JP6898417B2 - 炎症を検出および/または処置するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、2013年11月7日に出願された米国仮出願第61/962,476号、2014年1月24日に出願された同第61/931,146号および2014年1月24日に出願された同第61,931,184号の恩典を主張し、これら各々の内容の全体を参照により本明細書に組み入れる。
本発明は、概ね、炎症、特に腎臓の炎症の検出および/または処置に関する。
腎不全は、ほとんど常に、制御されない炎症を伴う。急性腎障害(AKI)は、集中治療室患者の3分の2、心臓手術後の患者の40%および全入院患者の23%で起こっている。加えて、虚血、腎毒素、画像化造影剤および細菌内毒素を含む様々な要因が、AKIの発生率の増加に寄与する。AKIは、慢性腎疾患(CKD)から末期腎疾患への進行に寄与する。これは、より長い入院期間を伴い、したがってより多い費用を発生させる。米国において数百万人を悩ましている高血圧および糖尿病は、CKDの二大要因である。2012年に、6つの主要な市場(米国、フランス、ドイツ、イタリア、スペインおよび英国)において6953万例のCKDが報告され、米国単独でほぼ3900万例であった。CKDの有病率は、年1.62%成長しており、2022年に8083万例に達すると見積もられている。その進行の早期に検出されれば、腎疾患は鈍化させることができ、透析への移行を遅らせることができる。しかし、腎臓の炎症の早期マーカーは現時点で利用可能でない。
本明細書に開示される技術は一部、損傷した細胞から放出される危険分子であるUDP-グルコースを検出する受容体であるP2Y14を通じて腎臓の介在細胞が腎臓における炎症のセンサー、メディエーターおよびエフェクターとして機能することができるという発見に基づいている。さらに、P2Y14の発現が腎臓の炎症を有するマウスにおいて上昇することも発見された。本明細書に開示される技術は、初期の炎症の検出を実現し得る。
本開示は、一部、P2Y14および/またはUDG-グルコースを腎臓の炎症の検出のためのバイオマーカーとして使用することができるという発見に基づいている。対象由来のサンプルにおける、参照レベルと比較して上昇したレベルのP2Y14および/またはUDG-グルコースの検出は、したがって、対象における腎臓の炎症の存在を示すために使用され得る。初期の炎症をこれらのバイオマーカーの一方または両方を用いて検出できることが利点である。したがって、本明細書に記載される技術の態様は、とりわけ、対象が腎臓の炎症を有するかどうかを判定するためのアッセイ、方法およびシステム、腎臓の炎症を有する対象において処置経過をモニタリングするための方法、ならびに腎臓の炎症を有する対象を処置する方法を提供する。P2Y14およびUDP-グルコースは、バイオマーカーとして独立してまたは組み合わせて使用され得ることに注目されたい。
P2Yプリノセプター14(P2Y14)[ホモサピエンス](NCBI参照配列:NP_001074924.1)
本明細書で使用される「サンプル」、「生物学的サンプル」または「試験サンプル」という用語は、生物、例えば動物またはヒトから採取または単離されたサンプルを表す。例示的な生物学的サンプルは、バイオ液体サンプル;体液サンプル、血液(全血を含む);血清;血漿;尿;唾液;生検および/または組織サンプル等を含むがこれらに限定されない。この用語はまた、上記サンプルの混合物を含む。「サンプル」という用語はまた、未処置のまたは前処置(前処理)された生物学的サンプルを含む。いくつかの態様において、サンプルは、対象由来の1つまたは複数の細胞を含み得る。いくつかの態様において、本明細書に記載されるアッセイおよび方法において使用されるサンプルは、試験される対象から回収された尿サンプルを含み得る。いくつかの態様において、本明細書に記載されるアッセイおよび方法において使用されるサンプルは、試験される対象から回収された血液サンプルを含み得る。
いくつかの態様において、参照レベルは、正常な健常対象または正常な健常対象の集団のサンプル(例えば、尿)におけるP2Y14またはUDP-グルコースの平均レベルに対応し得る。これは、「正常な」レベルであろう。本明細書で使用される場合、「正常な健常対象」という用語は、いかなる疾患もしくは障害の症状も有さないまたは何らかの疾患もしくは障害を有すると判定されていないまたはいかなる薬物処置も行われていないまたは医学的試験に基づき医師によって健常と判定された対象を表す。測定されたP2Y14レベルはP2Y14の参照レベルと、および測定されたUDP-グルコースレベルはUDP-グルコースの参照レベルと比較されるのみであるべきことに留意されるべきであり、かつそれは当業者に明らかである。
本明細書に記載されるアッセイおよび/または方法のいくつかの態様において、アッセイ/方法は、本明細書に記載されるようにP2Y14および/またはUDP-グルコースのレベルを測定(例えば、変換および測定)し、それを参照レベルと比較するためのシステムを含むまたは該システムから本質的になる。P2Y14および/またはUDP-グルコースの測定されたレベルの量が参照量のそれよりも統計的に高いことをコンピュータにより実行されるシステムであり得る比較システムが示す場合、サンプルが回収された対象は、腎臓の炎症を有するとして特定され得る。
本明細書に記載されるアッセイおよび方法を実施するためのキットおよびデバイスが、本明細書に提供される。
いくつかの態様において、対象が腎臓の炎症を有するとして特定される場合、アッセイまたは方法はさらに、腎臓の炎症を処置するのに適した処置を対象に行う工程を含む。腎炎とも呼ばれる腎臓の炎症は、様々なタイプ、例えば糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、間質性腎炎、IgA腎症、腎盂腎炎、CKDおよび炎症に関連する自己免疫障害、ループス腎炎、グッドパスチャー症候群ならびにウェゲナー肉芽腫症を含み得る。
段落1.
