WO2020263011A1 - 미세아교세포 마커로서의 후각수용체 및 그의 용도 - Google Patents

미세아교세포 마커로서의 후각수용체 및 그의 용도 Download PDF

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이나혜
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Definitions

  • metabolites Small molecules that are biologically secreted and active by intestinal microbes are called metabolites, and play a role in mediating the interaction between the host and microbes in the intestine (Blacher et al., 2017; Nicholson et al., 2012). More specifically, metabolites such as niacin (NA), acetate, propionate, and small chain fatty acids (SCFAs), such as butyrat, secreted by the intestine, are inflammatory reactions of T cells or neutrophils and macrophages. It is known to have a very profound effect on the host's immune system while regulating the inflammatory response (Topping and Clifton, 2001).
  • NA niacin
  • SCFAs small chain fatty acids
  • SCFAs Short-chain fatty acids
  • organs in our body also send signals when the host's pathogen is infected. More specifically, infectious agents such as the intestinal microorganisms are metabolites that can affect host immunity called the pathogen-brain axis To secrete and transform them (Topping and Clifton, 2001). However, the pathogen-brain axis is rarely studied.
  • Microglia are important immune cell activities in the pathogen-brain axis. They play a very important role in combating pathogen-borne infection (Hanisch and Kettenmann, 2007; Nimmerjahn et al., 2005). After infection, microglia is activated very quickly, leading to morphological changes, cell chemotaxis, cytokine production, macrophages, and reactive oxygen (ROS) production (Kreutzberg, 1996). Patterns of molecular activity associated with pathogens are activated after recognition through cognate pattern recognition receptors (PRRs) (Block et al., 2007). However, little is known about how microglial cells are activated by micrometabolites derived from pathogens.
  • PRRs pattern recognition receptors
  • Microglia express various G protein-coupled receptors (GPCRs) that biologically detect small and large molecules (Hickman et al., 2013; McHugh, 2012).
  • GPCRs contain cytokine receptors and PRRs that detect small metabolites and influence microglia activation.
  • GPR55, GPR18, and CNR2 recognize cannabinoids to stimulate the migration of microglia (Gong et al., 2006; Pietr et al., 2009), and in the case of OPRM1, microglia migration is performed.
  • the opioid morphine sulfate, 758.8 Da
  • Cho et al., 1997 how these GPCRs are involved in the pathogen-brain axis remains unanswered.
  • Odorant receptor is the largest subfamily in the GPCRs group, accounting for 50% in humans and 60% in rats (Bjarnadottir et al., 2006). They can detect small molecules in a variety of non-sense tissues such as kidney skin and pancreatic tissue (Kang et al., 2015; Kang and Koo, 2012; Massberg and Hatt, 2018). For example, recognition of sandalwood fragrance by OR2AT4 promotes proliferation of keratinocytes in human skin and induces wound healing (Busse et al., 2014). Olfr78 also recognizes SCFAs in the renal juxtaglomerular apparatus to help regulate renin secretion and blood pressure (Pluznick et al., 2013).
  • Bacterial meningitis is a life-threatening disease caused by direct infection of the central nervous system or hippocampus.
  • Streptococcus pneumoniae S. pneumoniae
  • S. pneumoniae Streptococcus pneumoniae
  • S. pneumoniae is known to be a major pathogen causing bacterial meningitis
  • the activation of microglia is mainly characterized by the reaction of the brain to an inflammatory reaction after pneumococcal infection (Mook-Kanamori et al., 2011; Rock et al., 2004).
  • One aspect is to provide a composition for detecting microglia, including an agent capable of measuring the activity or expression level of the olfactory receptor Olfr110 or Olfr111 receptor.
  • Another aspect is the step of preparing microglia cells expressing the olfactory receptor Olfr110 or Olfr111; Treating the microglia with a candidate substance; And when the activity or expression of the olfactory receptor Olfr110 or Olfr111 in the candidate substance-treated microglia is changed compared to the control, selecting a candidate substance as a substance regulating the activity or expression of microglia, microglia It is to provide a method of screening for an activity or expression modulating substance.
  • Another aspect is to provide a composition for preventing or treating meningitis comprising an inhibitor or an active agent for the interaction between 2-pentylfuran and the olfactory receptor Olfr110 or Olfr111 as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a health functional food for preventing or improving meningitis comprising an inhibitor or an activator of an interaction between 2-pentylfuran and olfactory receptors Olfr110 or Olfr111 as an active ingredient.
  • compositions for detecting microglia including an agent capable of measuring the activity or expression level of the olfactory receptor Olfr110 or Olfr111 receptor.
  • microglia refers to a neuroglia cell of the central nervous system derived from the mesoderm and refers to a cell that performs primary immune functions in the central nervous system. Microglia supports tissues, supplies necessary substances to nerve cells, is responsible for transporting, destroying, and removing substances within the tissues, and has different properties depending on whether or not it is activated.
  • the term "detection" as used herein generally means finding out the presence or absence of any element or ionic compound in a sample in a chemical analysis of a sample.
  • the detection of microglia refers to analyzing the level of activity of microglia in a biological sample. More specifically, when the biological sample is purified and then the composition for detecting microglia is treated, the level of activation of microglia may be detected due to the interaction between the olfactory receptor and the composition for detection.
  • microglia may include a morphological change, an increase in macrophage action, a change in intracellular calcium ions, an evaluation of cell chemotaxis, and an increase in the secretion of cytokines. More specifically, when microglia, which maintain the shape of the original elongated branches and thin cell bodies, are introduced from the outside or detect toxins generated inside, thick and short branches and thick cell bodies to protect nerve cells from these toxins. It may be that the branches change to an activated shape.
  • the activated microglia activates phagocytosis and proliferates cells, and cytokines such as TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6, chemokines, inducible nitric oxide (iNOS) synthase), COX-2 (cyclooxygenase-2), and other genes are expressed to produce inflammatory mediators.
  • cytokines such as TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6, chemokines, inducible nitric oxide (iNOS) synthase), COX-2 (cyclooxygenase-2), and other genes are expressed to produce inflammatory mediators.
  • Activation of microglia has one aspect of removing damaged cells and protecting nerve cells from invading bacteria or viruses, and at the same time, there is one aspect that damages nerve cells when overactivated.
  • the biological sample may be a nerve cell, a nerve tissue, or a nerve-derived cell, but is not limited thereto.
  • the activating material of the microglia may include lipopolysaccharide (LPS), an endotoxin of bacteria, interferon- ⁇ , beta amyloid, ganglioside and 2-Pentylfuran, and the like, in one embodiment, It may be 2-Pentylfuran or a furan derivative.
  • LPS lipopolysaccharide
  • endotoxin of bacteria interferon- ⁇
  • beta amyloid beta amyloid
  • ganglioside and 2-Pentylfuran, and the like, in one embodiment, It may be 2-Pentylfuran or a furan derivative.
  • composition for detecting microglia may include an agent capable of measuring the expression or activity level of the olfactory receptor Olfr110 or Olfr111.
  • odorant receptor 110 or odorant receptor 111 is a type of olfactory receptor that occupies the largest group in the G protein-coupled receptor (GPCR). It is also distributed in olfactory cells, but also in non-odor cells. The total number of receptors is known to be about 400 in humans. Among them, the olfactory receptors Olfr110 or Olfr111 are known to be specifically expressed in microglia. In an experimental example of the present invention, the olfactory receptor Olfr110 or Olfr111 may mean that it is present in the non-sense cells. For example, it may be a nerve cell, a nerve tissue, or a brain cell, but is not limited thereto.
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • the term "measurement of protein activity or expression level” is a process for determining the presence and activity of the olfr110 or olfr111 protein in a biological sample. More specifically, it is to measure whether microglia is activated in a sample of nerve cells. For example, it may include morphological changes, increased macrophages, changes in calcium ions in cells, evaluation of cell chemotaxis, and measuring increased secretion of cytokines. In addition, the amount of protein can be confirmed using an antibody, aptamer, probe, or polypeptide that specifically binds, but is not limited thereto.
  • the agent capable of measuring the activity or expression level may be an antibody capable of binding to the protein, an aptamer or a polypeptide, a primer capable of binding to the mRNA of the gene, or a probe.
  • an antibody refers to a protein molecule specific for an antigenic site.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to the olfactory receptor Olfr110 or Olfr111 protein, which is the protein, and includes all monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, and recombinant antibodies.
  • Monoclonal antibodies are well known in the art (Kohler and Milstein (1976) European journal of Immunology 6:511-519), or phage antibody library (Clarkson et al, Nature, 352:624-628, 1991 ; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991).
  • Polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art in which the above protein antigen is injected into an animal and blood is collected from the animal to obtain serum containing the antibody.
  • Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host, such as goat, rabbit, sheep, monkey, horse, pig, cow, and dog.
  • the antibody of the present invention also includes special antibodies such as chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies.
  • the antibody used in the present invention includes a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of antibody molecules.
  • the functional fragment of the antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen-binding function, and examples thereof include Fab, F(ab'), F(ab') 2 and Fv.
  • any method that can determine the level of generation of the antigen-antibody complex by treating the antibody in a biological sample can be used without limitation.
  • the "antigen-antibody complex” means a combination of Olfr110 or Olfr111 protein and an antibody specific thereto, and the amount of formation of the antigen-antibody complex can be quantitatively measured through the size of a signal of a detection label.
  • Western blot Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), immunoprecipitation assay (Immunoprecipitation Assay), complement fixation assay (Complement Fixation Assay), flow cytometry (Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), or protein chip (protein chip) may be illustrated, but is not limited thereto.
  • aptamer refers to single-stranded DNA (ssDNA) or RNA having high specificity and affinity for a specific substance. Aptamers have very high affinity for a specific substance, are stable, can be synthesized by a relatively simple method, can be modified in various ways to increase binding, and even cells, proteins, and even small organic substances can be target substances. Its specificity and stability are very high compared to the already developed antibodies.
  • the aptamer of the present specification is not limited as long as it can specifically bind to the Olfr110 or Olfr111 receptor, and the bases used for the aptamer are A, G, C, U bases in their deoxy form unless otherwise specified. It may be selected from the group consisting of.
  • the aptamer is polyethylene glycol (PEG), idT (inverted deoxythymidine), LNA (Locked Nucleic Acid) at the 5'end, middle, 3'end, or both ends to improve stability.
  • PEG polyethylene glycol
  • idT inverted deoxythymidine
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • 2'-methoxy nucleoside, 2'-amino nucleoside, 2'F-nucleoside, amine linker, thiol linker, and cholesterol may be bonded and modified one or more selected from the group consisting of.
  • the idT inverted deoxythymidine is one of molecules used to prevent degradation by nucleases of aptamers, which are generally weak in resistance to nucleases, and the nucleic acid unit is 3'-OH of the preceding unit and the next unit. It combines with 5'-OH to form a chain, but idT combines 3'-OH of the previous unit and 3'-OH of the next unit to make an artificial change so that 5'-OH is exposed instead of 3'-OH. By doing so, it is a molecule that causes an effect of inhibiting decomposition by 3'exonuclease, a kind of nuclease.
  • the olfactory receptor Olfr110 or Olfr111 in the microglia treated with the candidate substance provides a method of screening for a substance that regulates the expression or activity of microglia in which the candidate substance is selected as a substance for controlling the activity or expression of microglia.
  • the preparation of microglia may include extracting and culturing microglia from the cerebral cortex of an E18.5 mouse embryo, followed by centrifugation.
  • the term “candidate” refers to a substance that can be controlled by increasing or decreasing the activation of microglia, and more specifically, a substance that increases activation is an activator or an agonist, and activation Substances that reduce the can be competitive inhibitors or antagonists.
  • compounds, natural products, biopharmaceuticals antioxidants, aptamers, polypeptides, etc. may be included.
  • it may be a ligand of the olfactory receptor Olfr110 or Olfr111.
  • the candidate substances are 2-pentylfuran, 2-methylfuran, 2,3-dimethylfuran, 2-ethylfuran, 2-propylfuran, 2-butylfuran, 2-t-butylfuran, 2-pentylfuran , 2-hexylfuran, 2-heptylfuran, and derivatives thereof may include one or more from the group consisting of compounds.
  • the action of the candidate substance is regulation of increasing or decreasing the activation of microglia, and more specifically, when Olfr110 and 2-pentylfuran interact, the activation gene is upregulated. I can.
  • selection refers to a procedure for selecting a necessary substance from among various substances. More specifically, when the prepared microglia is treated with a candidate substance, when the activation of microglia is increased or decreased compared to the normal control, it is selected as an activity regulating substance, and the activation of microglia is compared with the normal control. If there is no change, it may mean not to screen.
  • the screening method may further include treating Olfr110 or 2-pentylfuran interacting with Olfr111. It refers to a method of selecting the candidate substance as a substance regulating the expression or activity of microglia cells by treatment with a 2-pentylfuran or furan derivative that interacts with Olfr110 or Olfr111 when the candidate substance is treated on the microglia. According to the method, it is possible to check whether the interaction between Olfr110 or Olfr111 and 2-pentylfuran is increased or decreased, and when the interaction is increased or decreased compared to the control, it means to select as a microglia activity or a regulatory substance. I can.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neuroinflammatory diseases or meningitis, comprising as an active ingredient an interaction inhibitor or active agent between 2-pentylfuran and olfactory receptors Olfr110 or Olfr111.
  • Another aspect is to provide a health functional food for preventing or improving neuroinflammatory diseases or meningitis, comprising an inhibitor or an active agent of an interaction between 2-pentylfuran and olfactory receptors Olfr110 or Olfr111 as an active ingredient.
  • prevention may refer to any action that delays or suppresses the onset of neuroinflammatory disease or meningitis by administration of a pharmaceutical composition.
  • treatment refers to any action in which symptoms of meningitis disease are improved or advantageously altered by administration of a pharmaceutical composition, and alleviation, progression of a disease, disorder or condition, or one or more symptoms thereof, or It may refer to, or include prevention.
  • the term “improvement” may refer to any action that improves symptoms of a neuroinflammatory disease disease by administration of a pharmaceutical composition.
  • the meningitis may be bacterial meningitis.
  • meningitis refers to a variety of diseases in which inflammation occurs in the subarachnoid space between the arachnoid and the soft membrane, and refers to meningitis caused by the penetration of viruses or bacteria into the space under the arachnoid. . Inflammation caused by certain chemicals, including those caused by dissemination of cancer cells into the cerebrospinal fluid space.
  • the meningitis may be bacterial meningitis. More specifically, it may be caused by Streptococcus pneumoniae , Hemophilus influenzae and Neisseria meningitides or Listeria monocytogenes . Preferably, it may be caused by Streptococcus pneumoniae .
  • interaction inhibitor includes all substances capable of inhibiting the interaction of the olfactory receptor Olfr110 or Olfr111 with 2-pentylfuran. More specifically, it may be an antagonist or a competitive inhibitor.
  • interaction activator includes all substances capable of promoting the interaction of the olfactory receptor Olfr110 or Olfr111 with 2-pentylfuran. More specifically, it may be an agonist.
  • the interaction may be a hydrophobic interaction.
  • the compounds may be competitively inhibiting the interaction between the 2-pentylfuran and the olfactory receptors Olfr110 or Olfr111. It may be to inhibit the hydrophobic interaction between the amino acid residues Y253, F102, F104 of the olfactory receptor and 2-pentylfuran by acting as a competitive inhibitor.
  • the "antagonist” may be a substance that acts antagonistically to binding to a receptor of a certain bioactive substance (agonist), but does not exhibit a physiological action through each receptor. Preferably, it may mean a drug that serves to attenuate some or all of its actions by combination of a drug with another drug.
  • the "agonist” is a substance that serves to positively stimulate a receptor, and may also be called an agonist.
  • the interaction inhibition may be a vector, an antisense nucleotide, a short hairpin RNA, or a small interfering RNA (RNA) that binds complementarily to the mRNA of the olfactory receptor Olfr110 or Olfr111.
  • RNA small interfering RNA
  • the interaction inhibitor or activator may be a peptide, a peptide mimetics, a matrix analog, an aptamer, or an antibody that complementarily binds to a protein of the olfactory receptor Olfr110 or Olfr111.
  • siRNA refers to a nucleic acid molecule capable of mediating RNA interference or gene silencing (see WO00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 And WO 00/44914). Since siRNA can inhibit the expression of a target gene, it is provided as an efficient gene knockdown method or as a gene therapy method.
  • the antibody or aptamer is as described above.
  • the interaction inhibitor or activator is 2-pentylfuran, 2-methylfuran, 2,3-dimethylfuran, 2-ethylfuran, 2-propylfuran, 2-butylfuran, It may include one or more from the group consisting of 2-t-butylfuran, 2-hexylfuran, 2-heptylfuran, and derivative compounds thereof. More preferably, it may be 2-ethylfuran.
  • compounds, natural products, biopharmaceuticals may be included.
  • the prevention or treatment of the therapeutic composition is, when administering a composition comprising an inhibitor or an active agent as an active ingredient of the interaction between 2-pentylfuran and the olfactory receptor Olfr110 or Olfr111 to an individual in need thereof, the mutual The action may be inhibited or activated so that the activation signal of microglia may not be up or down regulated.
  • the activation of microglia is regulated, which can lead to cytokine secretion, reduction in pathological behavior, and reduction in macrophages. This can prevent, improve, or treat the occurrence of neuroinflammatory diseases or meningitis.
  • the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in the formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia, rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose , Polyvinyl pyrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil, but are not limited thereto.
  • a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. may be additionally included in addition to the above components.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally (orally) or parenterally (for example, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal or topical application as an injection), for example, subcutaneous (i.e. , Skin external preparation) or oral (ie, oral preparation) administration, but is not limited thereto.
  • parenterally for example, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal or topical application as an injection
  • subcutaneous i.e. , Skin external preparation
  • oral ie, oral preparation
  • the buffer to be added to the various formulations it is preferable to use isotonic, non-irritating pH 4-9 and pH 5-9.
  • the dosage varies depending on the condition and weight of the patient, the degree of disease, the form of the drug, the route and time of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition may be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type of disease, severity, activity of the drug, and Sensitivity, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • Other pharmaceutical compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple. It is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect in a minimum amount without side effects in consideration of all the above factors, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's age, sex, condition, weight, absorption of the active ingredient in the body, inactivation rate and excretion rate, the type of disease, and the drug to be used in combination. It may be in the range of 0.1 to 500 mg per day, and may be administered daily or every other day, or divided into 1 to 5 times a day. However, since it may increase or decrease according to the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., the dosage amount is not limited in any way.
  • the health functional food may be added to the food as it is or used with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use (for prevention or improvement).
  • the composition of the present invention is added in an amount of 60% by weight or less, preferably 40% by weight or less based on the raw material.
  • the amount may be less than the above range.
  • the food composition is not particularly limited in other ingredients, and may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as an additional ingredient, such as a conventional beverage.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, and the like; And polysaccharides, for example, common sugars such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents tacmatin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the proportion of the natural carbohydrate can be appropriately determined by the choice of a person skilled in the art.
  • the food composition includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, coloring agents and thickeners (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof.
  • microglia can be detected by measuring the activity or expression level of a protein of the olfactory receptor Olfr110 or Olfr111, and using this, the olfactory receptor of microglia In addition to being able to select a ligand, there is an effect that an inhibitor or an activator of the interaction between the olfactory receptor and 2-PF can be used in the treatment of neuroinflammatory diseases or meningitis.
  • Figure 2 shows the mRNA expression levels of pro- (Tnf, Il6, Il1b) and anti-inflammatory cytokines (I10, Il13) in microglia cells were measured in the cerebral cortex after Sup treatment and IP injection.
  • 3 is a measure of the mRNA expression levels of pro- (Tnf, Il6, Il1b) and anti-inflammatory cytokines (I10, Il13) of astrocytes in the cerebral cortex after Sup treatment and IP injection.
  • FIG. 5 is a representative fluorescence image reflecting the morphology of microglia in a state in which the intensity of GFP was treated with Ctrl- and Sup.
  • the image shows microglia in the cerebral cortex after IP injection of Ctrl or Sup in CX3CR1 GFP/+ mice. Scale bar: 20 um.
  • 11 is an image showing that olfactory receptors are expressed in primary microglia according to mRNA-seq data.
  • 12 is an image showing the relative expression levels of olfactory receptors induced by Sup treatment.
  • 13 is an image showing that the relative luciferase activity (y-axis) of Olfr110 and Olfr111 was measured with increasing concentrations of 11 furan analogues.
  • 14 is an image showing relative luciferase activity by comparing Olfr110 and Olfr111 for candidate metabolites.
  • 15 is an image showing the relative luciferase activity of Olfr111.
  • 16 is an image showing a circular map explaining the molecular ranges of Olfr110 and Olfr111 for 11 furan analogues.
  • the analogue located at the center means the most reactive analogue, and the analogue located at the farthest means the least reactive.
