KR101445930B1

KR101445930B1 - 신생혈관성 망막질환 진단용 마커 및 치료제 표적으로서의 그 용도

Info

Publication number: KR101445930B1
Application number: KR1020120108483A
Authority: KR
Inventors: 김영수; 유형곤; 김상진; 진종화
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2014-10-07
Also published as: KR20140043175A

Abstract

본원은 신생혈관성 망막질환에서 차별적으로 발현되는 단백질 및 그 용도를 개시한다. 본원에 따른 ORP 150 또는 PGK 1은 신생혈관의 생성이 수반되는 각종 안질환의 치료제 개발의 표적, 상기 단백질 조절제를 포함하는 치료용 조성물, 또는 상기 단백질 또는 그 핵산 검출시약을 포함하는 신생혈관성 망막질환 진단키트 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신생혈관성 망막질환 진단용 마커 및 치료제 표적으로서의 그 용도 {Marker for diagnosing neovascular retinal disease and its use for therapeutic target}

본원은 신생혈관성 망막질환의 치료 약물 개발을 위한 치료 타겟 단백질 및 이의 치료 진단을 위한 바이오마커 발굴에 대한 것이다.

망막병증은 눈 뒤 안구 내부를 덮고 있는 빛에 민감한 얇은 신경막인 망막에 병변이 발생하는 질환이다. 원인과 진행 정도에 따라 다양한 형태의 망막증이 있으며, 예를 들면 미숙아망막병증, 연령관련황반변성, 당뇨망막병증, 고혈압망막병증, 망막혈관폐쇄증 및 중심장액망막병증 등을 들 수 있다.

이 중 당뇨망막병증은 망막의 혈관에 병변으로 시작되며, 비증식형과 증식형으로 진행된다. 망막증은 전체 당뇨병환자의 25%에서 발생하며, 증식형인 경우는 많은 경우 실명으로 이어진다. 치료를 위해 주로 범망막광응고치료술 또는 유리체절제술 등의 외과적 방법이 사용된다. 그러나 이러한 치료법은 매우 침습적이며, 종종 통증을 유발하고 주변부 시야결손, 야맹, 황반부종의 악화를 유발하며, 유리체출혈이나 백내장같이 매체 혼탁이 동반된 경우에는 완벽한 광응고치료를 시행할 수 없는 단점이 있다.

나아가 당뇨망막병증은 초기 증상이 거의 없어 조기 진단이 어려우나, 진단을 위한 바이오마커나, 상술한 외과적 시술이외에 질병억제를 위한 확실한 약물 치료제는 거의 없으며, 신생혈관을 억제하는 항-VEGF 항체 예를 들면 베바시주맵(Bevacizumab)가 유일한 약물 치료제이다.

따라서 초 증상이 거의 없어 조기 진단이 어렵고, 병증이 계속 진행되어 실명에 이르는 환자가 많은 당뇨망막병증의 조기발견과 진행 억제, 고위험군에 대한 조기 치료를 위한 새로운 기술 개발 필요성이 있다.

대한민국 공개특허 제2009-0022291호는 당뇨병성 망막병증 검출용 바이오 마커조성물 및 진단키트에 관한 것으로, 당뇨병성 망막증에서 차별적으로 발현되는 단백질 마커를 제시한다.

대한민국 공개특허 제2009-0012503호는 당뇨병성 망막증 진단용 마커, 조성물 및 키트에 관한 것으로, Chain G Gelsolin G4-G6 Actin complex, Complement component C4a, Complex-forming glycoprotein HC, Ficolin 3 precursor, C4B3 [Homo sapiens], Proapolipoprotein, Histidine-rich glycoprotein, Zn-alpha2-glycoprotein 및 Lambdachain precursor로 이루어지는 군으로부터 선택되는 당뇨병성 망막증 진단용 마커를 개시한다.

하지만 초기 증상이 거의 없어 조기 진단이 어렵고, 병증이 계속 진행되어 실명에 이르는 환자가 많은 당뇨망막병증을 포함하는 신생혈관성 망막증의 조기발견과 진행 억제, 고위험군에 대한 조기 치료를 위한 새로운 마커, 치료제의 발굴을 포함하는 새로운 기술 개발의 필요성이 있다.

본원은 신생혈관성 망막질환의 진단 마커 및 치료제 발굴을 위한 표적 및 그 용도를 제공하고자 한다.

ORP150 및 PGK 1은 OIR 모델을 이용한 생물학적 시료를 iTRAQ 분석 및 LC-ESI-MS/MS 결과, 대조군과 비교하여 신생혈관성 망막 질환에서 그 발현이 유의하게 차이가 나는 것으로 확인된 것이다.

한 양태에서 본원은 ORP 150 또는 PGK 1에서 선택되는 하나 이상의 신생혈관성 망막질환 진단용 마커를 제공한다.

다른 양태에서 본원은 ORP 150 또는 PGK 1에서 선택되는 하나 이상의 마커의 검출시약을 포함하는, 검체의 신생혈관성 망막질환 진단용 키트를 제공한다.

또다른 양태에서 본원은 또한 ORP 150 또는 PGK 1 중 하나 이상의 마커의 존재 또는 양을 검출하는 단계; 및 상기 검출된 마커의 존재여부 또는 양을 상기 검사 대상자의 신생혈관성 망막질환 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 신생혈관성 망막질환 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 검사 대상자의 검체로부터 단백질 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본원은 또한 ORP 150 억제제 또는 PGK 1 조절제 중 하나 이상을 포함하는 신생혈관성 망막질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본원은 또한 ORP 150 단백질 또는 PGK 1 단백질을 제공하는 단계; 상기 단백질을 시험물질과 접촉시키는 단계; 및 상기 시험물질과 접촉된 단백질과 접촉되지 않은 대조군에서의 ORP 또는 PGK 1의 발현을 비교하는 단계를 포함하는, 신생혈관 망막질환 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본원의 OIR 모델을 사용하여 망막병증에서 대조군과 비교하여 차별적으로 발현되는 ORP 150 및 PGK 1은 신생혈관 망막질환의 조기진단을 위한 바이오마커, 진단키트로서 유용하게 사용될 수 있으며 또한 치료제 발굴을 위한 스크리닝의 표적으로 사용될 수 있다.