(i)対象から得られたサンプルにおいて、P2Y14のレベルを測定する工程;
(ii)該P2Y14のレベルを参照レベルと比較する工程;および
(iii)対象を、(a)P2Y14のレベルが参照レベルを上回る場合に腎臓の炎症を有するとして特定し、(b)P2Y14のレベルが参照レベルであるかまたは参照レベルを下回る場合に腎臓の炎症を有さないとして特定する工程
を含むアッセイ。
段落2.
P2Y14のレベルが参照レベルを上回る場合に、腎臓の炎症を処置するのに適した処置を提供する工程をさらに含む、段落1に記載のアッセイ。
段落3.
処置がP2Y14阻害剤を含む、段落2に記載のアッセイ。
段落4.
P2Y14のレベルがタンパク質レベルである、前記段落のいずれか一つに記載のアッセイ。
段落5.
P2Y14のレベルが免疫アッセイによって測定される、段落4に記載のアッセイ。
段落6.
サンプルが抗P2Y14抗体と接触させられる、段落5に記載のアッセイ。
段落7.
抗P2Y14抗体が検出可能なように標識されているかまたは検出可能なシグナルを生成することができる、段落6に記載のアッセイ。
段落8.
抗体が蛍光標識されている、段落6または7に記載のアッセイ。
段落9.
P2Y14のレベルが、P2Y14をコードする核酸を測定することによって測定される、段落1〜3のいずれか一つに記載のアッセイ。
段落10.
参照レベルが、健常対象の集団における平均P2Y14レベルである、前記段落のいずれか一つに記載のアッセイ。
段落11.
参照レベルが、健常対象の集団における平均P2Y14レベルを2標準偏差上回る、段落1〜9のいずれか一つに記載のアッセイ。
段落12.
初期の炎症を検出する、前記段落のいずれか一つに記載のアッセイ。
段落13.
対象から得られたサンプルにおけるUDP-グルコースのレベルを測定する工程および該UDP-グルコースのレベルを参照レベルと比較する工程をさらに含む、前記段落のいずれか一つに記載のアッセイ。
段落14.
サンプルが尿サンプルである、前記段落のいずれか一つに記載のアッセイ。
段落15.
対象が哺乳動物である、前記段落のいずれか一つに記載のアッセイ。
段落16.
哺乳動物がヒトである、段落15に記載のアッセイ。
段落17.
(i)対象から得られたサンプルにおいて、P2Y14のレベルをアッセイする工程;
(ii)該P2Y14のレベルを参照レベルと比較する工程;および
(iii)対象を、(a)P2Y14のレベルが参照レベルを上回る場合に腎臓の炎症を有するとして特定し、(b)P2Y14のレベルが参照レベルであるかまたは参照レベルを下回る場合に腎臓の炎症を有さないとして特定する工程
を含む、対象の腎臓の炎症を検出する方法。
段落18.
P2Y14のレベルが参照レベルを上回る場合に、腎臓の炎症を処置するのに適した処置を提供する工程をさらに含む、段落17に記載の方法。
段落19.
処置がP2Y14阻害剤を含む、段落18に記載の方法。
段落20.
P2Y14のレベルがタンパク質レベルである、段落17〜19のいずれか一つに記載の方法。
段落21.
P2Y14のレベルが免疫アッセイによって測定される、段落20に記載の方法。
段落22.
サンプルが抗P2Y14抗体と接触させられる、段落21に記載の方法。
段落23.
抗P2Y14抗体が検出可能なように標識されているかまたは検出可能なシグナルを生成することができる、段落22に記載の方法。
段落24.
抗体が蛍光標識されている、段落22または23に記載の方法。
段落25.
P2Y14のレベルが、P2Y14をコードする核酸を測定することによって測定される、段落17〜19のいずれか一つに記載の方法。
段落26.
参照レベルが、健常対象の集団における平均P2Y14レベルである、段落17〜25のいずれか一つに記載の方法。
段落27.
参照レベルが、健常対象の集団における平均P2Y14レベルを2標準偏差上回る、段落17〜25のいずれか一つに記載の方法。
段落28.
初期の炎症を検出する、段落17〜27のいずれか一つに記載の方法。
段落29.
対象から得られたサンプルにおけるUDP-グルコースのレベルを測定する工程および該UDP-グルコースのレベルを参照レベルと比較する工程をさらに含む、段落17〜28のいずれか一つに記載の方法。
段落30.
サンプルが尿サンプルである、段落17〜29のいずれか一つに記載の方法。
段落31.
対象が哺乳動物である、段落17〜30のいずれか一つに記載の方法。
段落32.
哺乳動物がヒトである、段落31に記載の方法。
段落33.
腎臓の炎症に罹患した対象における処置経過をモニタリングする方法であって、
(i)第1の時点において、該対象から得られた第1のサンプルにおけるP2Y14の第1のレベルを測定する工程;
(ii)腎臓の炎症を処置するための治療剤を該対象に投与する工程;および
(iii)第2の時点において、該対象から得られた第2のサンプルにおけるP2Y14の第2のレベルを測定する工程であって、ここで第2の時点が第1の時点よりも後でありかつ前記投与の後であり、第2のレベルが第1のレベルよりも有意に低い場合、処置が有効とみなされる、工程
を含む、前記方法。
段落34.
第1のサンプルおよび第2のサンプルが尿サンプルである、段落33に記載の方法。
段落35.
治療剤がP2Y14阻害剤である、段落33または34に記載の方法。
段落36.
対象がヒトである、段落33〜35のいずれか一つに記載の方法。
段落37.
P2Y14阻害剤を対象に投与する工程を含む、腎臓の炎症を有する対象を処置する方法。
段落38.
P2Y14阻害剤がPPTNまたは抗P2Y14抗体である、段落37に記載の方法。
段落39.