  • FIG. 17 is an image showing a structural model of the 2-PF-Olfr110 polymer set showing four critical residues (F102, F104, Y252, and Y259) for the interaction between 2-PF and Olrf110.
  • FIG. 18 is an image showing the relative luciferase activity (y-axis) of wild-type Olfr110 and 9 Olfr110 mutations (indicated in the legend) measured with increasing concentration of (x-axis) 2-PF.
  • NT control solvent
  • EICs ion chromatograms
  • Fig. 21 is a Sup of a 2-PF precursor ion and a 2-PF precursor ion in a synthetic 2-PF. As an image representing the MS/MS spectra of fragmented ions, it is shown along with the corresponding structures predicted by HMDB (Wishart et al., 2007).
  • 23 is an image showing a cytotoxic assay.
  • 24 is an image showing an assay for active oxygen.
  • 25 is an image showing an assay of macrophages. Sup was measured after treatment with control media (Ctrl), ATP and increasing concentrations of 2-PF (0, 100, 300, and 500 uM) (see text).
  • OE olfactory epithelium
  • OB posterior bulb
  • Fig. 27 is an image showing co-immunostaining analysis showing the expression of Olfr110 (red) and Iba-1 (green) in the cerebral cortex (top panel). Microglia marker; Expression of Olfr110 and GFAP (green) in hippocampus (middle panel), microglia marker; Expression of Olfr110 and NeuN (green) in the cerebral cortex (bottom panel), neuronal markers. DAPI appears in blue. Scale bar: 50um.
  • FIG 28 is an image showing an Immunostaining analysis showing the expression of CX3CR1 GFP/+ GFP(+) microglia (green) Olfr110 (red) in the cerebral cortex.
  • the left and right panels show low and high resolution images. Scale bar: 50um (left) and Scale bar: 20um (right).
  • FIG 29 is an image showing an Immunostaining analysis showing the expression of Olfr110 measured after treatment with Control media (Ctrl) and Sup (top panel), plus PBS (Ctrl) and 2-PF (bottom panel). The expression level of Olfr110 was quantified according to the intensity of red.
  • 30 is a heat map showing the residence frequency of mice after IP injection of PBS solvent and 2-PF at three concentrations. The total distance traveled was quantified under the same conditions and displayed on a bar graph.
  • 31 is a graph showing the mRNA expression level of inflammatory cytokines measured in the cerebral cortex after IP injection of 2-PF.
  • Fig. 32 is a fluorescence image showing the intensity of GFP in microglia after control or 2-PF is injected into CX3CR1 GFP/+ mice. Produced by cortical microglia.
  • FIG 33 is an image of a low-speed confocal microscope formed by measuring cortical fragments at 1, 16, 25, 40 and 92 minutes, respectively, after control or 2-PF treatment.
  • the volume of microglia is indicated by green, and the protruding part under macrophage is indicated by arrows.
  • Figure 34 is an inflammatory cytokine of primary microglia transfected with non-targeting siRNA + Mock (siCtrl), siRNA against Olfr110 + Mock (siOlfr110), and siRNA against Olfr110 + the rescue vector (Rescue) after 2-PF pretreatment It is a graph showing the level of mRNA expression of (*, P ⁇ 0.05; **, P ⁇ 0.01; and ***, P ⁇ 0.001).
  • 35 is a graph showing the protein levels of Tnf and Il6 after 2-PF treatment measured in the culture supernatant.
  • 36 is a graph showing the amount of accumulated oxygen concentration generated in primary microglia when siRNA transfection is performed after 2-PF treatment. Measurements over 25 minutes are shown at 1-minute intervals.
  • Phagocytosis index represents the quantified average fluorescence intensity.
  • 38 is an image showing primary microglia at three different concentrations, 10, 100, and 1000 ⁇ M 2-PF.
  • transfected microglia (yellow). Non-microglia are indicated in red, and non-transfected microglia are indicated in green. The area marked with an asterisk is the part of the cerebral cortex of CX3CR1 GFP/+ mice after stereotactic injection.
  • FIG. 40 is a graph measuring the mRNA expression levels of Olfr110 and 111.
  • 41 is an image showing the distribution of beads in three types of cells in the brain of a CX3CR1 GFP/+ mouse. Beads are marked with white dots and microglia are marked with yellow dots. Counting was performed at six locations inside three independent mice under three conditions, and the counted beads were displayed as bar graphs. (*, P ⁇ 0.05; **, P ⁇ 0.01; and ***, P ⁇ 0.001)
  • Each number represents the number of DEG.
  • 43 is an image of a heat map showing log 2 -fold-changes of up-regulated (red) and down-regulated (green) genes.
  • Figure 48 shows phosphorylated ERK (pERK), p38 (pp38), JNK (pJNK) measured in primary microneural cells using Western blot analysis at 0, 2, 5, 10, 20 and 30 minutes after 2-PF and LPS treatment.
  • Akt Akt is an image showing the results of Western blot. ⁇ -actin was used as the loading.
  • FIG. 50 is a graph showing the amount of active oxygen produced under the same experimental conditions as in FIG. 49;
  • FIG. 51 is a graph showing the degree of macrophage action under the same experimental conditions as in FIG. 49.
  • Figure 53 shows the amount of ERK, phosphor-ERK (pERK), CREB, and phosphor-CREB (pCREB) measured in primary microglia by Western blot after pre-incubation with SQ22536 or pd98059 and treatment with 2-PF. It is a graph. (*, P ⁇ 0.05; **, P ⁇ 0.01; and ***, P ⁇ 0.001)
  • Figure 55 is a graph of the production of active oxygen generated in primary microglia treated with 2-EF-treated Sup and untreated Sup, respectively. (Left) Also, 2-EF co-treated with 500 ⁇ M 2-PF It is a graph of the production of reactive oxygen species in primary microglia treated with Sup and 2-EF treated Sup, respectively (right) (*, P ⁇ 0.05; **, P ⁇ 0.01; and ** *, P ⁇ 1.0) Tukey post-hoc correction method was used with ANOVA.
  • microglia or astrocytes were primarily extracted from the cerebral cortex of E18.5 mouse embryos (Tamashiro et al., 2012), and then cultured as in Example 1. More specifically, the cortex of mouse embryos was collected and then stored in a cold supernatant (#14170-112; Thermo Fisher Scientific) and pretreated at 37 degrees in a 0.25% trypsin solution (#15090-046; Thermo Fisher Scientific) for 20 minutes. .
  • the mixture was transferred to Dulbecco's modified eagle medium (DMEM; #SH30243.01; Hyclone) medium, and the medium was changed every 3 days for 2 weeks.
  • DMEM Dulbecco's modified eagle medium
  • the medium was changed every 3 days for 2 weeks.
  • DMEM Dulbecco's modified eagle medium
  • the separated microglia was transferred to a culture medium. After transferring the microglia, the remaining mixture was shaken at 160 rpm for 1 day and cultured to completely remove the microglia.
  • astrocytes were isolated by treatment with 0.25% trypsin, and collected by incubating again for 4 days in a T75 flask. The purity of the collected microglia and astrocytes was evaluated by qRT-PCR analysis and immunocytochemistry using marker genes and proteins Iba-1 and Gfap.
  • Encapsulated strains of two serotypes were treated with 30 g of sterile Todd Hewitt Broth (#249240; BD Biosciences), 0.5% yeast extract (#288620; BD Biosciences). Was incubated with. Subsequently, the grown bacteria were transferred to Thy broth, and cultured at 37° C. for 24 hours-48 hours to reach a concentration of 10 8 CFU/ml. The culture solution was maintained at 4°C at 4,000 xg and centrifuged for 10 minutes to separate the culture supernatant (Sup) and used for intraperitoneal injection (IP).
  • IP intraperitoneal injection
  • mice All mice were maintained and maintained according to protocols approved by DGIST's Animal Care Ethics Committee, under standard temperature control, laboratory conditions, or conditions with free access to colored tunnels, mazes, climbing materials, and running wheels.
  • BL6J or heterozygous CX3CR1 +/GFP mice between 8 and 10 weeks were used. The mice were generated by cross-crossing C57/BL6J and CX3CR1 GFP/GFP (Jung et al. 2000). All mice were provided with sterile food and water, optionally, at room temperature on a 12-hour cycle.
  • Tnf, il6, and Il1b cytokines secreted from microglia were measured according to the manufacturer's protocol. More specifically, it was measured by ELISA 24 hours after treatment with 2-PF or cell supernatant.
  • the ELISA kit was purchased from BD biosciences (#DY410 for Tnf; #DY406 for Il6; #DY401 for Il1b).
  • mice 9-week-old CX3CR1 GFP/+ mice were used. Two mice were injected with IP with and without 2-PF, respectively, and after 2 hours, brain slices were extracted using cold resection. After preparing a 40 ⁇ m-thick brain tissue fragment to be smaller than 1 ⁇ m, the GFP signal of the microglia was measured using a 40-fold magnification confocal microscope. Zeiss ZEN Software (Zeiss) was used to analyze the GFP-pixel signal of microglia.
  • the concentration of superoxide was calculated by measuring the degree of decrease in cytochrome c using a VersaMax microplate reader (Babior et al., 1973).
  • Microglia cells were cultured in a 96 well plate at a concentration of 1.0 x 10 5 cells/well. , The microglia were activated by a solution of 2-pentylfuran, a 10 ⁇ M ATP solution containing cytochrome c, or a solution of Sup mixed with cytochalasin B (5 ⁇ M; #C66762; Sigma Aldrich). The concentration of ROS by this was measured through the change in light absorption at 550 nm for 25 minutes at 1 minute intervals.
  • Cell chemotaxis was measured using a multiwell Boyden chamber. More specifically, a polycarbonate filter (8 ⁇ m pores; #101-8; Neuroprobe) was coated in PBS by 10 mg/ml fibronecter (Sigma-Aldrich) for 2 hours, and the coated filter was placed in a Boyden chamber. Installed. In addition, the bottom side of the plate was filled with serum-free DMEM or culture supernatant containing 2-pentylfuran. Next, microglia or Hana3A cells were infected with the olfactory receptor structure and then suspended in serum-free DMEM. Afterwards, microglia cells were stored for 4 hours and Hana3A cells for 8 hours at 37°C.
  • the primary microglia were incubated for 24 hours after inoculation of a 24-well plate (5 ⁇ 10 5 cells/well). Cells were pre-incubated with 2-PF or sup for 30 minutes, transferred to FITC-dextran (1 mg/ml, 20 mg/ml in PBS; #FD70S; Sigma Aldrich) in serum-free DMEM for 30 days at 37 degrees. Washed with PBS. Cells were isolated by 0.25% trypsin (#15090-046; Thermo Fisher Scientific) in PBS and the isolated cells were analyzed by FACS AccuriTM C6 (BD Biosciences). The mean fluorescence intensity (MFI) was calculated by integrating the fluorescence histograms under each condition using the above software. The macrophage action index was defined as MFI using the untreated group as the standard.
  • the concentration of active oxygen was measured using 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA, #D6883; Sigma Aldrich) using a method with minor modifications from the existing method (Bae et al., 2001). More specifically, the primary microglia were treated with 10 ⁇ M DCF-DA in a 24-well plate (5.0 ⁇ 10 5 cells/well) for 24 hours at a temperature of 37 degrees for 30 minutes. One plate was treated with 2-PF, and one was not. Cells in each well were measured with a flow cytometer (FACS AccuriTM C6; BD Biosciences). MFI was measured as described above.
  • olfactory receptor genes from mouse and human genomic DNA were amplified using appropriate primers. After digesting the resulting cDNA with a restriction enzyme, the product was prepared to generate an olfactory receptor structure having a restriction enzyme site in the P ME18S expression vector containing N-terminal Lucy, Flag, and Rho tags as described above. Connected. The structure of all olfactory receptors was confirmed by sequence analysis (Shepard et al., 2013). Then, it was transfected with Hana3A cells with RTP1S and confirmed its location and presence in the cell membrane as previously described (Behrens et al., 2009; Zhuang and Matsunami, 2008).
  • mice were then incubated with normal horse serum (#008-000-121; Jackson ImmunoResearch) for 1 hour at room temperature.
  • Cy3-conjugated donkey anti-mouse antibody (1: 1,000; #715-165-150; Jackson ImmunoResearch), Alexa488-conjugated donkey anti-mouse (1: 1,000; #715 -545-150; Jackson ImmunoResearch), or Cy3-conjugated donkey anti-rabbit antibody (1: 1,000; #711-165-152; Jackson ImmunoResearch) was treated at room temperature for 1 hour.
  • Cells were mounted with a Vectashield type and mounting medium containing DAPI (#H-1200; Vector Laboratories). The expression of heterologous olfactory receptors was analyzed with a confocal laser scanning microscope LSM700 and ZEN software (Zeiss).
  • the Dual-Glo luciferase assay system (#E2940; Promega) was used for olfactory receptor ligand screening. More specifically, Hana3A cells were plated on a white polystyrene 96-well plate (#353296; BD Biosciences) one day before transfection one day before transformation. For each plate, pCRELuc (1 ⁇ g; #219076; Agilent Technologies), pRL-SV40 (1 ⁇ g; #E2231; Promega), RTP1S (1 ⁇ g), and OR (6 ⁇ g; or Mock) vectors were transfected for 24 hours. Infected.
  • Olfr110/111 mouse olfactory receptor homology modeling includes template search, gene sequence alignment, model determination, and model quantity evaluation. In addition, this was done through SWISS-MODEL, a web-based homology modeling tool.
  • the amino acid sequence of Olfr110/111 was first obtained from NCBI Protein BLAST using the UniprotKB/Swiss-Prot database.
  • BLAST and HHblits of SWISS-MODEL Template Library (SMTL) were used. As a result, 179 and 186 templates were found.
  • the homology model of Olfr110/111 To construct the homology model of Olfr110/111, the X-ray crystal structure of human adenosine A2A receptor (resolution: 2.7 ⁇ , PDB ID: 3VG9) was selected as a template structure, which is based on both sequence identity and similarity. The 3d homology model structure was created using Promod. The overall evaluation of the generated model was performed using the QMEAN scoring function. The final 3D model structure of the Olfr110/111 was downloaded from the SWISS-MODEL website.
  • the two-dimensional structure of the ligand was created by ChemBioDraw (ver. 11.0.1) and transferred to Chem3D Pro (ver. 11.0.1) to create a three-dimensional structure.
  • the procedure used for ligand preparation and optimization was done using the'Sanitiza' protocol (default) of SYBYL-X 2.1.1 (Tripos Inc., St. Louis).
  • the homology model of Olfr110/111 was created using the SWISS-MODEL homology modeling tool.
  • the structural preparation power of SYBYL-X 2.1.1 was also used in the protein preparation process. The deletion of the amino acid residue was corrected, and additional hydrogen atoms were added to the protein using the TRIPOS force field.
  • the initial optimization setting was changed to'none' from the default setting, and then the protein minimization process was performed.
  • the gradient of EHgks neutralization was set to 0.5 kcal/(mol* ⁇ ), and the maximum repetition was set to 1000 times.
  • the entire docking process was performed using the protein and ligand prepared by the above method using the Surflex-Dock GeomX module (SYBYL-X 2.1.1).
  • the docking site was induced by the Surflex-Dock protomol, which is an ideal ligand phenotype, characterized by all interactions with existing binding sites.
  • This protocol was defined by jointly selecting and finding the receptor that is most widely expressed on the multi channel surface of SYBYL-X 2.1.1.
  • the occurrence factors of both protocols, Bloat and Thershold, were set to 0.5 ( ⁇ ) and 0, respectively.
  • the maximum value of poses generated was set to 20, and the minimum RMSD between generated forces was set to 20.
  • the minimum value of RMSD between poses was set to 0.05.
  • Surflex-dock GeomX's other docking parameters are set by default.
  • a specific mutant vector of the Olfr110 structure was generated using PfuUltra High-Fidelity DNA polymerase (#600380; Agilent Technologies).
  • the order of all mutant vectors (F102W; F104W; Y252F; Y259F; F102W/F104W; Y252F/Y259F; F102W/Y252F/Y259F; F104W/Y252F/Y259F; F102W/F104W/Y252F/Y259F) is forward and reverse.(Macrogen ).
  • Synthetic 2-PF solution (98% or higher purity) was purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). An equal amount of absolute (99.9%) methanol was added to the original solution of 2PF. The original solution of 2-PF and the solution to which methanol was added (2-PF + CH 3 OH) were analyzed by direct infusion mass spectrometry. For liquid-chromatography-tandem-mass-spectrometry (LC-MS/MS) analysis of the synthetic 2-PF, a 2-PF + CH 3 OH solution was used.
  • LC-MS/MS liquid-chromatography-tandem-mass-spectrometry
  • the 2-PF and 2-PF + CH 3 OH samples were injected into a heated electrospray ionization source using a 500 ⁇ l gas sealed syringe at a flow rate of 20 ⁇ l/min. In addition, it was measured for 8 minutes by the single ion monitoring method of the Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap mass spectrometer.
  • the capillary voltage was set to 3.5 kV (positive mode) and the temperature of the solvent removal capillary was set to 250°C.
  • the total MS was monitored with a mass range between 50 and 750 Thomsons (Th) with a resolution of 70,000 (m/z 200).
  • the maximum ion implantation time is 100ms and the automatic gain control value is 1x10 6 .
  • the isolation window was set to 1.0 m/z (Looße et al., 2015).
  • Thermo EASY-nLC 1000 (Thermo Scientific, Odense, Denmark) equipped with an analytical column (Thermo Scientific, Easy-Column, 75 ⁇ m ⁇ 50 cm) and trap column (75 ⁇ m ⁇ 2 cm) was used for LC separation.
  • concentration gradient was used for 50 minutes. : 2% to 40% solvent B for 36 min, 40% to 80% solvent B over 6 minutes and from 80% to 2% solvent B over 6 minutes.
  • MS scans were detected with a resolution of 17,500 (Saigusa et al., 2016).
  • the maximum ion implantation time was 100 ms and 50 ms for full MS and MS/MS scans, respectively.
  • the automated gain control target values were set to 1.0 ⁇ 10 6 and 1.0 ⁇ 10 5 for full MS and MS/MS scans, respectively.
  • the precursor ions were chromatographic peaks within a tolerance of 2 ppm. Was extracted by setting to 17 and 22 or 16 and 22. In each spectrum, the peaks of m/zf-the mass of CH 3 and the corresponding ones were connected, and as a result, a candidate structure was obtained with fragmented peak ions (HMDB) (Wishart et al., 2007).
  • HMDB fragmented peak ions
  • T-PER® reagent (#78510; Thermo Fisher Scientific) with protease inhibitors (#04-693-116-001; Roche Molecular Diagnostics), DMSF (Sigma-Aldrich) and lysed using MagNA lyser (Roche Molecular Diagnostics). Cells and tissues were prepared, and then lysed using a MagNA laser (Roche Molecular Diagnostics). Total protein extract was quantified by Bradford assay. The sample was dissolved in 7.5% SDS-PAGE or 4-20% gradient mini-PROTEIN TGX Precast Gels (#456-1064; Bio-Rad Laboratories), and then blotted onto nitrocellulose membranes (#10600002; GE Healthcare).
  • the membrane was then blocked in 5% skim milk powder and TBST, 0.1% TWEEN® 20 (#P9416; Sigma-Aldrich) and Tris-buffered saline for 1 hour, and then incubated with primary antibodies overnight at 4 degrees. .
  • the antibodies are: Olfr110 (36 kDa; 1:1,000; #ab177327; Abcam), anti rhodopsin (39 kDa; 1:1,000; #MABN15; Millipore), CREB (43kDa; 1:1,000; #9197; Cell Signaling Technology), phospho-CREB (43 kDa; 1:1,000; #9198; Cell Signaling Technology), ERK (44 kDa; 1:1,000; #sc094; Santa Cruz), phospho-ERK (42, 44 kDa; 1: 1,000; #sc-7383; Santa Cruz), phospho-Akt (60 kDa; 1:500; sc-293125; Santa Cruz), phospho-JNK (46, 54 kDa; 1:500; sc-6254; Santa Cruz) , phosphor-p38 (38 kDa; 1:1,000; sc-7973; Santa Cruz), or beta- Actin (45 kDa; 1:10,000; #
  • the Isotype-matched horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody was 1:100,000 in anti-rabbit (#711-035-152; Jackson ImmunoResearch) in TBST for 2 hours at room temperature, and anti-mouse (# 715-035-150; Jackson ImmunoResearch) was used as 1:40,000.
  • As the immunoreactive protein band SuperSignalTM West Pico Chemiluminescent Substrate (#34080; Thermo Fisher Scientific) was used.
  • a 22mm coverslip (#0101050; Marienfeld) was coated with poly-D-lysine (10 ⁇ g/ml; #P7280; Sigma Aldrich) under standard conditions for 48 hours, followed by culturing microglia. Thereafter, the cells were washed with PBS and fixed in 4% paraformaldehyde (#6148; Sigma Aldrich) for 5 minutes. Later, it was incubated for 1 hour at room temperature in PBS containing 4% of normal horse serum (#008-000-121; Jackson ImmunoResearch) and 0.1% TWEEN® 20 (#P9416; Sigma-Aldrich). The cells were then blocked overnight at 4 degrees with the primary antibody that had been listed.
