KR101875788B1 - 뇌염증 진단용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

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한국과학기술연구원
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Abstract

본원은 뇌염증 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이며, 더욱 구체적으로는 뇌세포에서 TonEBP의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 뇌염증 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 뇌세포에서 TonEBP의 발현을 검출함으로써 뇌염증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

Description

뇌염증 진단용 바이오마커 및 이의 용도{BIOMARKER FOR DIAGNOSING NEUROINFLAMMATION AND USE THEREOF}
본원은 뇌염증 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이며, 더욱 구체적으로는 뇌세포에서 TonEBP의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 뇌염증 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 뇌세포에서 TonEBP의 발현을 검출함으로써 뇌염증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
미세아교세포는 신경교세포의 일종으로 뇌에서 식세포 역할을 담당하여, 중추신경계에서 주변 환경을 탐색하고 감염원들에 대응하는 일차적인 방어 체계를 수립하는 역할을 수행하는 세포이다. 외부로부터의 유해한 자극을 감지하여 미세아교세포가 활성화되면 미세아교세포에서는 다양한 염증 유도 물질들이 분비되고, 활성 분자들을 생성하는 데 필요한 각종 효소가 발현되는 등 일련의 염증성 반응이 일어난다. 근본적으로, 중추신경계의 면역 시스템은 감염과 조직 손상으로부터 중추신경계를 보호하기 위하여 작동하지만, 장기간 동안 염증 반응이 지속되어 만성이 되면 미세아교세포가 과다하게 활성화되어 신경 독소 및 염증성 사이토카인 등의 분비가 증가하고, 결과적으로 각종 신경퇴행성 질환의 원인이 되기도 한다. 그러므로, 중추신경계 염증의 표지자 (마커)를 동정하고, 그 조절 기전을 이해하는 것이 매우 중요하다.
활성화된 T-세포의 핵 인자(nuclear factor of activated T-cells 5, NFAT5)로도 알려져 있는 TonEBP(tonicity-responsive enhancer (TonE) binding protein, 긴장성-반응 증강인자 결합 단백질)은 긴장성 [tonicity, 緊張性]의 변화에 의하여 그 발현 정도와 활성이 조절되는 전사인자(transcription factor)로서, 체내 삼투압 변화시 (특히 고장성 환경) 세포의 항상성 조절 및 생존에 매우 중요한 역할을 한다는 것이 알려져 있었다. 이러한 TonEBP는 고장성 환경에서 발현이 유도되고 핵 안으로 이동하여 전사 인자로서의 활성이 촉진되고 여러 유전자 발현을 증진시켜 고장성 환경에 저항성을 부여함으로써 세포의 생존과 항상성 유지에 결정적 역할을 담당한다. 그러나, TonEBP의 뇌 내에서의 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없으며, 다만 쥐의 경우 TonEBP는 정상적인 뇌에서 평상시에 주로 신경세포에서 발현되고 고장성 환경이 되면 신경세포의 핵에서 그 발현 정도가 증가하는 것으로 알려져 있었다. 항 TonEBP 항체를 사용한 면역조직화학검사에 의해 교세포 중 별아교세포와 희돌기교세포에서도 극히 일부에서 극소량의 TonEBP 발현이 보고된 바 있으나, 고장성 수크로스 용액을 복강 내에 주사하여 고장성 환경을 유도한 경우 신경세포에서와는 달리 별아교세포와 희돌기교세포에서 TonEBP의 발현이 증가하지 않았다. 한편, 또 다른 교세포인 미세아교세포에서는 현재까지 생리적 및 병리적 조건을 포함한 어떤 조건에서도 TonEBP의 발현은 보고된 바가 없다.
대한민국 등록특허 제 10-1370722 호
본원에서는 다양한 염증 신호들에 의하여 미세아교세포에서 특이적으로 TonEBP가 발현된다는 것을 최초로 발견하여, TonEBP를 뇌염증 진단용 바이오마커로서 사용할 수 있음을 확인하였다. 구체적으로는, 국소 정위주사법을 통해 쥐 중뇌의 흑질 (substantia nigra, SN) 내로 염증을 유도하는 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)를 주입하면 미세아교세포에서 TonEBP의 발현이 증가되는 반면 신경세포와 별아교세포에서는 변화가 없음을 발견하였다. 또한, 1차 체외 배양 미세아교세포에서도 LPS에 의하여 TonEBP의 발현이 증가하였음을 발견하였고, 인터페론 감마(interferon-g)와 인터루킨-4(interleukin-4)와 같은 다른 염증 활성제에 의해서도 TonEBP의 발현이 증가함을 발견하였다. 이에, 미세아교세포 내에서 발현되는 TonEBP를 신경 염증의 신규한 마커로서 적용하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 뇌세포에서 TonEBP(tonicity responsive enhancer binding protein)의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 뇌염증 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 뇌염증 진단용 조성물을 포함하는 뇌염증 진단용 키트를 제공할 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 뇌염증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 뇌 생검 시료 또는 뇌척수액 시료로부터 TonEBP의 발현을 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.
