CN101578376A - 诊断和治疗炎性应答的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及下述发现：VEGF、PlGF和sFlt－1水平在炎性应答(例如，在败血症、严重败血症或败血症性休克)中增加。此外，本发明提供了方法，用于鉴定出针对此类炎性应答的治疗手段以及提供对此类炎性应答的治疗，这包括减少VEGF或PlGF水平或者增加sFlt－1或PlGF水平。

Description

诊断和治疗炎性应答的方法
联邦基金资助研究相关声明
本研究由National Institutes of Health的National Heart，Lung，andBlood Institute的补贴支持(编号PO1 HL076540)。美国政府因此可能享有本发明的某些专利。
发明背景
本发明涉及对炎性应答进行诊断和治疗的领域。
炎性应答与威胁生命的病症，例如败血症、严重败血症以及败血症性休克相关。败血症被定义为对感染的全身性炎性应答。严重败血症与器官机能障碍相关，其常见(在美国每年新增750,000例)且死亡率高(30％)。发病率预计每年增加1.5％，这归因于人群老化以及免疫遏制剂和侵入性程序的更广泛使用。宿主对感染的应答是复杂的，其涉及可溶介体(例如，炎性和凝血级联的组分)和细胞(例如，血小板、单核细胞和内皮细胞)的精巧排列。人们之前为了阻止炎性或凝血途径中一种或另一组分的努力对存活的影响甚小。在已测试的多种试剂和药物中，仅有两种在3期临床试验中展示出效力：针对人肿瘤坏死因子(TNF)-α的鼠单克隆抗体和人重组活化蛋白C(rhAPC)。但是，尽管有这些措施，死亡率依然保持为25～30％的高位。显然，随着对败血症病理生理学的理解加深，将有可能取得疗法上的进步。未被治疗的严重败血症导致高死亡率，在本发明之前缺少有效的治疗方法，因此人们需要针对炎性应答(例如败血症)的更好的诊断和治疗工具。
血管内皮生长因子(VEGF)/血管通透因子(VPF)是Dvorak及同事最初鉴定并表征的，其被鉴定表征为内皮通透性的有效刺激因子。VEGF随后被报道为能促进内皮细胞的增殖、迁移(migration)和存活。VEGF(也被称为VEGF-A)是下述逐渐增加的相关蛋白家族的成员，所述家族包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和得自胎盘的生长因子(PlGF)。VEGF与两种跨膜受体(即Flt-1和Flk-1)结合，而PlGF仅与Flt-1结合。在血管壁中，Flk-1在内皮中选择性表达。Flt-1则既存在于内皮细胞又存在于单核细胞中。
发明内容
在第一个方面，本发明提供了在测试受试者(例如，人)中诊断炎性应答(例如，严重败血症或败血症性休克)的方法，所述方法包括分析从测试受试者分离的样品中的sFlt-1表达或活性水平，其中，样品中sFlt-1表达或活性水平相对未受影响的受试者中发现的水平而言，增加则表明该测试受试者具有炎性应答。所述方法还可包括分析VEGF、PlGF、TNF-α、IL-6、D-二聚体、E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM-1、VCAM-1、Cox-2或PAI-1中至少一种的水平。
本发明还提供了鉴定可用于对具有炎性应答的受试者进行治疗的候选化合物的方法，所述方法包括将sFlt-1与化合物(例如，选自化学物质文库的化合物)接触；以及测量sFlt-1的活性，其中，在存在所述化合物时的sFlt-1活性相对不存在该化合物时的sFlt-1活性增加，则将该化合物鉴定为用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物。测量步骤可包括测量VEGF或PlGF中的至少一种与sFlt-1的结合。
本发明还提供了鉴定可用于对具有炎性应答的受试者进行治疗的候选化合物的方法，所述方法包括：将包括编码sFlt-1的多核苷酸的细胞(例如哺乳动物中的细胞)或细胞提取物与化合物(例如，选自化学物质文库的化合物)接触；以及测量sFlt-1在所述细胞或细胞提取物中的表达水平，其中，在存在所述化合物时的sFlt-1的表达水平相对不存在该化合物时的水平增加，则将该化合物鉴定为用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物。所述方法还可包括在接触步骤之前向哺乳动物施用脂多糖。
本发明还提供了治疗具有炎性应答(例如，严重败血症或败血症性休克)的受试者(例如，人)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物(例如，包括sFlt-1的组合物)，所述组合物增加sFlt-1的表达或活性。所述方法还可包括施用选自由杀菌剂、流体、血管加压剂、皮质类固醇、活化蛋白C、胰岛素葡萄糖、机械通气、肾替代疗法和镇静构成的组的治疗。
本发明还提供了在测试受试者(例如，人)中诊断炎性应答(例如，严重败血症或败血症性休克)的方法，所述方法包括分析从所述测试受试者分离的样品中PlGF的表达或活性水平，其中，样品中PlGF表达或活性水平相对未受影响的受试者中的水平而言有所改变(例如，增加或减少)，表明该测试受试者具有炎性应答。该方法还可包括分析VEGF、PlGF、TNF-α、IL-6、D-二聚体、E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM-1、VCAM-1、Cox-2或PAI-1中至少一种的水平。
本发明还提供了鉴定可用于对具有炎性应答的受试者进行治疗的候选化合物的方法，所述方法包括将PlGF与化合物(例如，选自化学物质文库的化合物)接触；以及测量PlGF的活性，其中，在存在所述化合物时的PlGF活性相对不存在该化合物时的PlGF活性而言有所改变(例如，增加或减少)，则将该化合物鉴定为用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物。
本发明还提供了鉴定可用于对具有炎性应答的受试者进行治疗的候选化合物的方法，所述方法包括：将包括编码PlGF的多核苷酸的细胞(例如哺乳动物中的细胞)或细胞提取物与化合物(例如，选自化学物质文库的化合物)接触；以及测量PlGF在所述细胞或细胞提取物中的表达水平，其中，在存在所述化合物时的PlGF的表达水平相对不存在该化合物时的水平而言有所改变(例如，增加或减少)，则将该化合物鉴定为用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物。所述方法还可包括在接触步骤之前向哺乳动物施用脂多糖。
本发明还提供了鉴定用于治疗具有炎性应答(例如，严重败血症或败血症性休克)的受试者(例如，人)的候选化合物的方法，所述方法包括将PlGF受体(例如，神经纤毛蛋白(neuropilin)-1或VEGFR-1或其片段)或其PlGF结合片段与化合物(例如，选自化学物质文库的化合物)接触；以及测量所述化合物与所述受体的结合，其中，化合物与PlGF受体或其片段的特异性结合表明该化合物是用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物。
本发明还提供了治疗具有炎性应答(例如，严重败血症或败血症性休克)的受试者(例如，人)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的组合物(例如，这样的组合物，其包括PlGF、编码PlGF的核酸，或其具有PlGF活性的片段，与PlGF特异性结合的抗体或其PlGF结合片段、干扰编码PlGF蛋白的mRNA的RNA)，所述组合物改变(例如，增加或减少)PlGF的表达或活性。所述方法还可包括施用选自由杀菌剂、流体、血管加压剂、皮质类固醇、活化蛋白C、胰岛素葡萄糖、机械通气、肾替代疗法和镇静构成的组的治疗。
本发明还提供了治疗具有炎性应答(例如，严重败血症或败血症性休克)的受试者(例如，人)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物改变(例如，增加或减少)PlGF受体(例如，神经纤毛蛋白-1或VEGFR-1)的表达或活性。所述方法还可包括施用选自由杀菌剂、流体、血管加压剂、皮质类固醇、活化蛋白C、胰岛素葡萄糖、机械通气、肾替代疗法和镇静构成的组的治疗。
本发明还提供了在测试受试者(例如，人)中诊断炎性应答(例如，严重败血症或败血症性休克)的方法，所述方法包括分析从测试受试者分离的样品中的VEGF表达或活性水平，其中，样品中VEGF表达或活性水平相对未受影响的受试者中发现的水平而言增加，则表明该测试受试者具有炎性应答。所述方法还可包括分析PlGF、sFlt-1、TNF-α、IL-6、D-二聚体、E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM-1、VCAM-1、Cox-2或PAI-1中至少一种的水平。
本发明还提供了鉴定可用于对具有炎性应答的受试者进行治疗的候选化合物的方法，所述方法包括将VEGF与化合物(例如，选自化学物质文库的化合物)接触；以及测量VEGF的活性，其中，在存在所述化合物时的VEGF活性相对不存在该化合物时的VEGF活性减少，则将该化合物鉴定为用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物。
本发明还提供了鉴定可用于对具有炎性应答的受试者进行治疗的候选化合物的方法，所述方法包括：将包括编码VEGF的多核苷酸的细胞(例如哺乳动物中的细胞)或细胞提取物与化合物(例如，选自化学物质文库的化合物)接触；以及测量VEGF在所述细胞或细胞提取物中的表达水平，其中，在存在所述化合物时的VEGF的表达水平相对不存在该化合物时的水平减少，则将该化合物鉴定为用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物。所述方法还可包括在接触步骤之前向哺乳动物施用脂多糖。
本发明还提供了鉴定用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物的方法，所述方法包括将VEGF受体(例如，神经纤毛蛋白-1、VEGFR-1、VEGRF-2、或其片段)或其VEGF结合片段与化合物(例如，选自化学物质文库的化合物)接触；以及测量所述化合物与所述受体的结合，其中，化合物与VEGF受体或其片段的特异性结合表明该化合物是用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物。
本发明还提供了治疗具有炎性应答(例如，严重败血症或败血症性休克)的受试者(例如，人)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的组合物(例如，包括与VEGF特异性结合的抗体或其VEGF结合片段的组合物，其能减少VEGF的表达或活性，或者包括能干扰编码VEGF的mRNA的RNA的组合物)。所述方法还可包括施用选自由杀菌剂、流体、血管加压剂、皮质类固醇、活化蛋白C、胰岛素葡萄糖、机械通气、肾替代疗法和镇静构成的组的治疗。
本发明还提供了治疗具有炎性应答(例如，严重败血症或败血症性休克)的受试者(例如，人)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的、能减少VEGF受体(例如，神经纤毛蛋白-1、VEGFR-1或VEGFR-2)表达或活性的组合物。所述方法还可包括施用选自由杀菌剂、流体、血管加压剂、皮质类固醇、活化蛋白C、胰岛素葡萄糖、机械通气、肾替代疗法和镇静构成的组的治疗。
“炎性应答”表示对受试者(例如哺乳动物，例如人)免疫系统的活化。炎性应答可涉及对细胞因子、VEGF、PlGF和sFlt-1的诱导，其可能是例如由自体免疫疾病，哺乳动物与病毒、革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌或其组分(例如脂多糖)的接触导致的。
