CN113491764B

CN113491764B - Fam19a5的医药用途

Info

Publication number: CN113491764B
Application number: CN202110332382.8A
Authority: CN
Inventors: 王应; 马大龙; 黄诗扬; 邢国刚; 宋占明; 梁炜薇; 佘少平; 李青青; 刘中天
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2021-03-29
Publication date: 2023-09-19
Anticipated expiration: 2041-03-29
Also published as: CN113491764A

Abstract

本发明公开了FAM19A5蛋白在抑郁症、认知障碍、神经炎症的诊断、预防或治疗中的医药用途。FAM19A5蛋白具有调节抑郁及认知相关行为的作用，FAM19A5蛋白、编码FAM19A5的多核苷酸、含有该多核苷酸的基因工程载体和/或宿主细胞，以及药物组合物，可应用于预防、诊断或治疗抑郁症、认知障碍、神经炎症，还可以以所述蛋白或多核苷酸作为靶标开发化合物、抗体、多肽药物和商品化试剂，对相关疾病进行研究。

Description

FAM19A5的医药用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别地，本发明涉及具有多种功能的FAM19A5蛋白及编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的基因工程载体、以及相应的药物组合物，本发明还涉及所述FAM19A5蛋白和多核苷酸及其药物组合物在诊断、预防或治疗抑郁症、认知障碍、神经炎症等疾病中的医药用途。

背景技术

抑郁症是一种常见的精神疾病，也是导致残疾和自杀的主要原因，患病率约为17％。抑郁症包含一些持续性的症状，包括情绪低落、快感缺乏、易怒和智力迟钝。此外，抑郁症患者也会出现海马依赖的认知的改变。抑郁症是由遗传和环境风险因素共同造成的。其中，应激等环境因素在抑郁症的发生发展中起重要作用，导致基因表达、神经回路功能的改变，最终导致行为的改变。

细胞因子是由机体各种细胞合成分泌的具有多种生理活性和参与病理反应的小分子可溶性蛋白质。细胞因子为细胞提供相互沟通的能力，并介导复杂的多细胞行为。众多研究表明许多细胞因子在复杂的中枢神经系统功能中起着重要作用。三分之一的抑郁症患者炎性细胞因子水平升高，高达40％的接受细胞因子治疗的患者出现临床抑郁症。在一些前瞻性的人群研究中，一些促炎细胞因子，如白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)，与认知障碍相关。一些趋化因子如CXCL12、CCL2和CX3CL1及其各自受体的表达变化也越来越多地被发现参与到中枢神经系统疾病如抑郁症、认知障碍、神经炎症等的发病机制中。

基因表达及其编码产物蛋白质表达的检测方法包括反转录－聚合酶链式反应、蛋白质印迹、ELISA、FACS、免疫荧光、免疫组化、免疫细胞化学等检测方法。可以应用于实验研究以及临床生理和病理疾病(如，抑郁症、认知障碍、神经炎症、免疫调节)中细胞和组织的基因表达及其编码产物蛋白质表达的检测。

具有重要生理、病理意义的基因及其编码产物蛋白质，可以作为药物靶标，开发靶向这一分子本身及其相互作用分子的化合物、抗体、多肽药物或基因工程药物和商品化试剂，应用于发病机制研究，疾病标志物的研究及临床检测和药物治疗的研究。

发明内容

FAM19A5(Family with sequence similarity 19,member A5)蛋白是一种具有趋化活性的细胞因子，本发明的研究发现，FAM19A5蛋白、FAM19A5分泌蛋白、编码FAM19A5的多核苷酸、包含该多核苷酸的基因工程载体以及相应的药物组合物，具有调节抑郁相关情绪、认知相关行为及神经炎症的作用，可应用于抑郁症、认知障碍、神经炎症等的诊断、预防或治疗。

本发明在一方面提供了一种能够调节抑郁症、认知障碍和神经炎症的蛋白。所述蛋白是：

(1)具有序列表中SEQ ID No：2或SEQ ID No：3所示氨基酸序列的蛋白；或

(2)与(1)所述蛋白有至少80％氨基酸序列同源性的蛋白，且具有与(1)所述蛋白相同或相似的生物学功能。

序列表中SEQ ID No：2所示为人FAM19A5蛋白的全长氨基酸序列，SEQ ID No：3所示为人FAM19A5分泌蛋白，保留了全长FAM19A5蛋白C端的89个氨基酸，具有相同的活性。具有与SEQ ID No：2或SEQ ID No：3所示氨基酸序列至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更进一步优选至少95％，特别优选至少98％，更为特别优选至少99％同源性(序列匹配)的序列，且与SEQ ID No：2或SEQ ID No：3所示的氨基酸序列具有相同或相似生物学功能的蛋白也属于本发明调节抑郁症、认知障碍和神经炎症的蛋白范畴。

本发明在另一方面提供了一种能够调节抑郁症、认知障碍和神经炎症的编码本发明蛋白的多核苷酸。所述多核苷酸是：

(i)编码序列表中SEQ ID No：2或SEQ ID No：3所示氨基酸序列的多核苷酸；或

(ii)具有与(i)所述多核苷酸至少80％序列同源性的多核苷酸，其编码的蛋白与(i)所述多核苷酸编码的蛋白具有相同或相似的生物学功能。

序列表中SEQ ID No：1给出了编码全长FAM19A5蛋白的一种多核苷酸序列，基于密码子的简并性，本领域技术人员应该了解，FAM19A5蛋白的编码基因不止SEQ ID No：1。此外，本发明提供的多核苷酸可以是在蛋白编码序列的基础上，增加非编码序列，例如内含子、编码序列5’端或3’端的非编码序列、标签序列等。因此，本发明所述能够调节抑郁症、认知障碍和神经炎症的多核苷酸的还包括具有与FAM19A5蛋白的编码多核苷酸序列至少80％、优选至少85％、更优选至少90％同源性的多核苷酸，且该多核苷酸编码的蛋白与FAM19A5具有相同或相似生物学功能。本发明的多核苷酸序列最好是以“分离”形式提供的。所述“分离”形式，是指不仅已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开，而且已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来。

本发明在另一方面提供了一种含有编码本发明蛋白的多核苷酸的基因工程载体。所述基因工程载体可以是普通载体、表达载体、质粒载体、病毒载体等。优选地，本发明的基因工程载体为腺相关病毒基因工程载体，在本发明的实施例中提供的一种基因工程载体为含神经元特异启动子的腺相关病毒adeno-associated virus-FAM19A5(AAV9-hSyn-hFAM19A5)。

本发明在另一方面提供了一种本发明蛋白及编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的基因工程载体、以及相应的药物组合物的实施方法。

本发明在另一方面提供了一种药物组合物，该药物组合物含有本发明的蛋白多肽、多核苷酸和/或基因工程载体，以及一种或多种药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明在另一方面提供了本发明的蛋白或多核苷酸、包含多核苷酸的基因工程载体、以及相应的药物组合物在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用，其中所述疾病包括抑郁症、认知障碍、神经炎症。

本发明在另一方面提供了检测待测样品中本发明的蛋白或多核苷酸的表达水平是否变化的方法。这些方法包括但不限于反转录-聚合酶链式反应、蛋白质印记、免疫微球、免疫组织化学检测、免疫细胞化学检测。

本发明在另一方面提供了本发明的蛋白或其多肽片段或编码该蛋白或多肽的多核苷酸在制备用于研究疾病的商品化试剂中的应用，其中所述疾病包括抑郁症、认知障碍、神经炎症。所述商品化试剂可以包含本发明的蛋白或其多肽片段或编码它们的多核苷酸，也可以包含靶向本发明的蛋白或其多肽片段或编码它们的多核苷酸的化合物、抗体、多肽或寡核苷酸。

本发明在另一方面提供了以本发明的蛋白多肽或多核苷酸作为靶标开发化合物、抗体、多肽药物和商品化试剂的应用。例如，用来测量FAM19A5基因的mRNA表达水平或其蛋白质表达量的制剂，可用于诊断抑郁症、认知障碍和神经炎症。这种制剂可包括，例如，具有与FAM19A5 mRNA互补的序列的寡核苷酸，与FAM19A5 mRNA特异性结合的引物或核酸探针，以及FAM19A5蛋白质特异性抗体。

本发明首次证明了FAM19A5蛋白对认知和抑郁相关情绪调节的维持具有重要作用，由此获得针对抑郁症和认知障碍相关疾病的预防和治疗手段。FAM19A5还可以用作生物标记物，用于诊断抑郁症和认知障碍相关疾病。

附图说明

图1显示实施例1流式细胞术对已知浓度0-32000pg/mL的FAM19A5重组蛋白检测柱状图。

图2显示实施例1检测组织样本中FAM19A5含量的双抗夹心微球系统标准曲线。Tissue lysis：组织裂解液。

图3显示实施例1检测血浆样本中FAM19A5含量的双抗夹心微球系统标准曲线。Plasma：血浆。

图4显示实施例2Real-time PCR检测FAM19A5在小鼠各组织的表达谱。结果显示：FAM19A5在小鼠脑中高表达。Relative mRNA level：相对mRNA表达水平。