도 1a는 산소에 의해 유발된 망막병증 (Oxygen Induced Retinopathy, OIR) 모델의 제작 예시도이다.
도 1b는 OIR 마우스 모델의 플랫마운트 및 파라핀 절편 망막시료를 공촛점 현미경으로 관찰한 결과이다. (A)는 망막 혈관이 완전히 발달하기 전인 출생 7일째의 망막혈관을 나타내며, (B)는 12일째까지 75% 산소에 노출된 경우 혈관이 손실된 것을 나타내며, (C) 및 (D) 는 정상 대기로 돌아온 후, 혈관이 손상된 망막이 상대적 저산소 상태에서 새로운 혈관이 생성되고 17일째에 최고치를 보여주는 결과이고, (E)는 정상 대조군인 P17의 정상 망막 혈관총(적색)을 나타내며, (F)는 내부 경계막의 유리체 측상의 신생혈관총 (적색 화살표)를 나타낸다. (E) 및 (F)에서 핵은 DAPI(청색)로 카운터염색되었다. ILM (internal limiting membrane); NFL/GCL (nerve fiber layer/ganglion cell layer); IPL (inner plexiform layer); INL (inner nuclear layer); OPL (outer plexiform layer); ONL (outer nuclear layer). 스케일바: A-C, 500㎛; D, 100㎛; E-F, 20㎛.
도 1b는 OIR 마우스 모델의 플랫마운트 및 파라핀 절편 망막시료를 공촛점 현미경으로 관찰한 결과이다. (A)는 망막 혈관이 완전히 발달하기 전인 출생 7일째의 망막혈관을 나타내며, (B)는 12일째까지 75% 산소에 노출된 경우 혈관이 손실된 것을 나타내며, (C) 및 (D) 는 정상 대기로 돌아온 후, 혈관이 손상된 망막이 상대적 저산소 상태에서 새로운 혈관이 생성되고 17일째에 최고치를 보여주는 결과이고, (E)는 정상 대조군인 P17의 정상 망막 혈관총(적색)을 나타내며, (F)는 내경계막의 유리체 측상의 신생혈관총 (적색 화살표)를 나타낸다. (E) 및 (F)에서 핵은 DAPI(청색)로 카운터염색되었다. 약어 및 스케일 바는 상기 정의한 바와 같다.
도 2는 본원에서 채용된 iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantification) 표지와 질량분석의 원리를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본원에서 채용된 iTRAQ 실험절차를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 iTRAQ 실험에서 규명된 단백질의 구성 및 벤다이어그램이다. OIR 망막에 대한 3회 iTRAQ 실험 결과 95% 신뢰도 수준으로 2437 개 펩타이드로부터 699개 단백질을 규명하였다.
도 5는 도 4에서 규명된 699개 단백질을 분자적 기능에 따라 분류한 것이다.
도 6은 log2 iTRAQ 분포 및 차이에 있어 유의한 변화를 찾기 위해 컷오프 값을 결정하기 위한 그래프이다. log2 iTRAQ 비의 분포로 (A) 생후 12일 (P12) 대 생후 12일 대조군 (P12C), (B) P17 대 P17C, 및 (C) P17 대 P12를 나타내며, 동일한 3회의 iTRAQ 실험 결과를 비교하여 얻은 결과이다. 3회 모든 쌍의 비는 좁은 정규 분포를 나타내며 평균값은: 0.019±0.25, 0.038±0.25, 및 0.038±0.25 (P12 대 P12C); 0.014±0.24, 0.027±0.23, 및 0.031±0.25 (P17 대 P17C); 및 0.017±0.22, 0.025±0.23, 및 0.022±0.23 (P17 대 P12).
도 7은 생후 12일 (P12) 및 17일 (P17) 망막에서 차별적으로 발현되는 단백질의 기능적 분류를 나타낸다: (A) P12 대 생후 12일 대조군 (P12C), (B) P 17 대 P17C, 및 (C) P17 대 P12. 차별적으로 발현되는 72 종류의 단백질은 PANTHER ID 번호를 이용하여 5개의 주요 생물학적 프로세스에 따라 분류되었으며, 각 분류군은 상향 또는 하향 발현되는 단백질의 백분율로 나타내었다.
도 8은 P12 및 P17 망막에서 차별적으로 발현되는 단백질에 대한 클러스터 분석결과를 나타낸다. (A)는 iTRAQ 실험결과 차별적으로 발현되는 단백질의 평균 면적 수치를 기본으로 한 MultiExperiment Viewer (Version 4.3)를 사용한 계층적 클러스터링 분석 (HLS)이며, 특정 발현 패턴은 서브클러스터링 분석으로 수득하였으며, 4개의 클러스터 - 1 (P17에서 상향발현, B), 2 (P17 모두에서 상향발현, C), 3 (P12에서 상향발현, D), 및 4 (P17에서 하향발현, E)를 분석하였다. Y-축: 각 대조군과 비교한 변화 (배수).
도 9a 내지 9d는 LTQ Velos 실험을 통해 규명된 단백질을 나타낸다. 도 9a는 OIR 망막을 사용한 LTQ Velos 실험에서 규명된 총 1074 종류의 단백질을 나타내며, 도 9b는 생후 12일 대조군 (PC12C)과 P12 망막조직에서, 364 종류의 단백질이 공통되며, 34 및 578 종류의 단백질이 각각 P12C 및 P12 망막조직에 특이적인 것을 보여주는 벤다이어그램이고, 도 9c는 P17C 및 P17 망막조직에서 496 종류의 단백질이 공통되며, 135 및 270 종류의 단백질이 각각 P17C 및 P17 망막조직에 특이적인 것을 보여주는 벤다이어그램이고, 도 9d는 LTQ에서 723 종류의 단백질이 새로이 규명되어, iTRAQ와 LTQ 실험을 합하여 총 1422 종류의 단백질이 규명되었음을 보여주는 벤다이어그램이다.
도 10은 OIR에서 크리스탈린 αA, 크리스탈린 βS, 및 LEDGF의 위치를 면역형광법으로 분석한 결과이다. 크리스탈린 αA는 대조군 및 OIR P12 망막과 비교하여 신경절 세포층 및 핵내층에서 강한 면역반응이 관찰되었으며 (A-C), 크리스탈린 βS는 대조군 망막(D)과 비교하여 OIR P12 (E) 및 P17 망막 (F)의 ONL에서 반응이 관찰되었으며, 모든 망막 핵층에서 양성으로 나타난 LEDGF의 경우는 그룹간 차이가 없었다 (G-I). 약어는 상기 도 1에 정의한 바와 같다. 스케일바: 20 ㎛ .
도 11은 OIR에서 크리스탈린 αB에 대한 면역위치분석 및 웨스턴블랏 분석 결과이다. 대조군 망막의 경우 크리스탈린 αB (초록)에 대한 면역반응이 신경절 세포층/신경섬유층 (GCL/NFL), 내부 플렉시폼 층(IPL), 핵내층 (INL), 및 핵외층 (ONL) (A)에서 양성으로 나타났다. P12 및 P17의 경우, 크리스탈린 αB에 대한 면역반응이 증가하였다 (B-D). OIR P17의 경우, 내망막표면 및 ONL에서 신호강도가 증가 하였다 (C, D). OIR P12 및 P17 망막의 경우, 크리스탈린 αB P-Ser-59 (초록)에 대한 면역반응이 대조군과 비교하여 GCL/NFL에서 강하게 나타났다 (E-H). OIR P17 망막의 경우, BS-1 렉틴 (적색)과 크리스탈린 αB P-Ser-59의 이중 면역표지의 고배율 영상으로부터 GCL/NFL에 대하여 신생혈관 총(tufts)은 약하지만 양성인 것으로 나타났다 (I-L). 웨스턴블랏 분석결과, 크리스탈린 αB 및 크리스탈린 αB P-Ser-59의 망막 발현이 대조군과 비교하여 P12 및 P17에서 현저히 상향발현된 것으로 나타났다 (M,N). OIR P17 망막의 경우, 크리스탈린 αB P-Ser-59의 발현이 OIR P12 망막과 비교하여 발현이 보다 증가되었다 (N). 데이터는 3회의 독립적인 웨스턴블랏 결과의 평균 ±S.E.M 이다. 스케일바: A-H, 20㎛ ; I-L, 10㎛. 청색, DAPI.
도 12는 뮐러세포에서 주로 발현되는 단백질에 대한 면역위치 분석결과를 나타낸다. OIR P17 망막의 경우, 교질섬유성산성단백질 (GFAP), 비멘틴, 및 글루타민 합성효소 (GS)의 발현이 대조군 및 OIR P12와 비교하여 증가하였으며, 특히 뮐러세포의 먼쪽가지에서 증가한 것으로 나타났다(A-C). GS와 같은 위치에 있는 것으로 나타난 망막 카르보닉 안하이드라제 II (CA II)은 OIR P17 망막에서 증가하였다 (D, E). 웨스턴블랏을 이용한 CA II 정량결과 CA II 단백질은 대조군 망막과 비교하여 OIR P12 망막에서 발현이 현저하게 증가한 것으로 나타났다 (H, I). 또한, OIR P17 망막의 CA II는 OIR P12과 정상 대조군 망막과 비교하여 발현이 증가하였다 (H, I). 데이터는 3회의 독립적인 웨스턴블랏 결과의 평균 ±S.E.M 이다 (I). 대조적으로, 뮐러세포의 CA XIV 에 대한 면역반응은 변화가 없었으며(F), CA XIV의 웨스턴블랏 결과도 OIR 및 대조군에서 차이가 없었다 (H). 흥분성 아미노산 수송체(EAAT-1)는 모든 망막층에서 양성인 것으로 나타났으며, OIR 및 대조군 망막에서 뚜렷한 차이는 나타나지 않았다 (G). P12C 및 P17C의 경우, 대조군으로 사용된 안구는 각각 P12 및 P17에 적출되었다. 약어 및 스케일바는 상기 도 1에 정의한 바와 같다.
도 13은 OIR에서 CA II 및 비멘틴의 면역위치 분석 결과를 나타낸다. OIR P17 망막에서, CA II 및 비멘틴에 대한 면역반응이 대조군 및 OIR P12 망막과 비교하여 증가하였으며, 특히 뮐러세포의 먼쪽가지에서 증가한 것으로 나타났다 (A-H). CA II는 망막에서 비멘틴과 같은 위치에서 발현된 것으로 나타났다 (I-L). 약어 및 스케일바는 상기 도 1에 정의한 바와 같다.
도 14는 OIR에서 PGK 1의 면역위치 분석결과를 나타낸다. OIR P17 망막의 경우, PGK 1 (초록)은 모든 망막층에서 면역반응을 나타냈고 (A-C) 신생혈관총과 약하게 같은 위치에서 검출되었다 (D, E). 혈관은 TRITC-표지된 BS-1 렉틴 (적색)으로 염색되었으며, 핵은 DAPI(청색)로 카운터염색되었다. 약어 및 스케일바는 상기 도 1에 정의한 바와 같다.
도 15는 OIR에서 ORP150의 면역위치 분석결과를 나타낸다. 망막 조직 절편을 분석한 결과, ORP150(초록)에 대한 면역반응은 대조군 (A, B, C) 및 P17 망막 (D, E, F)의 신경절 세포층의 핵주변, 핵내층, 및 망막색소상피에서 검출되었다. OIR P17 망막의 경우, ORP150는 신생혈관총과 같은 위치에서 발현되나 망막내 혈관구조에서는 발현되지 않았다 (G, H). 웨스턴블랏을 이용한 ORP150 정량결과 ORP150은 P12 및 P17 에서 대조군 망막과 비교하여, OIR P12 및 P17 망막에서 발현이 현저하게 증가한 것으로 나타났다(I). 데이터는 3회의 독립적인 웨스턴블랏 결과의 평균 ± S.E.M 이다. 약어 및 스케일바는 상기 도 1에 정의한 바와 같다.
도 16은 OIR에서 ORP150 및 Iba-1의 면역위치 분석결과를 나타낸다. P17 OIR 망막 조직 절편에서 소교세포 마커인 Iba-1과 같은 위치에서 발현되지 않았다.스케일바: 20㎛ .
도 17은 망막색소상피에서 siRNA를 이용한 ORP150의 결여가 VEGF에 미치는 영향을 분석한 결과이다. ORP150 siRNA를 ARPE-19 세포에 전달이입 후 24시간째에 단백질을 분석하였으며(A), 웨스턴블랏의 밴드를 덴시토미터를 이용하여 스캔한 후, 그 결과를 그래프로 나타내었다. ARPE-19 세포에서 분비되는 VEGF는 ELISA로 분석한 결과 전달이입 후 24시간에 현저하게 감소하였다 (B). 데이터는 3회의 독립적인 실험결과의 평균 ± S.E.M. *P < 0.01 vs. 대조군. 대조군의 수치를 100%로 설정하였다.
도 18은 ORP150을 표적으로 하는 siRNA 가 OIR의 혈관신생에 미치는 영향을 분석한 결과이다. ORP150을 표적으로 하는 siRNA를 수정체내에 투여 한 후 ORP150에 대한 웨스턴블랏 결과 ORP150의 발현이 현저하게 줄었다 (A). 데이터는 3회의 독립적인 웨스턴블랏 실험결과의 평균 ± S.E.M. 대조군 siRNA가 투여된 경우와 비교하여 (B), ORP150을 표적으로 하는 siRNA가 투여된 경우, 망막 플랫 마운트에서 망막의 혈관신생이 감소하였다(C). 망막의 혈관신생에 대한 정량적 평가는 내경계막의 유리체측 상의 혈관 내강 (화살표)의 개수를 세어서 수행하였다 (D, E, F). 각 그룹(n=6 안구)의 경우 조직 절편 당 평균 내강의 개수는 평균 ± S.E.M로 나타냈다. 결과에서 보는 바와 같이 대조군과 ORP150 siRNA 처리된 눈 사이에, 망막 혈관신생에 있어 현저한 차이가 있음을 알 수 있다 (*P<0.05). 스케일바: 500 ㎛ (B,C), 50 ㎛ (E,F).
도 19는 ORP150 siRNA를 수정체내에 주사한 후 글루타민 합성효소 및 비멘틴의 면역위치 분석 결과로, OIR 마우스모델에서 글루타민 합성효소 및 비멘틴에 대한 면역반응은 대조군 siRNA로 처리된 망막 (A-C)와 ORP 150 siRNA 처리된 망막 (D-F)간에 차이가 없음을 나타낸다. 스케일바: 20 ㎛.

본원은 신생혈관 생성시 발현되는 특이적 단백질을 발굴하고, 발굴된 단백질의 발현 양상과 이의 신생혈관성 망막 질환과의 연관성에 대하여 OIR 모델을 이사용하여 연구한 결과, ORP150 및 PGK 1이 iTRAQ 분석 및 LC-ESI-MS/MS 분석을 통해 대조군과 비교하여 신생혈관성 망막 질환에서 그 발현이 유의하게 차이가 나는 것을 규명하여 완성한 것이다.

신생혈관 생성시, 특히 신생혈관 발생 부위에 뚜렷하게 증가하는 ORP150 및 PGK 1에서, 전자는 산소조절성단백질 (Oxygen-Regulated Protein, ORP 150)로, 저산소 상향발현 단백질 1 (Hypoxia up-regulated 1 (HYOU1)) 또는 글루코스 조절 단백질 (glucose-regulated protein (GRP170))로도 불리우며, 후자는 포스포글리서레이트 카이나제이다.

따라서 한 양태에서 본원은 ORP 150 또는 PGK 1에서 선택되는 하나 이상의 신생혈관성 망막질환 진단용 마커 또는 이를 포함하는 신생혈관성 망막질환 진단용 마커 또는 마커 조성물에 관한 것이다.

본원에서는 OIR 동물모델을 통해, 당뇨망막병증, 연령관련황반변성 등에 동반된 맥락막신생혈관, 미숙아망막병증, 망막혈관폐쇄 등 신생혈관성 망막질환의 주요 원인중의 하나인 혈관신생을 유도해 신생혈관의 생성에 따른 주요 단백질 변화를 조사하고, 단백질 동정과 정량을 수행하였다. OIR 모델은 허혈성 당뇨망막 병증의 좋은 동물 모델로, 과산소 조건에서는 망막 혈관과 혈관의 성장저해를 유도하지만, 이를 다시 정상 대기 조건으로 바꾸면 상대적 저산소 조건을 유발하여 신생혈관 인자의 발현을 유도하게 된다.

본원에서 동정된 ORP 150 단백질은 150-kDa 크기의 산소조절성단백질이며, PGK 1은 포스포글리서레이트 카이나제로 대조군 비교하여 신생혈관 발생 부위에 뚜렷하게 그 발현이 증가되었다.

