하였고, SIRT2가 결여된 마우스에서는 의의있게 감소됨을 확인하였다.
도 30은 SIRT2유전자 발현에 의한 세포사멸(apoptosis) 조절 효과를 p53 발현 양상을 통해 확인한 웨스턴블랏의 결과이다. SIRT2가 존재하는 마우스에 cisplatin을 처리 하였을 때 증가한 p53의 acetylation이 SIRT2가 결여된 마우스에서는 감소함을 확인하였다.
도 31은 SIRT2유전자 발현에 의한 염증분자 조절 효과를 ICAM-1 및 VCAM-1 발현 양상을 통해 확인한 웨스턴블랏의 결과이다. 첫 번째와 두 번째 레인은 SIRT2 유무에 관계없이 vehicle을 처리 하였을 때 ICAM-1과 VCAM-1이 발현하지 않았다. 세 번째에서 다섯 번째 레인은 SIRT2가 존재하는 마우스에 cisplatin을 처리하였을 때 ICAM-1과 VCAM-1이 증가발현 하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 SIRT2가 결여된 마우스 대조군인 여섯 번째에서 여덟 번째 레인은 cisplatin을 처리 하였을 때 ICAM-1과 VCAM-1이 SIRT2가 존재하는 마우스 대조군에 비해 감소발현 하는 것을 확인 할 수 있었다.
도 32는 SIRT2억제제가 시스플라틴에 의한 세포 손상 억제 효과를 확인한 세포 사진이다. 도 33은 상기 도 32의 결과를 정량화한 그래프이다.
도 34은 세포 증식 검사를 통해 SIRT2억제제의 세포 증식 효과를 XTT를 수행하여 확인한 결과 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이 패혈증으로 인해 환자의 혈액 응고 능력이 상실되기 때문에, 예컨대 신장, 간, 심장 및 폐 등과 같은 중요한 기관들이 정상적인 관류의 부전으로 인해 손상 된다. 신장과 같은 장기에 패혈증이 유발될 경우 높은 사망률을 보임에도 아직까지 뚜렷한 치료제가 개발되지 않아 패혈증 및 패혈증에 의한 염증성 질환들에 대한 연구 및 치료방법이 부족하다는 문제점이 있었다.
또한, 염증 및 산화 스트레스에서 SIRT2의 생물학적 기능과 메카니즘에 대한 연구가 부족한 문제점이 있으며, 대표적인 항암제인 시스플라틴에 의해 유발되는 신장 독성 질환과 SIRT2의 세포내 상호작용 및 신호전달과 조절기작에 연관된 분자적 기전에 대한 연구가 매우 부족하여 항암제에 의해 유발되는 신장 독성질환의 예방 및 치료를 할 수 있는 방법이 매우 부족하다는 문제점이 있었다.
이에 본 발명은 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 SIRT2유전자의 발현 조절을 통한 패혈증에 의한 염증유발인자를 조절함으로써 신장염증을 완화시켜 신장손상을 억제하여 패혈증에 의한 신장 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명은 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 "SIRT2(Sirtuin 2)"는 써투인(sirtuin) 단백질 패밀리 중 하나이며, 어떤 조건 하에서 중요한 세포 생존 기능을 수행한다.
써투인(sirtuin)으로 알려진 SIRT2(silent information regulator 2)는 수명, 노화, 암발생, 신경퇴화 및 물질대사 질환과 같은 생물학적 과정에서 NAD+-의존적 디아세틸레이즈 조절자이다[Michan, S.; Sinclair, D. Biochem. J. 404: 1-13; 2007, Finkel, T. et al. Nature 460: 587-591; 2009, Donmez, Z.; Guarente, L. Aging Cell 9: 285-290; 20101-3]. SIRT2 유전자 패밀리는 세균에서 진핵생물까지 잘 보존되어 있다. 인간에서는 일곱 개 타입의 SIRT가 밝혀졌다[Frye, R. A. Biochem. Biophys. Res. Comm. 272: 793-798; 2000]. 인간의 일곱 가지 SIRT 중 대부분의 연구는 SIRT1에 촛점을 맞추었다. SIRT1의 과다발현은 DNA 손상 및 산화 스트레스하에서 세포의 생존율을 증가시킨다[Oberdoerffer, P. et al. Cell 135: 907-918; 2008.]. 또, SIRT1의 신경보호 역할은 알츠하이머 병과 근위축성 측색경화증 (amyotrophic lateral sclerosis)에서 잘 정립되어 있다[Chen, J. et al. J. Biol. Chem. 280: 40364-40374; 2005, Kim, D. et al. EMBO J. 26: 3169-3179; 2007]. 그렇지만, 염증 및 산화 스트레스에서 SIRT2의 생물학적 기능과 메카니즘은 잘 알려지지 않았다.
따라서 본 발명은 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환과 SIRT2의 세포 내 상호작용 및 신호전달과 조절기작에 연관된 분자적 기전을 규명함으로써 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
구체적으로, 실시예 3 및 실시예 4를 통해 알 수 있듯이, SIRT2유전자-결여된 마우스에서 LPS에 의해 증가된 CXCL2 및 CCL2의 발현 조절 효과를 확인하기 위하여 마우스 신장조직에 대해 면역화학염색 및 효소결합면역흡착분석법을 수행하여 CXCL2 및 CCL2의 발현을 확인 하였고, 혈액에서도 효소결합면역흡착분석법을 수행하여 CXCL2 및 CCL2 발현을 확인하였다. 그 결과, LPS를 투여하였을 때 증가한 CXCL2 및 CCL2의 발현이 SIRT2유전자-결여된 마우스에서 감소됨을 알 수 있었다(도 1 내지 8참조).