対象がヒトである、段落37または38に記載の方法。
段落40.
腎臓の炎症を処置するのに適した処置を施す工程を含む、参照レベルを上回るP2Y14のレベルを有すると判定された対象を処置する方法。
段落41.
腎臓の炎症を処置するのに適した処置がP2Y14阻害剤を含む、段落40に記載の方法。
段落42.
P2Y14阻害剤がPPTNまたは抗P2Y14抗体である、段落41に記載の方法。
段落43.
対象がヒトである、段落40〜42のいずれか一つに記載の方法。
段落44.
(i)対象から得られたサンプルにおいて、UDP-グルコースのレベルを測定する工程;
(ii)該UDP-グルコースのレベルを参照レベルと比較する工程;および
(iii)対象を、(a)UDP-グルコースのレベルが参照レベルを上回る場合に腎臓の炎症を有するとして特定し、(b)UDP-グルコースのレベルが参照レベルであるかまたは参照レベルを下回る場合に腎臓の炎症を有さないとして特定する工程
を含むアッセイ。
段落45.
UDP-グルコースのレベルが参照レベルを上回る場合に、腎臓の炎症を処置するのに適した処置を提供する工程をさらに含む、段落44に記載のアッセイ。
段落46.
処置がP2Y14阻害剤を含む、段落45に記載のアッセイ。
段落47.
参照レベルが、健常対象の集団における平均UDP-グルコースレベルである、段落44〜46のいずれか一つに記載のアッセイ。
段落48.
参照レベルが、健常対象の集団における平均UDP-グルコースレベルを2標準偏差上回る、段落44〜46のいずれか一つに記載のアッセイ。
段落49.
初期の炎症を検出する、段落44〜48のいずれか一つに記載のアッセイ。
段落50.
サンプルが尿サンプルである、段落44〜49のいずれか一つに記載のアッセイ。
段落51.
対象が哺乳動物である、段落44〜50のいずれか一つに記載のアッセイ。
段落52.
哺乳動物がヒトである、段落51に記載のアッセイ。
段落53.
(i)対象から得られたサンプルにおいて、UDP-グルコースのレベルをアッセイする工程;
(ii)該UDP-グルコースのレベルを参照レベルと比較する工程;および
(iii)対象を、(a)UDP-グルコースのレベルが参照レベルを上回る場合に腎臓の炎症を有するとして特定し、(b)UDP-グルコースのレベルが参照レベルであるかまたは参照レベルを下回る場合に腎臓の炎症を有さないとして特定する工程
を含む、対象の腎臓の炎症を検出する方法。
段落54.
UDP-グルコースのレベルが参照レベルを上回る場合に、腎臓の炎症を処置するのに適した処置を提供する工程をさらに含む、段落53に記載の方法。
段落55.
処置がP2Y14阻害剤を含む、段落54に記載の方法。
段落56.
参照レベルが、健常対象の集団における平均UDP-グルコースレベルである、段落53〜55のいずれか一つに記載の方法。
段落57.
参照レベルが、健常対象の集団における平均UDP-グルコースレベルを2標準偏差上回る、段落53〜55のいずれか一つに記載の方法。
段落58.
初期の炎症を検出する、段落53〜57のいずれか一つに記載の方法。
段落59.
サンプルが尿サンプルである、段落53〜58のいずれか一つに記載の方法。
段落60.
対象が哺乳動物である、段落53〜59のいずれか一つに記載の方法。
段落61.
哺乳動物がヒトである、段落60に記載の方法。
段落62.
腎臓の炎症に罹患した対象における処置経過をモニタリングする方法であって、
(i)第1の時点において、該対象から得られた第1のサンプルにおけるUDP-グルコースの第1のレベルを測定する工程;
(ii)腎臓の炎症を処置するための治療剤を該対象に投与する工程;および
(iii)第2の時点において、該対象から得られた第2のサンプルにおけるUDP-グルコースの第2のレベルを測定する工程であって、ここで第2の時点が第1の時点よりも後でありかつ前記投与の後であり、第2のレベルが第1のレベルよりも有意に低い場合、処置が有効とみなされる、工程
を含む、前記方法。
段落63.
第1のサンプルおよび第2のサンプルが尿サンプルである、段落62に記載の方法。
段落64.
治療剤がP2Y14阻害剤である、段落62または63に記載の方法。
段落65.
対象がヒトである、段落62〜64のいずれか一つに記載の方法。
段落66.
腎臓の炎症を処置するのに適した処置を施す工程を含む、参照レベルを上回るUDP-グルコースのレベルを有すると判定された対象を処置する方法。
段落67.
腎臓の炎症を処置するのに適した処置がP2Y14阻害剤を含む、段落66に記載の方法。
段落68.
P2Y14阻害剤がPPTNまたは抗P2Y14抗体である、段落67に記載の方法。
段落69.