图5显示实施例2双抗夹心微球检测FAM19A5在小鼠各组织的表达谱。结果显示：FAM19A5在小鼠脑中高表达。Concentration：蛋白浓度。

图6显示实施例2双抗夹心微球检测FAM19A5在小鼠的血浆和脑脊液中的浓度。结果显示：FAM19A5在小鼠的血浆和脑脊液中的浓度大致相同。Concentration：蛋白浓度；Plasma：血浆；CSF：cerebrospinal fluid，脑脊液。

图7显示实施例3Real-time PCR检测FAM19A5在小鼠各发育阶段的表达。结果显示：在mRNA水平上，FAM19A5的表达从小鼠胚胎期12.5天开始有轻微上升，在出生后1天表达最高达到峰值，然后在出生后7天表达下降。提示FAM19A5的表达可能与脑的发育相关。E12.5：Embryonic day 12.5，胚胎期12.5天；P 1：Postnatal day 1，出生后一天；8W：8Week，八周。Relative mRNA level：相对mRNA表达水平。

图8显示实施例3双抗夹心微球检测FAM19A5在小鼠各发育阶段的表达。结果显示：在蛋白水平上，FAM19A5的表达从小鼠胚胎期12.5天开始有轻微上升，接着在胚胎期16.5天和出生后1天持续上升，在出生后7天表达达到峰值，随后在第8周表达降低。提示FAM19A5的表达可能与脑的发育相关。E 12.5：Embryonic day 12.5，胚胎期12.5天；P 1：Postnatalday 1，出生后一天；8W：8Week，八周。Concentration：蛋白浓度。

图9显示实施例4Real-time PCR检测FAM19A5在小鼠不同脑区的表达。结果显示，FAM19A5在小鼠脑组织海马区高表达，在杏仁核、丘脑、大脑皮层、下丘脑及小脑呈现中等水平表达。Hippocampus：海马区；Amygdala：杏仁核；Thalamus：丘脑；Cerebral cortex：大脑皮层；Hypothalamus：下丘脑；Cerebellum：小脑。Relative mRNA level：相对mRNA表达水平。

图10显示实施例4双抗夹心微球检测FAM19A5在小鼠不同脑区的表达。结果显示，FAM19A5在小鼠脑组织海马区高表达，在杏仁核、丘脑、大脑皮层、下丘脑及小脑呈现中等水平表达。Hippocampus：海马区；Amygdala：杏仁核；Thalamus：丘脑；Cerebral cortex：大脑皮层；Hypothalamus：下丘脑；Cerebellum：小脑。Concentration：蛋白浓度。

图11显示实施例4免疫组化检测FAM19A5在小鼠不同脑区的表达。结果显示，FAM19A5在小鼠脑组织海马的CA1区高表达，特别是在椎体神经元上高表达，在杏仁核、丘脑、大脑皮层、下丘脑及小脑呈现中等水平表达。标尺＝50μm。

图12显示实施例5免疫荧光检测FAM19A5与神经元特异性标志物NeuN在成年小鼠的海马、皮层和原代培养的神经元上的共表达。结果显示：神经元表达FAM19A5。Neuron：神经元；Hippocampus：海马区；Cerebral cortex：大脑皮层；标尺＝25μm。

图13显示实施例5免疫荧光检测FAM19A5与神经干细胞特异性标志物Nestin在胚胎期小鼠的海马和原代培养的神经干细胞上的共表达。结果显示：神经干细胞表达FAM19A5。Hippocampus：海马区；Neural stem cell：神经干细胞；上图标尺＝100μm、下图标尺＝25μm。

图14显示实施例5免疫荧光检测FAM19A5与少突胶质细胞特异性标志物Olig2的共表达。结果显示：少突胶质细胞表达FAM19A5。标尺＝25μm。

图15显示实施例5免疫荧光检测FAM19A5与谷氨酸能神经元特异性标志物VGLUT2的共表达。结果显示：谷氨酸能神经元表达FAM19A5。标尺＝10μm。

图16显示实施例5Real-time PCR检测FAM19A5在HEK293T、神经元、星形胶质细胞和神经干细胞的表达。结果显示，神经元和神经干细胞表达FAM19A5。Neuron：神经元；Astrocyte：星形胶质细胞；Neural stem cell：神经干细胞。Relative mRNA level：相对mRNA表达水平。

图17显示实施例5双抗夹心微球检测FAM19A5在HEK293T、神经元、星形胶质细胞和神经干细胞培养上清的表达。结果显示，神经元和神经干细胞表达和分泌FAM19A5。Neuron：神经元；Astrocyte：星形胶质细胞；Neural stem cell：神经干细胞。Concentration：蛋白浓度。

图18显示实施例6旷场实验检测Fam19a5敲除(Fam19a5^-/-)小鼠和同窝野生型(WT)小鼠的在测量的30分钟内的运动距离。可见，Fam19a5^-/-小鼠表现为运动量显著增加。Distance：距离；min：分钟。

图19显示实施例6旷场实验检测Fam19a5^-/-小鼠和WT小鼠的在测量的前5分钟内在中心区所占的时间(％)。可见，Fam19a5^-/-小鼠表现进入中心区的时间减少。提示，Fam19a5^-/-小鼠表现为抑郁样行为增加。Time in center：位于中心区的时间。

图20显示实施例6旷场实验检测Fam19a5^-/-小鼠和WT小鼠的在测量的30分钟内的运动速度。可见，Fam19a5^-/-小鼠表现为运动速度增加。Movement speed：运动速度。

图21显示实施例6蔗糖偏好实验检测Fam19a5^-/-小鼠和WT小鼠对于蔗糖溶液的偏好。可见，Fam19a5^-/-小鼠对于蔗糖溶液的摄入显著减少，表现为快感缺失。提示，Fam19a5^-/-小鼠表现为抑郁样行为增加。Sucrose preference：蔗糖偏好。

图22显示实施例6强迫游泳实验检测Fam19a5^-/-小鼠和WT小鼠对于急性应激下的绝望行为。可见，Fam19a5^-/-小鼠不动时间增多，表现为绝望行为增多。提示，Fam19a5^-/-小鼠表现为抑郁样行为增加。Immobility：不动。

图23显示实施例6悬尾实验检测Fam19a5^-/-小鼠和WT小鼠对于急性应激下的绝望行为。可见，Fam19a5^-/-小鼠不动时间增多，表现为绝望行为增多。提示，Fam19a5^-/-小鼠表现为抑郁样行为增加。Immobility：不动。

图24显示实施例7水迷宫实验检测Fam19a5^-/-小鼠在训练期寻找水下平台的潜伏期。可见，Fam19a5^-/-小鼠寻找平台的潜伏期增长。提示，Fam19a5^-/-小鼠表现为空间认知障碍。Escape latency：逃逸潜伏期；Flag：旗帜；Day：天；Time：时间；sec：秒。

图25显示实施例7水迷宫实验检测Fam19a5^-/-小鼠在测试期寻找平台的轨迹图。可见，Fam19a5^-/-小鼠在平台所在目的象限的时间减少。提示，Fam19a5^-/-小鼠表现为空间认知障碍。KO：Fam19a5敲除小鼠。

图26显示实施例7水迷宫实验检测Fam19a5^-/-小鼠在测试期位于平台所在象限的时间。可见，Fam19a5^-/-小鼠在平台所在目的象限的时间减少。提示，Fam19a5^-/-小鼠表现为空间认知障碍。TQ，target quadrant，目标象限(在训练期间平台所在象限)；AR，adjacentquadrant right，邻近右侧象限；OQ，opposite quadrant，对侧象限；AL，adjacentquadrant left，邻近左侧象限。Time in quadrants：在象限所占时间。

图27显示实施例7水迷宫实验检测Fam19a5^-/-小鼠在测试期穿越平台所在位置的次数。可见，Fam19a5^-/-小鼠穿越平台所在位置的次数减少。提示，Fam19a5^-/-小鼠表现为空间认知障碍。Number of target crossings：穿越平台所在位置的次数。

图28显示实施例8双抗夹心微球检测在慢性束缚应激(CRS)模型和慢性强迫游泳应激(CFSS)模型小鼠的血浆中FAM19A5的表达。结果显示：FAM19A5在慢性应激模型小鼠的血浆中表达下调。Control：对照；Concentration：蛋白浓度。Plasma：血浆。

图29显示实施例8Real-time PCR检测在慢性束缚应激(CRS)模型和慢性强迫游泳应激(CFSS)模型小鼠的海马中FAM19A5的表达。结果显示：FAM19A5在慢性应激模型小鼠的血浆中表达下调。Hippocampus：海马区；Control：对照；Relative mRNA level：相对mRNA表达水平。