“血管内皮生长因子(VEGF)”表示与美国专利Nos.5,332,671、5,240,848、5,194,596和Charnock-Jones等(Biol.Reproduction，48：1120-1128，1993)定义的生长因子同源、并且具有VEGF生物学活性的哺乳动物生长因子。VEGF作为糖基化同源二聚体存在，其包括至少四种不同的可变剪接异构体(alternatively spliced isoform)。天然VEGF的生物学活性包括：促进血管内皮细胞或脐静脉内皮细胞的选择性生长，以及诱导血管形成。在本文中使用时，VEGF包括任何VEGF家族成员或异构体(例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF189、VEGF165或VEGF 121)。VEGF可以是VEGF121或VEGF165异构体(Tischer et al.，J Biol Chem 266：11947-11954，1991；Neufed et al.Cancer Metastasis 15：153-158，1996)，其被描述于美国专利Nos.6,447,768；5,219,739和5,194,596中，所述文献通过引用并入本文。其还包括VEGF的突变体形式，例如KDR-选择性VEGF和Flt-选择性VEGF，如Gille等(J Biol Chem 276：3222-3230，2001)所述。虽然人VEGF是优选的，但本发明不限于人的形式，其还可包括其它动物(例如，小鼠、大鼠、狗或鸡)形式的VEGF。
“胎盘生长因子(PlGF)”表示与GenBank编号P49763所定义的蛋白同源并且具有PlGF生物学活性的哺乳动物生长因子。PlGF是属于VEGF家族的糖基化同源二聚体，其可以作为通过可变剪接机制造成的两种不同异构体被发现。PlGF由胎盘中的细胞滋养层和合胞体滋养层表达，PlGF的生物学活性包括：诱导内皮细胞(特别是滋养层细胞)的增殖、迁移和活化。
“可溶Flt-1(sFlt-1)”(也被称为VEGF-R1)表示Flt-1受体的可溶形式，其与GenBank编号U01134所定义的蛋白同源，并且具有sFlt-1生物学活性。sFlt-1多肽的生物学活性可使用任何标准方法来检测，例如，通过检测sFlt-1与VEGF的结合。sFlt-1缺少跨膜结构域以及Flt-1受体的胞质酪氨酸激酶结构域。sFlt-1可与VEGF和PlGF以高亲和度结合，但是其不能诱导增殖或血管形成，因此与Flt-1和KDR受体在功能上有所不同。sFlt-1最初是从人脐带内皮细胞纯化的，其随后显示为由滋养层细胞体内产生。在本文中使用时，sFlt-1包括任何sFlt-1家族成员或异构体。
“改变”表示用本领域已知的标准方法(例如本文所述的那些)探测到的、基因或多肽表达水平的变化(增加或减少)。在本文中使用时，增加或减少包括：表达水平至少10％的变化，例如25％的变化、40％的变化或者表达水平50％或更高的变化。“改变”还可表示本发明的任何多肽(例如sFlt-1、VEGF或PlGF)在生物学活性的变化(增加或减少)。PlGF或VEGF的生物学活性的例子包括与受体的结合(通过免疫检测、配体结合检测或Scatchard作图分析测量)以及对细胞增殖或迁移的诱导(通过BrdU标记、细胞计数实验或针对DNA合成的定量检测(例如3H-胸腺嘧啶的掺入)来测量)。sFlt-1生物学活性的例子包括与PlGF和VEGF的结合(通过免疫检测、配体结合检测或Scatchard作图分析测量)。关于每种多肽生物学活性的其它例子如本文所述。在本文中使用时，增加或减少包括生物学活性10％的变化、25％的变化、40％的变化或者生物学活性50％或更高的变化。
“化合物”表示任何小分子的化学化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。
“片段”表示多肽或核酸分子的部分。该部分含有，例如，参照核酸分子或多肽全长的至少10％、20％、30％、40％、50％或60％。片段可含有至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。
“同源”表示在比较序列的长度上与已知基因或蛋白序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更高同源性的任何基因或蛋白序列。“同源”蛋白还可具有比较蛋白的至少一种生物学活性。对于多肽而言，比较序列的长度通常将是至少16、20、25或35个氨基酸。对于核酸而言，比较序列的长度通常将是至少50、60、75或110个核苷酸。“同源性”还可指在用于产生抗体的表位与该抗体所针对的蛋白或其片段之间的基本相似性。在这种情况下，同源性指足以引发能特异性识别所讨论的蛋白的抗体产生的相似性。
“嵌合抗体”表示这样的多肽，其至少包括与另一蛋白的至少一部分(典型地，免疫球蛋白恒定结构域)相连的抗体分子的抗原结合部分。
“人化抗体”表示能与预先给定的抗原相结合的免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段。通常，抗体将既含有轻链又含有重链的至少可变区域。抗体还可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3或CH4区域。人化抗体包括框架区域(其基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列)和互补性决定区域(其基本上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列(“输入(import)”序列))。
通常，人化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。通常，人化抗体将包含至少一个、以及典型两个可变结构域(Fab、Fab’、F(ab’)2、Fabc、Fv)的基本上全部，其中，CDR区域的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的那些，而FR区域的全部或基本上全部则是人免疫球蛋白共有区域的那些。最优地，人化抗体将包含免疫球蛋白恒定区域(Fc)(典型地，人免疫球蛋白的恒定区域)的至少一部分。
“杂交”表示互补多核苷酸序列或其部分在多种严谨度条件下配对而形成双链分子。(见，例如Wahl and Berger(1987)Methods Enzymol.152：399；Kimmel，Methods Enzymol 152：507，1987)。例如，严谨的盐浓度将通常为小于大约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，例如，小于大约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，或者小于大约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。低严谨度杂交可在不存在有机溶剂(例如甲酰胺)的情况下获得，而高严谨度杂交可在存在至少大约35％或至少50％甲酰胺的情况下获得。严谨的温度条件将通常包括至少大约30℃的温度，例如，至少大约37℃，或者至少大约42℃。变化的其它参数，例如杂交时间、去垢剂(例如，十二烷基磺酸钠(SDS))的浓度以及运载体(carrier)DNA的包括或排除都是本领域技术人员公知的。严谨度的不同水平可通过按照需要将上述多种条件组合起来来实现。在一种实施方式中，杂交将在750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中于30℃发生。在另一实施方式中，杂交将在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精DNA(ssDNA)中于37℃进行。在又一实施方式中，杂交将在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中于42℃进行。这些条件的有用变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。
对大多数应用而言，杂交之后的洗涤步骤的严谨度也将变化。洗涤严谨度条件可由盐浓度和温度定义。如上所述，洗涤的严谨度可通过减少盐浓度或通过增加温度而增加。例如，针对洗涤步骤的严谨盐浓度可以小于大约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，并且可以小于大约15mMNaCl和1.5mM柠檬酸三钠。针对洗涤步骤的严谨温度条件通常将包括至少大约25℃、42℃或68℃的温度。在一种实施方式中，洗涤步骤将在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中于25℃发生。在另一实施方式中，洗涤步骤将在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中于42℃发生。在又一实施方式中，洗涤步骤将在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中于68℃发生。这些条件的其它变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员公知的，其被描述于，例如Benton and Davis(Science 196：180，1977)、Grunstein andHogness(Proc Natl Acad Sci USA 72：3961，1975)、Ausubel et al.(CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，New York，2001)、Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques，1987，Academic Press，New York)和Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York中。
“特异性结合”表示这样的化合物或抗体，它们识别本发明的多肽并与之结合，但是基本上不识别并结合天然包括本发明的多肽的样品(例如生物样品)中的其它分子。在一个实例中，特异性结合sFlt-1的抗体并不与Flt-1结合。
“受试者”表示哺乳动物，其包括但不限于人和非人哺乳动物，例如牛、马、犬、羊或猫。
“生物样品”或“样品”表示从生物体或从生物体的组分(例如细胞)获得的样品。该样品可以是任何生物组织或流体。通常，该样品将是“临床样品”，这是得自受试者的样品。此类样品包括但不限于，唾液、血、血细胞(例如白细胞)、组织或细针活检样品、尿、腹膜液、胸膜液或细胞。生物样品还可包括组织切片，例如取来用于组织学目的的冷冻切片。
“基本上相同”表示仅因为保守氨基酸取代或在不会破坏蛋白功能的氨基酸序列位置上发生的一处或多处非保守取代、缺失或插入而导致不同的氨基酸序列，保守氨基酸取代例如是一个氨基酸被同类的另一氨基酸取代(例如，缬氨酸取代甘氨酸，精氨酸取代赖氨酸等)。氨基酸序列可与另一氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同源。用于测定同一性的方法可从公众可获得的计算机程序中获得。用于测定两条序列间同一性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux et al.，Nucleic Acids Research 12：387，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403(1990)。公知的Smith Waterman算法也可用于测定同一性。公众可从NCBI和其它来源(BLAST Manual，Altschul，et al.，NCBI NLM NIH，Bethesda，MD 20894；BLAST 2.0在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)获得BLAST程序。这些软件程序通过对不同的取代、缺失和其它修饰指定同源度来对相似的序列加以匹配。典型地，保守取代包括下述组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。
“治疗”表示施用药物组合物或开出药物组合物处方，以治愈、稳定、改善或预防疾病、病症或应答(例如，炎性应答)。该术语包括主动治疗，即，特异性地针对于改善疾病、病症或应答的治疗，还包括非正式(casual)治疗，即，针对去除疾病、病症或应答的诱因的治疗。此外，该术语包括缓和性治疗，即，设计来减轻症状而非治愈的治疗；预防性治疗，即，针对于预防的治疗；以及支持性治疗，即，用来补充针对于改善疾病的另一特定疗法的治疗。术语“治疗”还包括症状性治疗，即，针对疾病、病症或应答的组成性症状的治疗。
“有效量”表示能治疗疾病或病症的至少一种症状的化合物或化合物组合的量。活性化合物或组合的治疗有效量可根据施用方式，受试者年龄、体重和总体健康而变动。
本发明的其它特征和优点将从随后的详细描述、附图和权利要求中显而易见。
附图简述