특히 ORP 150의 발현을 사람의 망막 색소 상피세포 (ARPE-19 cell)에서 억제한 결과 신생혈관 발생을 촉진하는 가장 중요한 인자로 알려진 혈관내피성장인자 (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 분비의 감소를 확인하였으며, 또한 산소유발 망막병증(OIR) 동물 모델을 사용하여 ORP 150에 대한 siRNA로 ORP 150의 발현을 억제한 결과, 신생혈관의 발생이 감소하는 것을 관찰하였다.

따라서 망막 세포에서 ORP 150의 발현을 억제하는 경우, 신생혈관의 형성과 관련된 질환, 특히 신생혈관성 망막질환을 치료할 수 있다. 또한 PGK 1은 ORP150과는 반대로 발현 증가시 신생혈관을 억제할 가능성이 있으므로 PGK 1의 발현을 상향 발현시킬 수 있는 조절제가 신생혈관성 망막질환의 치료에 유용할 수 있다.

따라서 다른 양태에서 본원은 또한 ORP 150 억제제 또는 PGK 1 조절제 중 하나 이상을 포함하는 신생혈관성 망막질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본원에서 사용된 용어 신생혈관성 망막질환은 혈관신생과 관련된 안질환으로 이로 제한하는 것은 아니나, 예를 들면 당뇨망막병증, 미숙아망막병증, 연령관련황반변성, 고혈압망막병증, 망막혈관폐쇄증 또는 중심장액망막병증을 포함한다. 본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 질환은 당뇨망막병증이다.

따라서 ORP 150 또는 PGK 1 단백질의 발현 또는 활성을 억제/조절하는 다양한 물질이 치료제로서 사용될 수 있다. 여기에서 발현은 mRNA로의 전사 및 단백질로의 번역 수준에서의 억제/조절을 포함하는 것이며, 활성의 억제/조절은 생성된 단백질의 정상적인 기능의 감소, 억제 및/또는 방해 또는 조절을 의미하는 것이다. ORP 150 또는 PGK 1 단백질 억제/조절제로서 사용될 수 있는 물질은 이로 제한하는 것은 아니나 저분자화합물, 항체, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 및 폴리펩타이드를 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "치료" 이란 질환, 또는 질환으로 인한 증상 또는 상태의 억제, 제거, 경감, 완화, 개선, 및/또는 예방을 포함하는 개념이다.

본원은 ORP 150 및/또는 PGK 1 억제/조절과 관련된 것으로, 이러한 기능을 갖는 공지의 다양한 물질의 본원에 포함된다. 본원에서 억제제는 ORP 150 또는 PGK 1 단백질 또는 이의 mRNA를 포함하는 핵산과 결합 또는 상호작용하여 이들 단백질의 발현 (전사 및 번역) 및/또는 활성을 억제/조절할 수 있는 물질이다. 이러한 물질은 예를 들면 저분자 화합물, 항체 및 폴리펩타이드를 포함하는 단백질, 및 RNA와 DNA를 포함하는 핵산분자 또는 이들의 임의의 조합을 모두 포함하는 것이다. 본원에서 발현이란 유전자의 전사 및 전사체의 단백질로의 발현을 의미하며, 활성이란 발현된 단백질이 세포내에서 제 기능할 수 있도록 하는 생물학적 작용을 의미한다.

본원에서 ORP 150 및/또는 PGK 1 조절제란 예를 들면 ORP 150 또는 PGK 1 에 결합하거나 또는 이와 상호작용하여 이의 적어도 한가지의 생물학적 특징 및/또는 활성을 변경하는 물질을 의미한다. 본원에 따른 일 구현예에서 PGK 1 조절제는 PGK 1 단백질의 발현 (전사 및 번역) 및/또는 활성을 증가시키는 물질이다

본원의 일 구현예에서, 억제제 또는 조절제는 이를 코딩하는 유전자의 전사 및/또는 전사체의 단백질 합성을 특이적으로 조절할 수 있는 안티센스 올리고뉴큐클레오타이드, siRNA(small interfering RNA), shRNA (small hairpin RNA) 또는 miRNA (microRNA)이다. siRNA, shRNA 및 miRNA는 RNA 간섭 (interference) 작용을 통해, 예를 들면 짧은 길이의 간섭 RNA (siRNA)가 서열 특이적으로 전사체에 결합하여, RISC(RNA Induced Silencing Complex)를 형성하여, 전사된 RNA가 세포내에 단백질로 발현될 수 없도록 (silencing) 한다. 이러한 단백질 발현의 억제에 의해 상기 단백질에 의해 영향을 받는 다른 단백질의 발현이 증가할 수 있다. 예를 들면 특정 단백질의 발현을 억제하는 내인성 간섭 RNA에 결합하는 RNA는 상기 단백질의 발현을 상향 조절 할 수 있다. 이러한 siRNA, shRNA 또는 miRNA는 그 표적 서열에 상당히 상보적인 서열을 갖는다. 상당히 상보적 서열이란, 표적 유전자의 적어도 연속적인 15 베이스 길이의 서열과 적어도 약 70% 상보성, 적어도 약 80% 상보성, 적어도 약 90% 상보성, 또는 약 100% 상보성을 의미한다. 한 구현예에서는 본원의 실시예에서 ORP 150의 사일런싱에 사용된 siRNA가 포함될 수 있으나 이로 한정하는 것으로 아니며, 표적 핵산에 결합하여 사일런싱의 기능을 하는 한 다양한 유래의 ORP 150 유전자를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및/또는 miRNA가 사용될 수 있으며, 이들의 생물학적 동등체, 유도체 및 유사체도 포함하는 것이다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 바와 같으며, 예를 들면 표적 단백질의 임의의 코딩 서열에 결합하여, 표적 단백질의 발현을 억제/감소시키는 짧은 합성 핵산이다. 안티센스 RNA는 표적 유전자 및 전달 방법에 따라 적절한 길이를 가질 수 있으며, 예를 들면 약 6, 8 또는 10 내지 40, 60 또는 100 뉴클레오타이드이다. 한 구현예에서 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및/또는 miRNA은 인간 유래의 것으로 예를 들면 인간 유래 ORP 150는 (hypoxia up-regulated 1 / HYOU1)는 MIM 601746, PGK 1은 (phosphoglycerate kinase 1 / PGK 1) 은 MIM 311800를 예로 들 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원의 다른 일 구현예에서, ORP 150 및/또는 PGK 1 조절제는 이를 특이적으로 인식할 수 있는 항체이다. 본원에서 사용된 용어 항체는 완전한 항체, 항체분자의 항원결합 단편 및 이들과 기능적으로 동등한 항체 또는 단편을 포함하는 것이다. 또한 본 발명의 항체는 IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 또는 IgY 타입일 수 있으며, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2 클래스 또는 그 하부클래스일 수 있다. 본 발명의 항체는 모노클로날, 폴리클로날, 키메라, 단쇄, 이특이성, 유인원화 및 인간화된 항체 및 이의 활성 단편을 포함하는 것이다.

본원의 다른 구현예에서, ORP 150 및/또는 PGK 1 조절제는 그 활성 및/또는 작용/기전을 조절, 간섭, 방해 및/또는 억제할 수 있는 폴리펩타이드이다. 본원에서 사용된 용어 폴리펩타이드는 천연 또는 합성의 아미노산의 중합체를 일컫는 것으로 이러한 작용을 갖는 한 특정 길이를 지칭하는 것은 아니며, 펩타이드, 올리고펩타이드를 포함한다. 이러한 폴리펩타이드는 정상적 ORP 150과 경쟁하여 이의 작용을 방해하는 역할을 하는 경쟁적 억제자로서 기능할 수 있다. 폴리펩타이드는 자연적 또는 인위적으로 변형된 것 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등으로 변형된 것도 포함한다.

본원의 치료제는 상기 언급한 ORP 150 및/또는 PGK 1 억제제/조절제 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 본원의 치료제는 신생혈관성 망막질환의 치료 또는 예방을 위하여 단독으로, 또는 수술, 약물치료 및 생물학적반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본원의 치료제는 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

본원의 치료제의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형, 코/호흡기를 통해 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위해서는 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양할 수 있다. ORP 150 또는 PGK 1을 표적으로 하는 siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, shRNA 제제 및 폴리펩타이드를 포함한 단백질 제제의 경우 비경구 투여가 선호될 수 있으나 다른 경로 및 수단을 배제하는 것은 아니다. 전형적인 약물의 경우 투약단위체는, 예를 들어 약 0.01 mg 내지 100 mg를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다. 일일 투여량은 약 1μg 내지 10g 일 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

본원에서 ORP 150 단백질 및 PGK 1 단백질은 망막질환이 발생한 조직에서 대조군과 비교하여 차별적으로 발현된다. 따라서 다른 양태에서 본원은 ORP 150 단백질 및/또는 PGK 1 단백질, 또는 이들 각각을 코딩하는 핵산의 검출시약을 포함하는 검체의 신생혈관성 망막질환 진단용 마커 조성물 또는 진단용 키트에 관한 것이다.

본원에서 용어 "생물학적 시료 또는 검체"는 인체나 포유동물로부터 얻어지는 모든 고형 또는 액상의 시료, 예컨대, 특정 장기 유래의 조직, 오줌, 타액, 전혈, 혈장 또는 혈청 시료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 마커 단백질은 조직 또는 혈액 시료에 포함되어 있다.

본원의 신생혈관성 망막질환 진단용 마커의 검출은 정량적 검출 또는 존재여부 수준에서의 검출을 모두 포함하는 것으로, 본 질환의 발병 및 진행에 대한 지표가 될 수 있으며, 본 질환의 발병, 질환의 진행, 질환의 진단 또는 예후에 이용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 마커 단백질은 신생혈관성 망막질환 치료용 조성물 또는 진단 키트를 이용하여 신생혈관성 망막질환 진단에 필요한 정보 제공 방법에 사용될 수 있다.

본 발명의 명세서에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본원에서 용어 "진단용 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 신생혈관성 망막질환이 발생한 조직 또는 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 검체에 비하여 질환이 발생한 조직이나 부위에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질 , 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본원에서 신생혈관성 망막질환 진단 마커는 신생혈관성 망막질환 조직이나 혈액에서 발현이 증가하는 ORP 150 단백질 또는 PGK 1 단백질이다.

본원에 따른 일 구현예에서 본원의 신생혈관성 망막질환 진단용 마커가 사용되는 검체는 방수(aqueous humor), 유리체(vitreous), 조직, 전혈, 혈청 또는 혈장 중 하나 이상이다. 다른 구현예에서 본원에 사용되는 검체는, 비교 분석을 위해, 진단이 필요한 검사 대상자의 검체는 물론, 정상 대조군, 특정 질환을 갖는 대조군 유래의 검체가 또한 사용될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서 검체는 전혈이다.

ORP 150 및 PGK 1 단백질 및 그 핵산 서열은 공지된 것이며, 또한 앞서 언급한 바와 같으나, 이로 한정하는 것은 아니며, 이의 기능적 동등체를 포함하는 것이다.

본원에서 용어 검출시약은 본원의 마커를 단백질 또는 핵산 예를 들면 mRNA 수준에서 정량적으로 또는 존재여부의 판단을 위해 검출할 수 있는 물질이다. 단백질의 양, 존재여부 발현패턴의 분석을 위한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테를로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등을 들 수 있다. 단백질 또는 핵산 수준검출을 위한 시약은 공지된 것으로서, 예를 들면 전자는 항원-항체반응, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있거나, 또는 질량분광분석기를 이용할 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)과 함께 사용될 수 있다.