본원에서는, TonEBP는 긴장성의 변화에 의하여 그 발현 정도와 활성이 조절되는 전사인자임에 불구하고, 긴장성과는 무관하게 다양한 뇌염증 신호에 의하여 뇌세포 중 미세아교세포(microglia)에서 특이적으로 발현이 증가함을 최초로 발견하여 이를 뇌염증의 바이오마커로 적용하고자 하였다. 래트로부터 채취하여 체외 배양한 미세아교세포에 지질다당류 (lipopolysaccharide, LPS), 인터페론-감마 (interferon-g) 및 인터루킨 4 (interleukin , IL4) 등의 염증 유도 물질을 처리하면, 다양한 염증 신호에 의하여 상기 미세아교세포로부터 공통적으로 TonEBP가 발현된다. 또한, 생체 실험을 통하여 쥐의 대뇌 흑질 (substantia nigra) 부위에 LPS를 국소주입 (stereotaxic injection) 하면 뇌 내 미세아교세포에서 특이적으로 TonEBP 발현이 증가한다. 이러한 발견으로부터, 본원은 마세아교세포에서의 TonEBP 발현을 뇌염증 바이오마커로 제공하고자 한다.
도 1a 내지 도 1e는 본원의 일 실시예에 따라 LPS에 의해 유도되는 쥐 뇌염증 동물 모델 미세아교세포 내 TonEBP 발현 증가 여부를 분석한 결과이다.
도 2a 내지 도 2e는 본원의 일 실시예에 따라 1차 배양 미세아교세포에서 LPS에 의한 TonEBP의 발현 증가 여부를 분석한 결과이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 LPS 와 NaCl 처리에 따른 면역중재작용 및 삼투중재작용 관련 유전자의 발현량을 분석한 결과이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따라 LPS 이외의 다른 염증 신호에 의한 미세아교세포에서의 TonEBP의 발현 증가 여부를 분석한 결과이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.
본원에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본원의 목적상, 진단은 뇌염증의 존재 여부를 확인하거나, 나아가 뇌염증의 진행 여부 또는 심화 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다.
본원에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility) 을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함할 수 있다.
이하, 본원의 뇌염증 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 뇌염증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 TonEBP의 발현을 검출하는 방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 1 측면은, 뇌세포에서 TonEBP(tonicity responsive enhancer binding protein)의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 뇌염증 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 뇌염증 진단용 조성물은 미세아교세포(microglia)에서의 TonEBP 발현 수준을 측정하기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 뇌염증 진단용 조성물은 상기 미세아교세포의 핵 및 세포질 중 하나 이상에서의 TonEBP 발현 수준을 측정하기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 TonEBP의 발현 수준을 측정하기 위한 제제는 TonEBP에 특이적인 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원에서, "항체"란 항원성 부위에 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본원의 목적상, 항체는 상기 마커 단백질인 TonEBP에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다.
상기 모노클로날 항체는 당해 분야에 널리 공지된 하이브리도마 방법, 또는 파지 항체 라이브러리기술을 이용하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 폴리클로날 항체는 상기한 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 것을 포함하는, 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 폴리클로날 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
또한, 본원의 항체에는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간항체 등의 특수항체도 포함될 수 있다.
나아가, 본원에서 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
이러한 항체를 이용하여 시료 내 TonEBP의 발현 수준을 측정하기 위한 방법으로는, 시료에 상기 항체를 처리하여 항원-항체 복합체의 생성 정도를 확인할 수 있는 방법이라면 제한없이 사용할 수 있다.
상기 "항원-항체 복합체"란 TonEBP 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
상기 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
상기 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 TonEBP의 발현 수준을 측정하기 위한 제제는 TonEBP에 특이적인 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 뇌염증 진단용 조성물을 포함하는 뇌염증 진단용 키트를 제공할 수 있다.