  • Antibodies are: Olfr110 (rabbit-anti-Olfr110; 1:10,000; #ab177327; Abcam), Iba-1 (goat-anti-Iba-1; 1:1,000; #ab5076; Abcam), and GFAP (mouse -anti-GFAP; 1:1,000; #556330; BD Biosciences). Samples were incubated in a PBS solution containing 0.1% TWEEN® 20 (#P9416; Sigma-Aldrich) with a secondary antibody for 1 hour at room temperature.
  • Secondary antibodies are: Cy3-conjugated donkey anti-rabbit (1:1,000; #711-165-152; Jackson ImmunoResearch), Alexa488-conjugated donkey anti-goat (1:1,000; # 705-545-147; Jackson ImmunoResearch), or Alexa488-conjugated donkey anti-mouse (1:1,000; #715-545-150; Jackson ImmunoResearch). Thereafter, the cells were mounted with a Vectashield fluorescent material containing DAPI (#H-1200; Vector Laboratories), followed by a confocal laser scanning microscope, and an image resulting from the experiment using LSM700 and ZEN software (Zeiss). Was obtained.
  • mice were anesthetized at a dose of 400 mg of ketamine/kg body weight, perfused epidural and then fixed with 4% paraformaldehyde (PFA; #6148; Sigma Aldrich) in PBS.
  • PFA paraformaldehyde
  • the brains of mice were transferred to 4% PFA at 4 degrees for 4 hours, and then stored for 1 day in 30% sucrase solution.
  • O.C.T compound #4583; Scigen
  • a sample was formed by cutting it to a thickness of 40 ⁇ m using a cryotome (#HM 550; Thermo Fisher Scientific).
  • the brain sample was stored on a slide, and at the same time, after immersing for 30 minutes in 2% donkey serum in 0.3% PBST (1X PBS/0.3% Triton X-100), incubated with primary antibodies overnight in a blocking buffer at 4 degrees.
  • Primary antibodies are: rabbit anti-Olfr110; 1:10,000; #ab177327; Abcam, goat anti-Iba-1; 1:1,000; #ab5076; Abcam, mouse anti-GFAP; 1:1,000; #556330; BD Biosciences)
  • Secondary antibodies are: Cy3-conjugated donkey anti-rabbit; 1:1,000; #711-165-152; Jackson Immuno Research, Alexa488- conjugated donkey anti-mouse; 1:1,000; #715-545-150; Jackson ImmunoResearch, Alexa488-conjugated donkey anti-goat (1:1,000; #705-545-147; Jackson ImmunoResearch)
  • stained slides were Vectashield fluorescence containing DAPI (#H-1200; Vector Laboratories). Treated with material.
  • the image obtained as a result of the experiment showed a 20-fold magnification image using a confocal laser scanning microscope LSM700 (Zeiss).
  • mice The primary microglia of mice were placed in a 6 well plate 1 day before transfection. Then, in order to differentiate the primary microglia, Lipofectamine RNAiMAX (# 13778150, Themo Fisher Scientific) was used in Opti-MEM (# 11058021; Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's protocol.
  • the siRNA #3 structural vector of Olfr110 having several silent homologous mutations (5'-CUCAACGAGCUGCAAUACC-3') was generated using the site-directed mutagenesis method mentioned later, and then transfected for 24 hours for Olfr110 knockdown.
  • the rescue vector was used LipofectamineLTX (# 15338100; Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's protocol, and transfected with non-target or siRNA # 3 transfected cells for 24 hours.
  • Injection was made using a Hamilton syringe at a rate of 0.5 ⁇ l/min. 48 hours after injection, the in vitro imaging analysis method was performed with a slight modification to the method described above (Takayama et al., 2016). The delivery of the siRNA structure was confirmed by the red fluorescence of the siGLO RED oligonucleotide duplex. In addition, qRT-PCR was used to confirm the efficiency of transfection at the injection site.
  • the synthesis of the first strand of cDNA was initiated by adding 1 ⁇ l of 3'SMART CDS primer II A from 10 ng of total RNA for 3 minutes at 72°C.
  • the second strand was synthesized by addition of SMARTer-seq v4 oligo and SMARTScribe reverse transcriptase, and the reaction was incubated at 42° C. for 90 minutes and then inactivated at 70° C. for 10 minutes.
  • Double-stranded cDNA was amplified for 8 cycles by PCR and purified using Agencourt AMPure bead (Beckman, A63881).
  • the mRNA-seq library was generated according to the manufacturer's Nextera XT DNA library preparation kit (illumina, FC-131-1024) recommended protocol.
  • the cDNA was tagged with tagmentation (sequencing adapter) and amplified by PCR using Index Primers of the Nextera XT DNA Index Kit (Illumina, FC-131-1001). After PCR, the DNA library was purified using AMPure beads and the quality was evaluated using an Agilent 2100 Bioanalyzer. The DNA library of individual samples was quantified using the KAPA library quantification kit (KAPA biosystems, KK4854) and then pooled. All libraries were sequenced on the Illumina Hiseq2500 instrument to generate double indexed 100 bp paired reads, generating an average of 58 million reads for each sample.
  • KAPA library quantification kit KAPA biosystems, KK4854
  • the quality of raw sequences was checked using FastQC (Babraham Bioinformatics) and the adapter sequences were cleaned up using cutadapter software.
  • the remaining reads were aligned to the mouse reference genome (GRCm38) using TopHat (Trapnell et al., 2009) with default options.
  • the aligned reads were assembled to the annotated gene, and fragments per kilobase per million mapped reads FPKM were calculated using Cufflinks (Trapnell et al., 2010).
  • the cutoff was determined as the mean of the 5th and 95th percentile values in the distribution of log 2 fold change obtained in the random sampling experiment described above.
  • Enrichment analysis of Gene Ontology Biological Process (GOBP) was performed using DAVID software (Huang da et al., 2009). As a result, the concentrated GOBP was P ⁇ 0.05 calculated from DAVID and the count was ⁇ 3.
  • the newly isolated microglia is placed in cover glasses (#0111580; Marienfeld) coated with poly-D-lysine, and after 24 hours, the microglia are incubated for 30 minutes in a superfusion chamber.
  • the chamber was filtered with 0.22 ⁇ m Ringer's solution (115 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 , 1.5 mM MgCl 2 , 4.5 mM HEPES, pH 7.4) in 4 ⁇ M of Fura-2/AM (Ca 2+ - sensitive fluorescent dye; #F1221; Thermo Fisher Scientific). After the calcium staining incubation, the chamber was placed in an inverted microscope and rinsed with Ringer's solution for 20 minutes before 3-PF treatment.
  • the flow rate of the solution is 12 ml/min.
  • the primary microglia were treated with 300 ⁇ M ATP (#A2383; Sigma Aldrich) for 5 seconds. After washing for 5 minutes, the primary microglia were treated for 5 seconds with a 2-pentylfuran solution of 100 ⁇ M concentration. This step was carried out with two concentrations (300 and 1000 ⁇ M) of 2-pentylfuran solutions. Finally, 300 ⁇ M ATP solution is treated for 5 seconds. The emitted fluorescent material was photographed every 2 seconds using a CCD camera. Pseudo-color images were converted using fractional fluorescence changes ( ⁇ F/F, ⁇ [Ca 2+ ]i).
  • this image shows the change of calcium ions inside the cell.
  • the color intensity of the captured images was set to a maximum of 1.5 ⁇ 0.1 AU (arbitrary linear units) and a minimum of 0.4 ⁇ 0.1 AU.
  • a representative calcium ion peak was selected after analyzing 160 cells.
  • ATP diluted in DMSO (#A2383; Sigma Aldrich).
  • microglia causes a morphological change from the existing divided form to the amoeba form, and at the same time increases the number of steps and the length of each (Kreutzberg, 1996).
  • the present inventors compared the intensity of GFP in CX3CR1 GFP/+ mice using the control and microglia-specific tagged GFP to confirm the above morphological change. As a result, it was confirmed that the intensity of GFP was significantly higher (P ⁇ 1.0 ⁇ 10 -3 ) in the group in which microglia was injected intraperitoneally when compared with the control group. This means that the injection of 2-PF causes the activation of microglia, and this activation increases the number and length of microglia. (See Fig. 5).
  • microglia is activated and its shape changes. This is a change from the existing divided form to the amoeba form.
  • GFP intensity of the microglia in the experimental group injected with Sup was significantly higher (P ⁇ 1.0 ⁇ 10 -3 ) than the control group. Therefore, it can be concluded that the activation of microglia occurs and morphological changes also occur after 2-pentylfuran injection. (See Figs. 6 to 8).
  • olfactory receptor candidates primarily, mRNA sequencing analysis of primary microglia was performed.
  • the 13 olfactory receptors discovered as a result were Olfr111, Olfr110, Olfr482, Olfr99, Olfr132, Olfr115, Olfr77, Olfr543, Olfr461, Olfr455, Olfr1420, Olfr1417, and Olfr57, among which Olfr111/110 was most frequently expressed. (See Fig.
  • 11 volatile metabolites derived from S. pneumoniae were selected (Olfr111, Olfr110, Olfr482, Olfr99, Olfr132, Olfr115, Olfr77, Olfr543, Olfr461, Olfr455, Olfr1420, Olfr1417). , And Olfr57) using these 11 metabolites, it was confirmed that candidate olfactory receptors were instantaneously infected and then activated, and then reactivity was confirmed using a luciferase assay (Zhuang and Matsunami, 2008) with Hana3A cells.
  • the important residue of Olfr110 that binds to -PF was investigated.
  • the docking analysis predicting the amino acid of Olfr110 is important for hydrophobic interactions such as 2-PF and F102 and F104 of the transmembrane region 3 and Y252 and Y259 of the transmembrane region 6. (See Fig. 17) Among them, it was found that F104 and Y252 are particularly important for olfactory recognition by MOR256-3.
  • the increase in disease behavior by activation of microglia is known to be due to the increase in secreted cytokines.
  • This experiment was conducted to confirm an increase in disease behavior with an increase in cytokines. Assessment of disease behavior was made after IP injection of Sup or 2-PF into the mice.
  • the mouse was placed in a four-sided space (40 ⁇ 40 ⁇ 40 cm, white field, black wall), and recorded the position of the mouse using a camera for 30 minutes, and then the movement distance was calculated. After that, a pseudo-color heat map was created using EthoVision XT (Noldus, Netherlands).
  • the brain of a 9-week-old male CX3CR1 GFP/+ mouse was cut to a thickness of 150 ⁇ m using a vibratome (Leica VT1200), and then ice-cooled artificial cerebrospinal fluid (aCSF: 120 mM NaCl, 25 mM NaHCO 3 , 1.25 mM NaH 2 PO 4 , 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 , 1 mM MgSO 4 , 305mOsm glucose, pH 7.4). Later sliced brains were incubated for removal of cell debris. The oxygenated aCSF was pretreated in a perfusion chamber at 37 degrees for 2 hours.
  • aCSF artificial cerebrospinal fluid
  • a specific siRNA for Olfr110 and a specific mutant vector structure of Olfr110 that restores the siRNA were designed.
  • the structural vector restored the decrease in mRNA and protein induced by siRNA.
  • Using this siRNA and structural vector we were able to confirm the effect of Olfr110 on 2-PF-induced microglia activation.
  • the incapacitation of Olfr110 reduced the increase in the mRNA level of the inflammatory cytokine in the primary microglia induced by 2-PF, whereas the structural vector restored the effect of this incapacitation.
  • the increased active oxygen induced by 2-PF was reduced by siRNA and rebuilt by the rescue vector.
  • the increase in active births mediated by the P2Y receptor was not affected by the presence of the structural vector.
  • the present inventors investigated whether Olfr110 knockdown and rescue effects occurred in mouse brains. More specifically, in the cerebral cortex of CX3CR1 GFP/+ mice, non-targeting siRNA + Mock + siGLO (for Ctrl), Olfr110 siRNA + Mock + siGLO (siOlfr110), and Olfr110 siRNA + rescue vector + siGLO (for Rescue) The same combination was injected with stereotactic (Takayama et al., 2016). After injection, the infected microglia (yellow), uninfected microglia (green), and infected non-microglia (red) were compared and observed in the brain slices of mice. (See Fig. 39) Fluorescence in the sliced brain slices.
  • Olfr110 can regulate the activation of microglia (cytokine secretion, free radical secretion, cytotoxicity, macrophages) induced by 2-PF in both in vitro and ex vivo .
  • Example 5 G of Olfr110-dependent microglia activation induced by 2-PF ⁇ s -s-cAMP-PKAERK and G ⁇ --PLC-Ca 2+ whether or not to regulate by pathways
  • the phosphorylation of CREB and ERK was greatly reduced by SQ22536 and pd98059 (see Fig. 53).
  • the present study shows that the G ⁇ s -cAMP -PKA-ERK pathway modulates the production, cytotoxicity, and macrophages of cytokines, while the G ⁇ -PLC -Ca 2+ pathway modulates ROS production.
  • microglia can be detected by measuring the activity level of the protein of the olfactory receptor Olfr110 or Olfr111 or whether the protein is expressed, and using this, it is possible to select the olfactory receptor ligand of the microglia, as well as the above.
  • Inhibitors or activators of the interaction between olfactory receptors and 2-PF can be used in the treatment of neuroinflammatory diseases or meningitis.
  • the present invention detects microglia and selects its ligands in basic research fields and clinics to conduct related studies.
  • the inhibitor or active agent may be usefully used in the field of developing a therapeutic agent for neuroinflammatory diseases or meningitis.

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Abstract

미아세교세포의 후각수용체 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 일 양상에 따른 미세아교세포의 후각수용체 마커 및 이의 용도에 의하면, 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111의 단백질의 활성 또는 발현 수준을 측정하여 미세아교세포를 검출할 수 있고, 이를 이용하여 미세아교세포의 후각수용체 리간드를 선별할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 후각수용체와 2-PF의 상호작용 억제제 또는 활성제를 신경 염증질환 또는 뇌수막염의 치료에 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

미세아교세포 마커로서의 후각수용체 및 그의 용도
미세아교세포 마커로서의 후각수용체 및 그의 용도에 관한 것이다.
생물학적으로 장내 미생물이 분비하며 활성이 있는 소분자들을 대사체라고 명명되며 장에서 호스트와 미생물 사이의 상호작용을 중재하는 역할을 한다 (Blacher et al., 2017; Nicholson et al., 2012). 보다 구체적으로, 장에서 분비되는 나이아신(NA), 아세테이트, 프로피오네이트, 및 부티라트와 같은 단쇄지방산(small chain fatty acids: SCFAs)등의 대사체들은 T 세포의 염증반응 또는 호중구와 대식 세포의 염증 반응을 조절하면서 숙주의 면역계에 아주 깊이 영향을 준다고 알려져 있다 (Topping and Clifton, 2001). 이러한 장내 미생물에서 비롯되는 단쇄 지방산(SCFAs)은 장내 미생물로부터 뇌 축(Gut-Brain axis)이라고 불리는 뇌로 가는 신호를 조절한다(Erny et al., 2015). 게다가, 장내 공생하는 미생물 이외에 우리 몸 속의 기관들도 숙주의 병원균 감염 시 신호를 보내게 되는데, 보다 구체적으로는 장내 미생물과 같은 감염원들이 병원체-뇌 축이라 불리는 숙주 면역에 영향을 줄 수 있는 대사체들을 분비하고 변형시키는 것이다 (Topping and Clifton, 2001). 하지만 이러한 병원체-뇌 축(Pathogen-brain axis)의 경우 거의 연구되지 않았다.
미세아교세포는 병원체-뇌 축(pathogen-brain axis)에서 중요한 면역 세포 활동을 한다. 그들은 병원체에 의한 감염에 대항하여 아주 중요한 역할을 담당한다 (Hanisch and Kettenmann, 2007;Nimmerjahn et al., 2005). 감염이 일어난 후에, 미세아교세포는 매우 빠르게 활성화되고, 형태학적인 변화, 세포 주화성 반응, 사이토카인의 생산, 대식 작용, 및 활성 산소(ROS) 생성을 유도하게 된다 (Kreutzberg, 1996). 병원체와 관련된 분자 활동의 패턴을 동족 패턴 인식 수용체(PRRs)를 통해 인식 후에 활성화된다 (Block et al., 2007). 하지만 병원체로부터 유래되는 소대사체들이 어떻게 미세아교세포를 활성화시키는지는 거의 알려져 있지 않았다. 미세아교세포는 크고 작은 분자들을 생물학적으로 감지하는 다양한 G protein-coupled receptors (GPCRs)을 발현한다 (Hickman et al., 2013; McHugh, 2012). 게다가 GPCR의 경우 작은 대사체들을 감지하고 미세아교세포의 활성화에 영향을 주는 사이토카인의 수용체와 PRRs을 포함하고 있다. 예를 들어, GPR55, GPR18, CNR2는 미세아교세포의 이동을 자극하기 위해 칸나비노이드를 인식하고 (Gong et al.,2006; Pietr et al., 2009), OPRM1의 경우 미세아교세포의 이동을 저해하기 위해 아편유사제 (morphine sulfate, 758.8 Da)를 인식한다 (Chao et al., 1997). 하지만, 이러한 GPCRs이 병원체-뇌 축(pathogen-brain axis)에 어떻게 관여되어 있는지는 여전히 의문이 풀리지 않았다.
Odorant receptor (OR, 후각수용체)는 GPCRs 군에서 사람의 경우 50%, 쥐의 경우 60%에 해당하는 가장 큰 아과이다 (Bjarnadottir et al., 2006). 그들은 신장 피부 및 췌장 조직과 같은 다양한 비 후각 조직에서 소분자체들을 검출할 수 있다 (Kang et al., 2015; Kang and Koo, 2012; Massberg and Hatt, 2018). 예를 들어, OR2AT4에 의한 샌달 우드 향기의 인식은 사람의 피부에서 케라티노사이트(keratinocytes)의 증식을 촉진시키고, 상처 치유를 유도한다 (Busse et al., 2014). Olfr78은 또한 renal juxtaglomerular apparatus에서 SCFAs를 인식하여 레닌 분비 및 혈압 조절을 돕는다 (Pluznick et al., 2013). Olfr78에 의한 저산소 상태의 젖산의 인식은 경동맥의 glomus 세포에서 칼슘 과도 현상을 유도하고 호흡을 조절하기 위하여 경동맥의 신경 활동을 조절한다 (Chang et al., 2015). 결과적으로 이러한 정보들은 후각수용체가 선택적으로 병원체에서 유래한 대사체의 수용체로 작용한다는 사실을 제시해 준다.
세균성 뇌수막염은 중추신경계 혹은 해마에 직접적인 감염에 의한, 생명을 위협할 수 있는 병이다. (Mook-Kanamori et al., 2011) 폐렴구균 (Streptococcus pneumoniae, S. pneumoniae)이 세균성 뇌수막염을 유발하는 주요 병원균으로 알려져 있다 (Mook-Kanamori et al., 2011; van de Beek et al., 2006). 미세아교세포의 활성화는 폐렴구균 감염 후에 뇌가 염증 반응을 일으키며 반응하는 것으로 주로 특징된다 (Mook-Kanamori et al., 2011; Rock et al., 2004). 페렴구균용혈소(Braun et al., 2002; Kim et al., 2015), 폐렴구균용혈소 막 단백질 C (Peppoloni et al., 2006), 세포막 구성 물질들과 같은 몇몇의 큰 분자들은 미세아교세포의 활성화를 유발할 수 있다 (Hanisch et al., 2001).
이러한 기술적 배경 하에서, 미세아교세포와 후각수용체의 관계에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으나, 미세아교세포의 후각수용체를 마커로 이용하는 것과 병원균에서 유발되는 대사체와 미세아교세포 후각수용체의 상호작용을 이용하는 치료는 연구된 바 없어 필요성이 시급한 실정이다.
일 양상은 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111 수용체의 활성 또는 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 미세아교세포 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111를 발현하는 미세아교세포를 준비하는 단계; 상기 미세아교세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보 물질 처리된 미세아교세포에서 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111의 활성 또는 발현이 대조군에 비해 변화한 경우 후보 물질을 미세아교세포의 활성 또는 발현 조절 물질로 선별하는 단계를 포함하는, 미세아교세포를 활성 또는 발현 조절 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 2-펜틸퓨란과 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111과의 상호작용 억제제 또는 활성제를 유효성분으로 포함하는 뇌수막염 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 2-펜틸퓨란과 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111과의 상호작용 억제제 또는 활성제를 유효성분으로 포함하는 뇌수막염 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구 범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
일 양상은 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111 수용체의 활성 또는 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 미세아교세포 검출용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "미세아교세포(Microglia)"는 중배엽에서 유래한 중추 신경계의 신경 아교 세포로서, 중추신경계에서 일차적인 면역 기능을 수행하는 세포를 말한다. 미세아교세포는 조직을 지지하고 신경 세포에 필요한 물질을 공급, 조직 내의 물질 운반, 파괴, 및 제거를 담당하며 활성화 여부에 의해 다른 특성을 가진다.