즉 본원에 따른 키트는 ORP 150 또는 PGK 1 마커를 단백질 또는 핵산 예를 들면 mRNA 수준에서의 검출에 필요한 시약을 포함할 수 있다. 예를 들면 상기 단백질 수준에서 검출할 수 있는 시약은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 수용체, 리간드 또는 보조인자 등을 포함할 수 있다. 이러한 시약은 필요한 경우 나노입자 또는 칩에 통합하여 사용할 수 있다. 단백질은 또한 질량분광분석기를 이용하여 검출될 수 있다.

RNA 수준에서의 검출, 발현량 또는 패턴의 검출을 위해 전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)/중합효소연쇄반응, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR RNase 보호 분석법, 칩 또는 노던블랏 등을 이용한 방식이 사용될 수 있으며, 이러한 분석법은 공지된 것이며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 상기 mRNA의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 RT-PCR로 측정하기 위한 방법에서 검출시약으로, 예를 들면 본원 마커의 mRNA에 특이적인 프라이머를 포함한다. 프라이머는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다.

본원에 사용되는 상기 검출 시약은 신호검출을 위해 형광물질과 같은 발색물질과 컨쥬게이션 된 것일 수 있다.

본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것 방법을 선택할 수 있을 것이다. 원의 일 구현예에 따르면 검출시약은 항체를 포함하며, 본원의 ORP150 또는 PGK 1 단백질 검출은 이에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 이용하여 실시된다.

본원에 이용될 수 있는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불멸 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.

본원의 다른 구현예에 따르면 검출시약은 RNA 분석용 시약으로, 본원의 ORP150 검출은 mRNA 수준에서 실시된다. mRNA 검출은 통상 노던블랏이나 역전사 PCR (중합효소연쇄반응)을 통해 수행된다. 후자의 경우 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성 한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H.; Bearss, D. J.; Browne, L. W.; Calaluce, R.; Nagle, R. B.; Von Hoff, D. D., Identification of differentially expressed genes in pancreatic cancer cells using cDNA microarray. Cancer Res 2002, 62, (10), 2890-6)에 기재되어 있다.

본원의 또다른 일 구현예에 따르면 질량분석법(Mass spectrometry)를 이용하여 마커를 검출할 수 있으며, 검체로부터 단백질을 분리 한 후 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방식대로 분석될 수 있으며, 또한 예를 들면 ( Kim, S. J.; Yu, H. G.; Yu, J.; Park, K. S.; Jang, I. J.; Kim, Y., Verification of biomarkers for diabetic retinopathy by multiple reaction monitoring. J Proteome Res 2010, 9, (2), 689-99 / Anderson, L.; Hunter, C. L., Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics 2006, 5, (4), 573-88.)를 참조할 수 있다.

이러한 본원의 마커를 검출할 수 있는 시약은 구획이 되어 있는 용기에 개별적으로 분주되어 존재할 수 있으며, 이러한 의미에서 본원은 또한 본원의 마커 검출시약을 구획되어 포함하는 장치/기구에 관한 것이다.

다른 양태에서 본원은 검체로부터 ORP 150 및/또는 PGK 1 단백질, 및/또는 그 RNA의 존재여부 또는 그 양을 검출하는 단계; 및 상기 검출된 마커의 존재여부 또는 양을 상기 검사 대상자의 신생혈관성 망막질환 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 신생혈관성 망막질환 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 검사 대상자의 검체로부터 단백질 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 ex vivo에서 수행되며, 검체는 방수, 유리체, 조직, 전혈, 혈청 또는 혈장 중 하나 이상을 사용하여 수행될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 전혈, 혈장 또는 혈청이 사용된다.

본원의 방법에서 마커의 존재/부존재 또는 발현양의 검출은 단백질 및/또는 mRNA 발현 수준에서 결정될 수 있으며, 이에 관해서는 언급한 바와 같다.

본원의 방법은 신생혈관성 망막질환의 진단 또는 예후에 관한 정보를 제공하기 위해, 마커 분석 결과에 추가하여, 환자의 비단백질 임상정보 즉, 마커이외의 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 비단백질 임상정보란, 예를 들면 환자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 검안경 검사(Opthalmoscopy), 안저촬영(Funds photography), 또는 형광안저혈관조영술 (Fluorescin angiography) 중 하나 이상을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원 방법은 마커의 검출 결과를 신생혈관성 망막질환의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하며, 일 구현예에 따르면 상기 연관시키는 단계는 결정된 각 마커의 단백질 양 또는 존재여부를 정상 대조군에서 결정된 상기 각 마커의 검출결과와 비교, 예를 들면 그 증감을 비교한 후, 이를 근거로 진단하는 것이다. 예를 들면 대조군의 값과 비교하여 예를 들면 ORP 150이 유의하게 증가된 경우, 대상체에서 상기 질환이 발생한 것으로 진단하는 정보를 제공할 수 있다. 본원 일 구현예에 따르면 상기 연관시키는 단계는 정상 대조군과 대상체의 시료를 비교한 후, 상기 각 마커에 대하여 발병여부를 진단할 수 있는 임계값을 설정한 후, 대상체의 검출 결과를 상기 임계값과 비교할 수 있다. 임계값 설정은 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방법을 참조할 수 있다.

나아가 본원은 신생혈관성 망막질환에서 차별적으로 발현되는 ORP 150 단백질 및/또는 PGK 1에 근거한 것으로, 한 양태에서 ORP 150 및/또는 PGK 1을 표적으로 하는 신생혈관 망막질환 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 방법에 의해 선별된 물질은 특히 신생혈관성 망막질환은 억제제/치료제로서 유용하다.

상기 방법은 ORP 150 및/또는 PGK 1 단백질을 발현하는 세포를 제공하는 단계; 상기 단백질을 시험물질과 접촉시키는 단계; 및 상기 시험물질과 접촉된 단백질과 접촉되지 않은 대조군에서의 ORP 150 및/또는 PGK 1의 발현 및/또는 활성의 증감을 비교하는 단계를 포함한다.

본원의 방법에 사용되는 시험물질은 ORP 150 및/또는 PGK 1 단백질의 발현 및/또는 활성을 조절할 것으로 기대되는 물질로, 예를 들면 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.

본원의 스크리닝 방법에 사용될 수 있는 ORP 150 또는 PGK 1 은 앞서 언급한 바와 같으며, ORP 150 또는 PGK 1 단백질을 스크리닝을 하는 구체적 방법에 따라 다양한 숙주 유래의 것이 본 방법에 사용될 수 있으며, 전장 또는 잘린 형태의 것이 모두 포함된다. 또한 동일한 숙주, 예를 들면 인간에서 유래된 것이라도 특정 개인, 지역, 환경 등에 따라 서열변이가 있을 수 있으며, 이러한 것은 물론 일부 서열이 변형(결실, 치환, 부가)되었으나, 기능적으로 동등한 변이체가 모두 본 발명에 사용될 수 있다. 한 구현예에서는 인간 유래의 것으로 이에 관하여는 앞서 언급한 바와 같다.

본원의 방법에는 ORP 150 또는 PGK 1 단백질을 발현하는 세포가 사용될 수 있으며, 또는 이러한 세포를 포함하는, 예를 들면 본원 실시예에서 사용된 것과 같은 OIR 동물모델이 사용될 수 있다.

ORP 150 또는 PGK 1 단백질을 발현하는 세포 및 동물모델은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 전자의 경우 일 구현예에서 유전자 재조합 기술을 이용하여 스크리닝에 사용되는 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 적당한 숙주 세포에서 발현시켜 사용하는 것이다. 예를 들면 상기 단백질을 코딩하는 상응하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 진핵세포 세포 예를 들면 곤충세포, 포유류 세포에 전달한 후 (stable 또는 transient) 사용하는 것이다. 상기 세포를 세포의 성장 유지가 가능한 조건에서 시험물질과 접촉한 후에 ORP 150의 발현을 RNA 및 단백질 수준에서 조사하는 것이다. ORP 150의 발현 RNA 및 단백질 수준에서의 검출방법은 앞서 언급한 바와 같다.

본원에 따른 일 구현예에서, ORP 150 또는 PGK 1 단백질을 발현하는 세포는 예를 들면 상기 단백질의 전부 또는 일부를 발현 (Transient 또는 Stable 전달이입 또는 내인성 발현)하는 포유류 세포, 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 망막 색소 상피세포 (ARPE-19 세포), 뮐러 교질 세포, 또는 망막혈관내피세포를 세포배양 플레이트에 배양한 후, 여기에 시험물질을 첨가한 후, 일정 시간 후에 세포로부터, 총 단백질을 추출한 웨스턴블랏을 수행하여, 대조군(시험물질을 처리하지 않은 경우)와 비교하여, 발현이 억제된 것을 신생혈관성 망막질환의 치료용 후보물질로 선별할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서 상기 후보물질은 예를 들면 본원의 실시예에서 사용된 것과 같은 siRNA를 포함한다.

나아가, 본 이론으로 한정하는 것은 아니지만, ORP 150 또는 PGK 1 단백질은 VEGF에 작용하여 신생혈관을 억제하므로, 본원에 따른 다른 구현예에서는 상술한 바와 같이 ORP 150 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리한 후 VEGF 농도 변화를 측정하여, 신생혈관성 망막질환의 후보물질을 선별한다.

본 방법에서 사용되는 단백질의 양, 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 단백질 발현 또는 활성의 감소를 가져오는 물질을 상호작용을 억제하는 물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소, 약 40% 이하 감소, 약 30% 이하 감소, 약 20% 이하 감소를 의미하나, 이를 벋어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.

또한 이런 치료제를 스크리닝하는 방법으로는, 본원의 마커를 친화성 칼럼에고정시키고 이를 시료와 접촉시켜 정제하는 방법 [Pandya et al, Virus Res 87: 135-143, 2002], 투-하이브리드 방법을 이용하는 방법 [Fields, S and Song, O., Nature 340: 245 -246, 1989], 웨스턴블랏 ("MolecularCloning - A Laboratory Manual" Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al.(1982) section18.30-18.74], 대용량스크리닝 방법 [Aviezer et al, J Biomol Screen 6: 171-7, 2001] 등 을 비롯한 다수의 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 당업자라면 구체적인 실시양태에 따라 적절한 방법을 선택할 수 있다. 스크리닝에 사용하기 위한 시험물질을 포함하는 시료로서는 조직 추출액, 유전자 라이브러리의 발현산물, 합성화합물, 합성 펩티드, 천연 화합물 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하나 본 발명의 범주가 이로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: OIR ( Oxygen Induced Retinopathy ) 동물모델의 제작

OIR은 종전에 기술된 바와 같이 제조되었다 (Smith, L.E et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 1994, 35, 101-111; Connor, K.M et al., Nat Protoc. 2009, 4, 1565-1573). 요약하면, 신생 C57BL/6 마우스를 무작위로 실험군과 대조군으로 나누었다. 태어난 지 7일째 (P7)에 새끼와 이를 보살피는 어미 마우스를 75% 산호 대기하에 두었다. 산소농도는 Pro-Ox 110 산소조절기 (Bio-Spherix, Redfield, NY, USA)를 사용하였다. CO₂를 소거하기 위하여 50g의 소다 라임을 챔버의 바닥에 두었다. 새끼는 P12일째에 정상 대기로 돌아왔고, 마우스는 P12 및 P17일째에 희생되었다. P17에 몸무게가 6g미만인 마우스는 혈관 형태의 변형 가능성으로 인해, 분석에서 제외하였다. OIR의 발생을 확인하기 위해, 망막플랫마운트(그룹당 8개 안구)와 파라핀에 포매된 망막 절편(그룹당 10개 안구)을 제조하고, 망막 혈관을 TRITC-표지된 BS-1 렉틴 (L5264, Sigma Aldrich,St. Louis, MO, USA)으로 제조자의 방법대로 염색한 후, 공촛점형광현미경(LSM 500, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany)을 이용하여 P12 망막에서 망막혈관 폐색 (retinal vaso-obliteration)을 검사하고, P17에서 혈관 재성장 및 신생혈관생성 여부를 관찰 하였다. 마우스는 4개의 그룹으로 나누었다: P12 및 P17에 적출된 대조군 각각 P12C 및 P17C; P12 및 P17에 적출된 OIR그룹 각각 P12 및 P17.