LPS에 의해 증가된 CXCL2 및 CCL2의 발현이 SIRT2유전자-결여된 마우스에서 LPS에 의해 증가된 CXCL2 및 CCL2의 발현이 감소됨을 알 수 있었다(도 1 내지 8 참조).
또한, 본 발명의 항암제는 시스플라틴일 수 있다.
대표적인 항암제인 시스플라틴(cis-diammine-dichloroplatinum [II])은 난소암, 방광암, 폐암, 두경부암, 고환암 등의 치료를 위한 화학요법제로 임상에서 널리 사용되고 있다(Rosenberg B., Cancer, 55: pp2303-2315, 1985). 시스플라틴은 활성산소종을 생성하여 암세포를 공격하고, 암세포에서 DNA의 인터-인트라스트랜드 교차결합(inter-intrastrand cross-linking), DNA 부가체 형성을 유도하여 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 치료과정 중 약물의 제한된 함량 이상에서는 청각의 상실, 신경 독성, 신장 독성과 같은 부작용이 나타나며(Mollman et al., 1998; Screnci and McKeage, 1999), 고농도의 시스플라틴의 투여 시에는 간 독성 및 신장 독성 또한 빈번하게 관찰되는 것으로 알려져 있다.
따라서 본 발명은 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환과 SIRT2의 세포내 상호작용 및 신호전달과 조절기작에 연관된 분자적 기전을 규명함으로써 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
구체적으로, 실시예 10에서 알 수 있듯이, SIRT2유전자 발현이 시스플라틴에 의한 신장독성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 SIRT2유전자-결여된 마우스에 시스플라틴을 투여하여 신장 기능 및 손상도를 확인한 결과, 마우스에 시스플라틴을 투여하면 신장 손상을 초래하여 신손상도 측정 기준인 BUN 및 크레아티닌이 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, SIRT2유전자-결여된 마우스에서는 시스플라틴에 의해 증가한 BUN 및 크레아티닌이 현저히 감소됨을 확인하였다(도 25 내지 26 참조).
또한, 시스플라틴 투여로 인한 신장의 조직학적인 손상을 확인하기 위하여 PAS염색을 수행한 결과, 도 27에서 알 수 있듯이, SIRT2유전자 WT(SIRT2 +/+) 마우스에 시스플라틴을 투여한 대조군의 신장에서는 상피세포의 박리, 브러쉬보더의 손실, tubular cast 형성 등의 조직 손상이 관찰 되지만, SIRT2유전자-결여된(SIRT2 -/-) 마우스에서는 이러한 신장 손상이 현저히 감소됨을 확인하였다. 뿐만 아니라, 생존율 역시 증가함을 알 수 있었다(도 28 참조).
이를 통해 SIRT2유전자가 결여되었을 때 시스플라틴에 의한 신장 손상을 억제함을 확인할 수 있었다.
본 발명에서 상기 치료란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본 발명에서 사용된 상기 치료라는 용어는 치료하는 이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.
따라서 본 발명에 따른 SIRT2억제제는 SIRT2유전자-결여된 마우스에서 LPS에 의해 유도된 염증유발인자인 CXCL2 및 CCL2의 발현을 억제함으로써 신장염증을 완화시켜 신장손상을 억제하여 패혈증에 의한 신장 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.
구체적으로, 실시예 5 및 실시예 6에 나타난 바와 같이, 마우스의 근위세뇨관 세포에서 SIRT2유전자를 siRNA를 통해 결여시켰을 때 LPS에 의해 증가하는 CXCL2 및 CCL2의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과, SIRT2유전자-결여된 세포에 LPS를 처리 하였을 때, LPS에 의해 증가한 CXCL2 및 CCL2의 mRNA의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다. 이와 반대로, SIRT2-재조합 아데노바이러스를 제작하여 SIRT2유전자를 과발현 시켰을 때, LPS에 의해 CXCL2 및 CCL2의 발현이 현저히 증가함을 확인할 수 있었다(도 9 내지 20 참조).
이를 통해 SIRT2유전자의 발현이 LPS 처리에 의해 증가한 염증유발인자인 CXCL2 및 CCL2의 발현에 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.
나아가, 본 발명에 따른 SIRT2억제제는 p53 acetylation 경로 조절을 통한 세포사멸(apoptosis)을 억제하고, 시스플라틴에 의해 증가한 염증반응 관련 인자인 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현 감소시킴으로써, 항암제인 시스플라틴에 의한 신장손상을 억제하고 신장독성을 감소시키면서 항암 효능을 증진시키는 우수한 효과가 있고, 항암제와 병용하였을 경우 항암제의 항암효능을 증진시킴을 확인함으로써, 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.
구체적으로, 실시예 10에서 알 수 있듯이, 일반적으로 시스플라틴에 의한 신장의 손상은 세포사멸의 영향을 받기 때문에, SIRT2유전자가 결여되었을 때, 시스플라틴에 의한 세포사멸 조절에 미치는 영향을 확인 하고자 caspase-3 및 p53의 acetylation을 웨스턴 블랏을 수행하여 확인 하였다. 그 결과, WT 마우스에 시스플라틴을 투여한 그룹에서 증가한 cleaved caspase-3가 SIRT2유전자-결여된 마우스에서는 현저히 감소함을 확인 할 수 있었고, acetyl p53의 발현 또한 감소함을 확인할 수 있었다(도 29 내지 30 참조).