图30显示实施例8双抗夹心微球检测在慢性束缚应激(CRS)模型和慢性强迫游泳应激(CFSS)模型小鼠的海马中FAM19A5的表达。结果显示：FAM19A5在慢性应激模型小鼠的血浆中表达下调。Hippocampus：海马区；Control：对照；Concentration：蛋白浓度。

图31显示实施例8双抗夹心微球检测在慢性社会挫败应激(CSDS)模型小鼠的血浆中FAM19A5的表达。结果显示：FAM19A5在慢性应激模型小鼠的血浆中表达下调。Plasma：血浆；Control：对照；Resilient：恢复型；Susceptible：易感型。

图32显示实施例8双抗夹心微球检测在慢性社会挫败应激(CSDS)模型小鼠的海马中FAM19A5的表达。结果显示：FAM19A5在慢性应激模型小鼠的血浆中表达下调。Hippocampus：海马区；Control：对照；Concentration：蛋白浓度。

图33显示实施例9旷场实验检测在海马中过表达AAV-Null/AAV-FAM19A5的慢性束缚应激诱导的抑郁模型小鼠在测量的前5分钟内进入中心区的次数。可见，在海马中过表达AAV-FAM19A5的慢性束缚应激诱导的抑郁模型小鼠表现进入中心区的次数增多。提示，在海马中过表达AAV-FAM19A5可以逆转慢性束缚应激诱导的抑郁模型小鼠的抑郁样行为。Entries into center：进入中心区的次数。

图34显示实施例9旷场实验检测在海马中过表达AAV-Null/AAV-FAM19A5的慢性束缚应激诱导的抑郁模型小鼠在测量的前5分钟内进入中心区的时间(％)。可见，在海马中过表达AAV-FAM19A5的慢性束缚应激诱导的抑郁模型小鼠表现进入中心区的时间增多。提示，在海马中过表达AAV-FAM19A5可以逆转慢性束缚应激诱导的抑郁模型小鼠的抑郁样行为。Time in center：位于中心区的时间。

图35显示实施例9悬尾实验检测在海马中过表达AAV-Null/AAV-FAM19A5的慢性束缚应激诱导的抑郁模型小鼠对于急性应激下的绝望行为。可见，在海马中过表达AAV-FAM19A5的慢性束缚应激诱导的抑郁模型小鼠表现更少的不动时间，表现为绝望行为减少。提示，在海马中过表达AAV-FAM19A5可以逆转慢性束缚应激诱导的抑郁模型小鼠的抑郁样行为。Immobility：不动。

图36显示实施例9海马CA1区原位注射AAV-Null/AAV-FAM19A5后，海马组织的免疫荧光染色。由于AAV-FAM19A5病毒载体的C端带有Flag标签，因此可以通过检测Flag的表达反应FAM19A5的表达情况。结果显示：原位注射腺相关病毒AAV-FAM19A5可使FAM19A5在海马CA1区过表达。标尺＝50μm。

图37显示实施例9海马CA1区原位注射AAV-Null/AAV-FAM19A5后，双抗夹心微球检测海马和皮层组织的FAM19A5的表达。结果显示：原位注射腺相关病毒AAV-FAM19A5的小鼠海马和皮层中FAM19A5的表达显著高于对照组。Concentration：蛋白浓度。Hippocampus：海马区；Cerebral cortex：大脑皮层。

图38显示实施例10流式细胞术分析WT和Fam19a5^-/-小鼠外周血中中性粒细胞、单核/巨噬细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞的比例。结果显示：与WT小鼠相比，Fam19a5^-/-小鼠外周血中的CD4⁺T淋巴细胞比例显著上调、B淋巴细胞比例显著下调。Neutrophil：中性粒细胞；Monocyte：单核细胞；Blood：外周血。B cells：B淋巴细胞；T cells：T淋巴细胞。

图39显示实施例10流式细胞术分析WT和Fam19a5^-/-小鼠脑中中性粒细胞、单核/巨噬细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞的比例。结果显示：与WT小鼠相比，Fam19a5^-/-小鼠脑中的单核/巨噬细胞比例显著上调。Neutrophil：中性粒细胞；Monocyte/macrophage：单核/巨噬细胞；B cells：B淋巴细胞；T cells：T淋巴细胞。Brain：脑。

图40显示实施例11流式细胞术分析Fam19a5^-/-小鼠尾静脉注射或腹腔注射FAM19A5真核蛋白后取小鼠血浆和脑脊液中FAM19A5的含量。结果显示：无论是尾静脉注射或是腹腔注射蛋白后，小鼠血浆里都可以检测到FAM19A5蛋白，而只有尾静脉注射蛋白5分钟后才可以在小鼠脑脊液中检测到FAM19A5蛋白。i.v.：尾静脉注射；i.p.：腹腔注射。BL：血浆；CSF：脑脊液。

图41显示实施例12免疫荧光检测WT和Fam19a5^-/-小鼠皮层和海马中神经元特异性标志物NeuN和小胶质细胞特异性标志物Iba-1的染色。结果显示：Fam19a5^-/-小鼠皮层和海马中Iba-1的阳性着色更多。Hippocampus：海马区；Cerebral cortex：大脑皮层。标尺＝50μm。

图42显示实施例13Real-time PCR检测加入FAM19A5真核蛋白和LPS后小胶质细胞系BV2的炎性表型。结果显示：FAM19A5可以抑制小胶质细胞系BV2的炎性表型。

图43显示实施例14CCK-8检测加入不同浓度FAM19A5重组蛋白刺激24小时后神经干细胞的增殖和自我更新情况。结果显示：FAM19A5可以抑制神经干细胞的增殖和自我更新。

图44显示实施例14CCK-8检测WT及Fam19a5^-/-小鼠神经干细胞的增殖和自我更新情况，以及给予FAM19A5重组蛋白刺激后神经干细胞的增殖和自我更新情况。结果显示：Fam19a5^-/-小鼠原代神经干细胞的增殖能力增强，二代神经球的数量和大小增加，FAM19A5重组蛋白可以逆转敲除小鼠原代神经干细胞的增殖和自我更新能力。

具体实施方式

以下通过一些实施例对本发明进行较为详细的说明。然而应该理解，这些说明以及后面所列的实施例不是用来限制本发明的保护范围。

本发明构建了FAM19A5腺相关病毒表达系统，经立体定位注射的方式在小鼠海马CA1区过表达FAM19A5蛋白，起到治疗慢性应激诱导的抑郁症的作用，为本发明通过实验在国际上的首次发现。

本发明通过实验证明，本发明的表达FAM19A5蛋白的腺相关病毒对慢性应激诱导的抑郁症具有治疗作用，而编码该FAM19A5蛋白的多核苷酸衍生自编码人类FAM19A5蛋白的序列。

根据本发明的具体实施例，FAM19A5在脊椎动物的脑中特异性高表达。对小鼠进行立体定位注射腺相关病毒AAV-FAM19A5可减轻慢性应激诱导的小鼠抑郁症表型，从而可知FAM19A5为脑组织的重要保护因子。因此，本发明首次证明了FAM19A5在抑郁症中的调节作用。

因此，本发明提供用于调节抑郁症的药物组合物，该组合物包含AAV-FAM19A5或其他表达FAM19A5的载体或FAM19A5蛋白多肽。

根据本发明的另一具体实施例，FAM19A5在脑中特异性高表达，特别是在海马区高表达。神经元、神经干细胞和少突胶质细胞可以表达FAM19A5。经构建Fam19a5敲除小鼠证明FAM19A5的缺失导致小鼠表现出增多的抑郁样行为及认知障碍。慢性应激诱导的抑郁模型小鼠的海马和血浆中FAM19A5的表达下调。通过给海马CA1区立体定位注射含神经元特异启动子的腺相关病毒AAV-FAM19A5在海马中过表达FAM19A5，可以减轻慢性应激诱导的抑郁样行为，从而可知FAM19A5蛋白为空间认知和抑郁相关的情绪调节的保护因子。因此，本发明首次证明了FAM19A5蛋白对认知和抑郁相关的情绪调节的维持有重要作用，或者可作为针对抑郁症和认知障碍相关疾病的治疗手段。

因此，本发明提供用于参与维持认知和抑郁相关的情绪调节的药物组合物，该组合物包含可作为参与维持认知和抑郁相关的情绪调节的FAM19A5蛋白或编码FAM19A5的多核苷酸、包含多核苷酸的基因工程载体、以及相应的药物组合物。优选的基因工程载体为含神经元特异启动子的腺相关病毒AAV9-hSyn-hFAM19A5。

本发明的用于维持认知和抑郁相关的情绪调节的组合物可包含天然或重组FAM19A5、与之具有实质上等同的生理活性的FAM19A5蛋白质、过表达所述天然或重组FAM19A5的转基因神经元细胞，或FAM19A5抑制剂。所述具有实质上等同的生理活性的蛋白质包含天然/重组FAM19A5、其功能性等同物和功能性衍生物。