모든 동물실험은 서울대학교 생물의학연구소의 동물실험윤리위원회 (IACUC)의 승인하에 안및시연구학회(ARVO)의 이 분야에서의 동물실험에 관한 연구지침에 따라 수행되었다.

결과는 도 1a 및 b에 기재되어 있다. P12 시료의 망막 중앙 부분에서 망막혈관 폐색이 관찰 되었으며, P17 시료에서 신생혈관의 생성이 관찰되었다. 내부 경계막의 유리체 측 상의 신생혈관총(Neovascular tufts)이 P17에서 관찰되었으나, P17 대조군에서는 정상적 혈관총만이 관찰되었으며, 이는 유효한 동물모델이 제작되었음을 나타내는 것이다.

실시예 2: 망막단백질의 추출

실시예 1의 동물모델에서 안구적출 후에 망막을 해부현미경 하에서 분리하였다. 각막을 따로 분리해낸 후, 해부용 집게를 사용하여 시신경쪽으로 공막을 벗겨내었다. 공막, 시신경 및 망막색소상피를 제거하였다. 마지막으로 렌즈 및 유리체에서 렌즈가 상하지 않도록 하면서 망막을 제거하였다.

단백질은 상기 4개의 망막 그룹으로부터 추출하였다 (그룹당 22 개 안구). 각 그룹의 망막을 하나로 모아 얼음에서 냉각된 단백질 분해효소 억제제 칵테일 (Roche Complete Mini Tablets, Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN, USA) 을 포함하는 PBS에서 음파 및 얼림-녹임 방법을 사용하여 균질화하였다. 단백질 농도는 Pierce BCA reagent (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)을 사용하여 측정하였다. 제조된 시료는 사용 시까지 70℃에 보관하였으며, 후술하는 iTRAQ 실험, LC-ESI-MS/MS 분석 및 웨스턴블랏에 사용하였다.

실시예 3: iTRAQ ( Isobaric tags for relative and absolute quantitation ) 분석을 이용한 차별적으로 발현되는 단백질의 동정

본 실험은 P12 와 P12C사이, 그리고 P17과 P17C 사이의 OIR조직에서의 단백질 발현 양상을 비교하기 위하여 수행하였다. 4iTRAQ 리포터 이온을 분석하면 각 조직에서 차별적으로 발현되는 단백질체에 대한 종합적 분석이 가능하다. iTRAQ 표지 및 분획화는 종전에 기술된 바와 같이 수행되었다 (Jin, J et al., J Proteome Res. 2011, 10, 977-989; Jin, J. et al., J Proteome Res. 2009, 8, 1393-1403).

iTRAQ 시약 (Applied Biosystems, USA)은 모든 펩타이드의 라이신과 N 말단을 표지하는 아민 특이적 동중 동위원소 태그로, 리포터기, 밸런스기, 펩타이드 반응성기로 구성되어 있다. 표지한 샘플을 혼합하여 분석을 할 경우, 각각의 샘플이 서로 다른 태그 (m/z 114-117)로 표지 되었더라도, iTRAQ 밸런스기의 영향으로 MS 스펙트럼에서 단일 피크로 보여지게 된다. MS분석에 이어, CID (collision induced dissociation)에 의한 MS/MS 분석이 진행되는 동안, 동중동위원소 태그의 분절부위에서 절단이 일어나 밸런스기가 떨어져 나가고 그 결과 iTRAQ 리포터기가 생성되어 114-117 m/z의 영역에서 아이온 피크로 나타난다. 이 아이온의 피크면적을 정량하여 각 샘플 내에서 주어진 펩타이드의 상대적인 양을 비교하면 시료의 단백질 양을 정량 할 수 있게 된다. 또한 MS/MS 결과, 리포터 아이온뿐만 아니라 b-아이온과 y-아이온을 얻게 되는데, 이들 아이온은 단백질을 동정하는데 이용하게 된다 (도 2 참조). 실험 원리 및 실험과정은 각각 도 2 및 도 3에 요약하였다.

iTRAQ 표지

실시예 1에서 준비한 단백질을 iTRAQ 시약을 제조자 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)의 지시대로 사용하여 표지하였다. 요약하면, 단백질 100 ㎍을 speed vac으로 건조한 후 20㎕의 dissolution buffer (0.5 M triethylammonium bicarbonate, 0.05% SDS)에 재현탁하였다. 여기에 1㎕ 의 변성제 (2% SDS)를 처리하고 2㎕의 환원제 (50 mM tris-(2-carboxyethyl) phosphine) 처리한 후 60℃에서 1시간 두었다. 이것을 1㎕의 시스테인 블로킹 제제 (200 mM methyl methanethiosulfonate in isopropanol) 처리 후 20 ㎕의 0.5 ㎍/㎕ 트립신 (Promega, Madison, WI, USA)을 처리하고 37℃ 에서 16시간 반응시켰다. 4 개의 망막 그룹, 즉 P12C, P17C, P12 및 P17을 iTRAQ 시약 114, 115, 116, 및 117로 표지한 후, 혼합하여 speed vac으로 건조하였다. 동일한 실험은 세 번(triplicate) 수행되었다.

SCX ( Strong cation exchange ) 크로마토그래피

상기와 같이 준비한 시료를 강한 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 45개 분획으로 분리하였다. 분리를 위해 Agilent 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)의 SCX 컬럼 (4.6 mm ID x 100 mm, 5 ㎛, 200Å , PolyLC, Columbia, MA, USA)을 제조자의 방법대로 사용하였다. 총 45개의 분획으로 분리된 샘플을 speed vac으로 건조하였다.

iTRAQ 표지(labeling) 효율을 측정하기 위해서, 2437개 펩타이드의 모든 표지 가능한 부위 (N-terminal과 lysine side 체인)와 실제 표지된 부분과 직접적인 비교를 통하여 iTRAQ 표지(labeling) 효율을 계산 하였다. 본 iTRAQ 표지(labeling) 효율을 계산하기 위하여, 프로테인 파일럿 (Protein Pilot: Applied Biosystems; MDS-Sciex,Concord,Canada)프로그램의 프로 그룹 (Pro Group^TM )알고리즘을 활용 하였다.

LC - MS / MS 분석

LC-MS/MS 분석은 온라인으로 연결된 hybrid Quadrupole-TOF LC-MS/MS spectrometer (QStar Elite, Applied Biosystems)로 LC-MS/MS 분석을 수행한 후 ProteinPilot (ver.2.0.1)을 사용하여 분석하였다. 요약하면 상기 건조된 펩타이드 샘플은 용매 A (water/ACN [98:2 v/v] 및 0.1 % 포름산) 20㎛로 재현탁하여 이 중 5㎕를 nanoLC의 자동시료채취기를 사용하여 주입하였다. 펩타이드는 trap column (300 m i.d x 5 mm, 5 ㎛, 100 Å , Zorbax 300SB-C18, Agilent Technologies)을 이용하여 capillary flow (20lμl/min)을 이용하여 10분간 탈염하고 용매 B (water/ACN [2:98 v/v] 및 0.1 % 포름산)의 농도 구배에 따라 Zorbax 300SB-C18 capillary column (75 ㎛ i.d x 150 mm, 3.5 ㎛, 100Å)에 의해 nanoflow (300nl/min)으로 분리하였다. 용매 농도 구배는 98% 용매 A 및 2% 용매 B에서 시작하였으며, 용매 B를 120분에 걸쳐 2%에서 35%로, 10분간에 걸쳐 35%에서 90%로, 15분에 걸쳐 90%로 점차 증가하였다.

용출된 펩타이드는 2300eV에서 코팅된 실리카 팁을 통하여 전자분무되었다. 정보 의존적 데이터 획득 (IDA)을 위해, 400 내지 1600 m/z mass 범위에서 1초간 전구체 이온에 대한 서베이 스캔을 수행하였으며, 20 카운트를 초과하는 5 개의 가장 많이 존재하는 펩타이드 (+2 ~ +4 전하 상태)를 MS/MS (100-2000 m/z mass range) 분석용으로 선별하였다. 효과적인 분석을 위하여, 선별된 각 단편의 표적 이온은 60초 이내에 다시 분석되는 것을 방지하기 위하여, 60초 동안 제외하는 방법(dynamically excluded method)을 사용 하여 분석을 진행 하였다. 본 분석의 질량 허용 오차(mass tolerance)는 100ppm에 맞추어 사용하였다.

동정된 단백질체 분석

3회의 iTRAQ 분석데이터를 합한 결과, 2437 개 펩타이드로부터 699 개의 단백질을 최소 95%의 신뢰도로 동정하였다 (unused ProtScore>1.3) (도 4). iTRAQ로 동정된 단백질 중 54%는 1- 펩타이드 단백질, 15%는 2- 펩타이드 단백질, 8%는 3-펩타이드 단백질, 4%는 4-펩타이드 단백질 이었으며, 19%는 5개 이상의 펩타이드를 포함하는 단백질 이었다(도 4). 182개의 단백질 (unused ProtScore>1.3) 은 3 개의 망막 시료를 합하여 수행된 3회의 모든 iTRAQ 실험에서 최소 신뢰도 95%로 공통된 것으로 나타났다.

동정된 699 개의 망막 단백질체를 PANTHER 분류 프로그램을 이용하여 분자기능 하위 항목으로 분류하였으며, 그 결과 두 개의 가장 큰 단백질 그룹은 핵산 결합 단백질 과 세포골격 단백질로 이들은 각각 24% 및 10%를 구성하였다 (도 5).

유의한 발현 차이 규명을 위한 컷오프 임계값의 결정

iTRAQ 표지를 사용한 LC-MS/MS 실험에서 표지 효율은 앞서 기술한 바와 같으며, iTRAQ 태그에서 표지가 가능한 총 개수 (라이신 측쇄 및 모든 펩타이드의 N-말단)를 검출된 펩타이드의 표지 개수와 비교하였다 (ibid). 표지의 효율은 98%를 초과하였다 (결과는 나타내지 않음).

실제 iTRAQ 결과를 얻기 위하여, 반복실험을 통해 가능한 변수(variation)를 규명하고 최소화하였다. 실험오차와 비교하여 의미 있는 배수 차이 결정을 위한 컷오프 임계값(threshold)를 계산하기 위하여, 반복 실험에서의 변수를 3회의 iTRAQ 실험에서의 실제 변수로 간주하였다. 결과적으로 3회의 iTRAQ 실험결과 699개의 단백질을 동정하였으나, 공통적인 단백질은 182개인 것으로 나타났다.