이를 통해 SIRT2유전자-결여된 마우스 신장 조직에서 세포사멸을 감소시킴을 의미하며, 이는 p53 acetylation 경로를 통해 조절됨을 확인 하였다.
더불어, 실시예 12에서 알 수 있듯이, 시스플라틴에 의한 염증반응과 관련된 분자인 ICAM-1 및 VCAM-1유전자의 발현이 SIRT2유전자에 의해 조절되는지 확인한 결과, WT 마우스에 시스플라틴을 투여하였을 때 증가한 ICAM-1 및 VCAM-1유전자의 발현이 SIRT2유전자-결여된 마우스에 시스플라틴을 투여하였을 때 감소함을 확인하였다(도 31 참조).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 SIRT억제제를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기에서 약학적으로 유효한 양이란 염증성 질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양 또는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 SIRT2억제제의 약학적으로 유효한 양은 0.5 내지 100 ㎎/(day·체중·㎏), 바람직하게는 0.5 내지 5 ㎎/(day·체중·㎏)이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 신장 독성 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 염증성 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 SIRT2억제제는 상기 SIRT2에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, siRNA, shRNA, 앱타머, 항체, 단일사슬 가변영역 단편, 저분자량의 화합물 또는 천연추출물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 AGK2 또는 AK-1일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 AK-1일 수 있다.
상기 AK-1은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다.
화학식 1
Figure PCTKR2014004108-appb-C000001
상기 AGK2는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다.
화학식 2
Figure PCTKR2014004108-appb-C000002
또한, 상기 AK-1 및/또는 AGK2는 benzylsulfonamide의 세포 투과를 통해 SIRT2 nicotinamide binding site를 타겟하여 SIRT2 activity를 억제할 수 있다.
본 발명의 SIRT2억제제는 LPS에 의해 유도된 패혈증에 의한 신장염증 반응 및 신장기능 손상의 억제 효과를 제공한다.
구체적으로, 실시예 7에서 알 수 있듯이, 신장세포에서 SIRT2억제제에 의한 염증유발인자인 CXCL2 및 CCL2의 발현 양상 확인하기 위하여, 마우스 근위세뇨관 세포에 LPS 처리 30분 전에 미리 SIRT2억제제인 AK-1(10μM)을 처리한 후, LPS(10μg/mL)를 1시간 동안 처리하고 세포를 수확하여 CXCL2 및 CCL2의 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR을 수행한 결과, SIRT2억제제인 AK-1을 처리 하였을 때, LPS에 의해 증가된 CXCL2 및 CCL2의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다(도 21 내지 22 참조).
또한, 실시예 8에서 알 수 있듯이, 신장기능 손상도를 확인하기 위하여, 마우스에 LPS를 처리하고 3 시간 후 방광을 통해 소변을 수확하였다. 수확한 소변은 효소결합면역흡착분석법을 통해 NGAL 및 KIM-1의 함량을 측정하였다.
그 결과, LPS를 투여한 대조군에서 증가한 NGAL 및 KIM-1의 함량이 SIRT2유전자-결여된 마우스에서는 유의성 있게 감소함을 확인할 수 있었다(도 23 ~ 24).
이를 통해 SIRT2유전자가 LPS에 의해 유도된 신장손상에도 영향을 미침을 확인할 수 있었고, SIRT2유전자의 조절을 통해 LPS에 의한 신장손상을 억제할 수 있는 효과가 있음을 확인하였다.
나아가, 본 발명의 SIRT2억제제는 항암제인 시스플라틴에 의한 세포 손상 억제 효과 및 세포증식 효과를 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 실시예 13에 나타난 바와 같이, SIRT2억제제가 시스플라틴에 의한 세포 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 마우스 근위세뇨관세포에 시스플라틴을 처리 하였을 때 SIRT2억제제인 AGK2 및 AK-1의 효과를 확인한 결과, 시스플라틴을 투여한 세포에서는 부착된 세포들이 감소하였음을 확인할 수 있으나, SIRT2억제제를 사용한 대조군에서는 부착된 세포들이 유의성 있게 증가해 있음을 확인할 수 있었다(도 32 내지 33 참조).
게다가, 세포 증식 검사를 통해 SIRT2억제제의 세포 증식 효과를 확인한 결과, 도 34에 나타난 바와 같이, XTT검사를 수행한 결과, 시스플라틴을 처리 하였을 때 감소한 세포 증식이 SIRT2억제제인 AGK2 및 AK-1을 함께 처리하였을 때, 유의성 있게 증가함을 확인하였다.
이를 통해 SIRT2유전자가 결여되었을 때 시스플라틴에 의한 신장 손상을 억제하여 신장 보호 효과가 있음을 확인할 수 있었고, 이를 통해 SIRT2유전자 발현의 조절이 급성 신장 손상 치료에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 상기 유전자의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합 할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, 상기 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.
더불어, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제 5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 "RNAi"는 RNA Interference를 지칭하는 말로, 우리말로 풀이하면 RNA 간섭이라는 뜻을 지니고 있다. RNA 간섭은 대부분의 생물체 사이에서 잘 보존되어 있는 특이적 유전자억제 현상이다. 바이러스 감염에 대한 방어나 트랜스포손을 억제하기 위하여 혹은 비정상적 mRNA를 제거하기 위하여 세포가 사용하는 유전자 감시기작의 일종으로 생각되고 있다. 특히, small RNA에 의한 유전자 억제현상을 넓은 의미에서 RNA간섭이라 하고, 좁은 의미의 RNA 간섭은 siRNA에 의한 mRNA 분해 현상을 뜻한다. 또한 RNA간섭은 siRNA를 이용한 유전자 억제 실험 기술을 뜻하기도 한다.