所述小鼠抑郁相关行为检测是广泛使用的小鼠旷场实验、蔗糖偏好实验、强迫游泳实验和悬尾实验。

所述小鼠认知相关行为检测是广泛使用的小鼠水迷宫实验。

所述小鼠慢性应激诱导的抑郁模型，被认为可以较好地反映人类的抑郁症，包括慢性束缚应激(Chronic restraint stress，CRS)、慢性强迫游泳应激(Chronic forcedswimming stress，CFSS)和慢性社会挫败应激(Chronic social defeat stress，CSDS)。

所述术语“功能性等同物”是指部分或全部的天然蛋白质的氨基酸被置换或部分氨基酸被删除或添加的氨基酸序列变异体和过表达载体，而且与天然FAM19A5具有实质上等同的生物活性。

所述术语“功能性衍生物”是指经修饰的蛋白质，其能增强或降低所述FAM19A5蛋白质的物理和化学性质，而且与天然FAM19A5具有实质上等同的生物活性。

所述FAM19A5抑制剂可以为反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、miRNA或包含其的载体，或者受体序列，或者抗体中的任一种。本发明所述的反义链可以为如SEQ ID NO:1所示的序列的互补序列。本领域普通技术人员已知，反义链或者其一部分(反义寡核苷酸)可用于抑制细胞内FAM19A5蛋白的表达。

此外，根据本发明的另一具体实施例，在小鼠应激诱导的抑郁症模型中，FAM19A5随着抑郁症的发生发展而下调。FAM19A5的缺失造成小鼠自发抑郁样行为和认知障碍，因此可预期，从长远来看，在体内FAM19A5对认知和抑郁相关的情绪调节具有重要作用。因此，FAM19A5可用作生物标记物，用来诊断抑郁症和认知障碍相关疾病。

本说明书中使用的术语“应激”包括各种紧张性刺激物(应激源)引起的个体非特异性反应。例如，交感神经兴奋、垂体和肾上腺皮质激素分泌增多、血糖升高、血压上升、心率加快和呼吸加速、情绪反应与自我防御反应、应对反应等，但所述应激不限于此。

所述术语“抑郁症”是指，症状包括心境低落，自卑抑郁，甚至悲观厌世，可有自杀企图或行为；甚至发生木僵；部分病例有明显的焦虑和运动性激越；严重者可出现幻觉、妄想等精神病性症状的一种心境障碍疾病，但该疾病不限于任何具体的疾病种类。

所述术语“认知障碍相关疾病”是指，学习记忆以及思维判断有关的大脑高级智能加工过程出现异常，从而引起严重学习、记忆障碍，同时伴有失语或失用或失认或失行等改变的病理过程，但该疾病不限于任何具体的疾病种类。

所述术语“诊断”是指，病理状态的确定。鉴于本发明的目的，所述诊断是指，测定FAM19A5表达作为抑郁症和认知障碍的诊断标记，以确认抑郁症和认知障碍的发病、进展及缓解。

所述术语“诊断标记”是指，能够从普通细胞中诊断出抑郁症和认知障碍的细胞的物质，其包括有机生物分子，如多肽或核酸(如mRNA)、脂质、糖脂、糖蛋白以及糖(单糖、二糖、寡糖等)，这些物质在抑郁症和认知障碍的细胞中比起正常细胞有增加或减少。本发明所提供的用于抑郁症和认知障碍的诊断标记可以为蛋白质，该蛋白质是由FAM19A5基因表达的。

本发明的用于诊断抑郁症和认知障碍的组合物，包含用来测量FAM19A5基因的mRNA表达水平或其蛋白质表达量的制剂。这种制剂可包括，例如，具有与FAM19A5 mRNA互补的序列的寡核苷酸，与FAM19A5 mRNA特异性结合的引物或核酸探针，以及FAM19A5蛋白质特异性抗体。

此外，根据本发明的另一具体实施例，与野生型小鼠相比，FAM19A5的缺失导致小鼠外周血和脑组织中的免疫细胞组成发生改变。脑组织中的免疫细胞组成发生改变可影响神经炎症。

本发明的用于诊断抑郁症、认知障碍和神经炎症的药物组合物可以为包含于试剂盒的形式。所述试剂盒可包含用来测量FAM19A5基因的表达水平或蛋白质的量的所述引物、探针或抗体。

当所述试剂盒应用于PCR扩增过程中时，PCR扩增所必要的试剂可有选择地包括，如缓冲液、DNA聚合酶、DNA聚合酶辅助因子和dNTP。当所述试剂盒应用于免疫分析时，其可有选择性地包括二抗和做标记的底物。进一步，本发明的试剂盒可制成能够包含上述试剂化合物的多个单独的包裹或隔室(compartment)。

用于测量基因的表达水平或所表达的蛋白质的量的方法为公知技术，其包括从生物样品中分离出mRNA或蛋白质的已知过程。

所述生物样品是指，从抑郁症、认知障碍和神经炎症的发病或进展程度与正常对照组进行对比时具有不同的基因或蛋白质表达水平的生物体中收集的样品。所述样品的例子可包括组织、细胞、血液、血清、血浆、唾液和尿，但不限于此。

当测量所述基因的表达水平时，优选会测量mRNA的水平。作为测量mRNA的水平的方法可使用RT-PCR、real-time PCR、核糖核酸酶保护分析法、Northern印迹法、DNA芯片等，但不限于此。

当测量所述蛋白质水平时，可使用抗体。此时，生物样品中的FAM19A5蛋白质和其特异性抗体可形成结合物(conjugate)，即抗原-抗体复合物。所形成的抗原-抗体复合物的量可通过由检测标记产生的信号的大小进行定量测定。此检测标记可选自酶、荧光物配体、发光物质、微粒、氧化还原分子或放射性同位素，但不限于此。用于测定蛋白质水平的分析方法包括Western印迹法、ELISA、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、Ouchterlony免疫扩散法、火箭免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、FACS、蛋白质芯片等，但不限于此。

因此，通过利用所述检测方法，本发明可确定对照组中表达的mRNA或蛋白质的量、以及疑似患有抑郁症、认知障碍和神经炎症的患者中表达的mRNA或蛋白质的量。然后，可互相对比所述结果，以诊断抑郁症、认知障碍和神经炎症的发病、进展程度等。

此外，在本发明的用于诊断抑郁症、认知障碍和神经炎症疾病的方法中，当本发明的FAM19A5基因的表达水平或所表达的蛋白质的量与所述正常对照组样品相比有区别时，可判断抑郁症、认知障碍和神经炎症疾病的存在。

本发明还提供用于抑郁症、认知障碍和神经炎症疾病的预防性或治疗性药物的筛选方法，该方法包括：在体外使FAM19A5基因与候选物质进行接触，并且判断所述候选物质能否促进或抑制所述基因的表达；或者，在体外使FAM19A5蛋白质与候选物质进行接触，并且判断所述候选物质能否提高或抑制所述蛋白质的功能或活性。

根据本发明的筛选方法，首先，将待分析的候选物质与包含所述基因或蛋白质的抑郁症和认知障碍疾病的细胞进行接触。

根据传统的选取方法，所述候选物质可包含：能够促进或抑制在FAM19A5基因序列中转录成mRNA和翻译成蛋白质的物质，被推测具有能够促进或抑制FAM19A5蛋白质的功能或活性的医学上应用的可能性的物质，或随机选取的单个的核酸、蛋白质、肽，其它提取物、天然产物、化合物等。

然后，在处理候选物质的细胞中测量基因表达的量、蛋白质的量或蛋白质的活性。在所测结果中，当测到基因表达的量、蛋白质的量或蛋白质的活性有增加或降低时，可判断所述候选物质为能够治疗或预防抑郁症和认知障碍疾病的物质。

如上所述，可通过各种本领域内公知的方法对所述基因表达的量、蛋白质的量或蛋白质的活性进行测量，如RT-PCR、实时聚合酶链反应、Western印迹法、Northern印迹法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、放射免疫扩散法、免疫沉淀法等，但不限于此。

通过本发明的筛选方法，可获得展示出能够促进基因表达或促进蛋白质功能的候选物质、以及反之展示出能够抑制基因表达或抑制蛋白质功能的候选物质。

用于抑郁症、认知障碍和神经炎症疾病的治疗制剂候选物质可在后期的用于抑郁症、认知障碍和神经炎症疾病的治疗制剂的研发过程中起到主导化合物的作用。当对所述主导化合物的结构进行变形和最优化以促进或抑制FAM19A5基因或其表达出的蛋白质的功能时，可研发出一种新型的用于抑郁症、认知障碍和神经炎症疾病的治疗制剂。

本发明还提供编码FAM19A5的多核苷酸或FAM19A5分泌蛋白在制备商品化试剂研究抑郁症、认知障碍和神经炎症疾病的应用。

在本发明中，与基因工程技术有关的内容可从Sambrook,et al.MolecularCloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(2001)和Frederick M.Ausubel et al.,Current protocols in molecularbiology volume1,2,3,John Wiley&Sons,Inc.(1994))书所公开的内容中得到清晰的理解。