본원의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 키트는 환자 시료 내 TonEBP의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제 뿐만 아니라, 발현 수준 분석에 적합한 한 종류 이상의 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 검출 라벨로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
구체적인 일례로, 상기 뇌염증 진단용 키트는 ELISA 키트, 샌드위치 ELISA등 다양한 ELISA 방법을 구현하기 위하여, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. 이러한 ELISA 키트는 상기 단백질들에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 TonEBP 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 재조합 항체일 수 있다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
이 외에도, 상기 키트는 웨스턴 블롯, 면역침전분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석, 또는 단백질 칩 등을 구현하기 위한 키트일 수 있으며, 각 분석 방법에 적합한 부가적인 구성을 추가로 포함할 수 있다. 이 분석 방법들을 통하여, 항원-항체 복합체 형성량을 비교함으로써 뇌염증을 진단할 수 있다.
또 하나의 구현예로서, 상기 키트는 상기 뇌염증 진단용 조성물을 포함하는 뇌염증 진단용 단백질 칩을 포함할 수 있다.
상기 단백질 칩은 TonEBP에 대한 항체가 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 단백질 칩을 이용하여 분석하는 방법은, 검체 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여 단백질의 발현 정도를 확인하여 뇌염증을 진단할 수 있다.
상기 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능할 수 있다. 상기 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원에서 용어, "시료"란 미세아교세포를 포함하는 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 또는 뇌척수액 같은 시료 등을 포함하나 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 뇌염증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 뇌 생검 시료 또는 뇌척수액 시료로부터 TonEBP의 발현을 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 시료 내의 미세아교세포로부터 TonEBP의 발현을 검출하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 미세아교세포의 핵 및 세포질 중 하나 이상에서의 TonEBP 발현을 검출하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 TonEBP의 발현의 검출은 TonEBP에 특이적인 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 단백질을 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 TonEBP의 발현의 검출이 TonEBP에 특이적인 항체를 이용하여 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포 측정법(flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 및 단백질 칩으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
I. 재료와 방법
1. 실험동물
암컷 흰쥐 (Sprague-Dawley 종 SD 래트, 8 주령, 230-280 g)를 표준화된 조건대로 (22 ± 2°C, 정습도, 12 시간 광/암주기) 사육하였다.
2. 쥐 국소의 정위주사법 ( stereotaxic surgery)
실험동물은 클로랄 수화물(chloral hydrate)(400 mg/kg)을 복강 내 주사하여 마취시킨 후 두정부를 절개하여 두개골을 노출시키고 뇌정위 고정 장치에 고정시켰다. 이어서 5 mg 지질다당류 (lipopolysaccharide, LPS) (5 mg을 3 ml PBS(phosphate buffered saline)에 녹임)를 해밀턴(Hamilton) 주사기 (30 s 베벨 게이지(gauge beveled) 주사기가 시린지 펌프에 부착됨)를 사용하여 우측 흑질 (브레그마(bregma) 기준: anteroposterior (AP) 5.1 mm, mediollateral (ML) 2.0 mm, dorsoventral (DV) 7.9 mm)에 1 분당 0.5 ml의 속도로 서서히 주입하였다. 대조군은 동량의 생리식염수를 같은 위치에 같은 속도로 주사하였다. 실험동물은 3 일 후 도살하여 뇌조직을 채취하였다.
3. 뇌조직 준비
실험동물은 마취 후 절개하여 심장을 노출시켜 심장 내로 0.5% 질산나트륨과 헤파린 (10 U/ml)이 함유된 생리식염수를 관류시킨 후, 4% 파라포름알데히드 (0.1 M 포스페이트 버퍼 내) 용액으로 관류 고정하였다. 두개골에서 적출한 뇌는 다시 4% 파라포름알데히드에서 16 시간동안 4℃에서 후고정(post-fixation)을 수행한 후, 30% 수크로스 용액에 넣은 후 잠길 때까지 4℃에 저장하였다. 충분히 고정된 뇌는 슬라이딩 마이크로톰(sliding microtome)을 활용하여 동결 절편(frozen section)으로 30 μm 두께의 관상(coronal) 절편을 제작하였다. 절제된 뇌조직은 면역조직화학검사에 사용되었다.