본 명세서에서 사용된 용어 "검출"이란, 일반적으로는 시료의 화학적 분석에서 시료 속의 어떤 원소나 이온 화합물의 유무를 알아내는 것을 의미한다. 본 발명에서 미세아교세포의 검출이란, 생물 시료에서 미세아교세포의 활성 수준을 분석하는 것을 의미한다. 보다 구체적으로, 생물 시료를 정제한 다음, 미세아교세포 검출용 조성물을 처리하는 경우, 후각수용체와 검출용 조성물과의 상호작용으로 인해 미세아교세포의 활성화 수준을 검출하는 것일 수 있다.
미세아교세포의 활성화란, 형태학적 변화, 대식 작용의 증가, 세포 내 칼슘 이온의 변화, 세포 주화성 평가, 및 사이토카인의 분비 증가를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본래 가늘고 긴 가지와 얇은 세포체의 모양을 유지하고 있는 미세아교세포가 외부에서 유입되거나 내부에서 발생되는 독소들을 탐지할 경우, 이들 독소로부터 신경 세포를 보호하기 위해 굵고 짧은 가지와 굵은 세포체를 가지는 활성화된 모양으로 변화하게 되는 것일 수 있다. 상기 활성화된 미세아교세포는 정상 상태의 미세아교세포와는 달리 포식작용을 활발히 하고, 세포증식을 하며, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등과 같은 사이토카인, 케모카인, iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2) 등의 유전자를 발현시켜 염증매개물질들을 생성하는 것을 의미한다. 미세아교세포의 활성화는 손상된 세포를 제거하고 외부에서 침입하는 박테리아나 바이러스로부터 신경세포를 보호하는 일면이 있고, 동시에 과활성화될 경우 신경세포를 손상시키는 일면 또한 있다.
보다 구체적으로, 생물 시료는 신경 세포, 신경 조직, 신경 유래 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 미세아교세포의 활성화물질로는 박테리아의 내독소인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS), 인터페론-γ, 베타아밀로이드, 갱글리오사이드 및 2-Pentylfuran 등이 포함될 수 있고, 일 구체 예에 있어서, 2-Pentylfuran 또는 퓨란 유도체일 수 있다.
상기 미세아교세포 검출용 조성물은 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111의 발현 또는 활성 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "후각수용체 odorant receptor 110 또는 odorant receptor 111는"은 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에서 가장 큰 군을 차지하는 후각수용체의 한 종류이다. 후각 세포에도 분포하지만 비 후각 세포에도 분포한다. 수용체의 총 개수는 인간에서는 약 400개 정도로 알려져 있다. 그 중 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111는 미세아교세포에 특이적으로 발현된다고 알려져 있다. 본 발명의 일 실험 예에서 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111이란, 비 후각 세포에 존재하는 것을 의미할 수 있다. 예를 들면, 신경세포, 신경조직, 또는 뇌 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "단백질 활성 또는 발현 수준 측정"이란 생물학적 시료에서 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111의 단백질의 존재 여부와 활성 정도를 확인하는 과정이다. 보다 구체적으로는, 신경 세포의 시료에서 미세아교세포의 활성화 여부를 측정하는 것이다. 예를 들면 형태학적 변화, 대식 작용의 증가, 세포 내 칼슘 이온의 변화, 세포 주화성 평가, 및 사이토카인의 분비 증가를 측정하는 것이 포함될 수 있다. 더불어 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머, 프로브, 또는 폴리펩티드를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일 구체 예에 있어서, 상기 활성 또는 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 단백질에 결합할 수 있는 항체, 앱타머 또는 폴리펩타이드, 상기 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체"란 항원성 부위에 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 단백질인 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 단일클론항체, 다클론항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 단일클론항체는 당해 분야에 널리 공지된 하이브리도마 방법(Kohler 및 Milstein (1976) European journal of Immunology 6:511-519), 또는 파지 항체 라이브러리(Clarkson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 다클론 항체는 상기한 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 또한, 본 발명의 항체에는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간항체 등의 특수항체도 포함된다.
본 명세서에서, 나아가, 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등을 예시할 수 있다.
이러한 항체를 이용하여 생물 시료 내의 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111 단백질의 활성 또는 발현을 측정하기 위한 방법으로는, 생물 시료에 상기 항체를 처리하여 항원-항체 복합체의 생성 정도를 확인할 수 있는 방법이라면 제한없이 사용할 수 있다. 상기 "항원-항체 복합체"란 Olfr110 또는 Olfr111단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 예를 들어, 웨스턴블롯(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip) 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 명세서에서, "앱타머"란 특정 물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA를 말한다. 앱타머는 특정 물질에 대한 친화도가 매우 높고 안정하고, 비교적 단순한 방법으로 합성할 수 있으며, 결합력을 높이기 위해 다양한 변형이 가능하고, 세포, 단백질, 및 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에, 그 특이성 및 안정성이 이미 개발되어 있는 항체에 비해 매우 높은 특징이 있다.
본 명세서의 앱타머는 Olfr110 또는 Olfr111 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 제한되지 않으며, 앱타머에 사용되는 염기는 특별한 언급이 없는 한, A, G, C, U 이들의 deoxy 형태의 염기들로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또한, 상기 앱타머는, 안정성 증진을 위하여, 5' 말단 부위, 중간 부위, 3' 말단 부위, 또는 양 말단 부위에 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민 링커, 티올 링커 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것이 결합되어 변형된 것일 수 있다. 상기 idT(inverted deoxythymidine)는 일반적으로 뉴클레아제에 대한 내성이 약한 앱타머의 뉴클레아제에 의한 분해를 막기 위하여 사용되는 분자 중 하나로서, 핵산단위체는 앞 단위체의 3'-OH와 다음 단위체의 5'-OH와 결합하여 사슬을 이루지만, idT는 앞 단위체의 3'-OH와 다음 단위체의 3'-OH를 결합하여 3'-OH가 아닌 5'-OH가 노출이 되도록 인위적인 변화를 가함으로써 뉴클레아제의 일종인 3'엑소뉴클레아제(3'exonuclease)에 의한 분해를 억제하는 효과를 일으키는 분자이다.
다른 구체 예에 있어서, 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111을 포함하는 미세아교세포를 준비한 후 상기 미세아교세포에 후보 물질을 처리하는 단계를 거친 후에, 상기 후보 물질 처리된 미세아교세포에서 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111의 활성 또는 발현이 대조군에 비해 변화한 경우, 상기 후보 물질을 미세아교세포의 활성 또는 발현 조절 물질로 선별하는 미세아교세포의 발현 또는 활성 조절 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시 예에 따르면, 미세아교세포의 준비는 E18.5 마우스 배아의 대뇌 피질에서 미세아교세포를 추출하여 배양한 후 원심분리하는 과정을 거치는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "후보 물질"이란, 미세아교세포의 활성화를 증가시키거나 감소시키는 등으로 조절할 수 있는 물질을 의미하며, 보다 구체적으로 활성화를 증가시키는 물질은 활성제 또는 작용물질(agonist)이고, 활성화를 감소시키는 물질은 경쟁적 억제제 또는 길항물질(antagonist)일 수 있다. 또한, 화합물, 천연물, 바이오 의약품(항체, 앱타머, 폴리펩티드 등) 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시 예에 따르면, 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111의 리간드 일 수 있다.
또한, 상기 후보 물질은 2-펜틸퓨란, 2-메틸퓨란, 2,3-다이메틸퓨란, 2-에틸퓨란, 2-프로필퓨란, 2-부틸퓨란, 2-t-부틸퓨란, 2-펜틸퓨란, 2-헥실퓨란, 2-헵틸퓨란 및 이들의 유도체 화합물로 이루어지는 군으로부터 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시 예에 따르면, 후보 물질의 작용은, 미세아교세포의 활성화를 증가시키거나 감소시키는 조절이며, 보다 구체적으로는 Olfr110과 2-펜틸퓨란이 상호작용하면 활성화 유전자가 상향 조절되는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "선별"이란, 여러 물질 중에서 필요한 물질을 가려내는 절차이다. 보다 구체적으로는 준비된 미세아교세포에 후보 물질을 처리할 경우, 미세아교세포의 활성화가 정상 대조군과 비교하여 증가하거나 감소되는 경우 활성 조절 물질로 선별하고, 미세아교세포의 활성화가 정상 대조군과 비교하여 변화가 없는 경우에는 선별하지 않는 것을 의미할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 스크리닝 방법은 Olfr110 또는 Olfr111과 상호작용하는 2-펜틸퓨란을 처리하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 미세아교세포에 후보 물질을 처리할 때에 Olfr110 또는 Olfr111과 상호작용하는 2-펜틸퓨란 또는 퓨란 유도체를 처리하여 상기 후보 물질을 미세아교세포의 발현 또는 활성 조절 물질로 선별하는 방법을 의미한다. 상기 방법에 따르면, Olfr110 또는 Olfr111과 2-펜틸퓨란 상호작용의 증가 또는 감소 여부를 확인할 수 있고, 대조군에 비하여 상호작용이 증가 또는 감소된 경우에 미세아교세포 활성 또는 조절 물질로 선별하는 것을 의미할 수 있다.
또 다른 양상은, 2-펜틸퓨란과 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111와의 상호작용 억제제 또는 활성제를 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환 또는 뇌수막염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은, 2-펜틸퓨란과 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111와의 상호작용 억제제 또는 활성제를 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환 또는 뇌수막염 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 용어, "예방"은 약학적 조성물의 투여에 의해 신경염증 질환 또는 뇌수막염의 발병을 지연시키거나 억제시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "치료"는 약학적 조성물의 투여에 의해 뇌수막염의 병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 그를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "개선"은, 약학적 조성물의 투여에 의해 신경염증 질환 질환의 증상을 호전시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 뇌수막염은 세균성 수막염일 수 있다.
본 발명의 "뇌수막염"은 거미막과 연질막 사이에 존재하는 거미막 밑 공간(subarachnoid space)에 염증이 발생하는 다양한 질환으로, 거미막 밑 공간에 바이러스나 세균이 침투하여 발생하는 수막염을 의미한다. 특정 화학 물질에 의한 염증, 암세포의 뇌척수액공간으로의 파종에 의해 발생하는 것도 포함한다.
일 구체 예에 있어서, 상기 뇌수막염은 세균성 뇌수막염 (bacterial meningitis)일 수 있다. 보다 구체적으로는 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae), 인플루엔자간균(Hemophilus influenzae)과 수막구균(Neisseria meningitides) 또는 단구성 리스테리아균(Listeria monocytogenes)에 의한 것일 수 있다. 바람직하게는, 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae)에 의한 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "상호작용 억제제"는, 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111와 2-펜틸퓨란의 상호작용을 저해할 수 있는 모든 물질을 포함한다. 보다 구체적으로, 길항 물질(antagonist)나 경쟁적 억제제일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "상호작용 활성제"는, 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111와 2-펜틸퓨란의 상호작용을 촉진할 수 있는 모든 물질을 포함한다. 보다 구체적으로, 작용 물질(agonist)일 수 있다.
본 발명의 일 실시 예에 따르면, 상기 상호작용은 소수성 상호작용일 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물들은 상기 2-펜틸퓨란과 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111와의 상호작용을 경쟁적으로 억제하는 것일 수 있다. 상기 후각수용체의 아미노산 잔기 Y253, F102, F104와의 2-펜틸퓨란 간의 소수성 상호작용을 경쟁적 저해제로서 작용하여 억제하는 것일 수 있다. 상기 "길항 물질(antagonist)"이란, 어떤 생체작용물질(아고니스트)의 수용체로 결합에 길항적으로 작용하지만 자신은 각 수용체를 통한 생리작용을 나타내지 않는 물질일 수 있다. 바람직하게는 어떤 약물이 다른 약물과의 병용에 의하여 그 작용의 일부 또는 전부를 감쇄시키는 역할을 하는 약제를 의미할 수 있다. 상기 "작용물질 (agonist)"은 일반적으로 수용체(receptor)를 긍정적으로 자극하는 역할을 하는 물질로서, 효능제라고도 불릴 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 상호작용 억제는 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111의 mRNA에 상보적으로 결합하는 벡터, 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA, 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)일 수 있다.
또한, 상기 상호작용 억제제 또는 활성제는 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111의 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 또는 항체일 수 있다.
본 발명에서 용어 "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.
상기 항체 또는 앱타머에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 발명의 일 실시 예에 따르면, 상기 상호작용 억제제 또는 활성제는, 2-펜틸퓨란, 2-메틸퓨란, 2,3-다이메틸퓨란, 2-에틸퓨란, 2-프로필퓨란, 2-부틸퓨란, 2-t-부틸퓨란, 2-헥실퓨란, 2-헵틸퓨란 및 이들의 유도체 화합물로 이루어지는 군으로부터 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 2-에틸퓨란일 수 있다. 또한, 화합물, 천연물, 바이오 의약품(항체, 앱타머, 폴리펩티드 등) 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시 예에 따르면, 2-에틸퓨란과 2-펜틸퓨란을 같이 처리한 실험군을 주입한 경우, 단독으로 2-펜틸페닐만 주입한 경우보다 활성 산소의 생성이 감소하였으며, 이는 농도 의존적이었다.
보다 구체적으로, 본 치료용 조성물의 예방 또는 치료는, 2-펜틸퓨란과 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111와의 상호작용 억제제 또는 활성제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여할 경우, 상기 상호작용이 억제 또는 활성화되어 미세아교세포의 활성화 신호가 상향 또는 하향 조절되지 못할 수 있다. 결과적으로 미세아교세포의 활성화가 조절되어 사이토카인 분비, 병증 행동의 감소, 대식 작용의 감소가 일어날 수 있다. 이로 인해 신경염증 질환 또는 뇌수막염이 발병하는 것을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
또한 상기 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여(경구제)하거나 비경구투여(예를 들어, 주사제로서 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 예를 들어, 피하(즉, 피부 외용제) 또는 경구(즉, 경구제) 투여일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 각종 제형에 첨가되는 완충액으로는, 등장(isotonic)으로 pH 4-9, pH 5-9의 무자극인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 다른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 하루에 체중 1 kg 당 0.1 내지 500 mg의 범위 내일 수 있고, 매일 또는 격일로 투여되거나, 1일 1 내지 5회의 범위 내로 나누어 투여될 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 그 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 건강기능식품은 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 60 중량% 이하, 바람직하게는 40 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
상기 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 추가되는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에도, 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
일 양상에 따른 미세아교세포의 후각수용체 마커 및 이의 용도에 의하면, 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111의 단백질의 활성 또는 발현수준을 측정하여 미세아교세포를 검출할 수 있고, 이를 이용하여 미세아교세포의 후각수용체 리간드를 선별할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 후각수용체와 2-PF의 상호작용 억제제 또는 활성제를 신경 염증질환 또는 뇌수막염의 치료에 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 위의 color heat map들은 각각 마우스에 폐렴구균 (104, 105, 및 106 colony-formation-units, CFU)를 3 가지의 다른 량으로 투여한 control media (Ctrl)와 culture supernatants (Sup)를 복강 내 (IP) 주사 한 후의 residence frequency를 나타내는 이미지이다. 총 거리 값은 같은 조건에서 수량화 되었다 (n = 5에서 10/condition). (P<0.05; **, P<0.01; 및 ***, P<1.0x10-3).
도 2는 미세아교세포에서의 pro- (Tnf, Il6, Il1b)와 anti-inflammatory cytokine (Il10, Il13)의 mRNA 발현양을 Sup 처치와 IP 주사한 대뇌겉질에서 측정한 것이다.
도 3은 성상세포의 pro- (Tnf, Il6, Il1b)와 anti-inflammatory cytokine (Il10, Il13)의 mRNA 발현양을 Sup 처치와 IP 주사한 대뇌겉질에서 측정한 것이다.
도 4는 4 가지의 다른 폐렴구균 투여량 (1, 10, 100, 및 1000 multiplicity of infection, MOI; n=5/condition)으로 제조된 Sup 처치한 1차 미세아교세포에서 측정된 사이토카인의 단백질량을 나타내는 이미지이다. (Tnf, IL6, IL1b). (P<0.05; **, P<0.01; 및 ***, P<1.0x10-3)
도 5는 GFP의 강도가 Ctrl- 및 Sup 처치한 상태의 미세아교세포 형태를 반영하는 대표 형광 이미지이다. 이미지는 CX3CR1GFP/+ 마우스에 Ctrl 또는 Sup의 IP 주사 후 대뇌겉질에 있는 미세아교세포를 보여준다. Scale bar: 20 um. GFP 강도는 다음의 2가지 조건에서 수량화되었다 (n=3 to 5 mice/condition).
도 6은 25분 간 1분 간격으로 측정된 Ctrl 및 Sup 처치 뒤 생성 후 축적된 O2 -의 양을 보여주는 이미지이다. Data는 Mean±SEM으로 각 시점에서 보여준다.
도 7은 Ctrl 또는 Sup으로 이주한 1차 미세아교세포를 보여주는 이미지이다. 이미지는 Boyden chamber assay를 사용해 만들었다. 주화성 지수는 이주한 미세아교세포의 (n=5/condition)의 수량화된 개수를 보여준다.
도 8은 Ctrl 또는 Sup 처리한 후 Fluorescence　activated　cell　sorting (FACS) analysis로 측정한 Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran의 1차 미세아교세포의 분포를 보여준다. 식세포작용 지수는 mean fluorescence intensities (MFIs) (n = 5/condition)를 대변한다.
도 9는 주화성 분석과 ROS 생성을 보여주는 이미지이다. (P<0.05; **, P<0.01; 및 ***, P<1.0x10-3)
도 10은 주화성 분석을 보여주며, Ctrl, Sup와 flow-through (FT) 처리한 후의 식세포작용을 보여주는 이미지이다. (P<0.05; **, P<0.01; 및 ***, P<1.0x10-3)
도 11은 mRNA-seq data에 따르면 후각수용체가 1차 미세아교세포에서 발현됨을 보여주는 이미지이다.
도 12는 Sup 처치로 유도된 후각수용체의 상대적 발현량을 보여주는 이미지이다.
도 13은 Olfr110와 Olfr111의 상대적 luciferase 활동량 (y축)은 11개의 furan analogue의 증가하는 농도로 측정되었음을 나타내는 이미지이다.
도 14는 후보 대사체에 대해 Olfr110과 Olfr111를 비교하여 상대적인 루시퍼라아제 활성을 나타내는 이미지이다.
도 15는 Olfr111의 상대적인 루시퍼라아제 활성을 나타내는 이미지이다.
도 16은 11개의 furan analogue에 대한 Olfr110과 Olfr111의 분자수용범위를 설명하는 원형지도를 보여주는 이미지이다. 중심에 위치한 유사체는 가장 반응성이 강한 유사체를 의미하고 가장 가쪽에 위치한 유사체는 가장 반응성이 약함을 의미한다.
도 17은 2-PF와 Olrf110과의 상호작용을 위한 4개의 결정적 잔기 (F102, F104, Y252, 및 Y259)를 보여주는 2-PF-Olfr110 고분자집합의 구조모델을 나타내는 이미지이다.
도 18은 증가하는 농도의 (x축) 2-PF로 측정된 wild-type Olfr110와 (범례에 표기된) 9개의 Olfr110 돌연변이들의 상대적 luciferase 활동량 (y축)을 나타내는 이미지이다.
도 19는 위의 이미지들은 MOCK, Olfr110, 혹은 Olfr111 to 2-PF을 발현하고 있는 이주한 Hana3A 세포들을 보여준다. 이미지는 Boyden chamber assay를 사용해 만들었다. 이주한 미세아교세포의 개수를 보여주는 주화성 지수는 control solvent (NT)와 2-PF at concentrations of 10, 100, 1000um (n=5/condtion)를 처치한 후 측정되었다.
도 20은 합성 2-PF, Sup, control media (Ctrl)에 대한 LC-MS/MS datasets로 부터 얻은 2-PF의 전구 이온에 (m/z = 153.091) 대해 추출된 ion chromatograms (EICs)을 나타내는 이미지이다.
도 21은 합성 2-PF 안에 있는 2-PF 전구이온과 2-PF 전구이온의 Sup. Fragmented 이온들의 MS/MS spectra를 나타내는 이미지로서 HMDB로 예측 구상된 각각에 해당하는 구조와 함께 보여진다(Wishart et al., 2007).
도 22는 102 와 104uM 2-PF를 추가로 넣은 후 Sup 안의 2-PF 전구이온에 대한 EIC를 보여주는 이미지이다.
도 23은 세포독성의 assay를 나타내는 이미지이다.
도 24는 활성산소의 assay를 나타내는 이미지이다.