图1是VEGF家族的蛋白和相应受体的示意图。VEGF与sVEGFR-1(sFlt-1)、VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)和神经纤毛蛋白-1相互作用；PlGF和sVEGFR-1(sFlt-1)、VEGFR-1(Flt-1)和神经纤毛蛋白-1相互作用。
图2是炎性应答期间白细胞附着和囊泡移出的示意图。该过程涉及白细胞与血管内皮细胞上存在的ICAM-1和VCAM-1的附着。
图3图示了NF-κB诱导的对内皮粘附分子和趋化因子的活化。
图4a和4b是一组图表，其展现了在6小时、12小时和24小时时，对照小鼠、用LPS处理过的小鼠或盲肠结扎穿刺小鼠中循环的IL-6(血浆)、TNF-α(血清)、PlGF(血浆)和VEGF(血浆)的水平。对于两种小鼠模型而言，都观察到了VEGF和PlGF相对于对照小鼠的增加。
图4c是一组图表，其展示了6小时和24小时时小鼠肺炎模型中的PlGF和VEGF水平。图4d是一组图表，其展示了在指出的时间点人内毒素血症模型中的PlGF和VEGF水平。受试者被施用LPS或盐水(安慰剂)。图4e是一组图表，其展示了随机选择的严重败血症患者中血浆PlGF和VEGF水平对在重症监护单元(ICU)的时间的图。每条线代表一个患者个体(P)。
图5是一组图像和图表，其展示了肺感染之后对肺、肾和肝中血管渗漏的明显诱导。
图6是一组图表，其展示了肺感染之后血浆PlGF和IL-6水平的明显增加，但VEGF水平并没有。
图7是用于测定sFlt-1对针对LPS感染的应答的影响的实验流程示意图。简言之，用含有编码sFlt-1或对照基因的腺病毒载体去感染小鼠。感染四天后，小鼠受到18mg/kg LPS的腹膜内注射。感染五天后，进行生理性评估，包括心回波图和心电图(ECG)，以及对来自小鼠的样品，包括血(例如，血清和血浆)和器官(例如，心脏、肝、脾、肺、肾、脑)进行评估。进行对RNA水平、蛋白水平和组织学分析。
图8a-8c是图表，其展示出，较之对照小鼠而言，在用编码sFlt-1的基因感染的小鼠中获得了对游离VEGF和PlGF的完全阻碍。
图9a和9b是图像和图表，其展示了小鼠内毒素血症模型中sFlt-1过量表达对于血管通透性的影响。用过量表达GFP(CTRL-ad)或sFlt-1(sFlt-ad)的腺病毒去感染小鼠。三天以后，向动物IP施用盐水(对照)或LPS。二十四小时后，用0.1ml的1％Evans蓝染料对动物进行静脉内注射。40分钟后，灌注小鼠，收获脑(Br)、肺(Lu)、心脏(H)、肝(Li)、肾(Ki)和脾(Sp)，将其在甲酰胺中孵育3天以洗脱Evans蓝染料。图9a展示了器官的整体(whole mount)显微照片。在每组中，最左边的标本来自对照的未受处理小鼠，中间的标本来自经CTRL-ad处理的内毒素血症小鼠，右边的标本来自经sFlt-1-ad处理的内毒素血症小鼠(在肾的情况下，对于每种条件展示了两份标本)。图9b展示了对Evans蓝渗出(extravasation)的定量(620nm处的OD)。*；p＜0.05，**；p＜0.01，***；p＜0.0001。
图10a是图表，其展示出，较之LPS施用后用对照载体感染的对照小鼠(n＝24)而言，LPS施用后用含有sFlt-1基因的腺病毒载体感染的小鼠(n＝24)存活率升高。LPS处理后96小时，表达sFlt-1的24只小鼠中存活了22只，而表达对照基因的24只小鼠仅存活了6只。
图10b-10e是图表，其展示了在小鼠败血症模型中进行的存活率研究。图10b展示了过量表达GFP(CTRL-as)、sFlt-1(sFlt-ad)、PlGF(PlGF-ad)和VEGF(VEGF-ad)并经IP注射LPS的小鼠的存活曲线。LPS注射后24小时时循环中的VEGF、PlGF和sFlt-1分别为：VEGF：5.08+1.41ng/ml，PlGF：28.23+5.84pg/ml和20.64+5.20ng/ml。图10c展示了过量表达GFP(CRTL-as)或sFlt-1(sFltad)并经历了CLP的小鼠的存活曲线。图10d展示了通过IP注射针对Flk-1的抗体预处理过的内毒素血症小鼠的存活曲线。图10e展示了通过IP注射针对Flt-1的抗体的内毒素血症小鼠的存活曲线。
图10f和10g是图表，其展示了可溶sFlt-1肽对败血症死亡率的治疗效果。LPS注射(图10f)或CLP(图10g)后1小时，静脉内注射sFlt-1肽或等体积PBS(对照)的小鼠的存活曲线。
图10h和10i是图表，其展示了对PlGF(-/-)小鼠和用抗PlGF抗体处理的小鼠进行的存活研究。PlGF的量或PlGF活性减少与增加的死亡率相关。
图11a和11b是图表，其展示出，用LPS处理过的对照小鼠较之未用LPS处理的小鼠(对照和表达sFlt-1的)而言IL-1和D-二聚体水平增加。观察到，在未经LPS处理的小鼠以及经含编码sFlt-1的基因的腺病毒载体感染过并用LPS处理过的小鼠中，IL-6和D-二聚体的水平都相近。
图12a-12o是图像和图表，其展示了小鼠内毒素血症模型中sFlt-1过量表达对于心脏功能的影响。用含编码sFlt-1基因的腺病毒载体感染过接着用LPS处理过的小鼠具有与未用LPS处理过的小鼠相似的心脏功能，而用LPS处理过的对照小鼠则展示出改变的心脏活性。用过量表达GFP(CTRL-ad，C)或sFlt-1(sFlt-ad，S)的腺病毒注射小鼠(图12a、12h、12i、12l和12m)。三天后，对动物IP施用盐水(对照)或LPS，或者进行CLP。或者，在LPS注射或CLP手术后一小时，对小鼠IV注射PBS(C)或sFlt-1肽(S)(图12j、12k、12n和12o)。图12a-12e展示了心回波图测量的结果，图12f和12g展示了心电图。心回波图和心电图都是在注射盐水或LPS后24小时或CLP后26小时进行的。图12a展示了内毒素血症模型中来自心回波图的2D图像和代表性的M模式。图12h和12j展示了对内毒素血症模型中来自心回波图的缩短分数(fractional shortenings)的定量分析。图12l和12n展示了在内毒素血症模型中心电图上进行的心率测量。图12i和12k展示了对CLP模型中来自心回波图的缩短分数的定量分析。图12m和12o展示了在CLP模型中心电图上进行的心率测量。用ANNOVA进行统计分析。*；p＜0.05，**；p＜0.01，***；p＜0.0001。
图13a-13f是图像，其展示了在对照小鼠和用含编码sFlt-1的基因的腺病毒载体感染过的小鼠中，LPS施用对心脏中E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM-1、VCAM-1、Cox-2和PAI-1蛋白水平的影响，这是通过免疫检测测定的。较之未用LPS处理过的小鼠而言，用LPS处理过的经sFlt-ad感染的小鼠展示出的蛋白水平相似，这些蛋白的表达也相似。
图13g-13l是图像，其展示了在对照(经ctrl-ad感染过的)小鼠和用含编码sFlt-1的基因的腺病毒载体感染过的(经sFlt-ad感染的)小鼠中，LPS施用对心脏中E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM-1、VCAM-1、Cox-2和PAI-1蛋白水平的影响，这是通过Taqman PCR测定的。较之未用LPS处理过的小鼠而言，用LPS处理过的经sFlt-ad感染的小鼠展示出的这些基因的表达水平相似。
图14a-14f是图像，其展示了在对照小鼠和用含编码sFlt-1的基因的腺病毒载体感染过的小鼠中，LPS施用对脑中E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM-1、VCAM-1、Cox-2和PAI-1蛋白水平的影响，这是通过免疫检测测定的。较之未用LPS处理过的小鼠而言，用LPS处理过的经sFlt-ad感染的小鼠展示出的蛋白水平相似，这些蛋白的表达也相似。
图14g-14l是图像，其展示了在对照(经ctrl-ad感染过的)小鼠和用含编码sFlt-1的基因的腺病毒载体感染过的(经sFlt-ad感染的)小鼠中，LPS施用对脑中E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM-1、VCAM-1、Cox-2和PAI-1蛋白水平的影响，这是通过Taqman PCR测定的。较之未用LPS处理过的小鼠而言，用LPS处理过的经sFlt-ad感染的小鼠展示出的这些基因的表达水平相似。
图15a-15f是图像，其展示了在对照小鼠和用含编码sFlt-1的基因的腺病毒载体感染过的小鼠中，LPS施用对肺中E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM-1、VCAM-1和Cox-2蛋白水平的影响，这是通过免疫检测测定的。较之未用LPS处理过的小鼠而言，用LPS处理过的经sFlt-ad感染的小鼠展示出的蛋白水平相似，这些蛋白的表达也相似。
图15g-15l是图像，其展示了在对照(经ctrl-ad感染过的)小鼠和用含编码sFlt-1的基因的腺病毒载体感染过的(经sFlt-ad感染的)小鼠中，LPS施用对肺中E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM-1、VCAM-1、Cox-2和PAI-1蛋白水平的影响，这是通过Taqman PCR测定的。较之未用LPS处理过的小鼠而言，用LPS处理过的经sFlt-ad感染的小鼠展示出的这些基因的表达水平相似。
图16a-16f是图表，其展示出，较之未用sFlt-1处理过的细胞而言，在用2％小鼠血清中的LPS处理过的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中，sFlt-1降低了E-选择蛋白、ICAM-1和VCAM-1的表达。
图16g-16j是图表和表格，其展示出VEGF和PlGF对于原代人内皮细胞的细胞因子应答性的影响。这些结果是对VACAM-1(图16g和16j)、Cox-2(图16h和16j)和组织因子(图16i和16j)进行定量TaqMan分析(相对每106个拷贝的18S的mRNA拷贝数)得到的。图16j额外展示了不存在(CTRL，对照)或单独或组合存在TNF-α、VEGF、PlGF的情况下处理4小时的血清饥饿型HUVEC中的E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICMA-1和PAI-1。
图17a-17f是图表，其展示出，较之未用LPS处理的动物而言，LPS在心脏、肺、肾和脑中诱导了对PlGF的上调。用sFlt-1的处理阻止了用LPS处理时所观察到的PlGF的增加。
图18a和18b是图表，其展示出，在用18mg/kg LPS处理后24小时，较之用LPS处理的野生型小鼠中观察到的增加而言，TNF和IL-1受体敲除小鼠的PlGF和VEGF增加更小。
图19是一组图表，其展示了小鼠内毒素血症模型中的VEGF和PlGF蛋白水平。于所指出的时间点，在来自用或不用LPS注射的小鼠的组织中，针对VEGF(上图)和PlGF(底图)进行的ELISA结果被示出。*；p＜0.05，**；p＜0.01，***；p＜0.0001。
图20a-20i是图表，其展示了小鼠内毒素血症模型中sFlt-1过量表达对于循环中的细胞因子水平和D-二聚体的影响。图20a-20f展示了用过量表达GFP(CTRL-ad)或sFlt-1(sFlt-ad)的腺病毒注射的小鼠。三天之后，向动物IP施用盐水(对照)或LPS。在6、12和/或24小时时测量TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、sFlt-1和D-二聚体的血清或血浆水平。n.s.，不显著。*；p＜0.05，**；p＜0.01，***；p＜0.0001。图20g-20i展示了在具有LPS诱导的内毒素血症的三突变体小鼠(IL-1-/-、TNFR1-/-、TNFR2-/-)中VEGF和IL-6水平的循环水平。IP注射盐水(对照)或LPS之后24小时，在注射过LPS的野生型(WT)或三突变体(TM)小鼠中VEGF、PlGF和IL-6的血浆水平。*；p＜0.05，**；p＜0.01，***；p＜0.0001。
详细描述
本发明包括诊断和治疗炎性应答(例如，败血症、严重败血症或败血症性休克)的方法。本发明还包括筛选可用于治疗炎性应答的候选化合物的方法。这些方法基于下述发现：在败血症的动物和人模型中，败血症中VEGF、PlGF和sFlt-1的循环水平以时间依赖性方式升高，VEGF和PlGF增加的水平与败血症的病理学相关，并且用sFlt-1进行的治疗降低败血症、严重败血症或败血症性休克的严重性或预防败血症、严重败血症或败血症性休克。