본 발명에서 "siRNA라는 용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(상기 마커 유전자의 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(상기 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 상기 마커 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자 내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.
본 발명에서의 "앱타머(aptamer)"라는 용어는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 올리고뉴클레오타이드 분자를 말한다. 앱타머는, 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.
본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 본 발명의 앱타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상 15 내지 200 뉴클레오타이드일 수 있지만, 예컨대 15 ~ 100 뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 15 ~ 80 뉴클레오타이드이며, 보다 바람직하게는 18 ~ 60 뉴클레오타이드이고, 가장 바람직하게는 20 ~ 45 뉴클레오타이드 이하일 수 있다. 총 뉴클레오타이드 개수가 적으면 화학합성, 화학수식 및 대량 생산이 보다 용이하고, 경제적이며, 생체내 안정성은 높으면서 독성은 낮아 유리하다.
또한, 본 발명의 SIRT억제제로는 SIRT2 단백질 활성 억제제를 포함하며, 이러한 단백질 활성 억제제로서, 바람직하게는 SIRT2에 특이적으로 결합하는 항체, 단일사슬 가변영역 단편, 펩타이드, 저분자량의 화합물 또는 천연추출물을 예시할 수 있다.
본 발명에서 이용될 수 있는 SIRT2 단백질에 특이적으로 결합하여 활성을 억제하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이다. SIRT2 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler et al., European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al.,J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 문헌[Harlow, E. et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991]에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 예를 들어, 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 SIRT2 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
본 발명에서 항체는 단일사슬 가변영역 단편(scFv)을 포함할 수 있다. 상기 단일사슬 가변영역 단편은 "경사슬의 가변성 부위(VL)-링커-중사슬의 가변성 부위(VH)"로 구성될 수 있다. 상기 링커는 중사슬 및 경사슬의 가변성 부위를 인위적으로 연결하는 작용을 하는 일정 길이의 아미노산 서열을 의미한다.
본 발명의 다른 일구현예에 따르면, SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다.
본 발명의 또다른 일구현예에 따르면, 항암제에 의해 유발되는 신장 독성에 대한 억제 활성을 갖는 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다.
나아가, 본 발명은 SIRT2억제제 및 식품학적으로 허용 가능한 식품첨가제를 포함하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
더불어, 본 발명은 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 SIRT2억제제를 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.
본 발명에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
또한, 염증성 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.
예를 들어, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 그대로 또는 부형제, 결합제, 붕해제 또는 다른 첨가제를 넣어 고르게 섞은 것을 적당한 방법으로 과립상으로 한 다음 활택제 등을 넣어 압축 성형하여 조제하거나 정제 형태의 건강기능식품을 그대로 또는 부형제, 결합제, 붕해제 또는 다른 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 것을 직접 압축 성형하여 만들거나 또는 미리 만든 과립에 건강기능식품을 그대로 혹은 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 다음 압축 성형하여 조제하거나 건강기능식품에 부형제, 결합제 또는 다른 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 분말을 용매로 습윤시키고, 습윤된 분말을 저압으로 틀에 넣어서 성형한 후, 적당한 방법으로 건조하여 조제한다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품에 필요에 따라 교미제 등을 넣을 수 있으며, 적당한 제피제로 제피가능하다.
본 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향료 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다(대한약전 해설편, 문성사, 한국 약학대학협의회, 제5개정판, p33-48, 1989).
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 SIRT2억제제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 SIRT2억제제는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0.01 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
따라서, 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환과 SIRT2의 세포내 상호작용 및 신호전달과 조절기작에 연관된 분자적 기전을 규명함으로써 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환의 예방 및 치료할 수 있는 방법이 될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 SIRT2억제제는 시스플라틴과 병용 투여하였을 때 시스플라틴의 부작용인 신장 독성은 감소시키면서 항암 효능은 증진시키는 효과가 있으므로 암 질환의 예방 및 치료를 위한 의약품 및 암 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품으로 이용할 수 있다.
실시예 1: 실험동물의 준비
본 발명에 사용된 실험동물로 8 내지 10 주령의 수컷 SIRT2유전자-결여된 마우스인 SIRT2-/- mice (Jackson laboratory, 미국)와 SIRT2유전자가 존재하는 마우스인 SIRT2 +/+ mice (C57BL/6, 오리엔트, 한국)를 사용하였다. 상기 실험동물에게 표준 실험실 사료와 물을 임의대로 제공하였고, 전북대학교 동물실험윤리위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 유지하였다.
1-1. 실험동물 준비
상기 실험동물은 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 4개 군으로 나누어 실험을 수행하였다.
표 1
그룹 SIRT2 유전자 LPS(10 ㎍/㎏) control buffer (CB)
1 +/+ - +
2 +/+ + -
3 -/- - +
4 -/- + -
상기 표 1과 같이, 1)정상 실험동물 (SIRT2 +/+)에 control buffer(CB)를 투여한 대조군, 2)정상 실험동물(SIRT2 +/+)에 Lipopolysaccharide(LPS, 10 ㎍/㎏)를 투여한 대조군, 3)SIRT2유전자-결여된 마우스(SIRT2-/-)에 CB를 투여한 대조군 및 4) SIRT2유전자-결여된 마우스(SIRT2-/-)에 LPS (10 ㎍/㎏)를 투여한 대조군으로 구분하였다. 상기 control buffer와 LPS는 멸균한 생리식염수 (0.9% NaCl 100 ㎕)에 희석하여 복강 내 주사하였다.