도 25는 대식작용의 assay를 나타내는 이미지이다. Sup에 control media (Ctrl)의 처치와 ATP와 (본문참조) 증가하는 농도의 2-PF (0, 100, 300, 및 500 uM)를 더한 후 측정되었다.
도 26은 1차 미세아교세포와 성상세포 Olfr110의 웨스턴블랏 분석과 더불어, positive control로 사용된 후각 상피 (OE)와 후구 (OB)를 보여주는 이미지이다. Loading control로는 β-actin이 사용되었다.
도 27은 대뇌겉질에서의 (상단패널) Olfr110 (빨강)과 Iba-1 (초록)의 발현을 보여주는 co-immunostaining analysis을 나타내는 이미지이다. 미세아교세포 마커; 해마에서의 (중간패널) Olfr110 과 GFAP (초록)의 발현, 미세아교세포 마커; 대뇌피질에서의 (하단패널) Olfr110과 NeuN (초록)의 발현, 신경세포 마커. DAPI는 청색으로 나타난다. Scale bar: 50um이다.
도 28은 CX3CR1GFP/+ 대뇌겉질 속의 GFP(+)미세아교세포(초록) Olfr110 (빨강)의 발현을 보여주는 Immunostaining analysis를 나타내는 이미지이다. 좌우 패널은 저해상도와 고해상도 이미지들을 보여준다. Scale bar: 50um (좌측)과 Scale bar: 20um (우측).
도 29는 Control media (Ctrl)와 Sup (상단패널)과 더불어 PBS (Ctrl)와 2-PF (하단패널) 처치 뒤 측정한 Olfr110의 발현을 보여주는 Immunostaining analysis를 나타내는 이미지이다. Olfr110 발현량은 빨강의 강도에 따라 수량화 되었다.
도 30은 3가지 농도에서 PBS 용매와 2-PF의 IP주입 후 마우스의 거주 빈도를 각각 나타내는 열 지도이다. 총 이동 거리는 동일한 조건으로 정량화하여 막대 그래프에 표시하였다.
도 31은 2-PF의 IP 주사 후 대뇌 피질에서 측정된 염증성 사이토카인의 mRNA 발현 수준을 나타내는 그래프이다.
도 32는 컨트롤 또는 2-PF를 CX3CR1GFP/+마우스에 주입한 후의 미세아교세포의 GFP의 강도를 나타내는 형광 이미지이다. 대뇌 피질의 미세아교세포에 의해 생성되었다.
도 33은 컨트롤 혹은 2-PF 처리를 한 후에 각각 1, 16, 25, 40 및 92 분에서 대뇌피질조각을 측정하여 형성된 저속의 공 초점 현미경의 이미지이다. 미세아교세포의 부피는 초록색으로, 대식 작용 중인 돌출 부분은 화살표로 표현되었다.
도 34는 2-PF 전처리 후에 non-targeting siRNA + Mock (siCtrl), siRNA against Olfr110 + Mock (siOlfr110), 그리고 siRNA against Olfr110 + the rescue vector (Rescue)로 형질감염된 1차 미세아교세포의 염증성 사이토카인의 mRNA 표현 정도를 나타낸 그래프이다.( *, P < 0.05; **, P < 0.01; 및 ***, P < 0.001)
도 35는 배양 상등액에서 측정한 2-PF처리 후의 Tnf 및 Il6의 단백질 수준을 나타낸 그래프이다.
도 36은 2-PF 처리 후 siRNA transfection 시켰을 경우의 일차 미세아교세포에서 생성된 축척된 산소 농도의 양을 나타낸 그래프이다. 1분 간격으로 25분 동안의 측정값이 나타나 있다.
도 37은 siRNA transfection 후 FACS 분석에 의해 측정된 FITC 덱스트린 강도를 갖는 1차 미세아교세포의 분포를 나타낸 그래프이다. 도 36에서 기술한 바와 같다. 식균 지수는 정량화 된 평균 형광 강도를 나타낸다.
도 38은 세 가지 다른 농도인 10, 100, 및 1000 μM 2-PF에서의 일차 미세아교세포를 보여주는 이미지이다.
도 39는 형질감염된 미세아교세포를 보여주는 대표적인 뇌 이미지이다(노란색). 비 미세아교세포는 적색으로 표시되어 있고, 형질 감염되지 않은 미세아교세포는 녹색으로 나타나 있다. 별표로 표시된 영역은 stereotactic 주입 후 CX3CR1GFP/+ 마우스의 대뇌 피질의 부분이다.
도 40은 Olfr110과 111의 mRNA 발현 수준을 측정한 그래프이다. 각각 non-targeting siRNA + Mock + siGLO (Ctrl); Olfr110 siRNA + Mock + siGLO (siOlfr110); 혹은 Olfr110 siRNA + rescue vector + siGLO (Rescue) 주입 후 측정된 것이다. ( *, P < 0.05; **, P < 0.01; 및 ***, P < 0.001)
도 41은 CX3CR1GFP/+ 마우스의 뇌 안에서 세 타입의 세포에서의 Beads의 분포를 보여주는 이미지이다. Bead는 흰 점, 미세아교세포는 노란색 점으로 표시하고 있다. 3가지 조건하에서 3마리의 독립적인 마우스 내부의 6개의 위치에서 계수하였으며, 계수된 Beads 는 막대 그래프로 표시되었다. ( *, P < 0.05; **, P < 0.01; 및 ***, P < 0.001)
도 42는 대조군과 실험군 미세아교세포 사이의 DEGs 관계를 나타낸 이미지이다. 각각의 숫자는 DEG의 숫자를 의미한다.
도 43은 up-regulated(빨간색)과 down- regulated(초록색) 유전자의 log2-fold-changes를 보여주는 히트 맵의 이미지이다.
도 44는 2-PF 처리된 미세아교세포 안의 up-regulated 유전자로 인해 GOBPs를 풍성하게 되는 것을 보여주는 그래프이다.
도 45는 다른 농도(0, 100, 및 500 μM)의 조건에서 처리된 미세아교세포(n = 5/condition)의 cAMP 생성 농도를 나타낸 그래프이다. 각각은 SQ22536 (adenylyl cyclase inhibitor)으로 처리된 군이거나 그렇지 않은 군이다.
도 46은 동일한 농도의 2-PF로 처리한 후 1 차 미세아교세포에서 생산되는 cAMP를 나타내는 그래프이다. (n = 5 / 조건)
도 47은 미세아교세포의 내부에 증가된 칼슘 농도를 fura-2AM calcium imaging으로 측정하여 나타낸 이미지이다. 높은 농도는 빨간색으로, 낮은 농도는 녹색으로 나타내었다.
도 48은 2-PF 및 LPS 처리 후 0, 2, 5, 10, 20 및 30 분에 웨스턴 블랏 분석을 사용하여 일차 미세 신경 세포에서 측정된 인산화 ERK (pERK), p38 (pp38), JNK (pJNK) 및 Akt (pAkt)의 웨스턴블랏의 결과를 나타내는 이미지이다. β-액틴을 로딩으로 사용 하였다.
도 49는 2-PF 전처리 후 일차 아교세포에서 분비되는 Tnf와 Il6의 농도를 나타낸 것이다. adenylyl cyclase (SQ: SQ22536)로 전처리한 군과 그렇지 않은 군으로 나뉜다.
도 50은 도 49와 같은 실험 조건에서 활성 산소의 생성량을 나타내는 그래프이다.
도 51은 도 49와 같은 실험 조건에서 대식 작용의 정도를 나타내는 그래프이다.
도 52는 이동된 미세아교세포를 나타내는 이미지이며, 동시에 도 49와 같은 실험 조건에서 세포 독성을 나타내는 그래프이다. (n = 5)
도 53은 SQ22536 또는 pd98059과 사전 배양시키고 2-PF를 처리한 후 웨스턴 블롯에 의해 일차 미세아교세포에서 측정되는 ERK, phosphor-ERK (pERK), CREB, 및 phosphor-CREB (pCREB)의 양을 나타내는 그래프이다. (*, P < 0.05; **, P < 0.01; 및 ***, P < 0.001)
도 54는 x축은 300 μM의 2-PF로 동시처리된 2-EF의 농도 증가, y축은 Olfr110의 상대적 루시퍼라제 활성을 나타내는 그래프이다. (*, P < 0.05; **, P < 0.01; 및 ***, P < 1.0)
도 55는 2-EF 처리된 Sup와 처리되지 않은 Sup로 각각 처리된 1차 미세아교세포에서 발생된 활성 산소 생성의 그래프이다.(왼쪽) 또한 500 μM의 2-PF으로 동시처리된 2-EF Sup와 그렇지 않은 2-EF가 처리된 Sup로 각각 처리된 1차 미세아교세포에서 발생된 활성 산소 생성의 그래프이다.(오른쪽) (*, P < 0.05; **, P < 0.01; and ***, P < 1.0) ANOVA와 함께 Tukey post-hoc 수정법을 이용하였다.
이하 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
참고 예. 실험 재료 및 실험 준비
1. 미세아교세포와 성상세포의 배양
본 실시 예에서는 일차적으로 미세아교세포 또는 성상 세포를 E18.5 마우스 배아의 대뇌 피질에서 추출한 다음(Tamashiro et al., 2012), 실시 예 1과 같이 배양하였다. 보다 구체적으로, 마우스 배아의 피질을 수집한 다음 차가운 상등액(#14170-112; Thermo Fisher Scientific)에 저장하고 0.25% 트립신 용액(#15090-046; Thermo Fisher Scientific)에서 37도, 20분 동안 전처리 하였다. 그 후에 10% FBS(#SH30919.03; Hyclone), 2mM L-글루타민(#25030-081; Thermo Fisher Scientific), 0.04% 포도당(#G7021; Sigma Aldrich), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(#15140-122; Thermo Fisher Scientific)이 첨가된 최소 영양 배지에서 세포를 플레이팅 한 후에, 40 μm 스트레이너(#352340; Thermo Fisher Scientific)를 이용해 여과하였다. 미세아교세포는 poly-D-lysine(#P7280; Sigma Aldrich)로 도금된 T75 플라스크에 1.2 x 107 cell의 밀도로 플레이팅 하였다. 2시간 후, 상기 혼합물은 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM; #SH30243.01; Hyclone) 배지에 옮겨지고, 2주 동안 3일을 주기로 배지를 교체해 주었다. 이러한 혼합액에서 미세아교세포를 분리하기 위하여, 먼저 37도에서 150rpm으로 2시간동안 흔들어준 뒤에, 미세아교세포를 포함하는 혼합액을 상부에서 따로 추출해 옮긴 후, 실온에서 1300rpm으로 5분간 원심분리하여 미세아교세포를 분리할 수 있었다. 분리된 미세아교세포는 배양배지에 옮겼다. 미세아교세포를 옮긴 후, 남은 혼합액을 160rpm으로 1일 동안 흔들어 배양하여 미세아교세포를 완전히 제거하였다. 그 다음 0.25% 트립신을 처리하여 성상세포를 분리하고 T75 플라스크에서 4일 동안 다시 배양해 수집하였다. 수집된 미세아교세포와 성상세포의 순도는 qRT-PCR분석 및 마커 유전자와 단백질인 Iba-1 및 Gfap을 이용해 immunocytochemistry를 이용하여 평가하였다.
2. 폐렴구균 배양액으로부터 2-pentylfuran의 선별
캡슐화된 2가지 혈청형의 균주(D39 S. pneumonia, Kim et al., 2015)를 30 g의 멸균된 Todd Hewitt Broth(#249240; BD Biosciences), 0.5%의 효모 추출액 (#288620; BD Biosciences)과 함께 배양하였다. 이어서, 성장한 박테리아를 Thy broth에 옮기고, 37℃에서 24시간-48시간 동안 배양하여 108 CFU/ml의 농도가 되도록 하였다. 배양액은 4,000 x g에서 4℃를 유지하며 10분 동안 원심 분리하여 배양 상등액(Sup)을 분리하고 복강 내 주사(IP)에 사용하였다. 대사체를 포함하는 분획물을 분리하기 위하여, ultracel YM-3막을 이용하여 추가로 여과하였다.(3kDa pore, Millipore Corporation, Bedford, MA) 더불어 실험을 위하여 98% 순도의 합성 2-PF 용액을 준비한 뒤에, 동량의 메탄올을 용액에 첨가하여 혼합 용액을 만들었다.(St.Louis, MO, USA사의 용액 구입) 102 또는 104 농도의 2-pentylfuran이 Sup에 첨가되었으며, 결과물은 0.1% 의 TFA로 처리되었다.
3. 동물 모델의 준비
모든 마우스는 표준 온도 조절, 실험실 조건, 또는 착색된 터널, 미로, 등산 재료, 러닝 휠에 자유롭게 접근할 수 있는 조건 하에서, DGIST의 동물 관리 윤리 위원회의 승인을 받은 프로토콜에 따라 유지, 및 관리되었다. in vivo, ex vivo의 실험 모두에서 8-10주 사이의 BL6J 또는 이형 접합체 CX3CR1+/GFP 마우스를 이용하였다. 상기 마우스는 C57/BL6J와 CX3CR1GFP/GFP를 교차 교배하여 생성하였다 (Jung et al. 2000). 모든 마우스는 실온에서 12시간의 주기로 임의로 무균 식품과 물을 제공받았다.
4. qRT-PCR 수행 방법
mRNA의 측정을 위하여, 제조사의 프로토콜에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용해 MagNa lyser(Roche Molecular Diagnostics)를 사용하여 적혈구와 미세아교세포, 성상 세포, Hana3A 세포 또는 대뇌 피질 세포에서 RNA를 분리 하였다. 이후 분리된 mRNA를 사용하여 역전사를 통해 cDNA를 생성하였다 (PrimeScript™ 1st str및 cDNA Synthesis kit -#6110; Takara Bio Inc 이용). 이 과정은 quantitative real-time-PCR(LightCycler® 480 SYBR Green I Master 이용)을 통해 실시간으로 정량적 측정하였다. 측정값은 2-ΔΔCt method를 이용해 계산하였다.
5. Cytokine ELISA assay 수행 방법
미세아교세포로부터 분비된 Tnf, il6, Il1b 사이토카인의 발현 수준은 제조사 프로토콜을 따라서 측정되었다. 보다 구체적으로는, 2-PF 혹은 세포 상등액으로 처리한 후 24시간 후에 ELISA에 의해 측정되었다. ELISA 키트는 BD biosciences에서 구매하였다 (#DY410 for Tnf; #DY406 for Il6; #DY401 for Il1b).
6. Quantitative morphological analysis 방법
미세아교세포 활성화의 형태학적 변화를 분석하기 위하여, 9주 된 CX3CR1GFP/+ 마우스를 사용하였다. 두 마우스에게 2-PF이 포함된 IP와 포함되지 않은 IP를 각각 주입한 후, 2시간 후에 저온 절제술을 이용해 뇌 절편을 추출하였다. 40 μm두께의 뇌 조직 조각을 1 μm으로 더 작게 균일화하여 준비한 뒤에, 40배 확대 공초점 현미경을 이용하여 미세아교세포의 GFP 신호를 측정하였다. Zeiss ZEN Software (Zeiss)를 사용하여 미세아교세포의 GFP-pixel signal를 분석하였다.
7. Measurement of superoxide (O 2 - ) 농도 측정 방법
슈퍼옥사이드의 농도는 VersaMax microplate reader를 사용하여 시토크롬 c가 감소되는 정도를 측정하여 계산하였다.(Babior et al., 1973) 미세아교세포는 96 well plate에 1.0 Х 105 cells/well농도로 배양되었으며, 상기 미세아교세포는 2-펜틸퓨란, 사이토크롬 c가 존재하는 10 μM ATP 용액, 혹은 Sup를 cytochalasin B (5 μM; #C66762; Sigma Aldrich)와 섞은 용액에 의해 활성화되었다. 이에 의한 ROS의 농도는 1분 간격으로 25분 동안 550nm에서 빛 흡수의 변화를 통하여 측정되었다.
8. 세포 주화성 측정 방법
multiwell Boyden chamber를 이용하여 세포 주화성을 측정하였다. 보다 구체적으로는, PBS에 2시간 동안 10 mg/ml 피브로넥터(Sigma-Aldrich)에 의해 폴리 카보네이트 필터(8 μm pore; #101-8; Neuroprobe)를 코팅하였고, 코팅된 필터를 Boyden chamber에 설치 하였다. 또한 플레이트의 바닥 면을 2-펜틸퓨란을 함유하는 혈청 없는 DMEM 또는 배양 상등액으로 채웠다. 다음으로 미세아교세포 또는 Hana3A 세포를 후각수용체 구조에 감염시킨 후, 무혈청 DMEM에 현탁시켰다. 후에 37도에서 미세아교세포는 4시간, Hana3A 세포는 8시간동안 비치하였다. 바닥면으로 가라앉은 세포는 4% PFA로 고정시키고, 헤마톡실린으로 10분간 염색하였다. 고정된 세포는 scored eyepiece를 사용하여 무작위로 선택된 5개의 고정 자기장 (200 X)에서 광학 현미경으로 계수되었다. 화학 주화성 지수는 아무 처리되지 않은 군을 표준으로 하여 세포의 이동 수로 정의되었다.
9. 대식작용 측정 방법
1차 미세아교세포를 24-well plate (5 Х 105 cells/well) 접종 후 24시간 동안 배양하였다. 세포를 2-PF 또는 sup와 함께 30분간 예비 배양하고, 37도에서 30일동안 무 혈청 DMEM에서 FITC-dextran (1 mg/ml, PBS 안의 20 mg/ml; #FD70S; Sigma Aldrich)으로 옮겨 4도의 PBS로 세척하였다. PBS에서 0.25% 트립신 (#15090-046; Thermo Fisher Scientific)에 의해 세포를 분리하고 분리된 세포를 FACS Accuri™ C6 (BD Biosciences)로 분석 하였다. 평균 형광 강도(MFI)는 상기 소프트웨어를 사용하여 각 조건에서의 형광 히스토그램을 통합하여 계산하였다. 대식작용지수는 아무 처리되지 않은 군을 표준으로 하여 MFI로 정의되었다.
10. 활성산소 농도 측정 방법
활성산소의 농도는 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA, #D6883; Sigma Aldrich)를 사용하여 기존의 방법에서 사소한 수정을 거친 방법을 이용해 측정하였다.(Bae et al., 2001). 보다 구체적으로, 1차 미세아교세포를 24시간 동안 24-well plate (5.0 Х 105 cells/well)에서 10 μM DCF-DA로 37도의 온도에서 30분 동안 처리하였다. 하나의 플레이트는 2-PF으로 처리하였고, 하나는 그렇지 않았다. 각각의 well에 있는 세포들은 flow cytometer (FACS Accuri™ C6; BD Biosciences)으로 측정되었다. MFI는 상기 방법과 같이 측정되었다.
11. 후각수용체 클로닝 및 세포 표면 발현 측정
마우스와 인간 게놈 DNA로부터의 전체 길이의 후각수용체 유전자를 적절한 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 이로 인해 생성된 cDNA를 제한 효소로 분해한 후, 상기 기술된 바와 같이 N-terminal Lucy, Flag, 및 Rho tags를 함유하는 PME18S 표현 벡터에서 제한 효소 부위를 갖는 후각수용체 구조를 생성하기 위해 생성물을 연결시켰다. 모든 후각수용체의 구조는 서열 분석에 의해 확인되었다(Shepard et al., 2013). 그 다음 RTP1S를 가진 Hana3A 세포로 형질을 감염시키고 이전에 기술된 바와 같이 세포막에서의 위치와 존재를 확인하였다(Behrens et al., 2009; Zhuang 및 Matsunami, 2008). 이러한 형질 감염은 Lipofectamine2000(#11668-019; Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행되었다. 보다 구체적으로는, 형질 전환된 세포를 폴리 D 라이신(10 μg/ml; #P7280; Sigma Aldrich)으로 코팅된 커버슬립(#0101050; Marienfeld)상에서 성장시켰다. 그 다음 따듯한 PBS 용액으로 세척하고 얼음으로 30분간 냉각시켜 엔도시토시스를 차단시켰다. 후에 차가운 PBS로 세척한 후, 세포를 2분 동안 얼음으로 냉각된 메탄올과 아세톤으로 고정 시켰다.(v/v = 1:1) (Methanol: #106009; MERCK, Acetone: #179124; Sigma Aldrich) 그 후 세포를 실온하에 1시간 동안 정상 말 혈청(#008-000-121; Jackson ImmunoResearch)과 함께 인큐베이션 하였다. 마우스 항 로돕신(anti-Rho; 1: 1,000; #MABN15; Millipore) 혹은 토끼 항 Olfr110 (#ab177327; Abcam)을 4도에서 밤새도록 인큐베이션 시켰다. 후에 PBS로 세척한 후 Cy3-컨쥬게이티트 당나귀 항-마우스 항체 (1: 1,000; #715-165-150; Jackson ImmunoResearch), Alexa488-컨쥬게이티트 당나귀 항-마우스(1: 1,000; #715-545-150; Jackson ImmunoResearch), 혹은 Cy3-컨쥬게이티트 당나귀 항-토끼 항체(1: 1,000; #711-165-152; Jackson ImmunoResearch)를 실온에서 한 시간 동안 처리하였다. 세포를 DAPI (#H-1200; Vector Laboratories)를 포함하는 Vectashield 형과 장착 매질로 장착하였다. 이종 후각수용체의 표현은 공 초점 레이저 스캐닝 현미경 LSM700과 ZEN 소프트웨어(Zeiss)로 분석 하였다.