特别地，在小鼠内毒素血症模型中，腺病毒(Ad)介导的sFlt-1过量表达削弱了VEGF和PlGF水平的增加，阻碍了内毒素血症对心脏功能、血管通透性和死亡率的影响。类似地，在盲肠结扎穿刺(CLP)模型中，Ad-sFlt-1提供了保护以免遭心脏机能障碍和死亡。当在CLP或内毒素血症发作后一小时开始的治疗方案中施用时，sFLT肽的施用导致心脏生理学和存活方面的显著改善。针对Flk-1而非Flt-1的抗体的全身性施用提供了保护以免遭败血症死亡。Ad介导的VEGF而非PlGF的过量表达使得脂多糖介导的毒性作用恶化。这些数据一起支持了VEGF在介导败血症表型中的病理生理学作用。
除了其促进内皮通透性和增殖的作用之外，VEGF可能作用于炎症和凝血。例如，在体外条件下，VEGF诱导细胞粘附分子(E-选择蛋白)、细胞间粘附分子(ICAM)-1和血管细胞粘附分子(VCAM)-1在内皮细胞中的表达，并且促进白细胞的粘附(Kim et al.，J Biol Chem276：7614-7620，2001；Reinders et al.，J Clin Invest 112：1655-1665，2003)。此外，VEGF的信号化使组织因子mRNA、蛋白和促凝血活性上调(Lucerna et al.，J Biol Chem 278：11433-11440，2003)。VEGF的这些促炎症/促凝血作用至少部分是由NF-κB、Egr-1和NF-AT转录因子的活化介导的。VEGF已被暗示为是在多种人类疾病状况中的病理生理学介体(mediator)，所述状况包括风湿性关节炎、癌症和炎性肠病(Kuenen etal.，Arterioscler Thromb Vasc Biol 22：1500-1505，2002；Harada et al.，Scand J Rheumatol 27：377-380，1998；Taha et al.，Dig Dis Sci 49：109-115，2004)。两项独立研究报道了人严重败血症/败血症性休克和升高的VEGF循环水平之间的关联(van der Flier et al.，Shock 23：35-38，2005；Pickkerset al.，Shock 24：508-512，2005)。目前的工作是首次将VEGF鉴定为在介导败血症表型中具有致病作用，由此其代表了新颖的治疗靶标。
使用多种不同的动物和人模型，我们已经发现，败血症与VEGF和PlGF的增加的循环水平相关联。在内毒素血症模型中水平最高，在CLP中中等，在肺炎中最低。重要的是，该发现在人内毒素血症和严重败血症模型中得到了验证。在所有情况下，较之TNF-α、IL-1和IL-6，对VEGF和PlGF水平的诱导都在较后时间点发生。sFlt-1阻碍了游离的VEGF和PlGF，但是对TNF-α、IL-1和IL-6的早期增加没有影响。此外，缺乏对IL-1和TNF-α应答的能力的三突变体小鼠没有展示出LPS介导的VEGF和PlGF水平的增加。这些发现一起表明，VEGF和PlGF是败血症的晚期标记，其位于早期应答细胞因子的下游。
sFlt-1的施用减弱了LPS介导的和CLP介导的发病率和死亡率。虽然sFlt-1与VEGF和PlGF都能结合，但是很多发现都指出了VEGF在介导败血症的病理生理学中的重要性。首先，人类败血症中，PlGF浓度比循环的VEGF浓度低至少10倍。第二，PlGF以比VEGF更低的亲和性与Flt-1结合。第三，VEGF(而非PlGF)使得内皮细胞对低TNF-α浓度的影响敏感。第四，VEGF(而非PlGF)的过量表达导致LPS敏感性的显著增加(100％死亡率)。最后也是最重要的，针对Flk-1(而非Flt-1)的抗体减少了败血症死亡率。
检查的所有器官都显示出增加的PlGF蛋白水平，而心脏、肝和肾是VEGF诱导的主要来源。VEGF在血清和血浆中水平相近(对照和LPS处理过的小鼠中均如此)这一发现对血小板对VEGF循环库的显著贡献提出了异议。虽然已知缺氧能诱导上述两种生长因子的表达，但是低血氧并非小鼠和人败血症模型中的普遍发现。研究显示，炎性介体，包括IL-1、IL-6和Cox可在多种细胞类型中增加VEGF的mRNA表达(Stocks et al.，FEBSLett 579：2551-2556，2005；Jung et al.，Angiogenesis 4：155-162，2001；Loeffler et al.，Int J Cancer 115：202-213，2005)。在体外条件下已显示出，VEGF和葡萄糖能在内皮细胞中诱导PlGF的mRNA和蛋白水平(Zhao etal.，Microvasc Res 68：239-246，2004)。因此，与败血症相关的细胞因子风暴(strom)可能对VEGF和PlGF水平的增加有作用。
观察到VEGF使得内皮细胞对于低TNF-α浓度敏感，这暗示，败血症中的高VEGF水平可能加强活化表型。此外，VEGF对内皮通透性的诱导可能对败血症的发病率和死亡率有作用。
我们对内毒素血症与增加的sFlt-1循环水平相关这一发现是新的。之前的研究已经揭示，sFlt-1循环水平在妊娠末期增加，并在具有先兆子痫的患者中异常升高(Maynard et al.，J Clin Invest 111：649-658，2003)。这些较后的变化与循环中游离VEGF和PlGF的降低相关。有趣的是，TNF-α已显示出诱导sFlt-1从正常胎盘绒毛外植体中释放(Ahmad et al.，CircRes 95：884-891，2004)。这可能与循环sFlt-1的败血症相关的变化一起代表着内源代偿性抗炎(endogenous compensatory antiinflammatory)机制。
概括来说，我们鉴定出了败血症和增加的VEGF、PlGF及sFlt-1的循环水平之间的关联。更重要地，结果表明了VEGF在介导败血症表型中的病理生理学作用，并且指出，VEGF、PlGF和sFlt-1可用于诊断/预断检测以及治疗性地用于治疗炎性紊乱(disorder)，例如败血症。
VEGF、其变体(例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E)和PlGF与膜受体VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)、VEGFR-3(Flt-4)相互作用，并且神经纤毛蛋白-1以及这些受体的可溶形式(例如sFlt-1，见图1)也包括在炎性应答中。NF-κ诱导的应答示于图2中，在图3中对其有更详细的描述。
下述实施例用于阐述本发明，其不应被理解为限制。
实施例1
sFlt-1、VEGF以及PlGF和炎性应答
在脂多糖(LPS)诱导的内毒素血症小鼠模型和盲肠结扎穿刺(CLP)小鼠模型中都观察到了血浆VEGF和PlGF水平的明显上调(图4a-4b)。小鼠中腹膜内施用脂多糖(LPS)导致血浆VEGF和PlGF浓度以时间依赖性方式增加，在24小时出现峰水平(分别为477pg/ml和4311pg/ml)(图4a)。相反，Il-6和TNF-α的循环水平在最早的测量时间点(6小时)最大。在败血症的CLP模型中，VEGF(137.26pg/ml)和PlGF(71.25pg/ml)的峰水平分别出现于24小时和12小时(图4b)。在大肠杆菌型肺炎的小鼠模型中，血浆VEGF水平并没有显著改变，而PlGF水平则在6小时处增加(23.01pg/ml)(图4c)。
人的数据
在人受试者中，LPS的全身性施用导致VEGF和PlGF的循环水平升高(图4d)，峰水平(分别为70pg/ml和23.5pg/ml)出现于4小时处，这与TNF--α和IL-6相反(其峰水平分别出现于1.5和2.5小时，数据未示出)。在10名严重败血症患者和10名健康志愿者中测量了VEGF和PlGF的血浆水平。在研究启动时，患者中的VEGF水平(均值和SD＝46.49±46.17pg/ml)显著高于健康志愿者(均值和SD＝3.83±3.16pg/ml)(P＝0.009)。类似地，研究启动时，患者中的PlGF水平(均值和SD＝13.52±14.55pg/ml)也显著高于健康志愿者(均值和SD＝0.18±0.58pg/ml)(P＝0.009)。在大多数情况下(8/10)，VEGF和PlGF水平在其ICU停留期间(在一些情况中多达29天)保持升高。最大VEGF和PlGF水平分别为367pg/ml和96pg/ml(图4e)。
VEGF水平与严重性相关
VEGF与内毒素血症的严重性显著相关。Miles检测显示了肺感染后肺、肝和肾组织中显著的血管渗漏(较之未感染的小鼠而言)(图5)。较之未感染的小鼠而言，PlGF和IL-6都被肺感染增加(图6)，这表明了PlGF和炎性应答之间的联系。在内毒素血症模型中进行的生理学测量揭示了降低的心脏输出、血压和体温(较之年龄相称的对照小鼠而言)。这些结果表明，对受试者中VEGF和PlGF的探测可用于诊断败血症，并且，败血症的严重性与在受试者中探测到的VEGF或PlGF的量相关。
经sFlt处理的小鼠
通过可溶Flt-1(sFlt-1)蛋白对循环VEGF的全身性阻碍预防了LPS诱导的内毒素血症症状，这是用下述流程来展示的(图7)。sFlt-1是细胞表面受体Flt-1的天然剪接变异体，Flt-1与游离VEGF-A、VEGF-B和PlGF结合，由此阻碍它们与细胞表面受体的相互作用(Kendall et al.，Biochem Biophys Res Commun 226：324-328，1996)。以前的研究已显示，注射后，Ad-sFlt-1在体内转导肝细胞，导致sFlt-1的高循环水平保持多达2周(Kuo et al.，Proc Natl Acad Sci USA 98：4605-4610，2001；Maynard etal.，J Clin Invest 111：649-658，2003)。
用含编码sFlt-1(sFlt-ad)的基因或对照基因(ctrl-ad)的腺病毒载体感染小鼠。四天后，对小鼠施用腹膜内注射的18mg/kg LPS。一天后(感染腺病毒载体5天后，见图7)，使用电回波图和ECG来评估小鼠，收获来自小鼠的样品，包括血(例如血清和血浆)和器官(例如，脑、心脏、肝、肺、脾、肾)，并进行分离。如图8a-8f所示，较之经Ad-GFP处理的动物而言，经Ad-sFlt-1处理的小鼠展示出升高的血清sFlt-1水平。重要的是，Ad-sFlt-1显著地抑制了LPS介导的对游离VEGF和PlGF的诱导，而对照Ad则没有此类作用。在对照动物中，LPS增加了内源sFlt-1的循环水平(从159.62pg/ml到1585.40pg/ml)，并且进一步增加了经Ad-sFlt-1处理的动物中的总sFLT-1。概括来说，较之经ctrl-ad感染的小鼠而言，施用LPS后，用sFlt-ad进行的感染导致了对游离VEGF和PlGF的几乎完全的阻碍。
较之ctrl-ad感染的小鼠而言，经sFlt-ad感染的小鼠还被保护免遭LPS施用诱导的肺、肝和肾中的血管渗漏(图9a和9b)。LPS施用导致肺、肝和肾中(而不在脑、心脏和脾中)的器官特异性的屏障功能丢失以及增加的Evans蓝染料渗出(图9a和9b)。sFlt-1的过量表达完全阻碍了肝和肺中LPS诱导的血管渗漏，但是仅部分抑制了LPS对于肾通透性的作用。
较之经ctrl-ad感染的小鼠而言，在LPS处理时，经sFlt-ad感染的小鼠显示出充分降低的死亡率(图10a)。24只sFlt-ad小鼠中22只在LPS处理后96小时保持存活，而24只ctrl-ad感染的小鼠中仅有6只存活。较之ctrl-ad感染的小鼠而言，sFlt-ad感染的小鼠还显示出D-二聚体的充分减少(图11a)，这测量了形成凝血块的趋势，以及显示出IL-6的充分减少(图11b)，其血清水平在炎性应答中增加。
此外，在过量表达GFP(对照)、VEGF、PlGF或sFlt的经LPS处理(20mg/kg)的小鼠中进行了存活研究(图10b)。在对照组中，13/24(54.2％)的小鼠死于内毒素血症。如上文所述，sFlt-1导致死亡率显著降低(24只动物中2只死亡)。VEGF的过量表达(平均血浆水平为5.08ng/ml)导致LPS敏感性显著增加(100％死亡率)，而PlGF的过量表达(平均血浆水平为28.23ng/ml)则没有此种作用。sFlt-1还改善了败血症CLP模型中的存活(图10c)。过量表达sFlt-1的15只小鼠中总共4只(27％)死于CLP诱导的败血症，而在表达GFP的对照组中为16只中的12(75％)(p＝0.0063)(图10c)。为验证VEGF的主要作用，用针对Flt-1或Flk-1的中和抗体对动物进行预处理。在这些实验中，抗Flk-1抗体(而非抗Flt-1抗体)降低了小鼠内毒素血症模型的死亡率(分别为图10d和10e)。这些发现一起表明VEGF-A是败血症表型的关键决定子。