1-2. 샘플의 준비
상기 CB나 LPS를 투여한 실험동물은 투여 3시간 및 6시간 후, 케타민(ketamine, 100 ㎎/㎏)과 자이라진(xylazine, 10 ㎎/㎏)으로 마취 후 혈액과 소변, 신장 조직을 수집하였다.
보다 구체적으로, 상기 혈액채취는 실험동물을 케타민(ketamine) 100 ㎎/㎏과 자이라진(xylazine) 10 ㎎/㎏으로 마취시킨 후, 심장천자(cardiacpuncture)에 의해 혈액을 채취하였다. 상기 신장 조직은 채취 후 4등분 하여 2등분은 4% 파라포름알데하이드로 고정시킨 후 CXCL2 및 CCL2 특이적으로 염색되는 항체를 이용하여 염색하여 CXCL2 및 CCL2의 발현을 확인하였다. 나머지 2등분은 RNA와 단백을 추출하여 실험에 사용하였다.
실시예 2: 실험재료 및 세포배양
2-1. 세포배양
마우스의 근위세뇨관 세포를 Dr Lloyd G. Cantley (Yale University School of Medicine, New Haven, CT, 미국)에게 제공받아, 가습된 5% CO2 및 95% 공기의 대기 조건, 그리고 37℃의 온도 조건에서 10%(vol/vol) 소태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 α-MEM 배지에서 배양하여 준비하였다.
지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)는 시그마알드리치(St Louis, MO, 미국)에서 SIRT2억제제(inhibitor)인 AK-1(하기 화학식 1과 같은 구조를 포함함)은 calbiochem(San Diego, CA, 미국)에서 구입하여 사용하였다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2014004108-appb-I000001
2-2. SIRT2유전자-결여된 세포의 준비
세포에서 SIRT2유전자를 제거하기 위하여 siRNA(100 pmol, Dharmacon ON-TARGETplus SMART pool, Dharmacon Inc., CO, 미국)와 10 ㎕ Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국)을 Opti-MEM 배지에 희석하여 처리한 후, 7시간 후에 배양배지로 바꾸어 배양한다. 배양 2일 후, 세포를 수확하여 SIRT2 단백이 감소함을 확인하였다.
SIRT2 siRNA처리 후 LPS와 control buffer(CB)를 처리 1, 3 및 6시간 후에 세포배양액과 RNA, 단백질을 얻어 Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)과 효소결합면역흡착분석법을 수행하였다.
2-3. SIRT2유전자 과발현
세포 내 SIRT2유전자의 발현을 증가시키기 위해서 유전자 재조합 아데노바이러스(Ad-CMVeGFP-SIRT2; ad-SIRT2 or AD-CMVeGFP; ad-cont)를 ViraQuest, INC.( IA, 미국)에서 구입하여 사용하였다. 혈청 2%가 포함된 α-MEM배지에 바이러스를 희석하여 세포에 24시간 동안 처리 후, 배양배지로 바꾸어 48시간 배양한다. 세포 내 바이러스 감염효율은 GFP의 발현을 통해 확인하였다.
SIRT2유전자 재조합 아데노바이러스를 처리 후, LPS와 control buffer를 처리 1 시간, 3 시간 또는 6시간 후에 세포배양액과 RNA, 단백을 얻어 qRT-PCR과 효소결합면역흡착분석법을 수행하였다.
실시예 3: SIRT2유전자-결여된 마우스에서 LPS에 의한 CXCL2의 발현 확인
상기 SIRT2유전자-결여된 마우스에서 LPS에 의해 증가된 CXCL2의 발현 조절에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 수득한 실험동물의 신장조직에 대해 면역화학염색 및 효소결합면역흡착분석법을 수행하여 CXCL2의 발현을 확인하였고, 혈액에서도 효소결합면역흡착분석법을 수행하여 CXCL2의 발현을 확인하였다.
상기 면역화학염색은 CXCL2로 염색된 근위세뇨관을 Zeiss Z1 현미경을 이용하여 가시화하는 방법으로 수행하였다. 각 부위에서 슬라이드당 10개의 무작위적, 중복되지 않는 필드를 선택하여 CXCL2 발현 양상(도 1)을 확인하였다.
도 1를 통해 확인한 신장 조직 내 CXCL2 양성 세포의 밀도 및 면적을 이미지 분석 프로그램을 이용하여 계산하였다(AnalySIS, Soft Imaging System, Munster, 독일). 그 결과를 도 2에 나타내었다. 또한, 혈액(도 3) 및 신장조직(도 4)에서 CXCL2의 발현을 효소결합면역흡착분석법 (Abcam, Cambridge, MA, 미국)을 이용하여 측정하였다.
도 1 내지 4에 나타난 바와 같이, LPS를 투여하였을 때 증가한 CXCL2의 발현이 SIRT2가 결여된 마우스에서 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: SIRT2유전자-결여된 마우스에서 LPS에 의한 CCL2의 발현 확인
상기 SIRT2유전자-결여된 마우스에서 LPS에 의해 증가된 CCL2의 발현 조절에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 수득한 실험동물의 신장조직에 대해 면역화학염색 및 효소결합면역흡착분석법을 수행하여 CCL2의 발현을 확인하였고, 혈액에서도 효소결합면역흡착분석법을 수행하여 CCL2의 발현을 확인하였다.