12. Luciferase assay 측정 방법
Dual-Glo 루시퍼라제 분석 시스템(#E2940; Promega)을 후각수용체 리간드 스크리닝에 사용하였다. 보다 구체적으로는, Hana3A 세포를 형질 전환하기 하루 전에 흰색 폴리스티렌 96-well plate(#353296; BD Biosciences)에 형질감염 하루 전에 도말하였다. 각 플레이트에 대해 pCRELuc(1 μg; #219076; Agilent Technologies), pRL-SV40(1 μg; #E2231; Promega), RTP1S(1 μg), 및 OR(6 μg; 혹은 Mock) 벡터를 24시간 동안 형질 감염시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 Lipofectamine2000 (#11668-019; Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 분석하였다. 형질 감염된 세포를 다양한 농도의 희석된 odorants을 이용하여 CD293 배지(#11913-019; Thermo Fisher Scientific) 내에서 37도, 4시간 동안 자극시켰다. 루시퍼라제의 활성은 renilla luciferase의 활성으로 정상화되었다. SpectraMax L microplate reader (Molecular Devices)을 이용하여 발광량을 측정하였다.
13. 상동성 모델링 방법
Olfr110/111의 마우스의 후각수용체 상동성 모델링은 템플레이트 검색, 유전자 시퀀스의 정렬, 모델 확정하기, 모델의 양 평가 등을 포함한다. 또한 이는 웹 기반 상동성 모델링 도구인 SWISS-MODEL을 통해 수행되었다. Olfr110/111의 아미노산 서열은 UniprotKB/Swiss-Prot database를 사용하여 NCBI Protein BLAST로부터 처음으로 수득하였다. Olfr110/111에 대한 템플레이트 검색은 SWISS-MODEL Template Library (SMTL)의 BLAST 및 HHblits를 사용하였다. 결과적으로, 179개와 186개의 템플릿을 발견할 수 있었다. Olfr110/111의 상동성 모델을 구축하기 위해 인간 아데노신 A2A 수용체 (resolution: 2.7Å, PDB ID: 3VG9)의 엑스선 결정 구조를 주형 구조로 선택하였으며, 이는 서열 동일성 및 유사성 모두에 기반한다. 3d 상동성 모델 구조는 Promod를 사용하여 생성하였다. 생성된 모델의 전체적인 평가는 QMEAN scoring 기능을 이용하였다. Olfr110/111의 최종 3D 모델 구조는 SWISS-MODEL 웹 사이트에서 다운로드되었다.
14. 수용체-리간드 분자 모델링 결합 방법
리간드의 이차원적 구조는 ChemBioDraw (ver. 11.0.1)에 의해 생성되었고, 이를 Chem3D Pro (ver. 11.0.1)로 전송하여 3차원 구조를 생성하였다. 리간드 준비 및 최적화에 이용된 과정은 SYBYL-X 2.1.1 (Tripos Inc., St. Louis)의 'Sanitiza' 프로토콜(기본값)을 사용하여 이루어졌다. Olfr110/111 (template structure PDB ID: 3VG9)의 상동성 모델은 SWISS-MODEL 상동성 모델링 도구를 이용하여 생성되었다. SYBYL-X 2.1.1의 구조 준비 도수는 단백질의 준비 과정에서도 이용되었다. 아미노산 잔기의 결손은 고쳐졌고, TRIPOS force field를 이용하여 단백질에 수소 원자가 추가로 첨가되었다. 그런 다음 POWELL 방법 (Abagyan et al., 1994)에서 초기 최적화 설정이 기본 설정에서 'none' 변화시킨 다음, 단백질 최소화 과정을 수행하였다. EHgks 중결 변화도는 0.5 kcal/(mol*Å)로 설정되었고, 최대 반복은 1000번으로 설정되었다. 다음으로 Surflex-Dock GeomX module (SYBYL-X 2.1.1)을 이용하여 상기 방법으로 준비된 단백질과 리간드를 사용해 전체 도킹 프로세스가 수행되었다. 도킹사이트는 Surflex-Dock protomol에 의해 유도되었고, 이는 이상적인 리간드의 표현형으로서, 존재하는 결합 부위와의 모든 상호작용을 나타낼 수 있음이 특징이다. 이 프로토콜은 SYBYL-X 2.1.1.의 Multi channel surface에서 가장 크게 발현되는 수용체를 공동으로 선택해 찾아내어 정의되었다. 두 가지 프로토콜의 발생 인자인 Bloat과 Thershold는 각각 0.5 (Å) 및 0으로 설정되었다. 발생되는 poses의 최대값은 20으로, 생성된 포스간의 최소 RMSD는 20으로 설정되었다. poses 사이의 RMSD의 최소값은 0.05으로 설정되었다. Surflex-dock GeomX의 다른 도킹 인자들은 기본값으로 설정되었다.
15. 구조 특이적 돌연변이 생성 방법
Olfr110 구조의 특이적 돌연변이 벡터는 PfuUltra High- Fidelity DNA polymerase (#600380; Agilent Technologies)를 사용하여 생성하였다. 모든 돌연변이 벡터 (F102W; F104W; Y252F; Y259F; F102W/F104W; Y252F/Y259F; F102W/Y252F/Y259F; F104W/Y252F/Y259F; F102W/F104W/Y252F/Y259F)의 순서는 정방향 및 역방향이다.(Macrogen).
16. 샘플 준비
합성 2-PF 용액 (98 % 이상의 순도)은 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. 동량의 absolute (99.9 %) 메탄올을 2PF의 original 용액에 첨가 하였다. 2-PF의 original 용액과 메탄올을 첨가 한 용액 (2-PF + CH3OH)을 직접 주입 질량 분광법 (direct infusion mass spectrometry)으로 분석했다. 합성 2-PF의 liquid-chromatography-tandem-mass-spectrometry (LC-MS / MS) 분석을 위해, 2-PF + CH3OH 용액을 사용 하였다. Sup 및 Control media (Ctrl)의 LC-MS / MS 분석을 위해 Sup 또는 Ctrl (1 ml)를 3 kD의 가공 크기를 갖는 ultracel YM-3 막을 통해 필터링하여 단백질을 제거했다 (Millipore Corporation, Bedford, MA). 500 μl의 flow-through을 같은 부피의 메탄올과 혼합 하였다. 생성된 샘플을 10 분 동안 초음파 (sonicated) 처리하고 4℃에서 20 분 동안 14,000g에서 원심 분리시켰다 (Lau et al., 2015). 상등액을 LC-MS / MS로 분석 하였다 (도면 3A-B). 또한 102와 104uM 농도의 2-PF가 Sup에 추가되었다. 생성된 샘플을 0.1 % TFA (trifluoroacetic acid)로 산성화시킨 후, LC-MS / MS로 분석 하였다.
17. Direct infusion with HESI source.
2-PF 및 2-PF + CH3OH 샘플을 500 μl 가스 밀폐 주사기를 사용하여 가열된 전기 분사 이온화 소스에 20 μl/분의 유속으로 주입하였다. 또한, Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap mass spectrometer의 단일 이온 모니터링 방법으로 8 분 동안 측정하였다. 더불어 모세관 전압은 3.5 kV (포지티브 모드)로 설정되었으며 솔벤트 제거 모세관의 온도는 250℃로 설정되었다. 다음으로는, 전체 MS를 70,000 (m / z 200)의 분해능으로 50 ~ 750 Thomsons (Th) 사이의 질량 범위로 모니터링했다. 최대 이온 주입 시간은 100ms이고 자동 이득 제어 값은 1x106이다. 격리 창은 1.0 m / z로 설정되었다 (Looße et al., 2015).
18. LC-MS/MS 분석법
analytical column (Thermo Scientific, Easy-Column, 75 μm Х 50 cm)과 trap column (75 μm Х 2 cm)이 장착된 Thermo EASY-nLC 1000(Thermo Scientific, Odense, Denmark)을 LC separation에 이용하였다. 이에 파라미터들은 다음과 같다: injection volume = 10μl; operation temperature of the analytical columns = 50℃; flow rate = 300 nL/min; 및 mobile phase A = 0.1% formic acid 및 mobile phase B = 0.1% formic acid 및 2% water in acetonitrile. LC separation를 위하여, 다음과 같은 농도 구배가 50분간 이용되었다. : 2% to 40% solvent B 을 36 min, 40% 내지 80% solvent B over 6 분 및 from 80% 내지 2% solvent B over 6 분. LC에서 용출된 시료는 나노 전자 분무 장치가 장착된 Q-Exactive™ hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer (Thermo Scientific)를 사용하여 분석하였다. 모세관 전압은 3.5 kV (positive mode)으로 설정되었고, 모세관의 온도는 250도로 설정되었다. 또한 Q-Exactive는 데이터 의존 모드로 설정되었고, 7만 해상도(at m/z 200)에서 50~750Th 질량 범위 스캔을 수행하였다. 실험 결과, 가장 많이 검출된 상위 10개의 이온까지 1.0m/z로 격리되었다. 또한 상기 이온들은 높은 에너지와의 충돌로 인해 조각남을 확인하였다. MS 스캔은 17,500의 해상도로 검출되었다 (Saigusa et al., 2016). 최대 이온 주입 시간은 full MS 및 MS/MS scans의 경우 각각 100ms 및 50ms였다. automated gain control target value는 full MS 및 MS/MS scans 각각에 대해 1.0Х106 및 1.0Х105으로 설정되었다.
19. Extracted ion chromatogram (EIC) 및 MS/MS spectra 측정 방법
full MS 및 MS/MS scans을 포함하는 전체 MS 스캔을 이용하여 취득한 미가공 데이터로부터 2-PF의 전구체 이온이 추출되었다(m/z = 153.091 Da) 상기 전구체 이온은 2ppm의 허용 오차 내에서 크로마토그래피 피크를 17 및 22 또는 16 및 22으로 설정하여 추출된 것이다. 각각의 스펙트럼에서 m/zf - the mass of CH3 의 피크와 상응하는 것들을 연결하였고, 결과적으로 단편화 된 피크 이온으로 후보 구조가 얻어졌다 (HMDB) (Wishart et al., 2007).
20. 웨스턴 블랏 방법
protease inhibitors (#04-693-116-001; Roche Molecular Diagnostics), DMSF(Sigma- Aldrich) 및 lysed using MagNA lyser(Roche Molecular Diagnostics)가 있는 T-PER® reagent (#78510; Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 세포와 조직을 준비한 다음 MagNA 레이저를 사용하여 용해시켰다(Roche Molecular Diagnostics). 총 단백질 추출물은 Bradford 분석법으로 정량화했다. 상기 샘플을 7.5% SDS-PAGE 혹은 4-20% gradient mini-PROTEIN TGX Precast Gels (#456-1064; Bio-Rad Laboratories)에 용해한 다음, nitrocellulose membranes (#10600002; GE Healthcare)에 블롯팅 하였다. 그 후 막을 5%의 탈지분유와 TBST, 0.1% TWEEN® 20 (#P9416; Sigma-Aldrich) 및 Tris-buffered saline에서 1시간 동안 블로킹한 다음, 4도에서 밤새 1차의 항체들과 함께 인큐베이션시켰다. 상기 항체들은 다음과 같다: Olfr110 (36 kDa; 1:1,000; #ab177327; Abcam), 항 로돕신 (39 kDa; 1:1,000; #MABN15; Millipore), CREB (43kDa; 1:1,000; #9197; Cell Signaling Technology), phospho-CREB (43 kDa; 1:1,000; #9198; Cell Signaling Technology), ERK (44 kDa; 1:1,000; #sc094; Santa Cruz), phospho-ERK (42, 44 kDa; 1:1,000; #sc-7383; Santa Cruz), phospho-Akt (60 kDa; 1:500; sc-293125; Santa Cruz), phospho-JNK (46, 54 kDa; 1:500; sc-6254; Santa Cruz), phosphor-p38 (38 kDa; 1:1,000; sc-7973; Santa Cruz), 혹은 beta- Actin (45 kDa; 1:10,000; #4967; Cell Signaling Technology). 또한, Isotype-matched horseradish 페록시다아제-컨쥬게이티드 2차 항체는 상온에서 2시간 동안 TBST중의 항-토끼(#711-035- 152; Jackson ImmunoResearch)를 1:100,000으로, 항-마우스(#715-035-150; Jackson ImmunoResearch)를 1:40,000으로 하여 사용되었다. 면역 반응성 단백질 밴드는 SuperSignal™ West Pico Chemiluminescent Substrate (#34080; Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다.
21. 면역염색법
면역 형광 염색을 위해 48시간 동안 표준 조건으로 poly-D-lysine (10 μg/ml; #P7280; Sigma Aldrich)으로 22mm 커버슬립 (#0101050; Marienfeld)을 코팅한 뒤에, 미세아교세포를 배양시켰다. 그 후 세포를 PBS로 세척하고, 4%의 파라포름알데히드 (#6148; Sigma Aldrich)에서 5분간 고정시켰다. 후에 4%의 정상 말 혈청 (#008-000-121; Jackson ImmunoResearch)과 0.1% TWEEN® 20 (#P9416; Sigma-Aldrich)를 함유하는 PBS에서 실온으로 1시간 동안 배양시켰다. 그 다음으로 세포를 나열하였던 1차 항체와 함께 4도에서 밤새 블로킹하였다. 항체는 다음과 같다: Olfr110 (rabbit-anti-Olfr110; 1:10,000; #ab177327; Abcam), Iba-1 (goat-anti-Iba-1; 1:1,000; #ab5076; Abcam), 및 GFAP (mouse-anti-GFAP; 1:1,000; #556330; BD Biosciences). 샘플은 상온에서 1시간 동안 2차 항체와 함께 0.1% TWEEN® 20 (#P9416; Sigma-Aldrich)를 포함하는 PBS 용액에서 배양되었다. 2차 항체는 다음과 같다: Cy3-컨쥬게이티트 당나귀 항-토끼 (1:1,000; #711-165-152; Jackson ImmunoResearch), Alexa488-컨쥬게이티트 당나귀 항-염소 (1:1,000; #705-545-147; Jackson ImmunoResearch), 혹은 Alexa488-컨쥬게이티트 당나귀 항-마우스 (1:1,000; #715-545-150; Jackson ImmunoResearch). 그 후 세포를 DAPI (#H-1200; Vector Laboratories)를 포함하는 Vectashield 형광 물질로 장착시킨 뒤에, 공 초점 레이저 스캐닝 현미경을 이용하고, LSM700과 ZEN 소프트웨어 (Zeiss)를 이용하여 실험의 결과물이 되는 이미지를 수득하였다.
22. 면역조직화학법
마우스를 400mg의 ketamine/kg체중의 용량을 마취시키고 경막 외로 관류시킨 다음 4%의 PBS 중의 파라포름알데이드(PFA; #6148; Sigma Aldrich)로 고정시켰다. 마우스의 뇌는 4시간 동안 4도의 4% PFA로 옮긴 뒤, 30%의 수크라아제 용액에서 1일 동안 보관하였다. 후에 O.C.T 화합물(#4583; Scigen)을 이용하여 세척한 후에 cryotome (#HM 550; Thermo Fisher Scientific)을 이용해 40 μm두께로 잘라내어 표본을 형성하였다. 상기 뇌 표본은 슬라이드에 보관되었으며, 동시에 0.3% PBST (1X PBS/0.3% Triton X-100) 안의 2% 당나귀 혈청에서 30분 동안 침지시킨 후에 4도의 blocking buffer에서 밤새도록 1차 항체들과 함께 배양되었다. 1차 항체들은 다음과 같다: rabbit anti-Olfr110; 1:10,000; #ab177327; Abcam, goat anti-Iba-1; 1:1,000; #ab5076; Abcam, mouse anti-GFAP; 1:1,000; #556330; BD Biosciences)
Knockdown 및 rescue experiment 다음 단계로, 슬라이드는 PBST안의 2차 항체들과 함께 배양되었다. 2차 항체들은 다음과 같다: Cy3- 컨쥬게이티트 당나귀 항-토끼; 1:1,000; #711-165-152; Jackson ImmunoResearch, Alexa488- 컨쥬게이티트 당나귀 항-마우스; 1:1,000; #715-545-150; Jackson ImmunoResearch, Alexa488- 컨쥬게이티트 당나귀 anti-goat (1:1,000; #705-545-147; Jackson ImmunoResearch) 다음으로, 염색 된 슬라이드들은 DAPI (#H-1200; Vector Laboratories)를 포함하는 Vectashield 형광 물질로 처리하였다. 실험의 결과물로서 수득되는 이미지는 공 초점 레이저 스캐닝 현미경 LSM700 (Zeiss)를 사용하여 20배 확대 이미지를 나타내었다.
23. Knockdown 및 rescue 실험 방법
마우스의 1차 미세아교세포는 형질감염 1일 전에 6 well plate에 위치시켰다. 이어서 1 차 미세 미세아교세포를 분화시키기 위해, 제조사의 프로토콜을 따라 Opti-MEM (# 11058021; Thermo Fisher Scientific)안에서 Lipofectamine RNAiMAX (# 13778150, Themo Fisher Scientific)를 사용하였다. 또한 100 nM의 Olfr110 siRNA (# LQ-064350-01-0002; 4 세트의 ON-TARGET + 마우스 Olfr110 siRNA; # 1 : CCUGUAAUUUAUACGCUAA; # 2 : CGUUAAGGUACUCAUUUAU; # 3 : CUGAAUGAAUUGCAGUAUU # 4 : GAUUGAUCUCAGUGCUGUA, Dharmacon) 혹은 또는 100 nM 비 표적 siRNA (UGGUUUACAUGUCGACUAA, Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 24 시간 동안 배양했다. siRNA 전달 효율은 siGLO Red oligonucleotide duplex (#D-001630-02-05, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 확인하였다. 이후 언급한 부위 지정 돌연변이 유발법을 이용하여 몇 가지 침묵 동성 돌연변이 (5'-CUCAACGAGCUGCAAUACC-3 ')를 갖는 Olfr110의 siRNA # 3 구조 벡터를 생성한 후 Olfr110 넉다운을 위해 24 시간 동안 형질 감염시켰다. 구조 벡터 실험에서, 상기 구조 벡터는 제조자의 프로토콜에 따라 LipofectamineLTX (# 15338100; Thermo Fisher Scientific)를 사용하였고, 비 표적 또는 siRNA # 3 형질 감염 세포로 24 시간 동안 형질을 감염시켰다.
24. Ex vivo knockdown 및 rescue 실험법
9주 된 CX3CR1GFP/+수컷 마우스를 케타민으로 마취시킨 후에, 작은 구멍 (~1 mm in diameter)을 두개골에 뚫고, 뇌에 접근 가능한 stereotaxic 주입을 시행하였다 (bregma -0.11 mm, 1 mm left spot from longitudinal fissure). 제조사의 프로토콜에 따라서, Lipofectamine RNAiMAX를 이용하여 Mock vector (knockdown의 경우) 혹은 rescue vector (recovery의 경우)가 존재하는 0.5 μl of siRNA (665 ng) 및 0.5 μl of siGLO Red oligonucleotide duplex (133 ng, #D-001630-02-05, Thermo Fisher Scientific)를 대뇌 피질에 주입하였다. 0.5μl/min의 속도로 헤밀턴 주사기를 이용하여 주입이 이루어졌다. 주사 후 48시간 후에, 전술된 방법 (Takayama et al., 2016)과는 약간 수정하여 생체 외 이미징 분석 방법을 수행하였다. siRNA 구조의 전달은 siGLO RED 올리고 뉴클라오타이드 이중체의 적색 형광에 의해 확인할 수 있었다. 또한 qRT-PCR을 이용하여 주사 부위에서 형질 감염의 효율성 또한 확인할 수 있었다.