하기의 선별기준을 사용하였다. P12 대 P12C, P17 대 P17C, 및 P12 대 P17 OIR 조직 비교의 경우 3 개 이상의 유니크한 펩타이드 포함(>95%), p-value <0.05, 및 오차인자 (EF)<2. 이러한 기준으로 165개의 단백질을 3회의 실험을 통해 정량하였다. 이들 단백질을 이용하여 초기에 실험 변이를 결정하였으며, 유의한 배수 차이 결정을 위한 컷오프 임계값을 확인하였다(Han, C. L et al., Mol Cell Proteomics. 2011, 10.M110.003087). 도 6에 나타난 바와 같이, P12 대 P12C의 경우 3회의 쌍별 비는 좁은 정규 분포를 가지고 있었으며, 평균값은 0.019±0.25, 0.038±0.25, 및 0.038±0.25 (95% confidence interval) 으로, 이는 예측 비인 1.0, 선형 스케일에서 상대적 표준 편차 17.7% 내지 18.5% 와 일치하는 값이다.

P17 대 P17C의 경우, 쌍별비는 또한 좁은 정규 분포를 나타내었으며, 평균값이 0.014±0.24, 0.027±0.23, 및 0.031±0.25 (95% confidence interval) 로 이는 예측 비인 1.0, 선형 스케일에서 상대적 표준 편차 18.2% 내지 19.7% 와 일치하는 값이다. P12 대 P17의 쌍별비는 좁은 정규 분포를 취하였으며, 평균값은 0.017±0.22, 0.025±0.23, 및 0.022±0.23 (95% confidence interval) 로 이는 예측 비인 1.0, 선형 스케일에서 상대적 표준 편차 16.0% to 16.6% 와 일치하는 값이다 (Keller, A et al.,. Anal Chem 2002, 74, 5383-5392).

3개의 표준 편차 모델을 기초로, >1.20 배의 변화 또는 <0.83 배의 변화가 116/114, 117/115, 및 117/116 리포터 이온 사이에서, 단백질 발현에 있어 실제 차이를 반영하는 의미 있는 컷오프 값인 것으로 결정되었다. 궁극적으로, 72개의 단백질은 p-value <0.05, EF<2 값을 가지며, >95% 신뢰도를 2개 초과의 유니크 펩타이드를 가지며, 3회의 iTRAQ 실험에서 >±1.20-배 차이를 가지는 것으로 나타났다.

OIR P12 에서 차별적으로 발현되는 단백질체

iTRAQ 실험에서 정량된 72개 단백질 중, 39개 단백질이 P12C (114 리포터)와 비교하여 P12 망막 (116 리포터)에서 차별적으로 발현되었으며, 25개는 상향 발현되었고, 14개는 하향 발현되었다 (표 1a).

이들 72개의 단백질을 PANTHER 분류 프로그램을 사용하여 생물학적 프로세스에 따라 분류하였다. 분류결과 P12C와 비교하여 탄수화물 대사 (75%), 단백질 대사 (83%), 및 신호전달 (50%) 단백질이 상향발현 되었다. 대조적으로, 세포구조운동성 (75%), 핵산 대사 (92%), 및 신호전달 (50%) 단백질은 하향 발현되었다. 하기 표에서 유의적으로 발현이 증가 한 것은 적색으로, 발현이 감소한 것은 청색으로 표시하였다.

[표 1a]

[표 1b]

[표 1c]

OIR P17 에서 차별적으로 발현되는 단백질체

P17 망막 (117 리포터)의 경우, 38개의 단백질이 차별적으로 발현되었으며, 21개는 상향, 17개는 P17C와 비교하여 하향 발현되었다 (115 리포터) (표 1b).

P17 단백질의 하위 카테고리 분류결과는 "탄수화물대사" (100%), "세포구조 및 운동성" (100%), 및 "신호전달" (100%)은 P17C와 비교하여 상향 발현(도 8)되었고, "핵산대사" (86%) 및 "단백질 대사" (25%) 에 속하는 단백질은 하향 발현되었다 (도 8).

P12 ( 저산소 ) 및 P17 ( 과산소 ) 망막의 단백질체 비교

P17 and P12 단백질체 비교분석결과, 36개의 단백질이 차별적으로 발현되었으며, 21개는 상향 15개는 하향 발현되었다 (표 1c).

P17에 대한 상기와 같은 분류 결과, "핵산대사" (73%) 및 "단백질 대사" (71%) 는 P12에서 하향 발현되었으며 (Supplementary Figure 3C and Supplementary Table 3), "탄수화물 대사" (88%), "세포구조 및 운동성" (67%), 및 "신호전달" (100%) 관련 단백질은 상향 조절되었다 (도 7).

실시예 4 : MS 결과 분석 및 유전자 온톨로지 분석

상기에서 수득한 데이터 분석은 종전에 기술된 바와 같이 수행되었다 (ibid). 요약하면, 분리된 펩타이드는 온라인으로 연결된 hybrid Quadrupole-TOF LC-MS/MS spectrometer를 이용하여 정성 및 정량 분석하였다. 분석 결과인 질량 스펙트럼은 ProteinPilot (ver.2.0.1)을 사용하여 분석하였고, 데이터베이스는 마우스 데이터베이스 (mouse combined_KBMS5.0.20050302. fasta - Applied Biosystems)를 이용하였다. 동정 및 정량에 사용한 조사계수는 다음과 같다: 펩타이드 및 단편 이온 질량 tolerance 0.2 Da, 1 missed 트립신 절단, 변하는 메티오닌 산화, 고정된 MMTS에 의한 시스테인 변형, 라이신 측쇄 및 펩타이드의 N-말단이 iRTRAQ 표지. 본 실험에서 사용되지 않은 ProtScore>1.3 (95% confidence interval)를 단백질 동정에 필요한 신뢰도 임계값(confidence threshold)로 사용하였다.

"생물학적 과정" 및 "분자 기능" 분류는 PANTHER ID numbers (http://www.pantherdb.org/)로 수행하였다. 전체 단백질 프로파일을 보다 효과적으로 분석하기 위해, MultiExperiment Viewer (http://www.tm4.org/ mev/)(Chu, V. T et al., Genome Biol 2008, 9, R118)을 이용한 차별적 발현 단백질체에 대한 서브클러스터링 분석 및 계층적 클러스터링(HLC) 분석을 수행하였다.

차별적으로 발현되는 단백질체의 클러스터 분석결과

이어, P12 및 P17의 과산소 및 저산소 상태에서의 단백질 농도의 증감을 기초로, 시간경과에 따른 단백질 발현 양상을 분석하였다. OIR 유도 모델에서 차별적으로 발현되는 단백질의 클러스터 분석의 경우 MultiExperiment Viewer (http://mev.tm4.org, Version 4.3)를 사용하여 OIR 발병에 관여하는 단백질 또는 경로를 결정하였다. 원웨이 클러스터링 방법을 이용하여 P12C, P17C, P12, 및 P17 망막에서 차별적으로 발현되는 72개의 단백질에 대하여 HLC를 수행하였다 (도 8A).

계층적 클러스터링의 경우, P12C (114 리포터) 및 P17C (116 리포터) 망막 단백질체는 유사한 발현 양상을 나타낸 반면, P12 (116 리포터) 및 P17 (117 리포터) 단백질체의 경우 12C 및 P17C 단백질체와 비교하여 상이한 단백질체 양상을 나타냈다(도 8A).

서브클러스터링 분석에서, 상향 및 하향 발현되는 주 양상을 4개의 서브클러스터로 나누었다: 서브클러스터 1 (P17에서 상향발현), 2 (P12 및 P17에서 상향발현), 3 (P12에서 상향발현), 및 4 (P17에서 하향발현).

서브클러스터 1은 P17에서 상향 발현되는 7개의 단백질 phosphoglycerate kinase 1 (PGK 1), microtubule-associated protein 1 B (MAP1B), 크리스탈린 βA2, 크리스탈린 βB2, 리커버린, 배시긴 전구체, 및 mKIAA0193로 구성되었다(도 8B).

서브클러스터 2는 P12 및 P17에서 상향 발현되는 10개의 단백질 크레아틴 카이나제 B, 14-3-3 단백질 zeta/delta, 혈청 알부민 전구체, 아실-CoA-결합 단백질, 트랜스케톨라제, 말레이트 데하이드로지나제 2, 크리스탈린 αA, 네딜린, 아이소사이트레이트 데하이드로제나제 및 크리스탈린 αB으로 구성되었다 (도 8C).

서브클러스터 3은 P12에서는 상향 발현되나 P17 망막조직에서는 하향 발현되는 6개의 단백질 s-어레스틴, Ubb 단백질, 비히스톤 염색체 단백질 HMG-17, 베시클-도킹 단백질, 트립시노겐 16, 및 디하이드로피리미디나제-관련 단백질-3 - 로 구성되었다(도 8D).

서브클러스터 4는 P17 망막 조직에서 하향 발현되는 6개의 단백질 히스톤 1, 히스톤 H2b, NRAA, 흥분성 아미노산 수송체 1, 40S 리보소말 단백질, 및 신경세포 부착 분자로 구성되었다 (도 8E).

실시예 5: LC - ESI - MS / MS 분석을 통한 단백질 규명

실시예 2에서 수득한 망막 단백질은 Easy-LC system (Proxeon, Odense, Denmark)이 장착된 LTQ Velos (Thermo, Waltham, MA, USA)를 통하여 분석되었다. 본 시스템은 나노전자분무장치를 구비하고 10-μm 용융 실리카 방출 팁 (New Objective, Woburn, MA, USA)을 갖춘 대용량 탠덤 질량분광분석기 이다. 나노플로우 LC 구배를 생성하기 위하여, 용매 A (ddH₂O 중의 2% 아세토니트릴 및 0.1% 포름산)와 용매 B(0.1% 포름산을 포함하는 98% 아세토니트릴)를 사용하였으며, 농도 구배는 76분 동안 용매 B의 농도를 0% 부터 40% 까지 생성하며, 이어, 12분에 걸쳐 40%에서 90% 까지 농도 구배를 생성하였다. 이어 5분에 걸쳐 용매 B의 농도를 90%에서 100%까지 생생하였다. 유속은 300nl/min이었다.

분무 전압은 양성 이온 모드에서 1.8kV이었으며, 가열된 모세관의 온도는 200C이었다. MS2의 경우, MS intensity 가장 높은 10개를 선별하여 MS2분석을 진행 하였다. 한 사이클의 풀 MS 스캔 (m/z 3001800)은 프로파일 모드로 수득하였다. 전구체의 분절환 및 산물 이온의 검출은 10개의 가장 강도가 높은 이온에 대하여 데이터 의존적 방식으로 리니어 트랩(linear trap)에서 분석되었다. 또한 본 실험에서는 1000 아이온 카운트 이상 되는 MS 전구체를 MS/MS 분석에 사용 하였다.

본 MS/MS 분석을 위한 파라미터(parameter)는 다음과 같다: normalized 충돌 에너지, 35; 이온선별 임계값, 1000 카운트; 활성화 Q, 0.25; 및 활성화 시간, 10 ms. Dynamic 배제는 반복 카운트 1, 15-s 반복 지속시간, 배제 리스트 크기, 배제 지속기간 30 s, 및 ±1.5 m/z 배제 질량 너비로 하여 사용되었다. 장비는 Tune 2.6.0 및 Xcalibur 2.1 (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA)을 통해 분석 되었다.

분석결과

P12 및 P17 OIR 조직에서 특이적으로 발현되는 단백질을 규명하기 위하여, LTQ Velos를 갖는 보완적 LC-ESI-MS/MS 분석 플래트폼을 사용하였다. P12C, P17C, P12, and P17 망막 조직에서 총 1074 개의 망막 단백질을 규명하였다 (도 9a). 이중 364 개의 단백질은 P12C 및 P12 망막조직에 공통된 것이었으며, 34 및 578 개 단백질이 각각 P12C 및 P12 망막 조직에서 특이적인 것이었다 (도 9b). 496 개의 단백질은 P17C 및 P17 망막조직에 공통된 것이었으며, 270 및 135 개 단백질은 각각 P17C 및 P17 망막조직에 특이적인 것이었다 (도 9c). 43 및 138 개 단백질은 각각 P17 and P12 망막조직에 특이적인 것이었다(도 9a).