対象がヒトである、段落66〜68のいずれか一つに記載の方法。
そうでないことに言及されているかまたは文脈から暗示されていない限り、以下の用語およびフレーズは、以下に提供される意味を含む。そうでないことが明示的に言及されているかまたは文脈から明らかでない限り、以下の用語およびフレーズは、それらが属する技術の分野において獲得した意味を排除しない。定義は、個々の態様の説明を補助するために提供されるものであり、特許請求の範囲に記載の発明を限定することは意図されておらず、発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定される。さらに、そうでないことが文脈によって要求されない限り、単数形の用語は複数形を包含し、複数形の用語は単数形を包含する。
制御されない炎症は、腎不全の主因の一つである。炎症促進応答は、感染の存在なしで起こり得、これは無菌性炎症と呼ばれるプロセスである。プリン受容体P2Y14(GPR105)が、集合管介在細胞(IC)において特異的かつ高度に発現され、腎臓における無菌性炎症を媒介することが本明細書に示されている。P2Y14は、損傷した細胞によって放出される傷害関連分子パターン分子(DAMP)であるUDP-グルコースによって活性化される。ICにおいてEGFPを発現するトランスジェニックマウスおよび培養細胞を用いて、UDP-グルコースがMEK1/2-ERK1/2経路を活性化し、炎症促進性ケモカインの発現を増加させることが見出された。これらの作用は、低分子PPTNによるP2Y14の阻害後に妨げられた。マウスの尾静脈へのUDP-グルコースの注射は、腎髄質への好中球の動員を誘導した。この研究は、ICを、腎臓におけるP2Y14を介する炎症の新規のセンサー、メディエーターおよびエフェクターとして特定する。
試薬および抗体
出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)由来のウリジン5'-ジホスホグルコース二ナトリウム塩水和物(UDP-グルコース)およびMEK阻害剤PD98059は、Sigma Aldrich(St. Louis, MO)から購入した。ウリジンジホスホ-D-[6-3H]グルコース([3H]UDP-グルコース)は、Perkin Elmer(Waltham, MA)から購入した。P2Y14受容体の選択的高親和性アンタゴニストであるPPTNは、以前に記載されている(50)。V-ATPase B1サブユニットに対するニワトリ抗体は、以前に記載されている(72)。V-ATPase Aサブユニットに対する親和性精製されたニワトリ抗体は、ウサギ抗V-ATPase Aサブユニット抗体に関して以前に記載されているのと同じ配列に対して惹起し、同じ特異性を有することが見出された(73、74)。ウサギ抗P2Y14抗体およびその免疫ペプチドは、Alomone labs(Jerusalem, Israel)から購入した。ウサギ抗細胞骨格アクチン抗体は、Bethyl Laboratory(Montgomery, TX)製であった。ウサギ抗ペンドリン抗体は、Aronson博士(Yale University)からの寄贈であった。p-p44/p42 MAPKに対するおよび総p44/p42 MAPKに対するウサギモノクローナル抗体は、Cell Signaling Technology(Boston, MA)から購入した。ラット抗Ly6G抗体は、Biolegend(San Diego, CA)製であった。マウス抗panアクチンは、EMD Millipore(Billerica, MA)から購入した。親和性精製された抗ウサギHRP、抗ニワトリHRP、抗マウスHRP、抗ウサギcy3および抗ニワトリcy3はすべて、ロバにおいて惹起されたものであり、Jackson Immunoresearch(West Grove, PA)から購入した。親和性精製された抗マウスHRPおよび抗ウサギFITCは、ヤギにおいて惹起されたものであり、Jackson Immunoresearchから購入した。ヤギ抗ラットcy3は、Invitrogen(Grand Island, NY)製であった。ストレプトアビジン・フルオレセインは、Invitrogenから購入した。細胞培養培地は、Invitrogenから購入し、ウシ血清は、Atlanta Biologicals(Lawrenceville, CA)から購入した。
成体オスマウス(8〜10週齢)をすべての実験で使用した。V-ATPase B1サブユニット(B1-EGFP)マウスのプロモーターの下でEGFPを発現するトランスジェニックマウスは、以前に記載されている(35)。野生型(C57BL/6x CBAF1)マウスはJackson Laboratory(Bar Harbor, ME)から購入した。動物を、標準的な条件下で収容し、標準的なげっ歯類用の食事で維持した。National Institutes of Health, Department of Agriculture, and Accreditation of Laboratory Animal Careの要件にしたがい、Massachusetts General Hospital(MGH) Subcommittee on Research Animal Careがすべての動物研究の承認を与えた。尾静脈注射では、200μlの生理食塩水溶液または100μM UDP-グルコース(200 mg/kg体重)を含む生理食塩水溶液のいずれかの注射を行うために、動物を数分間イソフラン麻酔(Baxter, Deerfield, IL)下で維持した。