25. mRNA-sequencing 및 data analysis
2 시간 동안 vehicle (대조군), Sup (MOI 100) 또는 2-PF (100μM)를 처리 한 후 RNeasy mini Kit (Qiagen, 74104)를 사용하여 2 × 106 개의 1 차 미세아교세포에서 총 RNA를 분리하고 정량 제조사의 표준 프로토콜에 따라 Qubit RNA HS 분석 키트 (Thermo Fisher Scientific, Q32852)를 사용하여 분석 하였다. Agilent Technologies 2100 BioAnalyzer를 사용하여 각 샘플의 RNA integrity number (RIN)를 측정했으며 모든 샘플의 RIN은 8.5 이상이었으며 이는 mRNA 시퀀싱에 적합하다. 제조사의 권장 프로토콜 SMARTer-Seq v4 Ultra Low input RNA Kit (Clontech, 634888)을 따라 전장 cDNA를 생성했다. cDNA의 첫번째 가닥 합성은 10 ng의 total RNA로부터 1 μl의 3 'SMART CDS primer II A를 3 분 동안 72℃에서 첨가함으로써 시작되었다. SMARTer-seq v4 oligo 및 SMARTScribe 역전사 효소를 첨가하여 두번째 가닥을 합성하고, 반응물을 42℃에서 90 분 동안 인큐베이션 한 다음, 70℃에서 10 분 동안 불활성화시켰다. 이중 가닥 cDNA를 PCR에 의해 8 사이클 동안 증폭시키고 Agencourt AMPure bead (Beckman, A63881)를 사용하여 정제 하였다. mRNA-seq library는 제조업체의 Nextera XT DNA library 준비 키트 (illumina, FC-131-1024) 권장 프로토콜을 따라 생성되었다. cDNA는 tagmentation (sequencing adaptor로 분활됨과 동시에 태깅)하고 Nextera XT DNA Index Kit (Illumina, FC-131-1001)의 Index Primers를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. PCR 후, AMPure beads를 사용하여 DNA library를 정제하고 Agilent 2100 Bioanalyzer를 사용해 품질을 평가했다. 개별 샘플의 DNA library는 KAPA library 정량 키트 (KAPA biosystems, KK4854)를 사용하여 정량화 한 다음 pooling했다. Illumina Hiseq2500 장비에서 모든 라이브러리를 시퀀싱하여 이중 인덱스된 100bp paired reads을 생성했고 각 샘플에 대해 평균 5,800 만 reads을 생성했다. FastQC (Babraham Bioinformatics)를 사용하여 raw sequences의 품질을 확인하고 cutadapter 소프트웨어를 사용하여 어댑터 시퀀스를 정리했다. 남아있는 reads는 기본 옵션과 함께 TopHat (Trapnell et al., 2009)를 사용하여 마우스 reference genome (GRCm38)에 정렬되었다. 그런 다음 정렬된 reads을 annotation이 완료된 유전자에 조립하고 Cufflinks (Trapnell et al., 2010)를 사용하여 fragments per kilobase per million mapped reads FPKM를 계산했다.
26. 분화 발현된 유전자의 선별
평균적으로 각 표본에서 5,800 만 건의 데이터가 수집되었으며 데이터의 89.9 %가 마우스의 참조 게놈에 정렬되었다. 적어도 하나의 샘플에서 FPKM> 1 인 유전자는 이전에 기술된 바와 같이 발현되는 것으로 나타났다(Graveley et al., 2011). 각각의 샘플의 FPKM 값을 모은 후에, log2로 변환된 FPKM 값에 양자 표준화 (Bolstad et al., 2003)를 적용하였다. DEG를 식별하기 위해 이러한 정규값을 이전에 보고된 통합 통계 테스트 (Lee 등, 2010)를 사용하여 다음과 같은 비교를 수행했다. 상기 비교는 Sup-treated samples과 Control을(Sup), 2-PF 처리된 샘플과 Control(2-PF)를 비교하는 것이다. 먼저 각 유전자에 대해 Student's t-test를 수행하여 T-value를 얻은 뒤에, 무작위 표본 추출 실험을 1,000 회 수행하고 이를 통해 얻은 T 값에 가우스 핵 밀도 추정을 적용하였다. T 값에 대한 경험적 널 분포를 생성했다. 또한 각 유전자에 대해, 관찰된 T- 값의 보정 P 값은 양측 검정법에 의한 경험적 분포를 사용하여 계산되었다. DEG는 보정 된 P 값이 0.05 미만이고 절대 log2-median-ratio> cutoff (Sup 대 대조군의 경우 log2 배 변화 = 0.41 및 0.54, 대조군의 경우 2 대 PF) 유전자로 확인되었다.
컷오프는 위에서 설명한 무작위 표본 추출 실험에서 얻은 log2 배 변화의 분포에서 5 번째 및 95 번째 백분위 수 값의 평균으로 결정하였다. 유전자 온톨로지 생물학적 과정 (GOBP)의 농축 분석은 DAVID 소프트웨어를 사용하여 수행되었다 (Huang da et al., 2009). 결과적으로 농축된 GOBP는 DAVID로부터 계산된 P <0.05이고 카운트는 ≥3 이었다.
27. cAMP ELISA assay
1차 미세아교세포를 48 well plate (2Х105 cells/well)에 접종하고 30분동안 30 μM forskolin (#F3917, Sigma Aldrich), 또는 2-PF (10, 100, 500 μM)으로 처리하였다. 억제제의 효과를 확인하기 위해서 1 mM of SQ22536 (#17318-31-9; Calbiochem)를 30분간 먼저 전처리하였다. 세포들을 10분 동안 0.1 M of HCl with 1% triton X 100 for 10 min 용액에서 용해시키고, 용해액을 600 Х g의 강도로 2분간 원심분리 시켰다. 상기 상층액은 직접 cAMP ELISA 키트 (Enzo Life Science)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 cAMP 분석에 사용하였다. 광학 밀도는 405 nm으로 VersaMax microplate reader (Molecular Devices)을 사용하여 분석하였다.
28. 칼슘 이미징
poly-D-lysine으로 코팅된 18 mm 구경 현미경 cover glasses (#0111580; Marienfeld)에 새롭게 분리된 미세아교세포를 위치시키고 24시간 후에, 상기 미세아교세포는 superfusion chamber에서 30분간 배양시킨다. 상기 챔버는 0.22μm 으로 여과된 Ringer's solution (115 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1.5 mM MgCl2, 4.5 mM HEPES, pH 7.4) 안에 4 μM of Fura-2/AM (Ca2+-sensitive fluorescent dye; #F1221; Thermo Fisher Scientific)가 함께 있는 것이다. 상기 칼슘 염색 배양 후에, 챔버는 반전된 현미경에 위치시키고 3-PF 처리 전에 Ringer's solution 으로 20분간 씻어내었다. 이때 상기 용액의 flow rate는 12 ml/min이다. 다음으로, 일차 미세아교세포에 300μM ATP (#A2383; Sigma Aldrich)를 5초간 처리시켰다. 후에 5분 동안 세척 후, 100μM 농도의 2-펜틸퓨란 용액으로 5초 동안 일차 미세아교세포를 처리하였다. 이 단계는 2가지 농도 (300 및 1000μM)의 2-펜틸퓨란 용액으로 진행되었다. 마지막으로, 300μM ATP용액을 5초간 처리한다. 방출된 형광 물질은 2초마다 CCD 카메라를 이용하여 촬영되었다. Pseudo-color images는 fractional fluorescence changes (ΔF/F, Δ[Ca2+]i)을 이용하여 변환되었다. 또한 이 이미지는 세포 내부의 칼슘 이온의 변화를 나타낸다. 촬영된 이미지들의 색상 강도는 최대 1.5 ± 0.1 AU (arbitrary linear units) 최소 0.4 ± 0.1 AU 로 설정되었다. 대표적은 칼슘 이온 피크는 160개 세포를 분석한 뒤에 선택되었다.
29. Chemicals 및 inhibitors
본 실험에서 사용된 화학 물질은 Sigma-Aldrich에서 구매하였다. 구매한 모든 화합물은 다음과 같다 : Acetic acid (#695092), acetone (#W332607), 2 aminoacetophenone (#W390607), dimethyl sulfide (#471577), ethanol (#E7023), hexanal (#115606), hydrogen sulfide (#742546), indole (#W259306), isopentanol (#320021), 2- pentylfuran (#W331708), trimethylamine (#W324108), furan (#185922), 2-methylfuran (#M46846), 2,3-dimethylfuran (#428469), 2-ethylfuran (#W367303), 2-propylfuran (#P1488; Tokyo Chemical Industry, TCI), 2-butylfuran (#CDS001204), 2-t-butylfuran (#386278), 2-hexylfuran (#H26698; Alfa Aesar), 및 DMSO에 희석된 2-heptylfuran (#A10604; AlfaAesar) (#D2650; Sigma Aldrich). DMSO에 희석된 ATP (#A2383; Sigma Aldrich). DMSO에 희석된 adenylyl cyclase, PKA, ERK, G, 및 PLC 경로의 억제제, 다음 농도에 따른 억제제들: pd98059 50 μM (#PHZ1164; Thermo Fisher Scientific), 300 μM SQ22536 (#568500; Calbiochem), 5 μM U73122 (#662035; Calbiochem), 10 μM H-89 (#tlrl-h89; InvivoGen), 및 10 μM Gallein(#371709; Calbiochem. 또한 각각의 억제제들은 실험 한시간 전에 전처리되었다.
30. 통계적 분석법
본 실험에서 모든 데이터들은 평균 ± SEM.으로 표시되었다. 통계적 유의성은 측정을 반복하거나 the GraphPad Prism 5 Software package (GraphPad Software Inc.)을 이용하여 respective control values를 unpaired Student's t-test 방법을 이용하였다.
실시 예 1. S.pneumoniae 에 의한 대사체들의 미세아교세포의 활성화 여부 확인
질병 행동은 과다한 사이토카인의 분비에 의해 유발되는 증상 중 하나로 알려져 있다. (Dantzer et al.,2008) 본 실험에서는 마우스의 복강 내에 S.pneumoniae 배양액을 주사 후 마우스의 이동성을 측정하여 질병 행동의 유도 여부와 반응을 확인하였다. 마우스에게서 나타나는 반응 중 섭취의 변화, 체중의 변화, 몸무게나 체온 등의 변화는 즉각적인 반응에 해당했다. 우리는 마우스의 이동성 변화량에 집중하였다. (Dantzer et al., 2008) 복강 내 주사 이후에 마우스의 이동성이 큰 폭으로 (P < 0.01) 감소하는 것을 확인했으며, 이러한 변화는 주사량에도 유의미한 의존성이 있었다 (도 1참조). 이와 대조적으로, 우리는 대조군을 복강 내에 투입한 마우스의 경우 병증 호소가 없는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 병증 호소, 질병 행동은 면역계의 과다한 사이토카인 분비에 의한 것으로서(Konsman et al., 2002), 실제 마우스의 사이토카인 분비 여부를 확인하기 위하여 대뇌 피질에서의 사이토카인 mRNA 레벨을 측정하여 비교하였다. 이 때 분석 방법으로는 quantitative real-time polymerase chain reaction(qPT-PCR)을 이용하였다. 실험군에서 복강 내 주사는 대뇌 피질에서의 염증성, 그리고 비 염증성 사이토카인의 분비를 대조군과 비교하였을 때, 모두 유의미하게(P < 1.0Х10-3) 증가한 것을 확인할 수 있었다. (도 2 참조) 감염 후의 미세아교세포와 성상세포는 각각 모두 pro와 anti 사이토카인를 분비한다고 알려져 있고,(Norden et al., 2016) 본 발명자들은 미세아교세포와 성상세포를 복강 내에 주사 한 경우, 둘 중 어느 경우에서 우선적으로 사이토카인 분비가 상승하는지를 알아보았다. 결과적으로, 다섯 개의 사이토카인의 mRNA의 분비의 유의미한(P < 1.0Х10-3) 상승이 미세아교세포에서 확인되었다. Tnf, Il6, Il1b, Il10, Il13 사이토카인이 그것으로, 이것들은 모두 미세아교세포 주입시 상승하였으나, 성상세포 주입에 의해서는 그러지 않았다.(도 3 참조) 또한 Tnf, Il6, Il1b의 증가는 또한 용량 의존적임을 확인할 수 있었다. (도 4 참조)
더불어, 미세아교세포의 활성화 시에 기존의 분열된 형태에서 아메바 형태로 형태학적 변화를 가져오며 동시에 단계의 수와 각각의 길이도 증가시킨다고 알려져 있다(Kreutzberg, 1996). 본 발명자들은 위와 같은 형태학적 변화를 확인하기 위하여 대조군과 microglia-specific tagged GFP를 이용하여 CX3CR1GFP/+ mice에서의 GFP의 강도를 비교하였다. 그 결과 GFP의 강도는 대조군과 비교하였을 때 미세아교세포가 복강 내 주사된 군에서 유의미하게(P < 1.0 Х10-3) 높은 것을 확인할 수 있었다. 이는 2-PF의 주입으로 인해 미세아교세포의 활성화가 일어나며, 이러한 활성화로 인하여 미세아교세포의 수와 길이가 증가한다는 것을 의미한다. (도 5 참조). 더불어 시간이 지날수록 미세아교세포가 활성화되며 모양이 변화하는 것을 확인할 수 있다. 이는 기존의 분열된 형태에서 아메바 형태로의 변화이다. 또한 대조군에 비해 Sup를 주입한 실험군의 미세아교세포의 GFP 강도가 유의미하게(P < 1.0 Х10-3) 높음을 알 수 있었다. 따라서 2-pentylfuran 주입 후에 미세아교세포의 활성화가 일어나고, 형태학적 변화 또한 일어난다는 결론에 이를 수 있다. (도 6 내지 8 참조).
결과적으로 S. pneumoniae에서 유래하는 소분자가 사이토카인의 분비를 증가시키며 대식작용도 증가시키며,(도 9 내지 10 참조) 미세아교세포의 형태학적 변화를 가져오는 미세아교세포 활성화를 유발한다는 것이 확인되었다.
실시 예 2. 2-pentylfuran의 미세아교세포 Olfr110와의 상호작용 여부 확인
본 발명자들은 S. pneumoniae에서 방출된 대사체가 후각수용체에 결합하여 미세아교세포의 활성화를 유도할 수 있다는 가설을 세웠다. 일차적으로 후각수용체 후보를 결정하기 위하여, 1차 미세아교세포의 mRNA sequencing 분석을 시행하였다. 이로 인해 발견된 13개의 후각수용체들은 Olfr111, Olfr110, Olfr482, Olfr99, Olfr132, Olfr115, Olfr77, Olfr543, Olfr461, Olfr455, Olfr1420, Olfr1417, 및 Olfr57으로, 이 중에서 Olfr111/110이 가장 많이 발현되는 것을 확인할 수 있었다.(도 11 참조) 또한 우리는 유전자 표현형 데이터베이스(GSE52564; (Zhang et al., 2014)를 이용하여 미세아교세포에서 발현되는 7가지의 후각수용체를 추가로 발견하였다.(Olfr110, Olfr111, Olfr99, Olfr1029, Olfr433, Olfr222, 및 Olfr920) 이러한 7가지의 후각수용체는 Olfr111/110을 포함하며, 다른 세포들과는 비교하면 미세아교세포에서 특히 발현되는 것들이다. 이러한 과정들을 통합하여 총 17개의 후보 수용체를 산출하였다.
또한 병원균과 연관된 패턴을 인지하는 많은 수용체는 효과적 면역 반응을 위해 병원균 감염에 의해 유도되기도 한다. (Wornle et al., 2006) 따라서 본 발명자들은 먼저 qRT-PCR를 이용하여 Sup처리 후 17개의 후각수용체 후보가 1차 미세아교세포로부터 유도되었는지 여부를 조사하였다. 결과적으로 우리는 Sup의 처리가 Olfr110/111을 가장 많이 증가시켰고, 그 다음으로 Olfr920, Olfr1417, Olfr99가 뒤를 이은 것을 확인할 수 있었다. (도 12 참조) 다음으로 우리는 이 5명의 후보 후각수용체가 Sup의 휘발성 분자와 반응하는 것인지 알아보았다.
미세아교세포의 mRNA-sequencing analysis를 통해, S.pneumoniae에서 유래된 11가지 휘발성 대사체를 선별하였다.(Olfr111, Olfr110, Olfr482, Olfr99, Olfr132, Olfr115, Olfr77, Olfr543, Olfr461, Olfr455, Olfr1420, Olfr1417, 및 Olfr57) 이러한 11가지 대사체를 이용하여 후보 후각수용체를 순간적으로 감염시킨 뒤 활성화되는 것을 확인한 다음에, Hana3A 세포와 함께 루시퍼라제 분석(Zhuang 및 Matsunami, 2008)을 사용하여 반응성을 확인하였다. 11가지 대사체 중에 특히 2-PF에 강한 반응성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 나머지 3가지 수용체들은 에탄올에도 높은 반응성을 보였으나, MOCK에도 반응한 것으로 보아 이는 비특이적 반응으로 보인다. 따라서 이러한 결과들은 Olfr110/111이 2-pentylfuran에 대한 선택적 리간드로 작용할 수 있다는 것을 의미한다.(도 13 참조)
2-PF-OR를 추가 평가하기 위해, 우리는 분자적으로 수용체를 분석하였다. 보다 구체적으로, 루시퍼라제 분석법을 사용하여 2-PF를 Olfr110/111로 처리한 뒤에 반응성을 비교하였다. 이러한 아날로그에는 2-PF, 2-butylfuran, 2-t-butylfuran, 2-hexylfuran, 및 2-propylfuran의 5가지 퓨란이 포함되어 있었다. 5가지 퓨란들은 Olfr110/111에 대해 모두 반응성을 보였다. (도 14 내지 16 참조). 특히 이들 중 2-PF이 가장 큰 반응성을 보였으며, 특히 Olfr110 과 가장 강한 반응성을 보여 주었다.(데이터 미도시) 우리는 Olfr110의 상동성 모델링과 Olfr110과 2-PF 간의 도킹 분석 방법을 이용하여 2-PF에 결합하는 Olfr110의 중요 잔기를 조사했다. Olfr110의 아미노산을 예측한 도킹 분석은 2-PF와 막관통영역 3의 F102, F104와 막관통영역 6의 Y252와 Y259와 같은 소수성 상호작용에 중요하다. (도 17 참조) 그 중에서도 MOR256-3에 의한 후각적 인식에 F104, Y252가 특히 중요함을 알 수 있었다. 우리는 루시퍼 라제 분석에 의해 예측된 4개의 잔기(F102, F104, Y252 및 Y259) 중 한 개, 혹은 다중의 위치지정돌연변이 유발 방법을 이용해 분석을 진행하였다. 그 결과 F104W 돌연변이의 경우, 루시퍼라제 활성을 완전히 잃어버렸는데, 이것은 F104가 2-PF와 Olfr110간의 상호작용에서 가장 중요한 역할을 수행하고 있다는 것을 나타낸다.(도 18 참조) 2-PF를 처리하고 나서, 세포 주화성 분석을 통해 Olfr110/111 처리한 세포가 농도에 비례하여 이동이 증가한다는 것을 알 수 있었다. 이러한 데이터들은 상기 2-PF와 Olfr110간의 상호작용이 세포 이동을 증가시키는 등으로 세포 기능을 변화시킬 수 있다는 것을 보여준다. (도 19 참조)
실시 예 3. 2-pentylfuran에 의한 미세아교세포의 활성화 확인
3.1. 2-PF에 의한 미세아교세포의 활성화 여부 확인
다음으로, 우리는 liquid-chromatography-tandemmass-spectrometry (LC-MS/MS)분석을 이용하여 Sup에 2-PF가 존재하는지 확인하였다. liquid-chromatography-tandemmass-spectrometry(LC-MS/MS)을 사용하여 2-PF에 관한 데이터를 얻은 다음에, 전량 대 전하 비를 이용하여 2-PF 이온 전구체를 확인하였다. (m/z = 153.091) 결과적으로 전구체 이온은 Sup 안에서는 확인되었으나, 대조군에서는 확인되지 않았다(도 20 참조). 합성 2-PF의 Sup에서 같은 MS 스펙트럼을 가지는 것 또한 확인 하였다.(도 21 참조) F102로 처리한 경우와, 104로 처리한 경우 2-PF 전구체 이온의 강도를 비교한 결과, 우리는 F104를 처리한 경우 102를 처리한 것보다 더 강도가 증가한 것(56.0배)을 확인할 수 있었다.(도 22 참조) 이러한 결과는 Sup에 2-PF가 구체적으로 존재함을 의미한다. 또한 Sup에서 2-PF가 미세아교세포 활성화를 유발하는지를 알아보기 위해, 2-PF를 100, 300, 500μM에서 처리하고 1차적으로 미세아교세포를 처리하였다. 결과적으로 미세아교세포의 농도 구배에 비례하여 유의적으로(P < 1.0 Х10-3) 세포주화성 (도 23 참조) 활성산소 분비(도 24 참조), 대식세포작용(도 25 참조)이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, 실험 마우스의 뇌에서 2-PF에 의해 유도된 대사체들에 대한 실험을 진행하였다. 미세아교세포에서 Olfr110이 발현된다는 것을 알아보았고, 항체를 이용하는 웨스턴 블랏을 이용하여 Olfr110가 미세아교세포에서 특이적으로 발현되나, 후각조직이나 성상세포에서는 그렇지 않다는 점을 확인하였다.(도 26 참조)
면역염색법(immunostaining)은 Olfr110에서 강한 발현을 확인해주지만, GFAP 양성의 성상세포(GFAP-positive astrocytes)나 대뇌 피질의 NeuN 양성 뉴런(NeuN-positive neurons in the cerebral cortex), CX3CR1GFP/+ mice의 GFP 양성의 미세아교세포(GFP (+) microglia of CX3CR1GFP/+ mice)에서는 그렇지 않았다.(도 28 참조) 대뇌 피질과 해마, 시상하부, 흑색질과 같은 다양한 대뇌 부분에서는 Iba-1-positive microglia안의 특정한 Olfr110 표현이 관찰된다. (데이터 미도시) 우리는 Sup 처리가 Olfr110의 mRNA발현 수준을 유도하였고(도 21 참조), Olfr110의 단백질 수준을 증가시켰다는 것을 보여주었다(도 29 참조, top image). 흥미롭게도 2-PF는 유의하게(P < 1.0Х10-3) Olfr110의 수준을 증가시켰다. (도 29 참조, bottom image) 2-PF 주입에 의해 유발된 병증 행동은 농도에 비례하게 마우스의 이동도가 감소되는 모습을 보여주었다. (도 30 참조) 2-Pf의 주입은 또한 염증성 사이토카인의 발현 수준을 유의미하게(P < 0.05) 증가시켰다.(Tnf, Il6, Il1b, 및 Il10) (Figure 3L) 또한 2-PF treated CX3CR1GFP/+ mice의 GFP 발현 강도 또한 매우 올려 놓았다.(도 32 참조) 이러한 결과들은 2-PF에 유도된 미세아교세포의 형태학적 변화가 미세아교세포의 활성화로 이어질 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 2-PF가 CX3CR1GFP/+ 마우스의 뇌 조각에서 2-PF 배양 후에 미세아교세포의 체외 대식세포활동을 변화시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. Time-lapse confocal microscopy imaging를 통해 미세아교세포의 용량, 돌출 정도, 식세포 작용의 활성 정도가 증가하는 것을 알 수 있었다(도 33 참조; 대식세포가 현저하게(P < 1.0Х10-3) 증가할수록, 식균 작용(도 22 참조) 또한 증가하는 것을 볼 수 있었다. 종합하여 보면, 이러한 데이터들은 2-PF가 뇌에서 미세아교세포를 활성화시킨다는 결론에 도달한다.