4. 면역조직화학검사
절제된 뇌조직 절편은 0.2% 트리톤 X-100 용액 안에 30 분 동안 침지시킨 후 0.5% 소혈청알부민 (bovine serum albumin)으로 세 번 세척하였다. 뇌조직 절편에서 TonEBP를 발현하는 세포의 종류를 규명하고 염증 전후 TonEBP 발현량의 차이를 정량화하기 위하여, 항 TonEBP 항체(1:1,000)와 함께 세포 종류별로 각각의 세포의 표지자를 사용하여 이중염색을 시행하였다. 미세아교세포, 신경세포 및 별아교세포의 표지자로서 각각 마우스 항-OX-42 (1:400, Serotec, UK), 마우스 항-NeuN (1:1,000, Milipore, US) 및 마우스 항-GFAP (1:1,500, Abcam, US) 항체를 일차 항체로 사용하였다. PBS로 세척한 후, 뇌조직 절편은 2차 항체(FITC-conjugated rabbit anti-rat IgG, 1:1,000; Texas Red-conjugated donkey anti-goat IgG, 1:1,000 (Abcam, USA))로 염색하였다. 뇌조직 절편은 Vectashield medium (Vector Laboratories)으로 마운팅 (mounting)하여 형광현미경 (LSM 700 confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Germany))으로 염색을 관찰하였다.
5. 1차 배양 미세아교세포 ( microglia primary culture)
미세아교세포의 1차 배양(primary culture)을 위해 Sprague-Dawley 래트 14일령 태아의 배쪽 중뇌 (ventral mesencephalon) 부위에서 세포를 추출하여 폴리-D-리신이 코팅된 75-cm2 T-플라스크에 플라스크 당 1×107 세포씩 넣은 후, 10% FBS가 함유된 DMEM 배양액으로 배양하였다. 2 내지 3 주 후, 배양 세포가 바닥 면적을 거의 (90% 이상) 차도록 자라면, 배양 플라스크를 가볍게 흔들어 접착력이 약한 미세아교세포를 바닥으로부터 떨어뜨렸다. 바닥으로부터 떨어진 미세아교세포가 포함된 배양액을 나일론 메쉬(nylon mesh)를 사용하여 이물질을 걸러낸 후, 별도의 배양접시에 넣고 10% FBS가 함유된 MEM 배양액으로 배양하였다. 24 시간이 지난 후, 배양액을 사용하여 순차적으로 희석한 LPS를 미세아교세포에 처리하였다. 75 mM NaCl 용액을 처리할 경우에는 25 배 농축된 25 리터의 NaCl 용액을 475 리터의 배양액에 처리하였다.
6. 1차 배양 미세아교세포에서의 항체염색법
상기 나열된 염증 유도 물질을 처리한 1차 배양 미세아교세포는 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 0.1% 소혈청알부민이 함유된 PBS로 두 번 세척한 후, 0.2% 트리톤 X-100 용액을 30 분간 처리하였다. 샘플간의 정확한 비교를 위하여 모든 샘플들은 동시에 염색이 수행되었다. 사용한 1, 2 차 항체는 면역조직화학검사법에 사용된 것과 동일하였다. 0.1% 소혈청알부민이 함유된 PBS로 세 번 세척한 후, 벡타실드 배지(Vectashield medium, Vector Laboratories)로 마운팅하여 공초점 또는 일반 형광현미경으로 염색을 관찰하였다. 세포질과 핵 내 형광의 정도는 ImageJ 소프트웨어로 정량화하였다.
7. 웨스턴 블롯 (western blot) 분석
1차 배양 미세아교세포에 명시된 농도의 LPS, 재조합 IFN-g (Novus, US), 또는 재조합 IL-4 (PeproTech, KR)를 처리한 후, 세포 용해물을 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였음. 단백질은 폴리아크릴아마이드 겔(SDS-PAGE) 상에서 분리한 후 PVDF 막으로 옮겼다. 사용된 1 차 항체는 항 TonEBP 항체 (1:3,000), 항 iNOS 항체 (1:1,000, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 및 항 액틴 항체 (1:5,000; Abcam) 였다. 면역활성 복합체는 ECL(Enhanced Chemiluminescence) 검출 시스템 (Millipore)으로 시각화하였다.