상기 면역화학염색은 CCL2로 염색된 근위세뇨관을 Zeiss Z1 현미경을 이용하여 가시화하는 방법으로 수행하였다. 각 부위에서 슬라이드당 10개의 무작위적, 중복되지 않는 필드를 선택하여 CCL2 발현 양상(도 5)을 확인하였다. 도 5를 통해 확인한 신장 조직 내 CCL2 양성 세포의 밀도 및 면적을 이미지 분석 프로그램을 이용하여 계산하였다(AnalySIS, Soft Imaging System, Munster, 독일). 그 결과를 도 6에 나타내었다. 또한, 혈액(도 7) 및 신장조직(도 8)에서 CCL2의 발현을 효소결합면역흡착분석법 (Abcam, Cambridge, MA, 미국)을 이용하여 측정하였다.
도 5 내지 8에 나타난 바와 같이, LPS를 투여하였을 때 증가한 CCL2의 발현이 SIRT2가 결여된 마우스에서 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 신장세포에서 SIRT2유전자의 발현 조절에 따른 CXCL2의 발현 확인
실시예 2의 방법으로, 마우스의 근위세뇨관 세포에서 SIRT2유전자를 siRNA를 통해 결여시켰을 때 LPS에 의해 증가하는 CXCL2 mRNA 발현에 효과를 미치는지 확인하고자 qRT-PCR을 수행하였다.
구체적으로, 마우스 근위세뇨관 세포에서 RNA를 수확하기 위하여 TRI Reagent(MRC, Cincinnati, OH, 미국)를 이용하였고, SYBR® Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, 미국)을 cDNA와 혼합한 후 7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems, 미국)이용하여 PCR을 수행함으로써 CXCL2의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, SIRT2유전자-결여된 세포에 LPS를 처리하였을 때, LPS에 의해 증가한 CXCL2의 mRNA의 발현이 감소함을 확인하였다.
또한, 마우스 근위세뇨관 세포에서 LPS를 처리하였을 때, CXCL2유전자의 발현을 확인하기 위하여 세포배양액과 세포에서 분리한 단백질에 대하여 효소결합면역흡착분석법을 수행하였다. 그 결과를 도 10 및 11에 나타내었다.
도 10 및 11에서 나타난 바와 같이, 세포 배양액에서도 SIRT2유전자-결여된 실험군에서 CXCL2의 발현이 감소함을 확인할 수 있었고, 세포에서 추출한 단백질 역시 SIRT2유전자가 결여되었을 때 CXCL2의 발현이 유의성 있게 감소함을 확인할 수 있었다.
나아가, 아데노바이러스를 이용하여 SIRT2유전자의 발현을 증가시켰을 때 CXCL2의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 12 내지 14에 나타내었다.
도 12 내지 14에 나타난 바와 같이, SIRT2유전자의 발현이 증가되었을 때 LPS에 의해 CXCL2의 발현이 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 신장세포에서 SIRT2유전자의 발현 조절에 따른 CCL2의 발현 확인
실시예 4와 동일한 방법으로 CCL2의 발현양상을 확인하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 세포에 LPS를 처리 하였을 때 증가한 CCL2의 발현이 SIRT2유전자-결여된 세포에서는 현저히 감소함을 확인할 수 있었고, 아데노바이러스에 의해 SIRT2 유전자가 과발현한 세포에서는 CCL2의 발현이 더욱 더 증가함을 확인할 수 있었다.
따라서, 도 9 내지 20에 나타난 바와 같이, SIRT2유전자의 발현이 LPS 처리에 의해 증가한 염증유발인자인 CXCL2 및 CCL2의 발현에 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 신장세포에서 SIRT2억제제에 의한 CXCL2 및 CCL2의 발현 확인
마우스 근위세뇨관 세포에 LPS 처리 30분 전에 미리 SIRT2억제제인 AK-1(10μM)을 처리한 후, LPS(10㎍/㎖)를 1시간 동안 처리하고 세포를 수확하여 CXCL2 및 CCL2의 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 21 내지 22에 나타내었다.
도 21 내지 22에서 나타난 바와 같이, SIRT2억제제인 AK-1을 처리하였을 때, LPS에 의해 증가된 CXCL2 및 CCL2의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다.
실시예 8: NGAL 및 KIM-1 함량 측정을 통한 신장기능 손상도 확인
마우스에 LPS를 처리하였을 때 신장기능 손상을 확인하기 위하여 LPS 처리 3 시간 후 실시예 1의 방법으로 마취 한 후, 방광을 통해 소변을 수확하였다. 수확한 소변은 효소결합면역흡착분석법을 통해 NGAL 및 KIM-1(R&D system, Minneapolis, MN, 미국)의 함량을 측정하였다. 그 결과를 도 23 내지 24에 나타내었다.
도 23 내지 24에 나타난 바와 같이, LPS를 투여한 대조군에서 증가한 NGAL 및 KIM-1의 함량이 SIRT2유전자-결여된 마우스에서는 유의성 있게 감소함을 확인할 수 있었다. 이를 통해 SIRT2유전자가 LPS에 의해 유도된 신장손상에도 영향을 미침을 확인할 수 있었고, SIRT2유전자의 조절을 통해 LPS에 의한 신장손상을 억제할 수 있는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 9: 실험동물의 준비
본 발명에 사용된 실험동물은 8 내지 10 주령의 수컷 SIRT2 단백이 결여된 마우스인 SIRT2-/- mice(Jackson laboratory, 미국)와 SIRT2 단백이 존재하는 마우스인 SIRT2 +/+ mice(C57BL/6, 오리엔트, 한국)로, 상기 실험동물에 대해 표준 실험실 사료와 물을 임의대로 제공하였고, 전북대학교 동물실험윤리위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 유지하였다.