实施例1、FAM19A5双抗夹心微球检测系统的建立

一、方法：

取100μL醛/硫酸乳胶微球和20μL兔抗FAM19A5多克隆抗体(2.5mg/mL)加入至终体积为200μL的MES Buffer(0.025mol/L，pH＝6.0)4℃缓慢旋转过夜。按照Latex BeadProtein Coupling Protocols(Thermo Fisher Scientific)处理包被FAM19A5兔多抗的微球。微球检测的过程如下：

·微球预处理：按照每个样品1μL微球，再加1μL封闭液(10％BSA的PBS溶液或稀释1000倍的Fam19a5^-/-小鼠血浆)计算所需微球和封闭液用量，混匀后于室温孵育30分钟。

·样品预处理：组织匀浆3000g/5分钟离心后吸取上清，使用Pierce BCA ProteinAssay Kit(Thermo Fisher Scientific)试剂盒定量后，根据组织匀浆蛋白的浓度将其稀释至终浓度为1mg/mL后使用，稀释液为PBS，总体积50μL。小鼠脑脊液和血浆3000g/5分钟离心后吸取上清，稀释2000倍后使用，总体积50μL。细胞培养上清不作稀释，总体积50μL。标准品为纯化定量后的FAM19A5重组真核蛋白的89个氨基酸的分泌形式(SEQ ID No：3)。检测组织匀浆和细胞培养上清所用标准品的稀释液体为5％BSA的PBS溶液；检测脑脊液和血浆所用标准品的稀释液为稀释2000倍的Fam19a5^-/-小鼠血浆。标准品倍比稀释后浓度为0-32000pg/mL。

·将处理好的每管50μL的样品加入预处理的2μL微球混合均匀后室温旋转孵育2小时。3000g/5分钟离心后吸走上清。

·用50μL的检测一抗稀释液(山羊抗FAM19A5多克隆抗体：0.2mg/mL，1/200稀释至5％BSA的PBS溶液)重悬微球，室温缓慢旋转孵育1小时。3000g/5分钟离心后吸走上清。

·用50μL的检测二抗稀释液(PE标记抗山羊IgG：1/1000稀释至5％BSA的PBS溶液)重悬微球，室温避光缓慢旋转孵育0.5小时。3000g/5分钟离心后吸走上清。

300μL的PBS溶液重悬微球后，用FACSVerse流式细胞仪检测。通过标准品的浓度以及Geomean值拟合标准曲线，通过标准曲线计算待测样品的FAM19A5浓度。

二、结果：

通过流式细胞仪检测样品中已知FAM19A5的浓度，以荧光强度的geomean值计算制得其标准曲线。图1显示流式细胞术对已知浓度0-32000pg/mL的FAM19A5重组蛋白检测柱状图。图2表明检测组织样本的微球标准曲线的线性系数R²为0.9834。图3表明检测血浆样本的微球标准曲线的线性系数R²为0.9902。

实施例2、FAM19A5在小鼠各组织的表达谱

一、方法：

从北京大学医学部实验动物部购买6-8周龄黑色雄性小鼠(C57BL/6J，小鼠)。购买的小鼠在鼠笼里进行饲养，在该鼠笼内有供应适当的食物和水，温度维持在20～24℃，湿度保持在40～70％。此外，在12小时/12小时光暗周期(上午八点开灯，下午八点关灯)内保管这些野生型的小鼠。所有实验被设计成均使用最少数量的小鼠，根据动物实验伦理，实施了麻醉方法，以最大程度降低实验中所用的小鼠的痛苦。小鼠麻醉后心脏灌注，取小鼠各器官，提取每个对应组织中总RNA，从然后通过使用逆转录酶和随机六聚体来制备互补DNA(cDNA)。随后，根据小鼠FAM19A5编码基因全长序列(SEQ ID No：4)设计引物，并通过利用相应的引物进行实时定量聚合酶链反应检测各器官FAM19A5的表达。以FAM19A5上游F(5'-gaccagcagccggcaagatg-3'，SEQ ID No：5)、下游R(5'-cgagcgtccacacaagcagg-3'，SEQ IDNo：6)，GAPDH上游F(5'-cggagtcaacggatttggtcgtat-3'，SEQ ID No：7)，下游R(5'-agccttctccatggtggtgaagac-3'，SEQ ID No：8)序列为引物，进行real-time PCR扩增40轮。另取小鼠各器官匀浆后取上清，利用双抗夹心微球检测体系检测各组织器官、血浆和脑脊液中FAM19A5的表达。

二、结果：

如图4所示，Fam19a5在脑组织高表达。进一步我们采用微球检测系统验证了FAM19A5在小鼠各组织的蛋白表达水平，与mRNA水平一致，FAM19A5的蛋白水平也在小鼠脑组织显著高表达(图5)。如图6所示，血浆和脑脊液中FAM19A5的浓度大致相同。

实施例3、FAM19A5在小鼠不同发育阶段的表达

一、方法：

用与上述方法相同的方式管理小鼠。小鼠麻醉后断颈处死出生前胚胎期12.5天(E12.5)、16.5(E 16.5)天以及出生后1天(P 1)、7天(P 7)和8周(8W)的小鼠而从其颅骨中取得脑。利用Real-time PCR和双抗夹心微球检测体系检测各发育阶段小鼠的脑中FAM19A5的表达。

二、结果：

结果如图7所示，在mRNA水平上，FAM19A5的表达从小鼠胚胎期12.5天开始有轻微上升，在出生后1天表达最高达到峰值，然后在出生后7天表达下降。如图8所示，在蛋白水平上，FAM19A5的表达从小鼠胚胎期12.5天开始有轻微上升，接着在胚胎期16.5天和出生后1天持续上升，在出生后7天表达达到峰值，随后在第8周表达降低。提示FAM19A5的表达可能与脑的发育相关。

实施例4、FAM19A5在小鼠不同脑区的表达

一、方法：

用与上述方法相同的方式管理6-8周龄的小鼠。

用于Real-time PCR和双抗夹心微球检测的小鼠麻醉后断颈处死，从其颅骨中取得脑。取不同脑区(海马、杏仁核、丘脑、大脑皮层、下丘脑及小脑)，利用Real-time PCR和双抗夹心微球检测体系检测各脑区中FAM19A5的表达。

用于石蜡切片的小鼠：

1)取材：用阿伏丁(240mg/kg)麻醉小鼠后，心脏灌注冷PBS和4％多聚甲醛(PFA)。取小鼠脑组织放入多聚甲醛溶液中固定24小时。

2)脱水：将组织从多聚甲醛溶液中取出，用PBS清洗组织后，将组织放入石蜡包埋盒中，用铅笔标记组织编号后，依次浸泡60％、70％、80％乙醇分别24小时，90％乙醇12小时，95％乙醇2.5小时，100％乙醇I和100％乙醇II分别1小时。

3)透明：将组织浸泡入二甲苯I和二甲苯II中分别25分钟。

4)浸蜡：将组织浸入预先加热融化的石蜡I和石蜡II中分别45分钟。

5)包埋：在石蜡包埋操作台上将组织放入模块中，加入过滤的预先加热融化的石蜡冷却成型。

6)切片：采用Leica半自动切片机对制作好的蜡块进行切片，切片厚度为4μm，使用阳离子预先处理过的载玻片贴片。贴好的石蜡切片于60℃烘箱烘片2小时。

7)放入二甲苯I和II中，分别浸泡20分钟，接着将石蜡切片依次放入100％乙醇I、100％乙醇II、95％乙醇和75％乙醇中分别浸泡5分钟，然后放入PBS中。

8)配置1.5L的酸性抗原修复液加入高压锅中煮沸，将组织切片放入高压锅后，继续加热至高压锅开始排气，排气2分钟后，停止加热，用自来水流冷却25分钟后，PBS洗三次。

9)配制3％过氧化氢溶液(原浓度30％)滴加至组织上，常温避光孵育20分钟后，PBS洗三次。

10)在组织上滴加与二抗种属相同的血清工作液后室温孵育40分钟，然后加入一抗稀释液，4℃过夜。

11)常温复温10分钟，PBS洗3次，在组织上滴加二抗稀释液，常温孵育1小时。

12)PBS洗三次，DAB显色，在显微镜下观察显色至合适程度，自来水终止显色。苏木素复染5分钟，盐酸酒精分化10秒后，自来水返蓝15分钟。

13)按照75％乙醇、95％乙醇、100％乙醇I和100％乙醇II梯度脱水，二甲苯I和二甲苯II透明。使用中性树胶封片。标本在通风橱中干燥后，显微镜阅片、拍照。

二、结果：

图9和图10显示FAM19A5在小鼠脑组织海马区高表达，在杏仁核、丘脑、大脑皮层、下丘脑及小脑呈现中等水平表达。图11显示对小鼠脑组织进行免疫荧光染色，结果也证实了FAM19A在小鼠脑组织海马区高表达，特别是在锥体神经元上有比较强的阳性着色。