8. RNA 추출 및 실시간 정량적 (real-time quantitative) PCR
미세아교세포에 LPS (10 mM, 8 시간) 또는 NaCl (75 mM, 4 시간)를 처리한 후, 트리졸(TRIzol) 시약 (Invitrogen), 페놀-클로로포름 추출(phenol-chloroform extraction, Junsei), 이소프로판올 침전(isopropanol precipitation, Merk millipore)로 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA로부터 cDNA는 제조자의 지시에 따라 역전사효소 (Promega)를 이용하여 제조하였다. 사용한 쥐 프라이머는 다음과 같다: 인터루킨-6(interleukin -6) (il-6; 5'-TCCTACCCCAACTTCCAATGCTC-3', 5'-TTGGATGGTCTTGGTCCTTAGCC-3'), 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α) (tnf -α; 5'-AAATGGGCTCCCTCTCATCAGTTC-3' , 5'-TCTGCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3'), 베테인-γ-아미노부티르산 수송체(betaine -γ-amino-butyric acid transporter) (bgt -1; 5'-CCTCCATGGCCTGTGTACCGC-3', 5'-GAGTTCTTGCTTGACTGGAGAG-3'), 나트륨 의존성 마이오-이노시톨 공수송체(sodium dependent myo - inositol cotransporter ) (smit; 5'- TGAACACTTCATTGGGCTGGTA-3', 5'-GAGCGGATGTAAATAGGGATGAAA-3'). 제조사의 지시에 따라 Step One Plus Real-Time PCR system (Life Technologies)을 사용하여 정량화하였음.
9. 통계분석
데이타는 평균 ± 분산으로 표기하였으며, 대응표본 t-검정 또는 일원분산분석(one-way analysis of variance, ANOVA)으로 분석하고 Newman-Keuls 사후검정(post-hoc test)을 수행하였다. 분석에서 p-값 < 0.05는 통계학적으로 유의한 것으로 판단하였음.
II. 결과
1. LPS로 유도되는 쥐 뇌염증 동물 모델 미세아교세포 내 TonEBP 발현 증가
쥐의 뇌에 있는 미세아교세포에서 TonEBP의 발현 및 염증에 의한 변화 여부를 규명하기 위하여, 국소정위주사법(stereotaxic surgery)으로 염증 유도 물질인 지질다당류 (lipopolysaccharide, LPS) (5 mg을 3 ml PBS에 녹임)를 우측 흑질에 서서히 주입하였다. 대조군으로는 LPS를 우측 형질(ipsilateral side, 도 1a 내지 도 1d에서 LPS (ipsi)로 표시됨)에 주입한 쥐에서 좌측 흑질(contralateral side, 도 1a 내지 도 1d에서 LPS (contra)로 표시됨)을 취하거나 동량의 PBS를 같은 위치에 같은 속도로 주사한 것을 사용하였다(ipsilateral side, 도 1a 내지 도 1d에서 PBS (ipsi)로 표지). 투입한 지 3 일이 경과된 뒤, 쥐에서 뇌조직을 채취하여 면역조직항체 검사법으로 흑질에서 TonEBP의 발현 유무 및 변화를 관찰하였다. 미세아교세포는 OX-42로 표지하였으며, LPS에 의하여 미세아교세포의 모양 변화를 통해 염증에 의한 미세아교세포의 활성화를 확인할 수 있었다 (도 1a 및 도 1b). 즉, 미세아교세포는 LPS를 주입한 우측 흑질(LPS (ipsi))에서만 활성화된 형태로 변화하였고, LPS를 주입하지 않은 좌측 흑질(LPS (contra))이나 PBS를 주입한 쥐의 뇌에서는 휴지기의 수지상 미세아교세포(ramified microglia) 형태에서 변화가 없었다는 사실을 통하여 염증 반응이 LPS를 주입한 뇌 흑질 부위에 특이적으로 일어났음을 확인할 수 있었다 (도 1a 및 도 1b에서 OX-42 표지된 세포의 모양 변화). 즉, LPS를 주입한 쥐 뇌의 동측(ipsilateral side)에서만 TonEBP가 OX-42+ 세포에서 특이적으로 증가함을 확인하였고 (도 1a), TonEBP 항체 대신 IgG (대조 immunoglobulin)를 사용하여 염색한 뇌절편에서는 염색이 되지 않는다는 사실로부터 항-TonEBP 항체의 특이성을 확인할 수 있었다 (도 1a 및 도 1b). 또한, LPS를 주입한 쥐 뇌의 대측(contralateral side, 도 1a의 하단)에서나 PBS를 주입한 쥐 뇌(도 1a의 상단)를 사용한 대조군 실험에서는 OX-42로 표지된 미세아교세포에서 TonEBP가 발현되지 않았음을 확인하였다.