为确定败血症发作后VEGF抑制是否导致改善的后果，从LPS施用或CLP手术后1小时开始，每3小时(x4剂量)用1μg人重组可溶Flt-1肽或等体积PBS(对照)对小鼠进行静脉内注射。如下文所述，可溶Flt-1肽完全阻碍了LPS或CLP对缩短分数(如图12j和12k所示)和心率(图12n和12o)的影响。在存活研究中，重组sFlt-1改善了败血症CLP模型和内毒素血症模型中的存活。LPS中的死亡率从80％降低至20％(p＝0.0091)(图10f)，而CLP介导的死亡率则从75％减少至16.7％(p＝0.0061)(图10g)。这些结果表明，阻碍VEGF功能(例如使用sFlt-1)可用于治疗炎性紊乱，例如败血症、严重败血症或败血症性休克。
对VEGF的全身性阻碍(通过sFlt-ad的感染)预防了小鼠中LPS诱导的发病，这是通过心脏输出、血压和体温测量到的(见图12a-12g)。小鼠中LPS的全身性施用或CLP导致心脏功能被明显压制(图12a-12o)，这是由心回波图上降低的心率(图12l-o)和缩短分数(图12h-k)所证实的，并且，LPS的全身性施用或CLP与心电图上PR间隔延长相关(图12f)。这些影响被Ad介导的sFlt-1的过量表达完全阻碍(图12h和12l)，但GFP(对照)或PBS(对照)注射却不能。在CLP模型中展现出了相似的结果(图12i和12m)。
小鼠中的内毒素血症与增加的炎性和促凝血分子mRNA表达相关(图13g-13l、14g-14l和15g-15l)。作为阴性对照，VE-钙粘着蛋白mRNA水平在所检查的任何组织中都没有增加(数据未示出)。在免疫荧光研究中，这些炎性介体中的大多数主要位于内皮中。在用LPS处理过的小鼠中，sFlt-ad在小鼠中的感染还将炎性标记(例如，E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM-1、VCAM-1、Cox-2和PAI-1)的表达(Taqman PCR测量的)和蛋白水平(免疫荧光测量的)减少至与在未经LPS处理过的对照(未受感染的和ctrl-ad感染的)小鼠中观察到相近的水平。这些降低被全身性地观察到，包括心脏(图13a-13l)、脑(图14a-14l)和肺(图15a-15l)。在心脏中，E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM-1、VCAM-2、Cox-2在小的微静脉中被诱导。ICAM-1和VCAM-1还在毛细血管内皮中增加。PAI-1仅在毛细血管中被诱导。在脑中，上述所有介体都在微静脉(而非毛细血管)内皮中被诱导。在肺中，E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM-1、VCAM-2和Cox-2在微静脉内皮中增加。ICAM-1和PAI-1在肺薄壁组织中增加。这些免疫组织化学分析展示出，内毒素血症期间这些活化标记的内皮表达被sFlt-1的施用阻止。
在细胞培养模型中观察到了类似的结果。用LPS处理过的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)展示出E-选择蛋白、ICAM-1和VCAM-1较之对照细胞的增加。这些增加被用sFlt-1转染HUVEC所逆转(图16a-16f)。为获得对VEGF介导败血症发病和死亡的机制的进一步了解，将HUVEC与TNF-α、VEGF和PlGF(单独或组合)孵育4小时。VEGF(而非PlGF)诱导了多种基因的表达，包括VCAM-1(9.3倍)和组织因子(16.4倍)(见图16h-16j)。用0.1ng/ml TNF-α单独处理的内皮细胞展示出VCAM-1mRNA水平29.4倍的增加，TF mRNA水平2.13倍的增加，但Cox-2mRNA水平无变化。相反，0.1ng/ml TNF-α加100ng/ml VEGF导致VCAM-1、Cox-2和组织因子的表达较之VEGF单独使用时的影响而言显著增加。VEGF因此可使得内皮细胞对低浓度的TNF-α敏感。
PlGF在LPS处理后被上调
LPS处理后，还在心脏、肺、肾和脑中观察到了对PlGF的上调，该增加通过sFlt-1处理变正常(图17a-17f)。用LPS处理过的TNF和IL-1受体敲除小鼠也具有与未用LPS处理的小鼠(野生型和TNF-IL-1受体敲除小鼠)相似的VEGF和PlGF水平，而LPS处理的野生型小鼠则展示出VEGF和PlGF的增加(图18a和18b)。
PlGF活性的丧失导致LPS处理过的小鼠的死亡率增加
还针对存活评估了抗PlGF抗体和PlGF遗传缺陷对败血症死亡率的影响。研究在经17mg/kg LPS处理过的野生型小鼠和PlGF空小鼠以及经20mg/kg LPS处理过的具对照IgG或抗PlGF抗体的小鼠中进行。在野生型小鼠中，7/16(43.7％)的小鼠死于内毒素血症(图10h)。PIGF缺陷导致死亡率显著增加(14/17的动物死亡；p＝0.0179)。类似地，抗PlGF抗体处理导致死亡率较之对照IgG处理组明显增加(100％死亡率；p＝0.0301)，对照组中12/18(66.7％)的小鼠死于LPS诱导的内毒素血症(图10i)。
增加的VEGF和PlGF的来源
为测定升高的生长因子浓度的来源，使用ELISA在多种组织中对VEGF和PlGF水平进行了检测。LPS在小鼠中的全身性施用导致在6小时时肝(3.8倍)、肾(1.9倍)和心脏(3.7倍)中VEGF蛋白水平增加，但在脑、肺和脾中水平减少(图19)。PlGF蛋白在被检查的所有组织中都增加，包括脑(4.8倍)、肺(7.1倍)、心脏(71.8倍)、肝(35.2倍)、肾(28.5倍)和脾(28.4倍)(图19)。LPS处理过的小鼠或对照小鼠中，血清中的VEGF蛋白较之血浆中的没有差异，这对内毒素血症中血小板对血浆VEGF水平的显著作用提出了质疑(数据未示出)。基于这些发现，败血症与VEGF和PlGF增加的表达和循环水平清晰地联系起来。
sFlt-1对细胞因子诱导的影响
外源sFlt-1对于内毒素血症期间诱导的血浆细胞因子的最初6小时峰没有影响(图20a-20i)。但是，较之获得对照腺病毒的动物而言，在获得Ad-sFlt-1的动物中细胞因子水平更为迅速地下降。在12小时和/或24小时处，Ad-sFlt-1显著地削弱了LPS介导的对TNF-α、IL-1β和IL-6以及D-二聚体的诱导(图20a-20f)。在对IL-1RI和两种TNF-α受体TNFR1和TNFR2是无效的的三突变体小鼠中施用LPS导致在24小时时对VEGF和PlGF的诱导较之野生型对照显著更低(图20g-20i)。这些发现一起表明，VEGF和PlGF位于通常牵连的败血症诱导的细胞因子的下游。
这些结果表明，sFlt-1、VEGF和PlGF是对具有炎性应答(例如，败血症、严重败血症和败血症性休克)的受试者进行治疗的新颖的诊断、筛选和治疗靶标。
实施例2
诊断炎性应答
本发明提供了可用于诊断炎性应答(例如，败血症、严重败血症和败血症性休克)的检测方法，其基于下述发现：VEGF、PlGF和sFlt-1的血清水平在炎性应答中增加。因此，对炎性应答的诊断可通过测量取自受试者的样品中的VEGF、PlGF和sFlt-1表达或活性水平来进行。然后可将该表达或活性水平与对照样品，例如取自对照受试者的样品相比，相对对照而言VEGF、PlGF或sFlt-1的增加被看作对炎性应答或具有发展成为炎性应答的倾向的风险的诊断。
对VEGF、PlGF或sFlt-1多肽水平或这些多肽活性的分析可用作筛选受试者样品(例如包含血或尿的样品)的基础。筛选多肽水平的方法可包括本领域中标准的免疫学技术(例如，Western印迹或ELISA)，其中使用与VEGF、PlGF或sFlt-1特异性结合的抗体，或者可使用色谱技术或其它蛋白纯化技术来进行筛选方法。在另一实施方式中，可测量VEGF、PlGF或sFlt-1的活性，其中，活性相对取自对照受试者的增加是对炎性应答的诊断。可测量VEGF活性，例如，如U.S.P.N.6,787,323所述。
对VEGF、PlGF或sFlt-1多核苷酸水平的分析还可用作筛选受试者样品的基础。在一种实施方式中，分析取自受试者的样品的mRNA水平，mRNA水平较之对照样品(例如，取自对照受试者的样品)的增加是对炎性应答或发展为炎性应答的倾向的指示。用于筛选mRNA水平的方法包括本领域中任何标准方法，例如，Northern印迹。还可使用PCR技术，例如定量逆转录酶(RT)-PCR(本领域的一种标准方法)来分析mRNA水平。
对VEGF、PlGF或sFlt-1多核苷酸的分析还可在相应的基因组序列上进行，以鉴定出在sFlt-1、PlGF或VEGF多核苷酸上具有遗传变化、突变或多态性的个体，这是对发展出炎性病症的易患病体质的指示。此类多态性是本领域已知的，其被Parry等(Eur.J Immunogenet.26：321-3，1999)描述过。此类遗传改变可存在于sFlt-1基因的启动子序列、开放读码框、内含子序列或3′非翻译区域中。与遗传改变相关的信息可用于将受试者诊断为具有炎性应答或者具有发展出此类病症的倾向。如本文所述，sFlt-1、VEGF和/或PlGF生物学活性水平的特定改变可与发展出炎症的可能性或这样的易患病体质相关。由此，本领域技术人员在探测到特定的突变时，进而能检测该蛋白的生物学活性，以确定该突变是否导致或增加了发展出炎性应答的可能性。
在上述方法中对多核苷酸的分析可通过对sFlt-1、VEGF或PlGF核酸分子的序列的直接分析来进行。例如，直接分析可用于诊断人是否具有发展出炎性应答的倾向。
本文所述的诊断方法可单独使用，或者与本文描述的任何其它诊断方法组合使用，以获得对炎性应答(例如，败血症、严重败血症和败血症性休克)的存在、严重性或估计的发作时间的更为精确的诊断。此外，本文所述的诊断方法可与确定可用于精确诊断炎性应答的存在、严重性或估计的发作时间的任何其它诊断方法(例如，测量IL-6或TNF-α活性，或D-二聚体检测)组合使用。
诊断试剂盒
本发明还提供了诊断测试试剂盒。例如，诊断测试试剂盒可包括针对VEGF、PlGF或sFlt-1的抗体以及用于探测和用于评估抗体和VEGF、PlGF或sFlt-1多肽之间结合的装置。就探测而言，对抗体或VEGF、PlGF或sFlt-1多肽进行标记，并将抗体或VEGF、PlGF或sFlt-1多肽与底物结合，使得可建立起VEGF、PlGF或sFlt-1多肽-抗体相互作用，这通过在抗体和VEGF、PlGF或sFlt-1多肽结合后测定与底物附着的标记的量来实现。传统的ELISA是本领域中已知用来探测抗体-底物相互作用的常用方法，其可与本发明的试剂盒一起提供。实质上，可在任何体液(包括但不限于，尿、血清、血浆、唾液、羊水或脑脊髓液)中对VEGF、PlGF或sFlt-1多肽进行探测。测定VEGF、PlGF或sFlt-1多肽水平相对参照水平(例如，正常对照中存在的水平)的改变的试剂盒可作为诊断试剂盒用于本发明的方法中。
实施例3
用于鉴定候选化合物的筛选方法
本发明还提供了鉴定与VEGF、PlGF或sFlt-1结合或调节VEGF、PlGF或sFlt-1表达或活性的化合物的方法，所述化合物可用于治疗炎性应答，例如，败血症、严重败血症或败血症性休克。有用的化合物减少VEGF的表达或活性，增加或减少PlGF的表达或活性，或者增加sFlt-1的表达或活性。
筛选检测
用于鉴定出减少VEGF表达或活性，增加或减少PlGF表达或活性，或增加sFlt-1表达或活性的筛选检测通过标准方法来进行。筛选方法可涉及高通量技术。此外，这些筛选技术可在培养的细胞中或非人生物体中进行。在这些生物体中进行的筛选可包括使用与人VEGF、PlGF或sFlt-1同源的多核苷酸。例如，在小鼠中进行的筛选可能包括：测量候选化合物对于小鼠Vegfa或Pgf基因表达或活性的影响。
多种方法可用于进行此类筛选检测。根据一种手段，将候选化合物以不同浓度加入到细胞培养基中，所述细胞表达编码VEGF、PlGF或sFlt-1的多核苷酸。然后测量基因表达，例如，通过使用从多核苷酸分子制备的任何合适的片段作为杂交探针，采用标准Northern印迹分析来进行(Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterscience，New York，1997)。将存在候选化合物时基因表达的水平与在缺乏候选化合物的对照培养基中测量到的水平相比较。能促进sFlt-1表达增加或VEGF或PlGF表达减少的化合物被认为可用于本发明，此类分子可用来，例如，作为对炎性应答(例如，败血症、严重败血症或败血症性休克)的治疗剂。