实施例5、FAM19A5在不同神经细胞上的表达

一、方法：

用与上述方法相同的方式管理小鼠。用上述方法获得小鼠脑组织石蜡切片。接着用免疫荧光染色检测不同神经细胞特异性标志物与FAM19A5的共表达情况。用Real-timePCR检测不同神经细胞中FAM19A5的表达情况。用双抗夹心微球检测不同神经细胞培养上清中FAM19A5的表达情况。

免疫荧光染色：

1)将石蜡切片放在60℃烤箱中烤片2小时融蜡，然后迅速地放入二甲苯I和II中，分别浸泡20分钟，接着将石蜡切片依次放入100％乙醇I、100％乙醇II、95％乙醇和75％乙醇中分别浸泡5分钟，然后放入PBS中。

2)配置1.5L的酸性抗原修复液加入高压锅中煮沸，将组织切片放入高压锅后，继续加热至高压锅开始排气，排气2分钟后，停止加热，用自来水流冷却25分钟后，PBS洗三次。

3)配制0.3％TritonX-100溶液滴加至组织上，常温孵育20分钟后，PBS洗三次。

4)在组织上滴加与二抗种属相同的血清工作液后室温孵育40分钟，然后加入一抗稀释液，4℃过夜。

5)常温复温10分钟，PBS洗3次，在组织上滴加荧光二抗稀释液，常温孵育1小时。

6)PBS洗三次，DAPI复染，使用抗淬灭剂封片。显微镜阅片、拍照。

二、结果：

如图12所示，FAM19A5与神经元特异性标志物NeuN存在共表达。如图13所示，FAM19A5与神经干细胞特异性标志物Nestin存在共表达。如图14所示，FAM19A5与少突胶质细胞特异性标志物Olig2存在共表达。如图15所示，FAM19A5与谷氨酸能神经元特异性标志物VGLUT2存在共表达。结果显示，神经元(特别是谷氨酸能神经元)、神经干细胞和少突胶质细胞表达FAM19A5。Real-time PCR和双抗夹心微球检测FAM19A5在293T、神经元、星形胶质细胞和神经干细胞的表达。结果如图16和图17显示，神经元和神经干细胞表达和分泌FAM19A5。

实施例6、FAM19A5缺失使小鼠产生抑郁样行为

为了对Fam19a5敲除小鼠的抑郁样行为进行评估，对Fam19a5^-/-小鼠及同窝野生型(Wild Type，WT)小鼠进行旷场实验、蔗糖偏好实验、强迫游泳实验和悬尾实验。

旷场实验(Open Field Test)：小鼠被单独放置在一个长40cm、宽40cm、高30cm的塑料制成的空旷箱子中央。自由探索30分钟。同时，用Smart 3.0视频系统记录小鼠活动轨迹。统计每只小鼠在旷场内运动的总距离、运动速度以及前5分钟在中心区的时间。

蔗糖偏好实验(Sucrose Preference Test)：将小鼠单笼饲养，笼子上放置两个水瓶，一个里面含有浓度为1％(质量/体积)的蔗糖水，另一个含有灭菌过的自来水。小鼠适应双瓶饲喂24小时后，开始正式实验并记录两个水瓶的初始重量。为避免小鼠有位置偏好性，每隔8小时更换一次水瓶位置。24小时后记录两个水瓶的最终重量，并计算小鼠在24小时内摄入的水量和蔗糖水量。蔗糖偏好指数的计算公式为：蔗糖偏好百分比(％)＝摄入蔗糖水量/(摄入水量+蔗糖水量)×100％

强迫游泳实验(Forced Swimming Test)：将小鼠单独置于一个透明的丙烯酸圆筒中(直径20cm，高度40cm)，筒内含有30cm高的水，水温保持在22℃。使用Smart 3.0视频系统记录小鼠放入水后6.5分钟的状态。分析小鼠在测试的最后5分钟静止不动的时间。

悬尾实验(Tail Suspension Test)：用胶带将小鼠尾悬吊6.5分钟，使用Smart3.0视频系统记录小鼠悬尾后6.5分钟的状态。分析小鼠在测试的最后5分钟静止不动的时间。

二、结果：

旷场实验用于测量动物在开放空间的中心区或外周的运动距离和运动时间，运动距离反映了动物在旷场中的自发性活动的活动量，在中心区的运动时间反映了动物的焦虑或抑郁的程度。结果表明，在旷场实验测量的30分钟内，Fam19a5^-/-小鼠的总运动距离和运动速度比WT小鼠显著增加(图18和图20)，而在实验测量的前5分钟内，Fam19a5^-/-小鼠在中心区所占时间的百分比相较于WT小鼠而言显著减少(图19)。该实验表明相较于同窝WT小鼠而言，Fam19a5^-/-小鼠表现出高活动性和显著增加的焦虑/抑郁样行为。为了进一步探究Fam19a5^-/-小鼠是否表现出抑郁样行为，我们进行了蔗糖偏好实验、强迫游泳实验和悬尾实验。我们首先进行了蔗糖偏好实验(Sucrose preference test，SPT)，该实验用于测量动物对于1％蔗糖(w/v)溶液摄取的百分比，反映动物是否具有快感缺乏，对奖励刺激缺乏兴趣等抑郁样表现。结果表明，Fam19a5^-/-小鼠对蔗糖溶液的偏好显著低于WT对照组小鼠(图21)，表明Fam19a5^-/-小鼠的快感缺乏行为显著增加。然后我们进行了强迫游泳实验(Forcedswimming test，FST)，该实验用于测量动物在水中的不动时间，作为一种急性应激实验反映动物的抑郁程度。结果表明，Fam19a5^-/-小鼠表现出更长的不动时间(图22)，反映出Fam19a5^-/-小鼠有更长时间的绝望行为。该结果在另一种急性应激试验——悬尾实验(Tailsuspension test，TST)中也得到了证实，Fam19a5^-/-小鼠同样表现出更长的不动时间(图23)。上述结果表明，Fam19a5^-/-小鼠相较于同窝的WT小鼠而言表现出增加的抑郁样行为。

实施例7、FAM19A5缺失导致小鼠认知障碍

为了对Fam19a5敲除小鼠的认知行为进行评估，对Fam19a5^-/-小鼠及同窝野生型(Wild Type，WT)小鼠进行水迷宫实验。

水迷宫实验(Morris Water Maze,MWM)：本研究使用的水迷宫由一个直径为120cm，深度为60cm的圆形水箱组成。水箱内充满不透明的水，温度为22±2℃，并配备直径为10cm的透明逃生平台，该平台位于水面以下1cm处。将不同的视觉图片贴在水箱周围，作为空间标志。在水迷宫上方安装了摄像机，记录水迷宫中小鼠游泳的轨迹。水迷宫被分为四个象限，目标象限(先前包含平台的象限)和三个非目标象限(相对象限、相邻的右象限和相邻的左象限)。第0天，老鼠被训练去寻找一个有可见旗帜的平台。第1-6天，平台淹没于水面以下1-2cm处，将小鼠置于迷宫的四个象限之一，面向水迷宫壁，寻找平台，时间为60秒。如果一只小鼠失败了，它会被引导到平台上并维持15秒。每天进行四次实验，每次实验间隔45分钟。记录每次实验每只小鼠的逃逸潜伏期。第7天，移除平台，进行空间记忆测试，将小鼠在目标象限的时间(％)与所有其他象限进行比较，并将小鼠穿过目标象限的平台的次数与所有其他象限的相似区域进行比较。

二、结果：

在MWM实验中，第0天，小鼠可以看到平台上的可见旗帜，Fam19a5^-/-小鼠寻找平台的时间相较于WT小鼠没有显著差异，表明Fam19a5^-/-小鼠寻找平台的动机相较于WT小鼠没有差异(图24)。第1-6天，Fam19a5^-/-小鼠在寻找水下平台的训练过程中发现隐藏平台的潜伏期明显延长(图24)。第7天，将平台撤除以后，Fam19a5^-/-小鼠相较于WT小鼠在平台所在的目的象限所占时间明显减少(图25和图26)。此外，Fam19a5^-/-小鼠穿过平台区域的次数明显少于WT小鼠(图27)，进一步表明Fam19a5^-/-小鼠表现出空间学习和记忆的认知障碍。

实施例8、慢性应激诱导的抑郁引起小鼠血浆和海马FAM19A5的表达明显降低

小鼠的慢性应激模型被认为可以较好地反映人类的抑郁症。为了探索在抑郁状态下FAM19A5的表达是否发生变化，我们将野生型小鼠分别置于慢性束缚应激(Chronicrestraint stress，CRS)、慢性强迫游泳应激(Chronic forced swimming stress，CFSS)和慢性社会挫败应激(Chronic social defeat stress，CSDS)三种经过动物行为学验证的应激模型下来探索FAM19A5的表达变化。