9-1. 실험동물 준비
상기 실험동물은 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 4개 군으로 나누어 실험을 수행하였다.
표 2
그룹 SIRT2 유전자 시스플라틴(20 ㎍/㎏) Vehicle
5 +/+ - +
6 +/+ + -
7 -/- - +
8 -/- + -
상기 표 2와 같이, 5)정상 실험동물군(WT)에 Vehicle를 투여한 대조군, 6)정상 실험동물 (WT)에 시스플라틴(20 ㎍/㎏)를 투여한 대조군, 7)SIRT2 단백이 결여된 마우스(KO)에 vehicle를 투여한 대조군 및 8)SIRT2 단백이 결여된 마우스(KO)에 시스플라틴(20 ㎍/㎏)을 투여한 대조군으로 구분하였다. 상기 control buffer와 시스틀라틴은 멸균한 생리식염수(0.9% NaCl 100 ㎕)에 희석하여 복강 내 주사하였다.
9-2. 샘플의 준비
상기 vehicle 또는 시스플라틴을 투여한 실험동물군은 투여 3일 후, 케타민(ketamine, 100 mg/kg)과 자일라진(xylazine, 10 mg/kg)으로 마취하여 혈액 및 신장 조직을 수집하였다.
보다 구체적으로, 상기 혈액 채취는 실험동물을 케타민(ketamine) 100㎎/㎏과 자이라진(xylazine) 10㎎/㎏으로 마취시킨 후, 심장 천자(cardiac puncture)에 의해 혈액을 채취하였다. 상기 신장 조직은 채취 후 4등분 하여 2등분은 4% 파라포름알데하이드에 넣어 고정시킨 후 Periodic acid-Schiff(PAS)를 확인하였다. 다른 2등분은 단백질을 추출하였다.
실시예 10: SIRT2유전자-결여된 마우스에서의 시스플라틴에 의한 신장 손상 억제 효과
10-1. 신장 기능 확인
먼저, SIRT2유전자 발현이 시스플라틴에 의한 신장 독성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 SIRT2유전자-결여된 마우스에 시스플라틴을 투여하여 신장 기능 및 손상도를 확인하였다.
구체적으로, BUN과 크레아티닌(creatinine)은 상기 실시예 9-2에 나타난 바와 같이, 마우스에서 혈액을 채취하여 원심분리기를 이용해 혈청만을 분리 한 후, automatic analyzer(Hitachi 7180; Tokyo, 일본)을 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 25 내지 26에 나타내었다.
도 25 내지 26에 나타낸 바와 같이, 마우스에 시스플라틴을 투여하면 신장 손상을 초래하여 BUN 및 크레아티닌이 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, SIRT2가 결여된 마우스에서는 시스플라틴에 의해 증가한 BUN 및 크레아티닌이 현저히 감소됨을 확인하였다.
10-2. 신장 손상도 확인
시스플라틴 투여로 인한 신장의 조직학적인 손상을 확인하기 위하여 PAS염색을 수행하였다. 상기 PAS염색을 통해 손상된 신장 조직을 Zeiss Z1 현미경을 이용하여 가시화하는 방법을 수행하였다. 그 결과를 도 27에 나타내었다.
도 27에 나타난 바와 같이, SIRT2유전자 WT(SIRT2 +/+) 마우스에 시스플라틴을 투여한 대조군의 신장에서는 상피세포의 박리, 브러쉬보더의 손실, tubular cast 형성 등의 조직 손상이 관찰 되지만, SIRT2유전자-결여된(SIRT2 -/-) 마우스에서는 이러한 신장 손상이 현저히 감소됨을 확인하였다.
10-3. 생존율 확인
도 28에 나타난 바와 같이, 대조군에서는 시스플라틴을 투여하였을 때 6일 만에 모든 마우스가 사망하였으나, SIRT2유전자-결여된 마우스에 시스플라틴을 투여한 군에서는 8일째 사망하는 것을 확인함으로써 생존율 역시 증가함을 알 수 있었다. 이를 통해 SIRT2유전자가 결여되었을 때 시스플라틴에 의한 신장 손상을 억제함을 확인할 수 있었다.
실시예 11: SIRT2유전자 발현에 의한 세포사멸(apoptosis) 조절 효과
일반적으로 시스플라틴에 의한 신장의 손상은 세포사멸의 영향을 받는다. SIRT2유전자가 결여되었을 때, 시스플라틴에 의한 세포사멸 조절에 미치는 영향을 확인하고자 caspase-3 및 p53의 acetylation을 웨스턴 블랏을 수행하여 확인하였다.
상기 실시예 9-2의 방법으로 신장 조직을 얻은 후, 이를 균질화하여 단백질을 추출하고 caspase-3 및 acetyl p53 항체(Cell Signaling Technology, Denvers, MA. 미국)를 이용하여 caspase-3 및 acetylp53 단백질 발현 양상을 확인 하였다. 단백의 정량 확인을 위하여 같은 블랏을 박리하여 액틴(Actin)(Sigma Aldrich, St Louis, MO, 미국)과 p53(Cell Signaling Technology)을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 29 및 도 30에 나타내었다.