マウスを、ペントバルビタールナトリウム(50 mg/kg体重、ip、Nembutal、Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)を用いて麻酔した。この動物にその左心室を通じてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を17 ml/分の一定流速でかん流させることによって臓器から血液を洗い流した。腎臓を摘出してスライスし、そしていくつかの腎臓を顕微解剖して皮質と髄質を分離した。次いで組織を、直ちに、1.0 mg/mlコラゲナーゼI型(Invitrogen)、1.0 mg/mlコラゲナーゼII型(Sigma Aldrich)および2 mg/mlヒアルロニダーゼ(Sigma Aldrich)を含むRPMI 1640培地(Invitrogen, Grand Island, NY)中でハサミを用いてみじん切りにし、37℃で45分間消化した。組織消化後に40-μm-ナイロンメッシュを用いて未消化物を除去した。次いで細胞をRPMI 1640培地で1回、カルシウム非含有PBSで1回洗浄した。EGFP陽性(EGFP(+))および陰性(EGFP(-))細胞を、以前に記載されたように(36)、それらの緑色蛍光強度に基づきFACSによって直ちに単離した。細胞の単離は、MGHフローサイトメトリーコア施設において改良型FACS Vantageセルソーター(BD Biosciences, San Jose, CA)を用いて実施した。FACS単離されたサンプルをPBS中に収集し、そしてその後の処置ならびに/または細胞分画、タンパク質およびRNA単離もしくは画像化のために間隔を空けずに使用した。
総RNAは、以前に記載されたように(36)、RNeasyマイクロキット(Qiagen, Valencia, CA)を用いて細胞からおよびRNeasyミニキットを用いて組織から単離した。DNase I消化は、RNase-Free DNaseセット(Qiagen)製造元の指示にしたがい用いて行った。全ての逆転写(RT)およびPCR試薬は、Applied Biosystems(Foster City, CA)製であった。逆転写は、42℃で1時間、1 x バッファーII、5 mM MgCl2、1.0 mM 各dNTP、1 U/μl RNase阻害剤、2.5μMランダムヘキサマーおよび2.5 U/μl MuLVリバーストランスクリプターゼを含む50μlの終量で行った。RT産物に対してPCRを行った。Invitrogenから購入したPCRプライマーセットの配列を表1に列挙する。エンドポイントPCRの場合、反応混合物は、2μlのテンプレート、1.25ユニットのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ、1 x バッファーII、1.5 mM MgCl2、1.0 mM 各dNTPならびに0.5μMの順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを含む20μl終量からなるものであった。以下のパラメータをPCRで使用した:ポリメラーゼを活性化させるために95℃で8分間、95℃30秒間の溶解、60℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の伸長を35サイクル、および72℃で10分間の最終伸長。増幅産物は、GelStar染色(Lonza, Rockland, ME)を含む1〜2%アガロースゲル上での電気泳動によって可視化した。
組織および細胞を、FACSに関して上記されているようにして調製した。フローサイトメトリーの前に、細胞懸濁物を、BSA 1%を含むPBS中で、BD Biosciences(San Jose, CA)から購入した以下の抗体を用いて染色した:PE結合抗CD90(クローン53-2.1)、PE結合抗B220(クローンRA3-6B2)、PE結合抗CD49b(クローンDX5)、PE結合抗NK1.1(クローンPK136)、PE結合抗Ly-6G(クローン1A8)、APC-Cy7結合抗CD11b(クローンM1/70)、PE-Cy7結合抗F4/80(クローンBM8)、Alexa Fluor 700結合抗CD11c(クローンHL3)。BD Pharmigenから購入した抗体も使用した:PE結合抗CD19(クローン1D3)、PE-Cy7結合抗B220(クローンRA3-6B2)、FITC結合抗CD3e(クローン145-2C11)、PE-Cy7結合抗CD4(クローンRM4-5)およびPerCP結合抗CD8a(クローン53-6.7)。単細胞懸濁物を、4℃で45分間標識した。単球/好中球染色のために、以下のPE結合抗体を使用した:抗CD90、抗B220、抗CD19、抗CD49b、抗NK1.1および抗Ly-6G。好中球は、Lin+CD11b+細胞と定義した。B細胞は、B220+CD19+細胞と定義した。総T細胞は、CD3e+細胞と定義した。CD4 T細胞は、CD3e+CD4+細胞と定義した。CD8 T細胞はCD3e+CD8a+細胞と定義した。好中球、BおよびT細胞の数は、臓器あたりの細胞の総数に、フローサイトメトリー(LSRII;BD Biosciences)によって同定された各細胞型の百分率を掛け合わせたものと定義した。染色対照として、脾臓から得た細胞懸濁物を、適当な抗体で標識した。データは、FlowJo v.8.8.7(Tree Star, Inc., Ashland, OR)を用いて分析した。
MDCK-C11細胞を、37℃、5% CO2 - 95% O2ミックス下、2 mMグルタミン、10%ウシ胎仔血清(Invitrogen)、ペニシリン(100 U/ml)およびストレプトマイシン(100μg/ml)(Invitrogen)を補充したDMEM(Invitrogen)中で培養した。あらゆる処置の前に、細胞を24時間血清飢餓させた。細胞表面ビオチニル化アッセイのために、細胞を、プラスチック皿上またはフィルター上のいずれかでコンフルエントになるまで成長させた。ビオチニル化は、以前に記載されたようにして行った(75)。簡潔に説明すると、細胞を、氷上で1時間、PBS pH8中1 mg/mlのビオチン(Thermo Scientific, Pittsburgh, PA)と共にインキュベートした。過剰なビオチンを100 mMグリシンを用いて不活性化させ、そして細胞を、免疫染色のためにさらに処理するかまたは4℃で20分間、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤(Complete Mini EDTA free、PhosSTOP、Roche Diagnostics, Laval, Canada)を含む溶解緩衝液[150 mM NaCl、5 mM EDTA、50 mM Tris/HEPES、pH 7.5;1%(vol/vol)Triton X-100]中に溶解させた。細胞全体抽出物由来の2〜5μgのタンパク質において、総タンパク質発現を測定した。50〜100μgの細胞溶解産物タンパク質を、(製造元のプロトコルにしたがい)4℃で一晩、ニュートラビジン(neutravidin)ビーズ(Thermo Scientific)と共にインキュベートした。