정상적인 뇌의 평상시 조건(normal condition)에서는 TonEBP가 주로 신경세포에서 발현되고, 비신경세포 중에서는 별아교세포에서 약하게 발현이 되는 것으로 알려져 있었다. 염증에 의해서 신경세포나 별아교세포에서도 TonEBP 발현이 변화하는지를 알아보기 위하여, LPS를 국소주입한 뇌의 조직 절편을 신경세포 또는 별아교세포 마커와 항 TonEBP 항체를 함께 사용하여 이중항체염색 (double-immunolabelling)을 하였다. 신경세포의 마커로는 항 NeuN 항체를 사용하였고 (도 1c) 별아교세포의 마커로는 항 GFAP 항체를 사용하였다 (도 1d). 뇌에 PBS를 주입하거나 LPS를 주입한 대측(contralateral side) (LPS (contra)) 등 대조군으로 사용한 두 가지 경우의 뇌절편에서 TonEBP는 NeuN으로 표지된 신경세포의 핵에서 발현이 확인되었고 (도 1c), GFAP으로 표지된 별아교세포에서는 거의 발현되지 않았다 (도 1d). (도 1a 내지 도 1d의 스케일 바: 30 μm)
도 1e는 LPS 또는 PBS를 뇌의 우측 흑질 부위에 국소 정위주사법으로 주입한 후, 3 일 뒤에 면역조직화학검사법으로 뇌조직 절편을 항 TonEBP 항체와 OX-42 또는 NeuN으로 이중 염색하여 TonEBP를 발현하고 있는 세포 수를 세어 나타낸 도표이다. Contra로 표기된 흰색 막대는 LPS를 우측 흑질에만 주입한 쥐에서 좌측 흑질 부위의 뇌절편을 분석한 것을 나타내며, PBS 또는 LPS로 표기된 회색 막대와 검정색 막대는 주입한 쪽인 우측 흑질의 뇌절편을 분석한 것을 나타내는 것이다. TonEBP를 발현하는 OX-42+ 또는 NeuN+ 세포 수는 대측(contralateral side)에서 TonEBP를 발현하는 수를 기준으로 상대값을 그래프로 나타낸 것이다. LPS에 의하여 TonEBP+ 세포는 OX-42+ 인 세포에서만 그 수가 증가되었고 NeuN+ 세포에서는 변화가 전혀 없었다. (*** p < 0.001; PBS 대비 LPS 처리한 샘플. student t test.) 그 결과, 미세아교세포는 LPS 처리에 의해서 TonEBP를 발현하는 세포의 수가 급증하였던 반면 (도 1e), 신경세포와 별아교세포에서는 LPS의 처리에 의한 변화가 전혀 없었다. 이러한 결과는 LPS 국소 주입으로 유도된 뇌염증 신호에 의하여 TonEBP를 발현하지 않았던 미세아교세포에서 특이적으로 TonEBP 발현이 급증하는 것을 보여주는 것이다.
2. 1차 배양 미세아교세포에서 LPS에 의한 TonEBP의 발현 증가
Sprague-Dawley 래트 14 일령 태아의 배쪽 중뇌 (ventral mesencephalon) 부위에서 세포를 추출하여 1차 배양한 세포 중 전체의 95% 이상이 미세아교세포임을 미세아교세포 마커인 OX-42를 사용한 항체염색법을 통하여 확인하였다. 도 2a는 항 OX-42 항체와 항 GFAP 항체로 이중염색한 세포배양의 대표 이미지이다.
도 2b 및 도 2c는 체외배양 18 일 후, 다양한 농도의 LPS를 처리한 후 항 TonEBP 항체, 항 iNOS 항체 및 항 β-actin 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 미세아교세포에서의 TonEBP와 iNOS의 단백질 양을 분석한 결과 (도 2b) 및 정량결과 (도 2c)이다. 이로부터, 1차 배양 미세아교세포에 LPS를 처리하면, 처리한 LPS의 농도가 증가할수록 염증신호에 의하여 발현이 증가한다고 알려져 있는 iNOS(inducible nitric oxide synthase)의 발현이 증가할 뿐 아니라, TonEBP의 발현 또한 증가함을 확인하였다.