如果需要的话，可选地，可使用同样的普通手段和标准免疫学技术，例如ELISA、Western印迹或免疫沉淀，采用特异于VEGF、PlGF或sFlt-1的抗体，在多肽产生的水平上来测量候选化合物的影响。例如，可使用免疫检测来探测或监测VEGF、PlGF或sFlt-1的表达。能与此类多肽结合的多克隆抗体或单克隆抗体可用于任何标准免疫检测形式(例如，ELISA、Western印迹或RIA检测)中，以测量VEGF、PlGF或sFlt-1的水平。能促进sFlt-1表达增加、PlGF表达增加或减少或VEGF表达减少的化合物被认为是特别有用的。同样，此类分子可用来，例如，作为对炎性应答(例如，败血症、严重败血症或败血症性休克)的治疗剂。
或者或此外，可筛选出与sFlt-1或PIGF特异性结合并活化sFlt-1或PIGF，或抑制VEGF或PlGF的候选化合物。此类候选化合物的效力取决于其与多肽相互作用的能力。可使用多种标准结合技术和功能性检测(例如，上文引用的Ausubel et al.所述的那些)容易地检测此类相互作用。例如，可针对与VEGF、PlGF或sFlt-1的相互作用以及结合来对候选化合物进行体外测试，可通过任何标准检测(例如，本文所述的那些)来检测其调节其活性的能力。
在一种具体实施方式中，可使用基于色谱的技术来鉴定与VEGF、PlGF或sFlt-1结合的候选化合物。例如，可通过标准技术，从经工程改造以表达VEGF、PlGF或sFlt-1的细胞纯化出重组VEGF、PlGF或sFlt-1，并且可将重组VEGF、PlGF或sFlt-1固定到柱上。然后使候选化合物的溶液流经该柱，鉴定出特异于VEGF、PlGF或sFlt-1的化合物，这是基于其与多肽结合并被固定到柱上的能力来鉴定的。为分离出该化合物，洗柱，以移除非特异性结合的分子，然后从柱上释放出感兴趣的化合物并对其进行收集。如果需要的话，通过该方法(或任何其它合适方法)分离出的化合物可被进一步纯化(例如，通过高效液相色谱)。通过该手段分离出的化合物还可用来，例如作为治疗炎性应答(例如，败血症、严重败血症或败血症性休克)的治疗剂。被鉴定为以小于或等于10mM的亲和常数与VEGF、PlGF或sFlt-1结合的化合物被认为在本发明中特别有用。
潜在的激动药和拮抗药包括：与VEGF、PlGF或sFlt-1结合的有机分子、肽、肽模拟物、多肽，和抗体或编码VEGF、PlGF或sFlt-1的多核苷酸，它们能由此增加或减少其活性。潜在的拮抗药包括与VEGF或PlGF结合的小分子，它们阻止这些蛋白结合其受体。其它潜在的拮抗药包括反义分子。或者，小分子可作为激动药发挥作用，与sFlt-1结合使得其活性增加。
编码VEGF、PlGF或sFlt-1的多核苷酸序列也可用于发现和开发化合物，以治疗炎性应答(例如，败血症、严重败血症或败血症性休克)。VEGF、PlGF或sFlt-1在表达时可用作筛选药物的靶标。此外，编码被编码多肽的氨基末端区域或Shine-Delgarno序列或各mRNA的其它翻译辅助序列的多核苷酸序列可用于构建反义序列，以控制感兴趣的编码序列的表达。例如，编码VEGF或PlGF的片段的多核苷酸可被表达，使得发生RNA干扰，由此降低VEGF或PlGF的表达或活性。
本发明的拮抗药和激动药可用于，例如，治疗多种炎性应答，例如，败血症、严重败血症或败血症性休克。
可选地，在标准组织培养方法或动物模型中，可对任何上述检测中鉴定出的化合物验证其是否能延迟或减轻炎性应答，如果成功的话，这些化合物可用作治疗炎性应答的治疗剂。
小分子提供了有用的候选治疗剂。此类分子可具有小于2,000道尔顿、300至1,000道尔顿之间或400至700道尔顿之间的分子量。这些小分子可以是有机分子。
测试化合物和提取物
一般而言，根据本领域已知的方法，从天然产物或合成(或半合成)提取物的大文库或化学物质文库，来鉴定能治疗炎性应答(例如，败血症、严重败血症或败血症性休克)的化合物。药物发现和开发领域的技术人员将理解，测试提取物或化合物的精确来源对于本发明的筛选流程来说并不重要。因此，可使用本文描述的方法，对实质上大量的化学提取物或化合物进行筛选。此类提取物或化合物的例子包括但不限于，基于植物、真菌、原核生物或动物的提取物，发酵培养液和合成化合物，以及对已有化合物的修饰。还可获得多种方法，用于产生对大量化学化合物的随机或定点合成(例如，半合成或全合成)，所述化合物包括但不限于基于糖、脂、肽和多核苷酸的化合物。合成化合物文库是商业可获得的。或者，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式存在的天然化合物的文库也是可商业获得的。此外，如果需要的话，可通过本领域已知的方法，例如通过标准提取和分级分离方法来生产天然及合成产生的文库。此外，如果需要的话，可容易地使用标准的化学、物理或生化方法来修饰任何文库或化合物。
此外，药物发现和开发领域的技术人员容易理解，有可能的情况下，应当使用用于反筛选(dereplication)(例如，分类学反筛选、生物学反筛选以及化学反筛选或其任意组合)或将已知具有治疗炎性应答活性的物质的复制或重复清除的方法。
当发现粗制提取物具有增加sFlt-1或PlGF表达或活性或减少VEGF或PlGF表达或活性的活性或结合活性时，必须对确定的主要(positivelead)提取物进行进一步分级分离，以分离出造成该观察到的效果的化学组分。因此，提取、分级分离和纯化工艺的目的是对粗制提取物内具有可能可用于治疗炎性应答(例如，败血症、严重败血症或败血症性休克)的活性的化学成分(entity)进行表征和鉴定。对此类异源提取物进行分级分离和纯化的方法是本领域已知的。如果需要的话，按照本领域已知的方法，对显示为是治疗炎性应答(例如，败血症、严重败血症或败血症性休克)的有用试剂的化合物进行化学修饰。
实施例4
治疗炎性应答
本发明还提供了治疗具有炎性应答(例如，败血症、严重败血症或败血症性休克)的受试者的方法。治疗方法包括：在具有炎性应答(例如，败血症、严重败血症或败血症性休克)的受试者中施用增加sFlt-1或PlGF的活性或量、或降低VEGF或PlGF的活性或量的化合物。
sFlt-1和PlGF
对具有炎性应答(例如，败血症、严重败血症或败血症性休克)的受试者的治疗可通过施用sFlt-1或PlGF来实现。施用可以是本文所述的任何途径；但是，优选非肠道施用，更优选静脉内施用。施用可以是使得sFlt-1的浓度较之Flt基线(即，未经处理的)水平增加2～50倍，例如5～10倍的量。类似地，PlGF的施用可使PlGF的水平较之基线(即，未经处理的)水平增加1.1～200倍，例如10～100倍。此外，施用的sFlt-1或PlGF多肽可包括修饰，例如翻译后修饰(例如糖基化、磷酸化)或其它化学修饰，例如，设计来改变sFlt-1或PlGF在受试者中的分布的修饰，或设计来改变sFlt-1或PlGF降解和/或分泌速率的修饰。
抗VEGF和抗PlGF抗体
对具有炎性应答的受试者的治疗还可通过施用与VEGF或PlGF蛋白特异性结合的抗VEGF或抗PlGF抗体(例如，单克隆抗体)来实现。抗VEGF抗体，例如U.S.P.N.6,884,879中所述的，可用于本发明的治疗方法。其它有用的抗VEGF抗体包括贝伐单抗(bevacizumab)(Avastin，Genentech，South San Francisco，Calif.)。VEGF和PlGF抗体还可从R&DSystems，Minneapolis，Minn获得。其它VEGF抗体包括HuMV833、2C3(Peregrine Pharmaceuticals，Tustin，Calif.)和VEGF-trap(RegeneronPharmaceuticals，Inc.，Tarrytown，N.Y.)。
此外，可通过任何标准方法来制造抗体，并针对它们直接或间接阻碍VEGF或PlGF活性的能力加以测试。可以通过任何方式对这些抗体加以修饰，使得它们更适于人类施用。例如，它们可以是单链抗体或人化抗体。同样，可通过任何途径、配方、频率或者以能获得足以治疗炎性应答的体内浓度的任何剂量施用这些抗体。
VEGF受体和PlGF受体的抑制性化合物
治疗炎性应答(例如，败血症、严重败血症或败血症性休克)的另一手段可以是用与VEGF或PlGF的受体特异性结合的抑制性化合物(例如，抗体)来治疗受试者。VEGF受体包括VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)、VEGFR-3和神经纤毛蛋白-1；PlGF受体包括VEGFR-1(Flt-1)和神经纤毛蛋白-1。此类抗体是本领域已知的(例如，与Flk-1和Flt-1特异性结合的抗体(R&D Systems)；2C7，人化抗VEGFR-2单克隆抗体)，或可用本领域的标准方法来产生，针对与VEGF或PlGF受体(例如，本文所述的那些)直接或间接结合的能力来对所述抗体加以测试。可以通过任何方式对这些抗体加以修饰，使得它们更适于人类施用。例如，它们可以是单链抗体或人化抗体。同样，可通过任何途径、配方、频率或者以能获得足以治疗炎性应答的体内浓度的任何剂量施用这些抗体。如上文所述，也可以通过本领域标准方法来产生用于治疗的抗体。
其它抑制性化合物包括SU5416(司马沙尼(semaxanib))、SU6668、SU011248、PTK-787/ZK222584、ZD6474、CD-547632、AG-013736和CEP-7055(Bergsland，E.K.Am J Health-Syst Pharm 61(Suppl 5)，S4-S11；Bergsland，E.K.，Am J Health-Syst Pharm 61(Suppl 5)，S12-S20)。
VEGF抑制性化合物
抑制VEGF或VEGF活性的任何化合物也可用于本发明的治疗方法。抑制VEGF的吡啶衍生物和类似物被描述于，例如U.S.P.N.6,706,731中。以高亲和性与VEGF结合的寡核苷酸被描述于，例如U.S.P.N.6,696,252中。作为VEGF受体抑制剂发挥作用的2-氨基-烟酰胺衍生物被描述于，例如U.S.P.N.6,624,174和6,878,714中。抑制VEGF活性的肽被描述于美国专利Nos.6,559,126、5,861,484、6,383,486、6,100,071、6,270,993、6,777,534中。
基因疗法/治疗性核酸
sFlt-1或PlGF表达或活性的增加或VEGF或PlGF表达或活性的减少也可通过向受试者引入基因载体来实现。近来的工作表明，将能表达内皮细胞促分裂原(mitogen)(例如VEGF)的核酸(DNA或RNA)递送至血管损伤的位点，将诱导损伤的血管增殖和重新内皮化。虽然本发明不涉及血管损伤，而是寻求降低VEGF水平，但这些研究中使用的递送编码内皮细胞促分裂原(例如sFlt-1和PlGF)的核酸的技术也可用于本发明。这些技术被描述于美国专利Nos.5,830,879和6,258,787中，上述专利通过引用并入本文。
在本发明中，核酸可以是任何核酸(DNA或RNA)，其包括编码sFlt-1、VEGF或PlGF或任何sFlt-1、VEGF或PlGF家族成员的基因组DNA、cDNA和mRNA。核酸还可包括编码显示出能与VEGF或PlGF受体结合的蛋白的任何核酸。可使用本领域中的常规流程，例如重组DNA、PCR扩增来获得编码想要的蛋白的核酸。
为治疗炎性应答(例如，败血症、严重败血症或败血症性休克)，可增加sFlt-1或PlGF表达，例如通过向受试者施用含有编码sFlt-1或PlGF的多核苷酸序列的载体来实现，所述序列与能驱动其在靶标细胞中表达的启动子可操作地相连。在另一手段中，可向具有炎性应答的受试者施用编码能增加sFlt-1或PlGF基因转录的蛋白的多核苷酸序列。任何标准的基因疗法载体和方法可用于此类施用。
或者，为减少VEGF或PlGF的表达，以治疗炎性应答(例如，败血症、严重败血症或败血症性休克)，可使用RNA干扰(RNAi)。可向具有炎性应答的受试者施用含有VEGF或PlGF mRNA转录本的靶标序列的载体，所述靶标序列例如，通过短(例如9个碱基对)序列连起来的短(例如19个碱基对)正义靶标序列和相应的反义靶标序列，其能形成茎环结构。在一种实施方式中，核酶angiozyme被施用给具有炎性应答的患者。当该载体在细胞中表达时，从该茎环结构产生小的抑制性RNA(siRNA)分子，它们与VEGF或PlGF mRNA转录本结合，这导致靶标mRNA转录本较之非靶标转录本来说降解增加。反义核碱基寡聚体下调VEGF表达的用途被描述于U.S.P.N.6,410,322中，其通过引用并入本文。为测试不同序列在哺乳动物细胞培养体系中的效力，可以使用，例如，pSuper RNAi系统(OligoEngine，Seattle，Wash.)。