遠心分離(2,500 gで5分間)および上清除去後、ビーズを溶解緩衝液で3回、高濃度塩緩衝液(500 mM NaCl、5 mM EDTA、50 mM Tris、0.1% Triton X-100、pH 7.5)で2回、無塩緩衝液(10 mM Tris、pH 7.5)で1回洗浄した。タンパク質を、95℃で5分間のLaemmli緩衝液中での変性後にSDS-PAGEに供した。酵素的脱グリコシル化の後、20μgの総タンパク質ならびに100μgのビオチニル化およびアビジン沈降タンパク質を、37℃で1時間、製造元のプロトコル(New England Biolabs, Ipsxich, MA)にしたがいエンドグリコシダーゼHまたはPNGase Fまたは対照のいずれかで処置した。P2Y14アンタゴニスト研究のために、PPTNをDMSO中に溶解させ、10μM(0.05% DMSO)の終濃度でコンフルエントなMDCK-C11細胞に適用した。PPTNまたはビヒクル(0.05% DMSO)による前処置は、対照またはUDP-グルコース処置前の30分間とした。
[3H]UDP-グルコース結合アッセイを、以前に記載されたようにして(16)、MDCK-C11細胞株およびFACS単離されたIC膜調製物において行った。コンフルエントなMDCK-C11細胞を氷冷PBS中で粉砕し、遠心分離(500g、10分間)によってペレット化させ、次いで25G針を用いてプロテアーゼ阻害剤(Complete Mini, Roche, Indianapolis, IN)を含む1 ml氷冷Tris-酢酸0.2 M緩衝液(pH 7.5)に再懸濁させた。細胞膜を、セルクラッカー(HGM lab equipment、Heidelberg, Germany)に10回通すことによって収集した。次いでこの溶液を17000gで10分間遠心分離し、膜ペレットを液体窒素中で凍結させ、使用するまで-80℃で維持した。タンパク質濃度を、ナノドロップ2000(Thermo scientific)を用いて測定した。
NuPAGE Novex bis/tris 4-12%ゲル(Invitrogen)上でタンパク質を泳動させ、ニトロセルロース膜(Bio-Rad)に転写した。ブロッキング(TBS 0.1% Tween 20中5% BSAで1時間)後、膜を、文献に示されているように、1次抗体と共に一晩インキュベートした。TBS 0.1% Tween 20中で3回洗浄した後、TBS 0.1% Tween 20中に1:10,000希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合2次抗体を室温で1時間適用した。膜を、Western Lightning Chemiluminescence試薬(Perkin Elmer Life Sciences, Waltham, MA, USA)およびKodakイメージングフィルムを用いてアッセイした。
マウスを、ペントバルビタール溶液(50 mg/kg体重、ip)を用いて麻酔した。左腎臓を、腎動脈を通じて、3.5 ml/分の一定速度で10分間、PBS(10 mMリン酸緩衝液、pH 7.4中0.9% NaCl)で、その後にパラホルムアルデヒド・リシン・過ヨウ素酸塩固定液(PLP;37.5 mMリン酸ナトリウム中4%パラホルムアルデヒド、75 mMリシン-HCl、10 mM過ヨウ素酸ナトリウムおよび0.15 Mスクロース)でかん流した。腎臓を、室温で4時間、その後に4℃で一晩、PLP中に浸漬させることによってさらに固定した。PBS中で十分洗浄した後、4℃で一晩、0.9 M(30% wt/vol)スクロースを含むPBS中で凍結切片化を行った。凍結切片化の前に、組織をTissue-Tek OCTコンパウンド4583(Sakura Finetek USA, Torrance, CA)中に包埋し、-20℃で凍結させた。切片(4〜10μm)を、Leica CM3050-Sクリオスタット(Leica Microsystems, Bannockburn, IL)上で切断し、使用するまで4℃で保存した(37、72)。切片をPBS中で再水和させ、5分間の間隔を空ける3回の1分間のアルカリ溶液(10 mM Tris緩衝液、1 mM EDTA、pH 9.0)中でのマイクロ波加熱によって抗原回復技術を実施し、その後に室温まで冷ました。次いで切片を1%(wt/vol)SDSで4分間処置した(76)。PBSで洗浄し1%(wt/vol)BSA含有PBS中で20分間インキュベートした後、切片を、1% BSAを含むPBS中に希釈した1次抗体と共に4℃で60分間または一晩インキュベートした。2次抗体を室温で1時間適用し、そしてスライドを、4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(Vector Laboratories, Burlingame, CA)を含むVectashield H1200培地中でマウントした。デジタル画像を、Nikon 90i落射蛍光顕微鏡(Nikon Instruments, Melville, NY)を用いて取得した。画像を、Volocityバージョン6.2.1画像処理ソフトウェア(Perkin Elmer)を用いて分析し、TIFFファイルとしてAdobe Photoshopソフトウェアにインポートし、顕微鏡下で可視化された生データの表示を良くするために全視野に対してレベルコマンドを適用した。
2つのグループ間の処置の効果を、適当な場合、対応のないスチューデントt検定によって決定した。複数グループ間の比較は、一元配置分散分析およびその後の事後t検定によって決定した。すべての検定は、両側であり、P<0.05を統計的に有意とみなした。
介在細胞におけるP2受容体mRNA発現
P2XおよびP2Y受容体のmRNA発現を、最初に、B1-EGFPマウスの腎臓からFACSによって単離されたIC濃縮EGFP(+)細胞においておよび全腎臓において従来的なRT-PCRによって分析した。これらのマウスにおいて、EGFP発現は、V-ATPase B1サブユニットのプロモーターによって誘導され、A型介在細胞(A-IC)、B型介在細胞(B-IC)および連結管(CNT)において特異的に起こる(35)。FACS単離後にすべての他の細胞型が除去されている高度に濃縮されたEGFP(+)細胞調製物が生成され得ることが以前に示されている(36、37)。図1に示されるように、P2Y4を除くすべてのP2受容体に特異的な転写物が全腎臓抽出物において検出され(下パネル)、この数はEGFP(+)細胞において3つのP2X(P2X1、P2X4およびP2X5)ならびに3つのP2Y(P2Y2、p2y5およびP2Y14)受容体に減少した(図1、上パネル)。