도 2d 및 도 2e는 LPS (10 μM)를 미세아교세포에 처리하고 0, 1, 3, 5, 18 시간 후 고정하여 TonEBP 단백질 양의 변화 및 세포 내 위치를 관찰한 이미지 (도 2d) 및 정량 결과 (도 2e)를 나타내는 것이다. 세포 고정 후 TonEBP 및 OX-42 염색 결과, 핵과 세포질 내에서 TonEBP 발현이 증가됨을 보여준다. 이러한 결과는 생체 내와 체외에서 TonEBP의 발현이 LPS에 의하여 미세아교세포에서 특이적으로 증가함을 보여주는 것이다. (스케일 바: 50 μm, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001; one-way ANOVA, 대조군 (vehicle control)에 대한 Newman-Keulus 사후 검정을 따른 통계 결과.)
다음으로, LPS 와 NaCl 처리에 따른 면역중재작용(immunomodulatory)과 삼투중재작용 (osmomodulatory)과 관련된 유전자 발현량을 분석하였다 (도 3). 먼저, 미세아교세포의 1차 배양을 위해 14 일된 배아의 중뇌 조직에서 미세아교세포를 분리 및 배양하였다. 배양 18 일에 기재된 바와 같이 LPS (10 μM, 8 hr) 또는 NaCl (75 mM, 4hr)를 미세아교세포에 처리한 후 qRT-PCR을 진행하였다. Smit(sodium/myoinositol cotransporter) (도 3의 A), Bgt -1(sodium/chloride/betaine cotransporter) (도 3의 B), Il -6(interleukin-6) (도 3의 C), 그리고 Tnf -α(tumor necrosis factor-alpha) (도 3의 D)의 전사체(mRNA)양을 β-액틴의 전사체 양을 기준으로 정류화하여 비교 분석하였다. LPS가 Il -6 와 Tnf -α mRNA 발현양은 증가시켰으나, Smit 발현 양에는 영향을 미치지 못하였으며, Bgt -1의 발현 증가에는 아주 미미한 영향을 미친 것을 확인하였다. (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001; 통계 처리는 대조군(vehicle control)에 대한 스튜던트의 t 검정 을 진행함.) 삼투압의 변화가 많은 신장에서는 고장성 상태에서 TonEBP가 활성화되면 세포 내 삼투질(osmolyte)의 농도를 높이거나 삼투압의 균형을 맞추는 데 중요한 smit (sodium/ myoinositol cotransporter), bgt -1(sodium/chloride/betaine cotransporter) 등의 유전자가 발현되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 삼투압을 변화시키는 NaCl과는 반대로, LPS에 의해서는 smit의 발현이 유도되지 않음을 확인하였다 (도 3의 A). bgt -1의 경우에도 NaCl에 의하여 수십 배 발현이 증가되는 것과는 대조적으로 LPS에 의해서는 그 증가가 매우 미비함을 확인하였다 (도 3의 B). 그에 반하여, 삼투압과 무관한 염증 관련 유전자인 interleukin -6 (il-6), tumor necrosis factor-alpha (tnf -α) 등은 LPS에 의하여 극명하게 증가하였고, NaCl에 의해서는 두 유전자 모두 발현량에 변화가 없었다 (도 3의 C 및 D).
3. LPS 이외의 다른 염증 신호에 의한 미세아교세포에서의 TonEBP의 발현 증가
1차 배양 미세아교세포의 배양 후 18일 째, 표기된 농도의 재조합 인터루킨-4 (IL-4) 또는 인터페론-g (IFN-g)를 처리한 후, 세포의 용출물을 사용하여 항 TonEBP 항체로 웨스턴 블롯을 수행하였다 (도 4). 로딩 대조군(loading control)으로 β-액틴 항체를 사용하였다. 도 4의 A 및 B에서는 IL-4 또는 IFN-g에 의하여 TonEBP 발현이 증가하는 것을 보여주고 있으며, 도 4의 C에서는 발현 정도를 정량화한 것을 보여주고 있다. (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001; one-way ANOVA 후 Newman-Keulus 사후검정 수행. IL-4 또는 IFN-g를 처리하지 않은 샘플과 비교하여 통계분석 하였음.) 그 결과, 1차 배양 미세아교세포에서 LPS 이외의 다른 염증 유도 인자인 인터페론 감마 (interferon-gamma, IFN-g) 또는 인터루킨 (interleukin-4, IL-4)에 의해서도 TonEBP의 발현이 증가함 확인하였다.