组合疗法
组合疗法的实行可通过1)将两种或多种本文所述的治疗方法组合起来(例如，用化合物和核酸来治疗，其中，该化合物抑制VEGF，该核酸增加sFlt-1的表达)或2)将本文所述的治疗方法和之前已有的针对炎性应答的治疗一起使用，这也是本发明提供的。之前已有的治疗方法包括施用杀菌剂(例如，广谱抗生素，例如青霉素、氨苄青霉素、杆菌肽、碳青霉烯、头孢菌素、甲苯氧青霉素、新青霉素II(oxacillin)、万古霉素)、流体、血管加压剂、皮质类固醇、活化蛋白C(Xigris，Eli Lilyand Co.)、胰岛素和葡萄糖的施用、机械通气、透析和镇静。
药物组合物的配制
对本文所述的(例如，VEGF抗体和sFlt-1)或使用本发明的方法鉴定出的任何化合物的施用可通过导致产生能治疗炎性应答的化合物浓度的任何合适途径来进行。化合物可以以任何合适量被包含于任何合适的运载体物质中，其通常以1～95％的量存在(按组合物总重计)。组合物可以以适合口服、非肠道(例如静脉内或肌内)、直肠、经皮、经鼻、阴道、吸入、皮肤(贴片(patch))、经目和颅内施用途径的剂量形式提供。因此，组合物可以是，例如，片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒、悬浮液、乳液、溶液、凝胶(包括水凝胶)、糊剂、膏剂、霜剂、膏药、饮剂、渗透性递送装置、栓剂、灌肠剂、注射剂、植入体、喷雾或气雾剂的形式。可按照传统药学实践来配制药物组合物(见，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th edition，2000，ed.A.R.Gennaro，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia和Encyclopedia ofPharmaceutical Technology，eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan，1988-1999，Marcel Dekker，New York)。
药物组合物可被配制为在施用之后立即，或在施用之后的任何预定时间或时间段释放出活性化合物。组合物的后面几种形式通常被称为受控释放配方，其包括(i)在体内于长时间段产生浓度基本上恒定的本发明试剂的配方；(ii)在预定的滞后时间后，在体内于长时间段产生浓度基本上恒定的本发明试剂的配方；(iii)在给定时间段期间，通过在体内保持相对恒定、有效的试剂水平，同时最小化与试剂血浆水平波动(锯齿动力学模式)相关的不想要的副作用，来维持试剂作用的配方；(iv)对试剂作用加以局限，例如，使受控释放的组合物空间上邻近疾病组织或器官或处于疾病组织或器官中的配方；(v)实现方便给剂量的配方，例如，每周施用一次组合物或每两周一次；以及(vi)通过使用运载体或化学衍生物，以将化合物递送至特定靶标细胞类型来靶定试剂作用的配方。施用以受控释放配方形式存在的化合物对于在胃肠道中具有窄吸收窗或相对较短的生物学半寿期的化合物来说是尤其优选的。
为获得受控释放(其中，释放的速率超过目标化合物的代谢速率)，可寻求多种策略中的任何策略。在一种实施例中，通过对多种配制参数和成分(包括，例如，多种类型的受控释放组合物和涂层)加以适当选择来获得受控释放。因此，用合适的赋形剂将化合物配制为施用时能以受控方式释放出化合物的药物组合物。例子包括单或多单位片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮液、乳液、微胶囊、分子复合体、微球、纳米颗粒、贴片和脂质体。
非肠道组合物
可通过以剂量形式、配方进行注射、注入(infusion)或植入(皮下、静脉内、肌内、腹膜内等)，或通过合适的递送装置或植入体(含有传统、非毒性可药用运载体和佐剂)，来非肠道地施用含有本文所述的或用本发明的方法鉴定出的化合物的组合物。此类组合物的配方和制备是药物配制领域技术人员公知的。
用于非肠道用途的组合物可以以单位剂量形式(例如，单剂量安瓿)，或含有若干剂量的小瓶(其中可加入合适的防腐剂，见下文)的形式提供。组合物可以是溶液、悬浮液、乳液、注入装置或用于植入的递送装置的形式，或者其可以作为有待在使用前用水或其它合适介载体(vehicle)重构的干粉存在。除了活性试剂之外，组合物可包括合适的非肠道可接受的运载体和/或赋形剂。活性试剂可被包括进微球、微胶囊、纳米颗粒、脂质体等用于受控释放。此外，组合物可包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、张力调节剂和/或分散剂。
如上文所述，根据本发明的药物组合物可以是适合用于无菌注射的形式。为制备这样的组合物，将合适的活性试剂溶解或悬浮于非肠道可接受的液体介载体中。可能使用的可接受介载体和溶剂包括水，通过加入适量氢氯酸、氢氧化钠或合适的缓冲液调节至合适pH的水，1，3-丁二醇，Ringer′s溶液，葡萄糖溶液和等渗(isotonic)氯化钠溶液。水性配方还可含有一种或多种防腐剂(例如，对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸乙酯或对羟苯甲酸正丙酯)。化合物之一仅略溶或微溶于水时，可加入增强溶解的试剂或增溶剂，或者溶剂可包括10-60％的丙二醇等。
受控释放非肠道组合物
受控释放非肠道组合物可以是水性悬浮液、微球、微胶囊、磁性微球、油溶液、油悬浮液或乳液的形式。组合物还可被包括进生物可相容运载体、脂质体、纳米颗粒、植入体或注入装置。
用于制备微球和/或微胶囊的材料是，例如，生物可降解/生物可侵蚀性聚合物，例如，聚泌乳激素(polygalactin)、聚-(氰基丙烯酸异丁酯)、聚(2-羟乙基-L-谷氨酰胺)、聚(乳酸)、聚乙醇酸及其混合物。配制受控释放非肠道配方时可使用的生物可相容运载体是，碳水化合物(例如葡聚糖)、蛋白质(例如清蛋白)、脂蛋白或抗体。用于植入体的材料可以是非生物可降解的(例如，聚二甲基硅氧烷)或生物可降解的(例如，聚(己酸内酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或聚(原酸酯))或其组合。用于口服用途的固体剂量形式
用于口服用途的配方包括片剂，其含有与非毒性可药用赋形剂一起处于混合物中的活性成分，此类配方是本领域技术人员已知的(例如，U.S.P.N.：5,817,307、5,824,300、5,830,456、5,846,526、5,882,640、5,910,304、6,036,949、6,036,949、6,372,218，其通过引用并入本文)。这些赋形剂可以是例如，惰性稀释剂或填料(例如，蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露糖醇、微晶纤维素、淀粉(包括马铃薯淀粉)、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；成粒剂和崩解剂(例如，纤维素衍生物(包括微晶纤维素)、淀粉(包括马铃薯淀粉)、交联羧甲基纤维素钠、藻酸盐或藻酸)；粘结剂(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯树胶、藻酸、藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、硅酸铝镁、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；和润滑剂、助流剂(glidant)和抗粘剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、硅石、氢化植物油或滑石)。其它可药用赋形剂可以是着色剂、增香剂、增塑剂、润湿剂、缓冲剂等。
片剂可以是没有涂层的，或者可用已知技术对它们进行涂布，可选地，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，由此提供更长时期的持续作用。涂层可被改造，以适于以预定模式释放化合物(例如，以获得受控释放配方)或者其可被改造为在通过胃之后才释放试剂(肠溶衣)。涂层可以是糖衣、膜衣(例如，基于羟丙甲基纤维素、甲基纤维素、甲羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮)或肠溶衣(例如，基于甲基丙烯酸共聚物、邻苯二甲酸乙酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙甲基纤维素、琥珀酸乙酸羟丙甲基纤维素、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、虫胶和/或乙基纤维素)。此外，可使用延迟时间的物质，例如，单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
固体片剂组合物可包括被改造来适用于保护组合物免受不想要的化学变化(例如，在释放活性物质之前的化学降解)的涂层。涂层可以以与上文提及的Encyclopedia of Pharmaceutical Technology所述的相似的方式应用于固体剂量形式。
本发明的组合物可在片剂中混合到一起，或者可分隔开。在一个实施例中，第一试剂被放在片剂内部，第二试剂被放在外面，使得第二试剂的相当大部分在第一试剂释放之前释放。
口服用途的配方还可作为可咀嚼片剂存在，或者作为明胶硬胶囊存在，其中，所述活性成分与惰性固体稀释剂(例如，马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或者所述配方作为明胶软胶囊存在，其中，所述成分与水或油介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。可使用，例如，混合机、流床装置或喷雾干燥设备，以传统方式，使用上文在片剂或胶囊下提到的成分，来制备粉末和颗粒。
受控释放的口服剂量形式
可构建用于口服用途的受控释放组合物，例如，通过控制化合物的溶解和/或扩散来释放化合物。
可通过对化合物的片剂、胶囊、团块(pellet)或颗粒配方加上合适的涂层，或通过将化合物包括进合适的基质来实现溶解或扩散受控释放。受控释放涂层可包括上文提到的涂布物质中的一种或多种和/或，例如，虫胶、蜂蜡、糖蜡(glycowax)、蓖麻蜡、棕榈蜡、十八烷醇、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、甘油棕榈酰硬脂酸酯、乙基纤维素、丙烯酸树脂、DL-聚乳酸、丁酸乙酸纤维素、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙烯吡咯烷酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、异丁烯酸甲酯、2-羟基异丁烯酸酯、异丁烯酸酯水凝胶、1，3-丁二醇、甲基丙烯酸羟乙酯和/或聚乙二醇。在受控释放基质配方中，基质材料还可包括，例如，水合甲基纤维素、棕榈蜡和十八烷醇、卡波普(carbopol)934、硅酮、三硬脂酸甘油酯、丙烯酸甲酯-异丁烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯和/或卤代氟碳。
含有本文所述的或使用本发明的方法鉴定的化合物的受控释放组合物还可以是飘浮(buoyant)片剂或胶囊(即，口服施用时在胃内容物上面浮一段时间的片剂或胶囊)。可通过对具有赋形剂的组合物与20～75％w/w水解胶体(例如，羟乙基纤维素、羟丙基纤维素或羟丙甲基纤维素)的混合物成粒，来制备化合物的飘浮片剂配方。然后可将获得的颗粒压成片剂。与胃液接触时，片剂在其表面周围形成基本上不渗水的凝胶屏障。该凝胶屏障参与保持小于一的密度，由此允许片剂在胃液中保持飘浮。
剂量
本文所述的或使用本文所述的方法鉴定的任何化合物的剂量取决于多种因素，包括：施用方法、待治疗的炎性应答、炎性应答的严重性、炎性应答是否将被治疗或预防以及待治疗的受试者的年龄、重量和健康情况。
在关于本发明的治疗方法的方面，发明人并不打算将化合物对受试者的施用限制为特定的施用模式、剂量或给剂量频率；本发明关注于施用的所有模式，包括肌内、静脉内、腹膜内、泡内、关节内、伤口内、皮下或足以提供足够用来治疗肝炎的剂量的任何其它途径。化合物可以以单剂量或多剂量形式施用给受试者。例如，本文所述的或使用本发明的筛选方法鉴定出的化合物可以每周施用一次，持续例如2、3、4、5、6、7、8、10、15、20或更多周。应当理解，对于任何特定的受试者而言，应当根据个体需要和施用或指导化合物施用的人的专业判断，随时间调节特别的剂量方案。例如，如果较低的剂量没有提供足以治疗炎性应答(例如，败血症、严重败血症和败血症性休克)的活性，那么可以增加化合物的剂量。反过来，如果炎性应答降低或消失了，那么可以减少化合物的剂量。