LC-ESI-MS/MS 분석을 통해, iTRAQ 결과와 비교하여 723개의 단백질이 새로이 규명되었다. 따라서, 총 1422 개의 단백질이 iTRAQ 및 LTQ Velos (도 9d) 분석을 통해 규명되었다.

단백질 동정 기준

LTQ Velos를 이용하여 수득한 모든 MS/MS 스펙트럼은 마우스 데이터베이스 Uniprot-mouse.FASTA (147,548 entries) 및 SEQUEST (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA; version v.27, rev. 11)를 사용하여 분석하였다. 동정 및 정량에 사용된 SEQUEST 계수는 1.00 Da의 분절 이온 질량 tolerance, 1.5Da 의 모 이온 tolerance, 시스테인의 카르바미도메틸화 (고정된 변형), 및 메티오닌의 산화 (변하는 변형)으로 정해서 사용하였다.

Scaffold version Scaffold_3_00_03 (Proteome Software Inc., Portland, OR, USA)를 사용하여 모든 MS/MS-기재의 펩타이드 및 단백질 동정의 정확성을 확인 하였다. Peptide Prophet 알고리즘(Keller, A et al., Anal Chem 2002, 74, 5383-5392)을 사용하여 95.0% 확률을 초과하는 펩타이드를 선별하였다. 아울러 특정 데이터베이스 서치 엔진의 임계값을 사용하였다. SEQUEST 동정의 경우 적어도 0.10을 초과하는 deltaCn 값을 요구하였으며, 단일, 이중, 및 삼중으로 하전된 펩타이드의 경우 각각 1.8, 2.8, 및 3.8을 넘는 X_Corr 값을 요구하였다. 규명된 모든 단백질은 적어도 두 개의 펩타이드에서 그리고 95.0% 넘는 확률로 상기 조건을 만족하였다 (Nesvizhskii, A. I. et al., Anal Chem. 2003, 75, 4646-4658).

실시예 6: 단백질의 선별 및 추가분석

OIR 망막 조직에 대한 나노-LC-ESI-MS/MS와 iTRAQ 실험은 망막 단백질체의 변화와 혈관신생, 혈관변화 및 신경퇴행에 있어서의 그 기능과 관련된 추가연구를 통해 치료제 개발 표적으로 작용할 수 있음을 나타낸다. iTRAQ으로 선별된 5 종류의 단백질 크리스탈린 αA, 크리스탈린 αB, PGK 1, 렌즈 상피 유도된 성장 인자 (LEDGF/Psip1), 및 흥분성 아미노산 수송체 1 (Slc1a3/EAAT-1/GLAST)과 LTQ 분석으로 선별된 3 종류 단백질 CA II, CA XIV, 및 크리스탈린 βS을 추가분석하였다. 이들 단백질의 OIR 망막에서의 위치를 대조군 및 OIR 망막조직에 대하여 면역조직화학분석을 통해 조사하였다.

실시예 7: 면역형광 염색

안구 (n=10 안구/그룹)를 적출한 후, 4% 파라포름알데하이드에 24시간 동안 담구어 둔 후 파라핀에 포매하였다. 파라핀 블록에서 4 마이크론 두께의 연속 절편을 잘라내었다. 탈파라핀화 및 탈수 후에, 절편을 2차 항체가 유래된 종으로부터 수득한 혈청 알부민을 포함한 블록킹 용액에 1시간 동안 넣어 두었다. 슬라이드를 하기 표 2에 기재된 항체와 배양하였다.

면역조직화학분석에 사용된 1차 항체 리스트

1차 항체	제조사	제품번호	희석배율
Rabbit anti-Crystallin alpha A	Enzo	ADI-SPA-221	1:100
Rabbit anti-Crystallin alpha B	Enzo	ADI-SPA-223R	1:100
Rabbit anti-Crystallin alpha B P-Ser59	Enzo	ALX-210-411	1:100
Rabbit anti-Crystallin gamma S	Abcam	ab80040	1:50
Rabbit anti-LEDGF	Cell signaling	#2088	1:25
Rabbit anti-PGK 1	LifeSpan	LS-C98055	1:25
Rabbit anti-CA2	Abcam	ab6621	1:700
Goat anti-CA2	Santa Cruz	sc-17246	1:50
Rabbit anti-CA14	Santa Cruz	sc-25602	1:200
Goat anti-Vimentin	Millipore	AB1620	1:100
Rabbit anti-GFAP	DakoCytomation	Z0334	1:300
Rabbit anti-GS	Abcam	ab49873	1:10000
Rabbit anti-EAAT1	Abcam	Ab416	1:50
Rabbit anti-ORP150	Epitomics	3905-1	1:250
Goat-anti-Iba-1	Abcam	Ab5076	1:100

이어 PBS로 세척한 후 Alexa Fluor 488 염소 항-마우스 IgG (1:400, Invitrogen Molecular probes, Eugene, OR, USA), Alexa Fluor 488 염소 항-래빗 IgG (1:400, Invitrogen Molecular probes), 또는 Alexa Fluor 555 당나귀 항-염소 IgG (1:700, Invitrogen Molecular probes)를 넣어 1시간 배양하였다. 염색을 마친 슬라이드는 공촛점 현미경으로 관찰하였다.

실시예 8: 웨스턴블랏

해당 단백질 시료 (10-30 ㎍) 4-12% Bis-Tris 젤 (NuPAGENovex, Invitrogen)에서 전기영동하여 분리한 후 PVDF 막 (Millipore, Billerica, MA, USA)으로 전달하였다. 이어 막을 5% 무지방 우유를 포함하는 TBS-T (20 mM Tris-base, 150 mM NaCl, pH 7.4) 및 1차 항체 래빗 항-크리스탈린 αB (1:500), 래빗 항-크리스탈린 αB P-Ser-59 (1:500), 래빗 항-ORP 150 (1:1000), 래빗 항-카르보닉 안하이드라제 II (CA II, 1:25,000), 및 래빗 항-카르보닉 안하이드라제 XIV (1:100) 와 배양하였다. 세척 후, 2차 항체로 항-래빗 IgG-알칼라인 포스파타제 항체 (1:20,000, Sigma Aldrich)를 추가한 후 실온에서 1시간 배양하였다. 항체 결합여부는 Fast BCIP/NBT 알칼라인 포스파타제 기질 (Sigma Aldrich)을 사용하여 분석하였다. 크리스탈린 αB, 크리스탈린 αB P-Ser-59, CA II, 및 ORP 150에 대한 웨스턴블랏은 3회 수행되었다. 웨스턴블랏 결과는 스캐닝하여 상대적 밴드 강도를 ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 측정하였다. 그룹간의 수치는 Mann-Whitney U test using SPSS for Windows (version 18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 분석하였다.

실시예 9: 크리스탈린 A, B, 및 S의 망막 발현

나노-LC-ESI-MS/MS 및 iTRAQ 실험으로 대조군 및 OIR 망막에서 크리스탈린αA와 αB를 동정하였다. iTRAQ 실험결과 크리스탈린αA과 αB OIR P12 망막에서보다 OIR P17에서 더 많이 상향 발현된 것으로 나타났다. 크리스탈린 αA는 대조군 및 OIR 망막의 뮐러 세포에 걸쳐 모든 망막층에서 면역반응을 나타냈다 (도 10). OIR P17 망막의 경우 신경절 세포층(GCL) 및 핵내층(INL)에 크리스탈린 αA에 대한 강한 면연반응이 관찰되었다 (도 10).

크리스탈린αB의 경우는 대조군 망막의 신경절 세포층/신경섬유층(GCL/NFL), 플랙시폼내층(IPL), INL,과 핵외막 (ONL)에서 면역양성 반응이 나타났다(도 11). OIR P12 및 P17 망막의 경우, 크리스탈린αB 면역반응은 모든 망막층에서 증가하였다 (도 11). OIR P17 망막의 경우, 내망막표면 및 ONL에서 신호가 특히 강하게 나타났다. 웨스턴블랏에 의하면, 크리스탈린 αB의 망막 발현이 대조군과 비교하여 P12 및 P17에서 상당히 상향발현된 것으로 나타났다 (도 11).

크리스탈린 αB의 샤퍼론 활성은 특히 Ser 59에서의 인산화에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다 (33) OIR P12 및 P17 망막에서, 크리스탈린αB P-Ser-59 의 면역반응은 GCL/NFL에서 높았다 (도 11). 크리스탈린 αB P-Ser-59를 with TRITC-표지된 BS-1 렉틴을 사용하여 이중 면역표지한 후 고배율 영상 촬영결과 이중 양성결과가 나타났으나, GCL/NFL 보다 신생혈관총 부위에서의 면역반응이 약한 것으로 관찰되었다. 웨스턴블랏 결과에 의하면, 크리스탈린 B P-Ser-59의 망막 발현은 대조군 망막과 비교하여 P12 및 P17에서 현저히 상향된 것으로 나타났다 (도 11)

나노-LC-ESI-MS/MS 결과 크리스탈린 βS는 4개의 모든 그룹에서 관찰되었다. 망막 절편에서, 크리스탈린 βS 면역반응은 P12 및 P17 OIR 망막의 ONL에서 상향된 것으로 나타났다 (도 10).

실시예 10: 뮐러 교질 세포의 주 망막 발현 단백질

성상세포 및 활성화된 뮐러 교질 세포의 마커인, 교질 섬유성 산성 단백질 (glial fibrillary acidic protein (GFAP))의 망막 발현은 OIR P17 망막에서 증가하였다 (도 12). 나아가, 뮐러 세포 교질증 마커인, 비멘틴과 글루타민 합성효소에 의 면역반응성은 대조군 및 OIR P12 망막과 비교하여 OIR P17 망막의 뮐러 세포의 원가지(distal branch)에서 증가한 것으로 나타났다 (도 12).

나노-LC-ESI-MS/MS 분석결과 CA 의 두 개의 아이소효소인 CA II 및 CA XIV를 망막에서 동정하였다. 이들 효소의 망막에서의 발현을 분석하기 위해 웨스턴블랏과 면역조직화학분석을 수행하였다. CA II의 웨스턴블랏결과, CA II는 P12의 대조군 및 P17과 비교하여, OIR P12 망막에서 현저히 상향발현된 것으로 나타났다 (도 12). 또한 CA II는 OIR P17 망막에서 OIR P12 망막 및 정상 대조군 망막에서 보다 더욱 상향 발현된 것으로 나타났다 (도 12). P17에서, 망막 CA II 발현은 NFL/GCL, INL, 및 ONL에서 증가하였으며, 글루타민 합성효소 및 비멘틴과 같은 뮐러 교질 세포에 대한 마커와 같은 위치에서 발현되었다 (도 12 및 도 13). CA II의 면역반응은 P17에서 뮐러세포의 원가지(distal branch)에서 특히 두드러졌다. CA II와 대조적으로, 웨스턴블랏결과 OIR 과 대조군 조직에서 CA XIV 발현에는 변화가 없는 것으로 나타났다 (도 12). CA XIV는 모든 망막층, 특히 내경계막 (internal limiting membrane (ILM)), 플랙시폼외층(outer plexiform layer (OPL)), 망막 하위 공간의 내부 아스펙트, 및 RPE 층에서 면역반응이 관찰되었으며, 모든 그룹에서 유사한 패턴을 나타냈다 (도 12).

iTRAQ 실험결과, 뮐러 교질 세포의 주요 글루타메이트 수송체인 EAAT-1은 OIR P12 및 P17 망막에서 하향 발현되었다 (도 8B). EAAT-1 에 대한 양성 면역반응은 모든 망막 층, 특히 IPL 및 OPL에서 관찰되었으나, OIR 및 대조군 망막간에는 차이가 없었다 (도 12).