P2Y14(緑色として可視化)およびV-ATPase B1サブユニット(赤色として可視化)についての腎臓切片の二重免疫蛍光標識は、皮質のA-ICおよびB-ICにおけるP2Y14の特異的発現を示し、一方P2Y14は遠位および連結管において検出されなかった(図3A)。髄質において、P2Y14は、A-ICでのみ検出された(図3B)。P2Y14は、A-ICにおいては頂端であるがB-ICにおいては基底外側または両極であるV-ATPase B1サブユニット(40)と比較して、A-ICおよびB-ICの両方の頂端領域で発現された。P2Y14抗体とその免疫ペプチドとのプレインキュベートは、皮質(図3C)および髄質(図3D)の両方においてP2Y14染色を消去した。P2Y14はまた、その以前に報告された循環する免疫細胞における局在化(28〜30)と同様に、血管壁に付着したままの偶発的な免疫細胞において検出された(データ示さず)。P2Y14抗体を用いたEGFP(+)細胞抽出物の免疫ブロットは、主要な50-KDaバンドおよびそれより弱い40-kDaバンドを示した(図4A)。次に、FACS単離されたEGFP(+)細胞およびEGFP(-)細胞から分離された膜全体を用いて放射標識UDP-グルコース結合アッセイを行った(図4B)。EGFP(+)細胞において測定された[3H]UDP-グルコース結合は、飽和濃度の非放射性UDP-グルコース[10-5 M]で置き換えられたが、ATP[10-5 M]ではそうならず、これによりUDP-グルコース特異的な結合が示された。対照的に、EGFP(-)細胞においては、UDP-グルコース特異的結合が測定されなかった。まとめると、これらのデータは、ICがP2Y14を発現する唯一の腎臓上皮細胞であることを示している。
P2Y14で安定的にトランスフェクトされたヒト胚腎臓(HEK)293細胞において、UDP-グルコースは、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)1/2をリン酸化するマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)経路を刺激する(46)。したがって、ICにおいてこの経路がUDP-グルコースによって活性化されたかどうかを試験した。FACS単離されたEGFP(+) ICを、15分間、100μM UDP-グルコースでインビトロ処置し、ERK1/2のリン酸化をWBによって測定した。図5A〜5Bは、EGFP(+)細胞におけるUDP-グルコース処置後のERK1/2のリン酸化の有意な増加を示している(左パネル)。ERKのリン酸化の増加は、ERFP(-)細胞では見られず(図5A、右パネル)、これによりICにおけるUDP-グルコースによるP2Y14の活性化の特異性が確認された。定量は、EGFP(+)細胞ではERK1/2のリン酸化が有意に増加したがEGFP(-)細胞ではそうならなかったことを示した(図5B)。
最初に、P2Y14シグナル伝達経路の最初の同定および特徴づけのための腎臓上皮細胞モデルとして、メイディン・ダービー・イヌ腎臓(MDCK)サブクローンC11(MDCK-C11)を使用した。MDCK-C11細胞は、Cl-およびH+分泌ならびにcAMPによるH+分泌の活性化を含むICのいくつかの特徴を有することが以前に示されている(47)。この記載と同様、RT-PCR分析は、これらの細胞におけるV-ATPase B1およびa4サブユニットを含むICのマーカーの発現を示した(図6A)。集合管の主細胞のマーカーであるAQP2は検出されず、これによりそれらの非主細胞表現型が支持された(47)。MDCK-C11細胞は、AE1を発現せず、したがってA-ICのすべての特徴を有していない。しかし、MDCK-C11細胞におけるV-ATPase B1およびAサブユニットの発現が、細胞全体溶解産物およびビオチニル化細胞膜タンパク質画分において、ウェスタンブロットによりタンパク質レベルで確認された(図6B)。同じ膜を、アクチンに関して再ブロットした。細胞表面調製物においてアクチン染色が存在しなかったことにより、このサンプルにおいて細胞内タンパク質のビオチン混入がなかったことが示された。RT-PCR分析は、P2Y1、P2Y4、p2y10、P2Y12およびP2Y14に特異的な転写物を示した(図6C)。P2X2を除く、すべてのその他のP2X受容体も検出された。ウェスタンブロット分析は、細胞全体溶解産物および細胞表面におけるP2Y14タンパク質の発現を示した(図6D)。神経膠腫C6細胞における以前の報告(48)と同様、細胞全体溶解産物における50 kDaバンドと比較してより高分子量側のより拡散したバンドが細胞膜において検出され、これによりグリコシル化された受容体のみが細胞表面に到達できることが示された。P2Y14のグリコシル化をPNGaseF処置によって確認し、細胞全体溶解産物および細胞表面タンパク質画分においてP2Y14の脱グリコシル化形態が45 KDa付近で確認された。共焦点顕微鏡は、頂端部細胞膜におけるP2Y14の局在化(赤色として可視化)を示し、これはフィルター上で成長させたMDCK-C11細胞においてビオチニル化およびビオチン標識された(緑色として可視化)(図6E)。P2Y14はまた、細胞の頂端下領域においても発現された。次に、MDCK-C11細胞におけるこの受容体の機能を、放射標識UDP-グルコース結合アッセイを用いることによって調査した。UDP-グルコース結合の特異性を、非標識UDP-グルコースまたはATPの存在下で、[3H]UDP-グルコースの線量変化によって分析した。図6Fに示されるように、漸増濃度の非標識UDP-グルコースの添加は、用量依存的な様式で、[3H]UDP-グルコースの結合を減少させた。10μMまでのATPの濃度は、[3H]UDP-グルコースの結合に対して有意な阻害効果を有さなかった。この結合のスキャッチャード分析は、11.5±1.3 nMの親和性および16.0±0.2 pmol/mgタンパク質の最大結合能の1つのみのクラスの結合部位を示した。これらの値は、P2Y14を発現するHEK-293細胞(KIAA0001として以前から知られている)において得られた値と非常に類似する(16)。