慢性束缚应激(Chronic restraint stress，CRS)：将2-3个月龄的雄性C57BL/6J小鼠置于带三个通气口的50mL离心管中，允许其伸展四肢，但不让其在管内移动。连续21天，每天施加2-3小时的慢性束缚应激。年龄匹配的非应激动物作为对照。

慢性强迫游泳应激(Chronic forced swimming stress，CFSS)：将2-3个月龄的雄性C57BL/6J小鼠置于40厘米高的透明丙烯酸圆筒中，连续5天，每天施加5分钟的慢性强迫游泳应激。年龄匹配的非应激动物作为对照。

慢性社会挫败应激(Chronic social defeat stress，CSDS)：将6-8周龄的雄性C57BL/6J小鼠直接置于4-6月龄的雄性CD-1退役鼠的笼里，每天进行5-10分钟的社会挫败应激，持续10天。与CD-1攻击小鼠直接接触后，C57BL/6J小鼠被转移到笼子的另一侧，中间用有孔的隔离板隔开使两者不能产生身体接触，置于分隔的笼内24小时。对照组将C57BL/6J对小鼠置于同样的笼子中。对照组小鼠每天都在对照组的笼子里进行轮换。在最后一次社交挫败应激24小时后，进行了社交互动测试。在社交互动试验前1小时使C57BL/6J小鼠习惯社交互动试验装置。在前2.5分钟的实验中(“无目标”)，将C57BL/6J社会挫败小鼠放入社交互动装置，让其自由探索一个开放场地(40×40cm)，场地内放有一个空的金属丝网箱(10×6cm)，没有“目标”CD-1小鼠。在第二次2.5分钟的试验(“有目标”)中，在“目标”CD-1鼠标在金属丝网箱内的情况下，小鼠被重新放入这个装置，使其自由移动。使用Smart 3.0视频跟踪系统记录和分析在“角落区域”(9×9cm)和“互动区域”(12×25cm)的时间。社会互动比例是指在“互动区域”花费的时间与在“角落区域”花费的时间之比。恢复型指社会互动比率≥1，易感型指社会互动比率<1。

二、结果：

首先，我们诱导CRS和CFSS模型，在最后一次束缚或强迫游泳以后，我们收取模型小鼠及对照小鼠的血浆，分离小鼠的海马。并且采用Real-time PCR和微球系统检测FAM19A5的表达水平。结果显示，经慢性束缚应激或慢性强迫游泳应激诱导的模型小鼠的血浆和海马中FAM19A5的mRNA和蛋白水平均显著下调(图28、图29和图30)。然后我们诱导了CSDS模型，在社会交互测试后检测模型小鼠血浆和海马中FAM19A5的水平。与对照组和恢复型小鼠相比，易感型小鼠血浆中FAM19A5的水平显著降低(图31)，同样海马中FAM19A5蛋白水平显著降低(图32)，这与CRS和CFSS小鼠的结果一致。上述结果表明，在慢性应激条件下，FAM19A5在血浆和海马的水平显著降低。

实施例9、AAV9-FAM19A5减轻慢性束缚应激诱导的小鼠抑郁样行为，具有抗抑郁药效活性

为了进一步探索FAM19A5在抑郁症中的作用，我们委托山东维真生物科技有限公司将人FAM19A5(hFAM19A5)多核苷酸序列(SEQ ID No：1)构建到含有神经元特异启动子hSyn的腺相关病毒AAV9中，获得AAV9-hSyn-hFAM19A5，并将AAV9-hSyn-hFAM19A5(图中和说明书中以AAV-FAM19A5表示)原位注射到海马区，在慢性束缚应激诱导的抑郁模型小鼠中过表达人FAM19A5蛋白(SEQ ID No：2)，来研究人FAM19A5蛋白对小鼠抑郁行为的影响。

原位注射病毒到海马区：

给小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)使其麻醉并固定在立体定位仪上。固定时，先将小鼠门齿卡在小鼠适配器门齿夹上并轻轻地压住横杆，调整小鼠前后和水平位置，托起小鼠头部，将左右侧耳杆插入小鼠外耳道，调节耳杆使得小鼠头部保持在中心位置，旋紧耳杆螺丝，使得小鼠头部不能晃动，同时拧紧门齿夹螺丝。用剃刀剔除小鼠头部毛发，用75％乙醇消毒头部暴露的皮肤，剪开皮肤，用干棉签擦拭去除颅骨表面的结缔组织，暴露出前后囟。

在玻璃电极内注入矿物油并安装到注射泵上，并将注射泵连接在立体定位仪上。确定前后囟位置，将小鼠头部调平。根据海马CA1区坐标(Bregma anteroposterior(AP):-2.06mm,mediolateral(ML):±1.50mm,dorsoventral(DV):-1.30mm)，以前囟Bregma为0点，移动注射泵，确定目的核团的位置。小心地用颅钻在注射位点处慢慢打薄颅骨，当颅骨出现小窗口的时候，停止打磨。用医用棉签轻轻擦拭颅骨窗口周围以清除杂质。用注射泵吸取500nL滴度为1×10¹³的含有神经元特异启动子的AAV9病毒载体(AAV-FAM19A5)或滴度相同的等量对照空载病毒(AAV-Null)，然后微调玻璃电极的位置与目的核团的位置相同，将玻璃电极缓慢下降至目的深度。设置微量注射泵在5分钟内将病毒注射完毕，并且停留5分钟，使病毒充分扩散，并且防止病毒随着玻璃电极的拔出而漏出核团。

待病毒表达3周后，对两组小鼠按照上述相同方法诱导慢性束缚应激模型，每天3小时，共诱导10天。待模型结束，小鼠恢复1-2天后进行上述相同方法的旷场实验和悬尾实验。

二、结果：

在旷场实验中，在实验测量的前5分钟内，感染AAV-FAM19A5的小鼠在中心区所占时间的百分比与进入中心区的次数相较于AAV-Null对照小鼠而言有显著增加(图33和图34)，表明AAV-FAM19A5小鼠抑郁样行为减轻。悬尾实验结果表明，感染AAV-FAM19A5的小鼠表现出更短的不动时间(图35)，反映出感染AAV-FAM19A5的小鼠有更短时间的绝望行为。由于AAV载体上的FAM19A5基因同时表达Flag标签，于是我们用免疫荧光检测感染AAV-Null以及AAV-FAM19A5的小鼠海马CA1区的Flag的表达水平来反应FAM19A5的表达情况，以及用微球系统检测小鼠海马中FAM19A5的表达水平。结果发现感染AAV-FAM19A5的小鼠海马中FAM19A5的蛋白水平显著高于对照组小鼠(图36和图37)，表明过表达成功。以上结果表明，与AAV-Null对照组小鼠相比，AAV-FAM19A5过表达FAM19A5能够减轻小鼠的抑郁样行为，AAV-FAM19A5具有抗抑郁药效活性。

实施例10、FAM19A5缺失影响小鼠外周血和脑中免疫细胞的组成

为了对Fam19a5敲除小鼠的外周血和脑中不同免疫细胞比例进行评估，使用流式细胞术对Fam19a5^-/-小鼠及同窝野生型(Wild Type，WT)小鼠的外周血和脑进行不同免疫细胞比例的评估。

对于脑中的免疫细胞的检测：

取小鼠整个脑组织放入HBSS溶液中研磨，铺于7mL含2％FBS的PBS溶液中，制成脑的单细胞悬液。将7mL的研磨液与3mL 90％的Percoll溶液混合，缓慢滴加到预先加入70％的Percoll的15mL离心管中。18℃，500g无刹车离心30分钟。用3倍体积的HBSS溶液洗细胞两次。用含2％FBS的PBS作为封闭液，冰上封闭20分钟。根据说明书加入适量含荧光标记流式抗体的染色液，置于冰上，避光孵育30分钟。2000rpm，5分钟，4℃离心，弃去上清。用PBS洗涤1遍，300μL PBS重悬后用BD Verse流式细胞仪检测。得到的数据用软件FlowJo 7.6进行数据处理和分析。

对于外周血中的免疫细胞的检测：

取小鼠的外周血100μL加入1mL PBS溶液中混匀。4500rpm，5分钟，4℃离心，弃去上清。加入700μL ACK红细胞裂解液冰上裂红3分钟。加入700μL PBS溶液中和后，4500rpm，5分钟，4℃离心，弃去上清。重复裂红一次后，用PBS洗涤1遍。用含2％FBS的PBS作为封闭液，冰上封闭20分钟。根据说明书加入适量含荧光标记流式抗体的染色液，置于冰上，避光孵育30分钟。2000rpm，5分钟，4℃离心，弃去上清。用PBS洗涤1遍，300μL PBS重悬后用BD Verse流式细胞仪检测。得到的数据用软件FlowJo 7.6进行数据处理和分析。

二、结果：

与WT小鼠相比，Fam19a5^-/-小鼠外周血中的CD4⁺T淋巴细胞比例显著上调、B淋巴细胞比例显著下调(图38)，而Fam19a5^-/-小鼠脑中的单核/巨噬细胞比例显著上调(图39)。