도 29 내지 30에 나타난 바와 같이, WT 마우스에 시스플라틴을 투여한 그룹에서 증가한 cleaved caspase-3가 SIRT2유전자-결여된 마우스에서는 현저히 감소함을 확인 할 수 있었고, acetyl p53의 발현 또한 감소함을 확인할 수 있었다. 이를 통해 SIRT2유전자의 결여는 마우스 신장 조직에서 세포사멸을 감소시킴을 의미하며, 이는 p53 acetylation 경로를 통해 조절됨을 확인하였다.
실시예 12: SIRT2유전자 발현에 의한 염증분자 조절 효과
시스플라틴을 투여한 실험군에서 염증반응과 관련된 분자인 ICAM-1 및 VCAM-1유전자의 발현이 SIRT2유전자에 의해 조절되는지 확인하였다. 상기 실시예 11과 동일한 방법으로, ICAM-1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 미국) 및 VCAM-1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 미국) 항체를 이용하여 웨스턴블랏을 수행하였다. 그 결과를 도 31에 나타내었다.
도 31에 나타난 바와 같이, WT 마우스에 시스플라틴을 투여하였을 때 증가한 ICAM-1 및 VCAM-1유전자의 발현이 SIRT2유전자-결여된 마우스에 시스플라틴을 투여하였을 때 감소함을 확인하였다.
실시예 13: SIRT2억제제에 의한 세포손상에 미치는 영향
SIRT2억제제가 시스플라틴에 의한 세포 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 마우스 근위세뇨관세포에 시스플라틴을 처리하였을 때 SIRT2억제제인 AGK2 및 AK-1의 효과를 확인하였다. 구체적으로, 마우스 근위세뇨관세포에 시스플라틴을 처리 30분 전 SIRT2억제제인 AGK2(10μM) 및 AK-1(10μM)을 처리한 후, 시스플라틴(20 ㎍/㎖)을 48시간 처리하여 세포를 Zeiss Z1 현미경을 통해 가시화 하였다. 그 결과를 도 32 내지 33에 나타내었다.
도 32 내지 33에 나타난 바와 같이, 시스플라틴을 투여한 세포에서는 부착된 세포들이 감소되어 있음을 확인할 수 있으나, SIRT2억제제를 사용한 대조군에서는 부착된 세포들이 유의성 있게 증가해 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 세포 증식 검사를 통해 SIRT2억제제의 세포 증식 효과를 확인하였다.
구체적으로, 세포 증식 검사는 마우스 근위세뇨관 세포를 트립신 처리 후, 96웰 플레이트에 각각 1×103개의 세포를 넣고, 24시간 동안 37 ℃에서 배양 후에 배양액을 제거하고, 1% FBS가 있는 배양액과 함께 AGK2, AK-1, 시스플라틴, 시스플라틴과 함께 AGK2 및 AK-1을 각각 처리하였다. 처리 24시간동안 37 ℃에서 배양 후, 세포증식키트 II(Cell proliferation Kit II, XTT, Roche, Mannheim, Germany)을 이용하여 세포의 증식 정도를 측정하였다. 세포가 증식될수록 세포 내 미토콘드리아의 발색물질의 증가로 흡광도가 증가하므로, 마우스 근위세뇨관 세포의 증식은 흡광도를 통해 측정하였으며, 그 결과를 도 34에 나타내었다.
도 34에 나타난 바와 같이, XTT검사를 수행한 결과, 시스플라틴을 처리하였을 때 감소한 세포 증식이 SIRT2억제제인 AGK2 및 AK-1을 함께 처리하였을 때, 유의성 있게 증가함을 확인하였다.
결국, SIRT2유전자가 결여되었을 때 시스플라틴에 의한 신장 손상을 억제하여 신장 보호 효과가 있음을 확인할 수 있었고, 이를 통해 SIRT2유전자 발현의 조절이 급성 신장 손상 치료에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
통계학적 분석
데이터를 평균±표준편차로 나타내었다. 아노바(ANOVA)를 이용한 유의차로 다중 비교하고 터키 사후검정을 이용한 개별 비교를 하였으며, 통계적 유의성은 p<0.05로 수행하였다.
실시예를 통해 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따른 SIRT2억제제는 세포사멸(apoptosis)을 억제하고, 염증반응 관련 인자인 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 조절함으로써, 항암제인 시스플라틴에 의한 신장손상을 억제하고 신장독성을 감소시키면서 항암 효능을 증진시키는 우수한 효과가 있고, 항암제와 병용하였을 경우 항암제의 항암효능을 증진시킴을 확인함으로써, 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물 또는 건강기능식품으로서 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물은 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환과 SIRT2의 세포내 상호작용 및 신호전달과 조절기작에 연관된 분자적 기전을 규명함으로써 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환의 예방 및 치료할 수 있는 방법이 될 수 있다.

Claims (15)

  1. SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 패혈증에 의한 신장 염증성 질환인 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 SIRT2억제제는 SIRT2유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 앱타머 또는 항체로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 SIRT2억제제는 AGK2 또는 AK-1로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 LPS-유도된 염증유발인자인 CXCL2 및 CCL2의 발현을 억제함으로써 신장염증을 완화시켜 신장손상을 억제하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
  7. SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항암제는 시스플라틴(cisplatin)인 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 SIRT2억제제는 SIRT2유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 앱타머 또는 항체로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 SIRT2억제제는 AGK2 또는 AK-1로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제7항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 세포사멸(apoptosis) 및 염증반응과 관련된 분자인 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 억제함으로써 신장 손상을 억제하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 항암제에 의해 유발되는 신장 독성에 대한 억제 활성을 갖는 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암보조제.
  13. SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  14. SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 신장 보호용 약학적 조성물.
  15. SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 신장 보호용 건강기능식품.
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