실시예 11: PGK 1 및 ORP 150의 망막 발현

iTRAQ 실험에서 OIR P12 및 대조군 P17 망막과 비교하여 OIR P17 망막에서 PGK 1이 상향 발현되었다(도 8B). PGK 1은 모든 망막층에서 면역반응을 나타냈으며 신생혈관총과 같은 위치에서 관찰되었다 (도 14).

나노-LC-ESI-MS/MS 실험결과, ORP 150은 OIR P12 및 P17 망막에서 발현되었다. 부가적으로 iTRAQ 실험에서 ORP 150은 모든 4개 그룹에서 발견된 것으로 나타났고, 1개의 펩타이드가 규명되었다. 비록 1개의 펩타이드가 규명되었지만, ORP 150 농도는 iTRAQ 실험결과 P12C 및 P17C와 비교하여 P12 및 P17 에서 1.4 배 증가한 것으로 나타났다.

웨스턴블랏을 통한 ORP 150 정량결과 ORP 150은 P12 및 P17 대조군 망막과 비교하여 OIR P12 및 P17 망막에서 발현이 현저히 상승된 것으로 나타났다 (도 15). 망막 절편 시료에서, ORP 150 면역반응성은 신경절 세포층의 핵주변 영역, 핵내층 및 RPE 층에서 나타났다 (도 15). 주목할 만하게도 OIR P17 망막에서, ORP 150 면멱방응성은 내부망막층에서 강하게 나타났으며, 신생혈관총과 같은 위치에 있었다 (도 15). ORP 150 면역반응성은 마이크로교질세포 마커인, Iba01의 면역반응성과 같은 위치에서 관찰되지 않았다 (도 16).

LEDGF 의 망막발현

iTRAQ 실험결과, LEDGF는 P12와 비교하여 P17에서 하향발현된 것으로 나타났다. LEDGF는 모든 망막 핵층에서 면역반응성이 관찰되었으나 그룹간 차이는 없었다 (도 10).

실시예 12: ORP 150 siRNA -처리된 ARPE -19 세포주 유래의 VEGF 에 대한 ELISA

불멸화된 인간 망막색소상피 세포주인 ARPE-19 세포 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)는 10% 소태아혈청 (FBS)을 포함하는 DMEM-F12 배지에서 유지하였다. 6 웰 플레이트의 각 웰에 2ml 부피의 항생제가 없는 10% 소태아혈청 (FBS)을 포함하는 DMEM-F12 배지 중의 2 x 10⁵세포를 분주하였다. 이어 세포를 대조군 siRNA (sc-37007, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 또는 ORP 150 siRNA (sc-96695, Santa Cruz Biotechnology), 유전자 발현을 없애도록 디자인된 3개의 표적 특이적 1925-nt siRNA로 제조자의 방법대로 전달이입하였다. 요약하면, ARPE-19 세포를 37℃, 5% CO₂ 조건에서 60% 내지 80% 정도의 컨플루언시까지 자라도록 배양하였다. 여기에 상기 siRNA 전달이입 시약을 500 nM 또는 1 μM 추가하였다. 6시간 배양 후에, 배지를 새로운 DMEM-F12 배지로 갈아주었다.

24시간 추가 배양 후에, 배양의 상층액을 수집하여 VEGF 농도를 인간 VEGF ELISA kit (Thermo scientific)를 제조자의 방법대로 사용하여 측정하였다. ORP 150의 결손을 확인하기 위하여, 세포에서 단백질을 추축하여 rabbit anti-ORP 150 (1:1000, Epitomics, Burlingame, CA, USA)를 사용하여 웨스턴블랏을 수행하였다. 웨스턴블랏 결과는 스캔한 후 각 밴드의 상대적 강도를 ImageJ로 분석하였다.

망막 색소 상피의 VEGF 분비에 있어서 ORP 150의 기능

망막 혈관 신생에 있어 ORP 150의 기능을 규명하기 위하여, 망막 색소 상피 (RPE) 세포에 의한 VEGF 분비를 ORP 150 발현을 억제한 후에 측정하였다. 웨스턴블랏 결과, ORP 150 발현은 ORP 150 siRNA 전달이입 후 감소하였다 (도 17A). 나아가 ARPE-19 세포에 의해 분비된 VEGF 농도도 전달이입 24시간 후에 현저히 감소하였다(p<0.01, t-test) (도 17B).

실시예 13: ORP 150에 대한 siRNA 의 OIR 동물모델의 유리체내 투여

ORP 150 억제를 통한 혈관신생 효과를 조사하기 위하여, 지질 기재의 생체내 전달이입 제제(Altogen Biosystems, Las Vegas, NV, USA)로 희석된 ORP 150 siRNA (550ng/1,sc-96695, Santa Cruz Biotechnology)를 실시예 1에서 제작한 P12 동물모델의 한쪽 눈의 유리체내에 주사하였고, 대조군 siRNA (sc-37007, Santa Cruz Biotechnology)는 나머지 눈에 주사하였다. P17째에 ORP 150의 결손을 확인하기 위하여, 망막 단백질을 추출 (n=6 안구/그룹)한 후 anti-ORP 150 (1:1000, Epitomics, Burlingame, CA, USA) 항체를 사용하여 ORP 150에 대한 웨스턴블랏을 수행하였다. 3회의 독립적인 실험을 수행하였다. 혈관 신생에 미치는 ORP 150 siRNA 효과의 정량 및 정성 평가를 위해, P17에 안구 (n=12 안구/그룹)을 적출한 후 4% 파라포름알데하이드로 고정하였다. 그룹 당 6 개의 안구를 파라핀에 포매한 후 혈관 신생의 정량분석은 종전에 기술된 바와 같이 수행하였다 (Lim, Y et al., Diabetes. 2012, 61,1599-1608). 요약하면, 파라핀 블록에서 준비한 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 후, 각 안구 유래의 적어도 10개의 절편에서 내부 경계 막의 유리체 측상의 혈관 루멘의 개수를 세었으며, 2 명의 연구자가 각각 측정하였다. 또한 비멘틴 및 글루타민 합성효소에 대한 면역형광 염색을 수행하여 ORP 150 결손 후 뮐러 교질 세포 (Mller glial cell)의 변화를 측정하였다. 정성적 분석을 위해, P17에 망막 플랫 마운트 (n=6 안구/그룹)를 제작하였다. TRITC-labeled BS-1 렉틴으로 망막 혈관을 염색한 후, 플랫 마운트를 공촛점 현미경으로 관찰하였으며. ORP 150 siRNA로 처리된 실험군을 대조군 siRNA로 처리된 안구의 결과와 비교하였다.

ORP 150을 표적으로 하는 siRNA 가 OIR 에서 망막 혈관신생에 미치는 영향

웨스턴블랏을 이용한 ORP 150 정량 결과 ORP 150을 표적으로 하는 siRNA의 유리체내 투여에 의해 ORP 150의 망막 발현이 현저히 감소하는 것으로 나타났다 (도 8). 망막 혈관 신생에 대한 정성 및 정량적 평가 결과, ORP 150을 표적으로 하는 siRNA의 유리체내에 투여에 의해 OIR 마우스모델에서 망막 혈관 신생이 현저히 감소한 것으로 나타났다 (도 18). 또한 뮐러 세포의 활성과 항-혈관신생 효과의 연관성에 대한 연구결과, 뮐러 세포 교질증의 마커인 비멘틴과 글루타민 합성효소에 대한 면역반응은 ORP 150 siRNA 처리된 망막과 대조군 siRNA 처리된 망막에서 차이가 없는 것으로 나타났다 (도 19).

Claims

ORP (Oxygen-Regulated Protein) 150 마커의 검출 시약을 포함하는 검체의 당뇨망막병증, 미숙아망막병증, 연령관련황반변성, 망막혈관폐쇄, 안허혈증후군, 또는 망막혈관염으로부터 선택되는 신생혈관성 망막질환 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 PGK (PhosphoGlycerate Kinase) 1 마커 검출시약을 추가로 포함하는 것인, 신생혈관성 망막질환 진단용 조성물.
삭제
삭제
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 검체는 방수, 유리체, 조직, 전혈, 혈청 또는 혈장 중 하나 이상인, 신생혈관성 망막질환 진단용 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 검출 시약은 상기 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약인, 신생혈관성 망막질환 진단용 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 단백질 수준에서 검출할 수 있는 시약은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 수용체, 리간드 또는 보조인자, 또는 질량분광분석기 검출용 시약인, 신생혈관성 망막질환 진단용 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약은 역전사 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, DNA 칩 또는 노던블랏에 사용되는 시약인, 신생혈관성 망막질환 진단용 조성물.
삭제
대상자로부터 분리된 검체로부터 ORP 150 마커의 존재 또는 양을 검출하는 단계; 및
상기 검출된 마커의 존재여부 또는 양을 검사 대상자의 신생혈관성 망막질환 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는,
당뇨망막병증, 미숙아망막병증, 연령관련황반변성, 망막혈관폐쇄, 안허혈증후군, 또는 망막혈관염으로부터 선택되는 신생혈관성 망막질환의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 검사 대상자의 검체로부터 상기 마커를 검출하는 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 방법은 상기 ORP 150 마커에 부가하여 PGK 1 마커의 존재 또는 양을 검출하는 단계를 추가로 포함하며,
상기 PGK 1 및 상기 ORP 150의 존재 또는 양은 단백질 또는 mRNA 발현 수준에서 결정되는 것인, 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 연관시키는 단계는 상기 신생혈관성 망막질환 검사 대상자의 비마커 임상정보를 추가로 사용하는 것인, 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 검사 대상자의 비마커 임상정보는 상기 대상자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 검안경 검사(Opthalmoscopy), 안저촬영(Funds photography), 또는 형광안저혈관조영술 (Fluorescin angiography) 중 하나 이상인, 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 연관시키는 단계는 상기 결정된 마커의 양 또는 존재여부를 정상 대조군에서 결정된 상기 각 마커에 대한 검출결과와 비교하는 것인, 방법.
삭제
삭제
삭제
ORP 150 단백질을 제공하는 단계;
상기 단백질을 시험물질과 접촉시키는 단계; 및
상기 시험물질과 접촉된 단백질과 접촉되지 않은 대조군에서의 ORP 150 발현을 비교하는 단계를 포함하는, 당뇨망막병증, 미숙아망막병증, 연령관련황반변성, 망막혈관폐쇄, 안허혈증후군, 또는 망막혈관염으로부터 선택되는 신생혈관성 망막질환 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
제 18 항에 있어서,
상기 방법은 상기 ORP 150 단백질에 부가하여, PGK 1 단백질을 제공하는 단계를 추가로 포함하며,
상기 ORP 150 또는 PGK 1 단백질은 이를 발현하는 세포 또는 동물모델의 형태로 제공되는 것인, 신생혈관성 망막질환 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
제 19 항에 있어서, 상기 세포는 망막색소상피세포 (ARPE-19 세포), 뮐러 교질 세포, 또는 망막혈관내피세포인, 신생혈관성 망막질환 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 방법은 대조군과 비교하여 VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) 농도를 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 신생혈관성 망막질환 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
삭제