实施例11、FAM19A5蛋白可以通过血脑屏障

一、方法：

为了探究FAM19A5真核蛋白是否可以通过血脑屏障，我们给予Fam19a5^-/-小鼠尾静脉注射(i.v.)或腹腔注射(i.p.)5μg FAM19A5真核蛋白，5分钟后给小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)用于麻醉，收集小鼠血浆和脑脊液，用微球检测系统检测其中FAM19A5的含量。

二、结果：

无论是尾静脉注射或是腹腔注射蛋白5分钟后，小鼠血浆里都可以检测到FAM19A5蛋白，而只有尾静脉注射蛋白5分钟后才可以在小鼠脑脊液中检测到FAM19A5蛋白(图40)。这些结果表明，FAM19A5真核蛋白可以通过血脑屏障，提示外周的FAM19A5可能会在脑中发挥作用。

实施例12、Fam19a5敲除小鼠脑中小胶质细胞Iba-1表达增加

一、方法：

用与上述方法相同的方式管理小鼠，然后获得脑组织冰冻切片。接着用免疫荧光染色检测WT和Fam19a5^-/-小鼠皮层和海马中神经元特异性标志物NeuN和小胶质细胞特异性标志物Iba-1的染色。

免疫荧光：

1)取材：用戊巴比妥钠麻醉小鼠后，心脏灌注冷PBS和4％多聚甲醛(PFA)。取小鼠组织，将组织块修剪至合适大小后，放入多聚甲醛溶液中4℃固定24小时。

2)脱水：将组织从多聚甲醛溶液中取出，用PBS清洗组织后，将组织依次放入20％和30％蔗糖溶液中4℃脱水24小时。

3)包埋：将组织放入用锡箔纸制作的模块中，加入OCT包埋剂后，放入-80℃冰箱凝固成型。

4)切片：采用Leica 3050s半自动切片机对制作好的组织块进行切片，切片厚度为50μm，使用阳离子预先处理过的载玻片贴片。贴好的冰冻切片于37℃烘箱烘片过夜后备用。

5)将保存好的冰冻切片放入PBS中洗3次溶解OCT胶，每次5分钟。

6)加入含有0.3％TritonX-100的PBS溶液孵育20分钟。

7)PBS洗3次后，加入羊血清工作液，常温封闭1小时。

8)加入一抗，4℃孵育过夜。

9)常温复温10分钟后，PBS洗3次，加入Alexa 488或者Alexa 594耦联的二抗IgG，常温避光孵育1小时。

10)PBS洗3次，核染料DAPI复染，常温避光孵育20分钟。

11)PBS洗3次，用抗荧光淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察和拍照。

二、结果

Fam19a5^-/-小鼠皮层和海马中Iba-1的阳性着色更多、形态发生改变(图41)。提示：FAM19A5可能影响小胶质细胞的形态和数量。

实施例13、FAM19A5抑制小胶质细胞系BV2的炎性表型

一、方法：

为了探究FAM19A5对小胶质细胞功能的影响，我们用Real-time PCR检测加入FAM19A5真核蛋白和LPS后小胶质细胞系BV2的炎性表型。

小胶质细胞系极化实验：

1)细胞铺6孔板过夜，每孔约6×10⁵个细胞；

2)PBS洗两遍，加入1μg/mL LPS，同时加入200ng/mLFAM19A5真核蛋白；

3)6小时后，PBS洗两遍，收集细胞，加入Trizol，提取RNA；

4)Real-timePCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS的mRNA表达水平。

二、结果

FAM19A5可以抑制LPS刺激后小胶质细胞系BV2的IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平(图42)。以上结果表明：FAM19A5抑制小胶质细胞系BV2的炎性表型。

实施例14、FAM19A5抑制小鼠神经干细胞的增殖与自我更新

一、方法：

为了探究FAM19A5对神经干细胞功能的影响，我们取出胚胎16.5天的野生型小鼠脑，体外分离神经干细胞进行培养，随后在培养上清中给予不同浓度的FAM19A5重组蛋白刺激，5天之后观察FAM19A5对神经干细胞增殖和自我更新的影响。

神经干细胞增殖与自我更新实验：

收集培养3-5天的神经干细胞(神经球)，用Accutase消化后，接种3000个细胞/孔于96板过夜。PBS洗两遍，细胞换液，加入不同浓度的FAM19A5重组蛋白培养24小时。加入CCK-8后放入孵箱孵育2-4小时，测量吸光度值OD450。

二、结果：

FAM19A5能够抑制小鼠原代神经干细胞(神经球)的增殖，同时也能抑制二代神经球的数量和大小，并且抑制作用与FAM19A5的浓度呈依赖关系(图43)。为了进一步验证FAM19A5对神经干细胞增殖和自我更新的抑制作用，我们取出胚胎16.5天的WT及Fam19a5^-/-小鼠脑，体外分离神经干细胞进行培养，随后在培养上清中给予不同浓度的FAM19A5重组蛋白刺激，5天之后观察WT及Fam19a5^-/-小鼠神经干细胞增殖和自我更新的情况。结果显示Fam19a5^-/-小鼠原代神经干细胞的增殖能力增强，二代神经球的数量和大小增加，FAM19A5重组蛋白可以逆转敲除小鼠原代神经干细胞的增殖和自我更新能力(图44)。以上结果表明：FAM19A5可以抑制小鼠神经干细胞的增殖与自我更新。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学

<120> FAM19A5的医药用途

<130> WX2021-BY-002

<150> CN 202010259573.1

<151> 2020-04-03

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<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 399

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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tcaactttct gggcgttcat gatcctggcc agcctgctca tcgcctactg cagtcagctg 120

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atcgcccggc agaccgcccg ctgtgcgtgt agaaaggggc agatcgccgg caccacgaga 240

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<210> 2

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Met Ala Pro Ser Pro Arg Thr Gly Ser Arg Gln Asp Ala Thr Ala Leu

1 5 10 15

Pro Ser Met Ser Ser Thr Phe Trp Ala Phe Met Ile Leu Ala Ser Leu

20 25 30

Leu Ile Ala Tyr Cys Ser Gln Leu Ala Ala Gly Thr Cys Glu Ile Val

35 40 45

Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln

50 55 60

Thr Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys Gly Gln Ile Ala Gly Thr Thr Arg

65 70 75 80

Ala Arg Pro Ala Cys Val Asp Ala Arg Ile Ile Lys Thr Lys Gln Trp

85 90 95

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100 105 110

Asn Arg Ser Gly Trp Thr Cys Thr Gln Pro Gly Gly Arg Ile Lys Thr

115 120 125

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130

<210> 3

<211> 89

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Thr Cys Glu Ile Val Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg

1 5 10 15

Thr Ile Ala Arg Gln Thr Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys Gly Gln Ile

20 25 30

Ala Gly Thr Thr Arg Ala Arg Pro Ala Cys Val Asp Ala Arg Ile Ile

35 40 45

Lys Thr Lys Gln Trp Cys Asp Met Leu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Gly

50 55 60

Cys Asp Leu Leu Ile Asn Arg Ser Gly Trp Thr Cys Thr Gln Pro Gly

65 70 75 80

Gly Arg Ile Lys Thr Thr Thr Val Ser

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<211> 399

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 4

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tcaacttttt gggcattcat gatcctggcc agcctgctca tcgcctactg cagtcagctg 120

gccgctggaa cctgtgagat tgtgacccta gaccgggaca gcagccagcc acggaggacg 180

atcgcccggc agacagcacg ctgtgcatgc agaaaggggc agatagcagg caccactcga 240

gcccggcctg cttgtgtgga cgctcgaatt atcaagacaa agcagtggtg tgacatgctt 300

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cagcccggag ggcggataaa gaccaccacg gtctcctga 399

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<213> 人工序列

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<212> DNA

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<213> 人工序列

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cggagtcaac ggatttggtc gtat 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agccttctcc atggtggtga agac 24

Claims

1.FAM19A5蛋白在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用，其中所述疾病为抑郁症；其特征在于，所述药物包含FAM19A5蛋白，和/或包含能够促进FAM19A5蛋白的功能或活性的物质；所述FAM19A5蛋白是具有序列表中SEQ ID No：2或SEQ ID No：3所示氨基酸序列的蛋白。

2.编码FAM19A5蛋白的多核苷酸在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用，其中所述疾病为抑郁症；其特征在于，所述药物包含编码FAM19A5蛋白的多核苷酸，和/或包含能够促进编码FAM19A5蛋白的多核苷酸表达的物质；所述多核苷酸是编码序列表中SEQ ID No：2或SEQ ID No：3所示氨基酸序列的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述多核苷酸的序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

4.包含权利要求2或3中所述多核苷酸的基因工程载体在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用，其中所述疾病为抑郁症。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因工程载体为含神经元特异启动子的腺相关病毒。