3.2. 질병 행동의 증가 실험
미세아교세포의 활성화에 의한 질병 행동의 증가는 분비되는 사이토카인의 증가 때문으로 알려져 있다. 사이토카인의 증가와 함께 질병 행동의 증가를 확인하기 위하여 본 실험이 진행되었다. 질병 행동의 평가는 상기 마우스에 Sup 또는 2-PF의 IP 주입 후에 이루어졌다.
IP 주입 후에, 네 면이 뚫린 공간 (40 Х 40 Х 40 cm, white field, black wall)에 마우스를 위치시키고 30분 동안 카메라를 사용하여 마우스의 위치를 기록한 후 이동 거리를 계산하였다. 그 후에 EthoVision XT(Noldus, Netherlands)를 이용해 pseudo-color heat map으로 작성하였다.
3.3. Ex vivo 에서의 대식작용의 증가 실험
본 실험에서는 미세아교세포의 대식 작용을 살피기 위하여, 9주 된 수컷 CX3CR1GFP/+ 마우스의 뇌를 vibratome(Leica VT1200)을 이용하여 150 μm두께로 잘라낸 다음 빙냉된 인공 뇌척수액(aCSF: 120mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 305mOsm glucose, pH7.4)에 보관하였다. 후에 슬라이스 된 뇌를 세포 파편의 제거를 위해 배양시켰다. 산소 처리된 aCSF를 37도에서 2시간 동안 perfusion chamber에서 전처리하였다. 이어서, 배양 전에 9.10 × 107 microspheres(360 / 407mm; # 17458; Polysciences)를 포함하는 500 μl의 aCSF와 함께 배양하고 맞춤형 나일론 그리드로 덮었다. 공 초점 현미경을 사용하여 92분 동안 1분의 간격으로 Time lapse 동영상을 촬영하였다. 식세포 작용을 하는 미세아교세포의 수를 이미지로부터 계산하였다.
실시 예 4. Olfr110의 2-PF에 의한 미세아교세포의 활성화 조절 가부
본 발명자들은 2-PF에 의해 유도되는 미세아교세포의 활성화가 Olfr110에 의해 중개되는지 실험하였다. 실험에서, Olfr110에 대한 특정 siRNA와 siRNA를 회복시키는 Olfr110의 특이적 돌연변이 벡터 구조를 설계하였다. 4개의 siRNA 후보 중 3번이 Hama3A 세포에서 Olfr110의 mRNA와 단백질 수준을 효과적으로 감소시킬 수 있었다. 형질 감염 후, 우리는 1차적 미세아교세포에서 mRNA와 단백질의 감소를 관찰할 수 있었는데, 구조 벡터는 siRNA에 의해 유발된 mRNA와 단백질의 감소를 회복시켰다. 이 siRNA 와 구조 벡터를 이용하여 우리는 Olfr110이 2-PF 유발성 미세아교세포 활성화에 미치는 영향을 확인할 수 있었다. 첫째로, Olfr110의 무력화는 2-PF에 의해 유도된 일차 미세아교세포의 염증성 사이토카인 mRNA 수준의 증가를 감소시켰고, 반대로 구조 벡터는 이러한 무력화에 의한 효과를 회복시켰다. 또한 우리는 mRNA 뿐 아니라 단백질 수준에서도 비슷한 효과를 관찰할 수 있었다. 2-PF에 의해 유도되어 증가된 활성 산소는 siRNA에 의해 감소되었고, 구조 벡터에 의해 다시 재건되었다. 하지만 P2Y 수용체에 의해 중개되는 활성 산고의 증가는 구조 벡터의 존재에 의해 영향을 받지 않았다. 우리는 Olfr110 knockdown 및 rescue effects후, 대식작용과 세포 주화성에서도 2-PF에 의한 비슷한 현상을 관찰할 수 있었다.
다음으로, 본 발명자들은 Olfr110 knockdown 및 rescue 효과가 마우스 두뇌에서 발생하였는지를 조사하였다. 보다 구체적으로, CX3CR1GFP/+ 마우스의 대뇌 피질에 non-targeting siRNA + Mock + siGLO (Ctrl의 경우), Olfr110 siRNA + Mock + siGLO (siOlfr110), 및 Olfr110 siRNA + rescue vector + siGLO (Rescue의 경우)와 같은 조합을 stereotactic 주입하였다(Takayama et al., 2016). 주입 후 마우스의 뇌 슬라이스에서 감염된 미세아교세포(노란색)과 감염되지 않은 미세아교세포(녹색) 및 감염된 비 미세아교세포(빨강)을 비교하여 관찰하였다.(도 39 참조) 슬라이스 된 뇌 조각에서 형광 부분을 microdissect한 후에, qRT-PCR을 이용하여 Olfr110의 발현 수준을 측정하였다. 결과적으로, siOlfr110 주사 후 해당 후각수용체의 유의적인 (P < 1.0Х10-3) 감소를 발견했으며 동시에 음성 대조군인 Olfr920의 경우에 이러한 변화가 없는 것을 관찰할 수 있었다. 실험자들은 CX3CR1GFP/+ 마우스의 대뇌 피질에서도 비슷한 knockdown 및 rescue 효과를 관찰할 수 있었다. 종합해 보면, in vitro와 ex vivo 모두에서 Olfr110은 2-PF에 의해 유도된 미세아교세포의 활성화(사이토카인 분비, 활성산소의 분비, 세포독성, 대식작용)을 조절할 수 있다는 결론이 나온다.
실시 예 5. 2-PF에 의해 유도되는 Olfr110 의존적 미세아교세포 활성화의 G αs -s-cAMP-PKAERK 및 G βγ --PLC-Ca 2+ pathways 경로에 의한 조절 가부
Olfr110을 통한 미세아교세포 활성화를 분자적 관점에서 이해하기 위하여, 본 실험에서는 Sup 또는 2-PF으로 처리한 일차 미세아교세포의 mRNA-시퀀스 분석을 수행하였다. 우리는 mRNA 시퀀싱 데이터를 사용하여 각각 1124, 1438개의 표현된 유전자(DEGs)를 확인할 수 있었다(도 42 참조). 이러한 (DEGs)의 유의미한 부분은(P < 0.01), 253개의 유전자 부분이며, 본 실험에서 253개의 유전자가(22.5 및 17.6% of 1124 및 1438 DEGs) 두 실험군 사이에서 공유되는 것을 확인하였다. 253개의 공유 DEG 중에서 135 및 78개의 유전자가 2-PF 처리된 미세아교세포에서 각각 일정하게 up-regulated 혹은 down regulated 되는 형상을 보였으나 나머지 40개의 유전자는 그렇지 않았다(도 43 참조). 다음으로 gene ontology biological processes(GOBPs) 분석 방법을 이용하여 위와 아래로 중첩되는 이러한 중복 유전자와 관련한 조사를 수행하였다. up-regulated되는 유전자들은 미세아교세포 활성과 관련이 있었다. 활성화의 구체적인 내용은 다음과 같다(도 44 참조): 사이토카인 분비 (사이토카인 생성 및 분비), 세포주화성(혈액세포 이동 및 주화성), 활성산소 생성 (활성산소 및 활성산소 대사 과정에 대한 세포 반응) 및 대식작용이다. 이러한 데이터들은 Sup와 2-PF 처리한 실험군 모두 미세아교세포의 활성화에 조절하는 유전자를 up-regulated 함으로서 활성화를 유도하는 반면, down-regulated 유전자는 전사를 조절한다는 것을 의미한다(데이터 미도시). 결과적으로 Olfr110에 대한 2-PF의 결합이 미세아교세포 활성화에 관여하며, 이로 인해 up-regulated를 유도하는 신호 전달 경로가 활성화된다는 사실을 확인할 수 있었다. 이러한 신호 전달 체계를 이해하기 위해서, 우리는 사이토카인 생성, 주화성, 활성산소 생성 및 대식작용과 관련된 신호 전달 체계의 상호 작용을 설명하는 네트워크 모델을 재구성할 필요가 있었다(데이터 미도시). 새롭게 정립된 모델은, cAMP, MAPK, PI3K, PLC, 및 Ca2+ 의 신호 전달 경로가 미세아교세포의 활성화에 관여하는 유전자를 up-regulated함을 확인하였고 이는 이전 연구 결과들과 일치하였다(Verderio 및 Matteoli, 2001).
다음으로 우리는 정립된 네트워크 모델을 이용하여 2-PF의 효과에 대해 실험하였다. cAMP 신호 전달 경로의 경우, 2-PF 처리 후 1차 미세아교세포에서 cAMP 농도를 측정하였다. 결과적으로 adenylyl cyclase 억제제에 의해 처리된 cAMP의 경우 2-PF 처리에 의해 미세아교세포의 활성화가 증가되었음이 확인되었으며, 이는 농도 의존적이었다(도 45 참조). Olfr110의 siRNA를 이용하면 2-PF에 유도되는 cAMP의 생산을 감소시킬 수 있었고, 구조 벡터를 주입할 경우 반대의 효과를 얻을 수 있었다(도 46 참조). 칼슘 신호 경로의 경우, 2-PF 처리 후에 칼슘 이미징을 수행하였다. 결과적으로 세포 내의 칼슘 이온의 농도가 주입량에 따라 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 47 참조). MAPK 및 PI3K 신호 전달 경로에 대해서, 우리는 ERK, p38, JNK, 및 Akt의 인산화 수준을 측정하였고, 처리 후 인산화 수준이 2분부터 증가하고 20분에서 멈추는 것을 확인할 수 있었다. 다음으로 이러한 신호 전달 경로의 억제제를 이용하여 미세아교세포의 활성화에 대한 상대적 기여도를 조사하였다. adenylyl cyclase (SQ22536), PKA (H-89), ERK (pd98059), 혹은 PLC 억제제 (U73122)로 전처리한 후에, 2-PF 단백질을 처리 하고 Tnf 및 Il6 cytokine의 농도를 측정하였다. 결과적으로 SQ22536 혹은 H-89에 의해서는 큰 감소를 pd98059 혹은 U73122에 의해서는 상대적으로 작은 감소를 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 49 참조). 특히 U73122는 ROS의 생성을 완전히 (P < 1.0Х10-3) 억제하였다(도 50 참조). 우리는 활성산소생성이 Gαss-cAMP-PKAERK 및 Gβγ-PLC-Ca2+ 경로의 억제제인 gallein에 의해서도 유사하게 억제됨을 확인할 수 있었다. (Bonacci et al., 2006; Ukhanov et al., 2011) 모든 저해제는 대식작용을 현저하게 감소(P < 0.05)시켰고 거의 완전히(P < 1.0Х10-3) 세포주화성을 감소시켰다. CREB 및 ERK의 인산화는 SQ22536 및 pd98059에 의해 크게 감소되었다(도 53 참조). 본 연구는 Gαs-cAMP-PKA-ERK 경로가 사이트카인의 생산, 세포독성, 및 대식작용을 조절하는 반면, Gβγ-PLC-Ca2+ 경로는 ROS 생성을 조절한다는 것을 보여준다.
실시 예 6. 2-PF의 경쟁적 억제제의 선별
이전 연구에 의해 후각수용체의 경우 활성제와 억제제가 구조적으로 관련이 있다는 보고가 있었다. 이를 바탕으로 본 발명자들은 2-PF과 유도체 중에서 Olfr110과 Olfr1111과 결합하지 않는 유도체들(2-메틸퓨란, 2,3-다이메틸퓨란, 2-에틸퓨란, 2-헥실퓨란, 또는 2-헵틸퓨란)을 동시에 처리하여 2-PF의 활성을 감소시키는 2-에틸퓨란 (2-ethylfuran, 2-EF)을 선별 하였다. Hana3A 세포에 Olfr110를 transfection한 이후 2-PF를 300 μM로 고정하고 2-EF를 1 μM ~10mM까지 각각 다른 농도로 2-PF와 같이 처리하여 경쟁적 활성을 측정하였고, 2-EF의 농도가 증가할수록 2-PF의 활성이 감소되는 것을 확인하였다(Kd=120 μM). 결과적으로, Olfr110의 agonist인 2-PF가 유도시킨 활성 산소는 그 경쟁적 억제제 (competitive inhibitor, antagonist)인 2-EF에 의해 감소된다.(도 54 참조) 경쟁적 억제제로 선별된 2-EF의 미세아교세포 활성을 확인 하기 위하여 일차 미세아교세포에 2-EF의 농도를 0, 100, 300, 및 500μM으로 전 처리하고 100 MOI의 Sup를 처리하고 활성 산소의 생성량을 측정하였다. 결과적으로, 100의 MOI에 의해 생성된 활성산소는 2-EF의 농도가 증가할수록 생성된 활성 산소의 양이 적어지는 것을 관찰할 수 있었다(도 55 왼쪽 참조). 다음으로, Sup에 5 의 MOI를 처리하고 동시에 2-PF를 500 μM 처리 후, 2-에틸퓨란의 농도를 0, 100, 300, 및 500μM로 동시에 처리하였다. 후에 활성 산소의 농도를 측정하였다. 그 결과, MOI 5 에 의해 활성산소가 생성되었고, 더불어 500 μM의 2-PF에 의해 활성산소의 생성이 더 증가 되었다(도 55 오른쪽 참조). 하지만 첨가된 2-EF의 농도가 높을수록 생성된 활성산소의 농도가 낮음을 확인할 수 있었다. 이는 활성산소가 경제적 억제제인 2-EF에 의해 억제된 결과를 얻었다는 것을 의미한다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 의하면, 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111의 단백질의 활성 수준 또는 단백질의 발현 여부를 측정함으로써 미세아교세포를 검출할 수 있고, 이를 이용해 미세아교세포의 후각수용체 리간드를 선별할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 후각수용체와 2-PF의 상호작용 억제제 또는 활성제를 신경 염증질환 또는 뇌수막염의 치료에 사용할 수 있는바, 본 발명은 기초 연구분야 및 임상에서 미세아교세포를 검출하고 이의 리간드를 선별하여 관련 연구를 진행하는데 활용될 수 있으며, 나아가 상기 억제제 또는 활성제는 신경 염증질환 또는 뇌수막염의 치료제 개발 분야에서 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Claims (20)

  1. 후각수용체 Olfr110(odorant receptor 110) 또는 Olfr111(odorant receptor 111)의 활성 또는 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 미세아교세포 검출용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 활성 또는 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 항체, 앱타머 또는 폴리펩티드인 것인, 미세아교세포 검출용 조성물.
  3. 미세아교세포에서 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111 수용체의 활성 또는 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 미세아교세포의 활성 또는 발현 수준을 검출하는 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 활성 수준을 측정할 수 있는 제제는 항체, 앱타머 또는 폴리펩티드인 것인, 미세아교세포의 활성 또는 발현 수준을 검출하는 방법.
  5. 후각수용체 Olfr110(odorant receptor 110) 또는 Olfr111(odorant receptor 111)을 발현하는 미세아교세포를 준비하는 단계;
    상기 미세아교세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    상기 후보 물질 처리된 미세아교세포에서 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111의 활성 또는 발현이 대조군에 비해 변화한 경우 후보 물질을 미세아교세포의 활성 또는 발현 조절 물질로 선별하는 단계를 포함하는, 미세아교세포의 활성 또는 발현 조절 물질 스크리닝 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 후보 물질을 처리하는 단계에 미세아교세포의 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111과 상호작용하는 2-펜틸퓨란을 더 처리하는 단계; 및 상기 후보 물질 및 2-펜틸퓨란 처리된 미세아교세포에서 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111와 2-펜틸퓨란의 상호작용을 대조군에 비해 변화시킨 후보 물질을 미세아교세포의 활성 조절 물질로 선별하는 단계를 추가적으로 포함하는, 스크리닝 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 미세아교세포의 활성 조절 물질은 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111의 리간드인 것인, 스크리닝 방법.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 후보 물질은 2-펜틸퓨란, 2-메틸퓨란, 2,3-다이메틸퓨란, 2-에틸퓨란, 2-프로필퓨란, 2-부틸퓨란, 2-t-부틸퓨란, 2-헥실퓨란, 2-헵틸퓨란 및 이들의 유도체 화합물로 이루어지는 군으로부터 하나 이상을 포함하는 것인, 스크리닝 방법.
  9. 2-펜틸퓨란과 후각수용체 Olfr110(odorant receptor 110) 또는 Olfr111(odorant receptor 111)와의 상호작용 억제제 또는 활성제를 유효성분으로 포함하는, 신경염증 질환 또는 뇌수막염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 뇌수막염은 세균성 뇌수막염인 것인, 약학적 조성물.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 상호작용 억제제는 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA, 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)를 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 상호작용 억제제 또는 활성제는 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111의 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 또는 항체를 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  13. 청구항 9에 있어서, 상기 2-펜틸퓨란과 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111의 상호작용 억제제 또는 활성제는 2-메틸퓨란, 2,3-다이메틸퓨란, 2-에틸퓨란, 2-프로필퓨란, 2-부틸퓨란, 2-t-부틸퓨란, 2-헥실퓨란, 2-헵틸퓨란 및 이들의 유도체 화합물로 이루어지는 군으로부터 하나 이상을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  14. 2-펜틸퓨란과 후각수용체 Olfr110(odorant receptor 110) 또는 Olfr111(odorant receptor 111)와의 상호작용 억제제 또는 활성제를 유효성분으로 포함하는, 신경염증 질환 또는 뇌수막염의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 뇌수막염은 세균성 뇌수막염인 것인, 건강기능식품.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 상호작용 억제제는 상기 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA, 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)를 포함하는 것인, 건강기능식품.
  17. 청구항 14에 있어서, 상기 상호작용 억제제 또는 활성제는 후각수용체 Olfr110 또는 Olfr111의 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 또는 항체를 포함하는 것인, 건강기능식품.
  18. 청구항 14에 있어서, 상기 상호작용 억제제 또는 활성제는 2-메틸퓨란, 2,3-다이메틸퓨란, 2-에틸퓨란, 2-프로필퓨란, 2-부틸퓨란, 2-t-부틸퓨란, 2-헥실퓨란, 2-헵틸퓨란 및 이들의 유도체 화합물로 이루어지는 군으로부터 하나 이상을 포함하는 것인, 건강기능식품.
  19. 2-펜틸퓨란과 후각수용체 Olfr110(odorant receptor 110) 또는 Olfr111(odorant receptor 111)와의 상호작용 억제제 또는 활성제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경염증 질환 또는 뇌수막염의 예방 또는 치료방법.
  20. 2-펜틸퓨란과 후각수용체 Olfr110(odorant receptor 110) 또는 Olfr111(odorant receptor 111)와의 상호작용 억제제 또는 활성제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의, 신경염증 질환 또는 뇌수막염의 예방 또는 치료용도.
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