4. 고찰
TonEBP는 세포 외부환경의 삼투압 변화에 따른 세포 손상을 방어하는 기전에 작용하는 주요 인자로 알려져 왔다. 그러나, 본원의 실시예에 따르면 삼투압 현상과 상관없는 TonEBP 발현과 기능 조절 기전이 존재한다. 특히 염증성 환경에서의 TonEBP 발현 및 기능 연구는 염증 조절 인자로서의 TonEBP의 새로운 기능을 제시한다.
기존 고장성 환경에서의 뇌속 신경세포 및 신경교세포에서의 TonEBP 발현 양상은 주로 신경세포에서 주로 발현되며 일부 극소수의 성상교세포에서 발현됨이 확인되었으나 미세교아세포에서는 발현이 확인되지 않았다. 그러나 본원에서는 LPS에 의해서 유도되는 뇌염증 환경에서 TonEBP의 발현이 미세아교세포에서 주로 이루어짐을 확인하였다. 이러한 결과는 삼투압 변화가 미세아교세포에서의 TonEBP 발현의 주요 조절인자가 아님을 시사한다. LPS에서 의해서 유도되는 TonEBP 발현 증가의 환경에서 고삼투압 연관 유전자 (smit 과 bgt -1) 발현 변화가 미비하다. 또한, 다양한 염증 유도 물질에 의하여 생체 외(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 조건에서 TonEBP 발현이 미세아교세포에서 증가하였다. 이상의 결과는 미세아교세포에서의 TonEBP의 발현 증가가 긴장성 비의존적으로 염증 신호에 의해서 조절됨을 시사한다.
LPS는 대표적인 염증 유도 물질로서 미세아교세포에서 다양한 염증성 사이토카인, 활성 산소 및 산화질소 발생을 유도한다. 하지만 이러한 면역 조절 인자들의 LPS에 의한 발생 기전은 완벽히 이해가 되고 있지 않다. 대식세포의 경우, LPS는 TonEBP 발현을 증가시키며 면역기능과 관련되는 다양한 유전자 (tnf, il6, nos2 (iNOS)) 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 특이적인 것은 이상의 TonEBP의 기능이 삼투압조절 기능과는 무관한 현상이라는 것이다. 면역기능 조절과 TonEBP의 연관성은 염증 유도물질인 TNF-a와 IL-1b에 의한 TonEBP 발현 증가 결과에 의해서도 제시가 된다. 본원에서는 IL-4와 인터페론-g에 의해서 미세아교세포에서 TonEBP 발현이 증가되며 이는 TonEBP의 미세아교세포의 M1 및 M2 기능과 관련됨을 제시한다. 본원의 연구결과로부터 향후 다양한 면역 유도 인자 및 뇌 염증 환경들에서 TonEBP의 각 조건에서의 특이적 및 선호적 발현 및 기능 조절 기전에 대한 연구를 진행하고, 뇌속 생리적 및 병리적 환경에서 TonEBP의 면역 연관 기능을 이해하며, 이의 조절을 통하여 뇌속 면역 및 염증 반응을 조절에 활용될 것으로 기대된다.
즉, 본원은 뇌염증 환경에서 TonEBP의 미세아교세포에서의 발현에 관한 것이고, 이를 이용하여 다양한 뇌병증에서의 뇌염증과 연관된 바이오마커로서 TonEBP를 활용하여 진단 기술 개발에 활용될 수 있다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 뇌염증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
    환자의 뇌 생검 시료 또는 뇌척수액 시료로부터 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS), 인터페론 감마(interferon-g, IFN-g) 및 인터루킨-4(interleukin-4, IL-4)에 의한 TonEBP의 발현을 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 발현을 검출하는 단계는, 상기 시료 내의 미세아교세포에서 TonEBP의 발현이 증가하고, 상기 시료 내의 신경세포 및 별아교세포에서 TonEBP의 발현에 변화가 없으면, 상기 TonEBP의 발현 증가는 세포 내의 긴장성(tonicity) 및 삼투압의 변화에 의한 것이 아니고, 염증 유도 물질 또는 염증 신호에 의한 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 삭제
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 시료 내의 미세아교세포는 미세아교세포의 핵 및 세포질 중 하나 이상인 것인, 방법.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 TonEBP의 발현의 검출은 TonEBP에 특이적인 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 단백질을 이용하여 수행되는 것인, 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 TonEBP의 발현의 검출이 TonEBP에 특이적인 항체를 이용하여 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포 측정법(flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법 및 항원-항체 응집법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는 것인, 방법.

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