図7A(上パネル)に示されるように、UDP-グルコース(100μM)はMDCK-C11細胞においてERK1/2のリン酸化の有意な増加を誘導した。これは、P2Y14アンタゴニストである4-((ピペリジン-4-イル)-フェニル)-(7-(4-(トリフルオロメチル)-フェニル)-2-ナフトエ酸(PPTN、10μM)を用いた前処置によって妨げられた。総ERK1/2に対するp-ERK1/2の比の定量は、UDP-グルコース処置後のERK1/2のリン酸化の有意な増加を示し、これはPPTNの存在下で打ち消された(図7B、下パネル)。以前の報告(46)と同様、他のMAPK標的、例えばp38およびJNK/SAPKのリン酸化の増加(データ示さず)は検出されなかった。
様々な炎症促進性ケモカインおよびサイトカインのmRNA発現に対するUDP-グルコースによるP2Y14活性化の効果を、ここでは、MDCK-C11細胞(図8A〜8C)およびB1-EGFPマウスからFACSによって単離した腎臓EGFP(+)細胞の両方において評価した(以下を参照のこと)。図8Aに示されるように、MDCK-C11細胞は、100μM UDP-グルコースによる4時間の処置後にIL-8およびCCL-2 mRNA発現を増加させた。IL-8およびCCL-2(MCP-1としても公知)は、それぞれ、好中球および単球に対する周知の化学誘引物質である。他の炎症促進性メディエーター、例えばCCL4、CCL5、IL1βまたはTNFαの検出可能な増加は見られなかった。サイトカイン産生におけるERKのリン酸化の寄与を決定するために、MEK阻害剤PD98059を使用することによってERK1/2のリン酸化を阻害した(51)。この処置は、IL-8およびCCL-2のUDP-グルコースにより誘導される上方調節を打ち消した(図8B)。加えて、P2Y14アンタゴニストであるPPTN(50)を用いたMDCK-C11細胞の前処置もまた、UDP-グルコースにより誘導されるIL8およびCCl2 mRNA発現の増加を打ち消した(図8C)。
ICにおけるP2Y14発現の病態生理学的関連性を、UDP-グルコース注射を行ったマウスにおいてフローサイトメトリーを用いて腎臓への免疫細胞の浸潤を測定することによって評価した。腎臓における免疫細胞の空間的分布を検証するために、腎臓を皮質および髄質に分離した。上記のようにして、B1-EGFPマウスに、100μM UDP-グルコース(処置)または生理食塩水(シャム)のいずれかの尾静脈注射を行った。48時間後に、腎臓血管から血液を洗い流し、それによって組織に浸潤した免疫細胞のみを測定するために、マウスを左心室を通じてPBSでかん流した。このアプローチにより、腎髄質における好中球の有意かつ選択的な蓄積が確認された(図10A)。この観察は、UDP-グルコース活性化後にEGFP(+)細胞において観察された好中球化学誘引物質の上方調節と一致する。抗炎症性(Ly6C低)単球もまた、髄質において若干減少し、それ以外では他の免疫細胞数に関して有意な変化が観察されなかった。腎皮質において、若干減少したLy6C低単球集団を除く大部分の細胞型の数はUDP-グルコース処置によっても変化しないままであった(図10B)。UDP-グルコース注射後の早期の時点(12および24時間)では皮質および髄質において浸潤免疫細胞の数の見かけ上の変化は観察されなかった(データ示さず)。
対照およびUDP-グルコース処置マウス由来の腎臓切片を、P2Y14(緑色として可視化)および好中球マーカーであるLy6G(赤色として可視化)に関して染色した。モザイク画像を取り込み、好中球を、それらのLy6Gに関する陽性標識およびそれらの多核表現型に基づき同定した(白色の丸)(図11A〜11B)。シャム措置対照マウス(図11A)と比較して、UDP-グルコース処置マウスの髄質(図11B)においてより多くの好中球が確認できた。より高倍率の画像は、UDP-グルコース処置マウス(図11D、11D'、11D'')の腎髄質に好中球が存在するが、対照(図11C、11C'、11C'')には存在しないことを示している。
この研究では、腎臓介在細胞のP2受容体プロフィールを特徴づけ、それらが高レベルの炎症促進性P2Y14受容体を発現することが示された。加えて、本明細書に提供されるデータは、ICにおけるUDP-グルコースによるP2Y14の活性化が、ERK1/2のリン酸化とそれに続くケモカインの上方調節および腎髄質への好中球の動員により媒介される炎症応答を誘導することを実証している。したがってこの研究は、ICを、腎臓における無菌炎症のセンサーおよびメディエーターの両方として同定する。
P2Y14はヒト腎臓介在細胞において発現される
P2Y14がヒト腎臓片由来の介在細胞(IC)において発現されることが示されている。ICは、プロトンポンプであるV-ATPaseに関するそれらの陽性標識によって特定した(図12)。
マウス由来の尿サンプル中のUDP-グルコースを測定した。尿サンプルは、UDP-グルコース注射の前および後に、それらの尾静脈を通じて、対照マウスと対にする様式で収集した。目的は、第一に、健常マウスの尿におけるUDP-グルコースのレベルを測定することであり、次に、腎臓において好中球浸潤が起こるしきい値を決定することであった。肺排せつ物におけるUDP-グルコースの測定に関する以前に公開されているプロトコルを使用した(Barrett et al. Molec. Pharmacol. 2013)。得られたデータは、対照条件下での非常に低いUDP-グルコース濃度(30 nM範囲)およびUDP-グルコースを含む溶液の単回IV注射後の有意な増加(200 nM)を示している。
UDP-グルコースレベルを、健常個体ならびにAKI、CKDおよび敗血症患者由来の尿サンプルにおいて測定する。集中治療室に収容された患者を試験する縦断研究においてもUDP-グルコースレベルを測定する。一部がAKIを発症しており一部がそうでないこれらの患者において尿サンプルを毎日収集する。
ICの新規の炎症促進機能を、様々なマウス疾患モデルにおいて調査する。
Claims (2)
- P2Y14阻害剤を含む、対象から得られたサンプルにおいて参照レベルを上回るP2Y14もしくはUDP-グルコースのレベルを有すると判定された対象における腎臓の炎症を処置するための薬学的組成物であって、該P2Y14阻害剤がPPTNである、前記薬学的組成物。
- 前記対象がヒトである、請求項1記載の薬学的組成物。
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