尽管最终将由参与医师来决定合适的量和剂量方案，但本文所述的化合物(例如，VEGF抗体或sFlt-1)或使用本发明的筛选方法鉴定出的化合物的治疗有效量可例如在0.0035μg至20μg/kg体重/天或0.010μg至140μg/kg体重/周的范围内。期待地，治疗有效量在每天、每隔一天或一周两次施用0.025μg至10μg/kg的范围内，例如至少0.025、0.035、0.05、0.075、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0或9.0μg/kg体重。此外，治疗有效量可以在每周、每隔一周或一月一次施用0.05μg至20μg/kg的范围内，例如，至少0.05、0.7、0.15、0.2、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0或18.0μg/kg体重。此外，化合物的治疗有效量可以在，例如，每隔一天、一周一次或每隔一周施用100μg/m2至100,000μg/m2的范围内。在一种人们期待的实施方式中，治疗有效量在每天、每隔一天、每周两次、每周或每隔一周施用1000μg/m2至20,000μg/m2的范围内，例如至少1000、1500、4000或14,000μg/m2化合物。
方法和材料
使用下述方法和材料进行前文所述的实验。
内毒素血症、CLP和肺炎小鼠模型
在雄性8周龄C57BL/6(体重22-24克)中进行LPS注射、CLP和肺炎模型。对于内毒素血症模型而言，用正常盐水(对照)或来自Escherichiacoli血清型0111:B4的LPS(Sigma，St.Louis，MO)(18mg/kg重量)对小鼠进行腹膜内(IP)注射。在相称的C57BL/6x129/Sv背景上，在指出的地方将LPS施用给三突变体(TM)小鼠(对于TNF受体1(TNFR1)、TNFR2和I型IL-1受体(IL1RI)来说是无效的)或野生型(WT)对照。TM小鼠以不含特定病原体的状态保存于完全屏障设施中(Mizgerd et al.，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 286：L1302-1310)。按照以前的描述，仅略加改变，来进行CLP(Rice et al.，J Infect Dis 191：1368-1376，2005)。简言之，用异氟磷麻醉小鼠。削开腹部后，在无菌条件下制造2cm的中线伤口，以暴露盲肠和邻近的肠。用4-0薇乔(vicryl)缝线将大约25～30％的盲肠末梢连接至近回盲瓣，然后用21目的针头穿刺。然后轻挤盲肠，以挤出少量粪便，以确保穿孔位点的开放性，再将盲肠放回到腹膜腔。小鼠在闭合时间点IP获得1ml盐水用于流体复苏，并在每12小时SC获得0.1mg/kg丁丙诺啡，以使得痛苦最小化。对于肺炎模型，通过肌内(IM)注射盐酸氯胺酮(100mg/kg)、乙酰丙嗪(5mg/kg IM)和阿托品(0.1mg/kg IM)来麻醉小鼠。手术暴露气管，通过血管插管将Escherichia coli(菌株19138，来自American Type Culture Collection；Manassas，VA)以每只小鼠106CFU经气管滴入左支气管。6或24小时后，通过吸入氟烷处死小鼠。
人内毒素血症和败血症模型
简言之，受试者经历复杂的筛选，如果他们目前或过去没有精神、神经、免疫、心血管或睡眠紊乱史；没有药物依赖/滥用史(包括过去六个月内抽烟)；具有正常的血化学(完全并分类的血球计数、T-细胞亚组、葡萄糖、肌氨酸酐、钠、钾、促甲状腺激素)和阴性的血尿毒物学结果，就被包括进来。受试者受到安慰剂静脉注射或2ng/kg Escherichiacoli内毒素(O：113，Lot EC-5)的宿主应答攻击。人败血症研究是获得Research Ethics Board of the Hamilton Health Sciences(Henderson GeneralHospital，Hamilton，ON)许可的。使用以前描述过的“包括和排除(inclusion and exclusion)”标准，在Henderson General Hospital、St.Joseph′s Healthcare和Hamilton General Hospital(Hamilton，Ontario，Canada)的重症监护单元，鉴定出具有严重败血症的患者。将接受过Xigris的患者排除在分析之外。收集患者的基础特征，包括人口统计信息、急性生理学和慢性健康评估(APACHE II)及格分数(admissionscores)、多器官机能障碍(MOD)分数、共发病率、器官功能、感染的位点和类型以及血液学测试(见下表)。
 年龄(岁)均值±SD(最小值，最大值)   65±14(36，81)
 APACHE II分数均值±SD(最小值，最大值)   26.6±8.2(10，42)
 MOD分数均值±SD(最小值，最大值)   11.1±3.7(3，15)
 初次感染位点(数量)肺腹部尿道其它未知 111111
 阳性血培养(数量)革兰氏阴性细菌革兰氏阳性细菌真菌混合未知 37113
 28天死亡率   47％
a多个器官机能障碍
测量血浆、血清或组织裂解液中的细胞因子水平
在血清中测量TNF-α和IL-1。在血浆中测量IL-6、VEGF和PlGF。为从小鼠分离出血浆，通过心脏穿刺将血样收集进肝素化管，离心，保存上清液作为血浆。为获得小鼠血清，在4℃对血样进行过夜孵育，离心，保存上清液作为血清。在人内毒素血症研究中，以规则间隔将血样采入EDTA管，放置于冰上5分钟，之后在2600g离心，然后吸取血浆分装为小份试样，贮存于-80℃，直到随后的检测。在具有严重败血症的患者中，在达到严重败血症定义的24小时内采血。在患者停留于ICU期间，前7天每天采血，之后每周一次。通过留置导管从患者采静脉血(9mL)。作为对照，通过静脉穿刺从健康成年志愿者采静脉血(9mL)。对于每名患者或志愿者，采集的血中取4.5mL，立即转移进含有0.5mL 0.105M经缓冲柠檬酸三钠(pH 5.4)的15mL聚丙烯管，剩下4.5mL转移进含有0.5mL 0.105M经缓冲柠檬酸三钠(pH 5.4)和100μL 1M苯甲脒HCl(最终为20mM苯甲脒)的15mL聚丙烯管。在20℃于1500g对血进行离心，将血浆作为小份试样贮存于-80℃。为制备小鼠器官组织裂解液，用含2mM EDTA的PBS灌注小鼠。取出器官，急冻于液氮中。在含50mMTris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl和0.05％蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)(Sigma)的裂解缓冲液中对冷冻组织加以匀浆，然后离心，获得上清液(组织裂解液)。使用Quantikine ELISA试剂盒(R&D systems Inc)来检测小鼠sFlt-1、VEGF、TNF-a、IL-6、IL-1α和IL-1β。使用AsserachromDI-D-D-二聚体的酶免疫检测(Diagnostica Stago，France)来测量小鼠的D-二聚体。使用人PlGF和VEGF Quantikine ELISA试剂盒(R&DSystems Inc，Minneapolis，MN)来测量人血浆PlGF、VEGF-A。使用之前描述过的方法(Liaw et al.，J Thromb Haemost 1：662-670，2003)，用柠檬酸盐/苯甲脒血浆样品来进行APC检测。
Ad介导的、可溶Flt-1(sFlt)、VEGF和PlGF的过量表达
用过量表达GFP(对照，2x108pfu)、鼠sFlt-1(1x108pfu)、鼠VEGF-A(异构体120)(2x108pfu)或鼠PlGF-2(2x108pfu)的Ad对小鼠进行静脉内注射。这些病毒的构建以前被描述过(H.A.von Recum etal.，Proc Natl Acad Sci USA 98：4605-4610，2001；Maynard et al.，J ClinInvest 111：649-658，2003；Luttun et al.，Nat Med 8：831-840，2002)。滴定Ad-sFlt-1、Ad-VEGF和Ad-PlGF的剂量，以获得大约10～25ng/ml的血浆水平。用测量鼠sFlt-1、VEGF和PlGF的商业Quantakine ELISA试剂盒(R&D Systems Inc)来检测来自小鼠血浆的这些细胞因子的循环水平。
抗体施用
在LPS施用前16小时，用800μg抗小鼠Flk-1抗体(DC101)、1200μg抗小鼠Flt-1抗体(MF-1)或对照PBS的注射液对小鼠进行IP注射。两种抗体都由ImClone Systems Incorporated(New York，NY)友情提供。
可溶Flt-1肽施用
在LPS施用或CLP后一小时开始的12小时内，每3小时用1μg人重组可溶Flt-1结构域D1-3(Cell Sciences，Inc，Canton，MA)或等体积PBS(对照)对小鼠进行静脉内注射。
心脏生理学分析
对小鼠进行的心回波图检查如以前所描述的(McMullen et al.，ProcNatl Acad Sci USA 100：12355-12360，2003；Shioi et al.，EMBO J19：2537-2548，2000)。简言之，通过IP注射盐酸氯胺酮(50mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)来麻醉小鼠。用装备有12MHz转换器(transducer)的Hewlett-Packard(Andover，MA)Sonos 1500扇形扫描仪记录二维导向的M-模式描图(tracing)，以评价左室(LV)壁厚、LV尺寸和缩短分数。用多通道放大器在经麻醉小鼠上获得心电图(ECG)记录，将其转化为数字信号用于分析(PowerLab system；ADInstruments，ColoradoSprings，CO)。
通透性检测
通过IP注射0.5ml Avertin来麻醉小鼠。将100μl 1％Evans蓝染料(处于PBS中)注射进尾静脉。40分钟之后，用含2mM EDTA的PBS通过心脏穿刺对小鼠进行20分钟灌注。收获器官(脑、心脏、肺、肝、肾、脾)，在甲酰胺中孵育3天，以洗脱Evans蓝染料。使用620nm波长测量甲酰胺溶液的OD。
组织RNA分离和定量TaqMan PCR分析
使用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)和RNA小量制备试剂盒(Qiagen，Germany)分离出组织RNA。为进行定量实时PCR，按照厂商说明书(Qiagen，Germany)，采用DNase I处理，使用RNeasy RNA提取试剂盒来制备总RNA。为产生cDNA，将来自三份重复样品中每份的总RNA(100ng)混合起来，使用随机引物和Superscript III逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)将其转化为cDNA。将所有cDNA样品分装为小份试样，贮存于-80℃。使用Primer Express寡核苷酸设计软件(AppliedBioSystems，Foster City，CA)来设计引物并通过Integrated DNATechnologies(Coralville，IA)合成。对所有引物组进行严格的数据库检索，以鉴定出与假基因或相关基因中同源结构域匹配的可能的冲突转录本。使用Applied Biosystems提供的引物熔解一阶导数曲线(firstderivative primer melting curve)软件，针对熔点温度来分析从引物组产生的扩增子。用SYBR Green I检测和ABI Prism 7500Sequence DetectionSystem来探测使用主模板从经逆转录的cDNA样品得到的实时PCR产物。每种样品的PCR反应都重复进行两份，按照以前的描述来测量拷贝数。将靶标基因表达的水平针对每份样品中的18S rRNA表达进行归一化，数据作为相对每106个18S rRNA拷贝而言的mRNA拷贝数呈现。
免疫化学
按照之前的描述，在来自对照和经LPS处理小鼠的心脏、脑和肺的5-μm冷冻切片上进行免疫化学研究。抗体包括：兔多克隆抗小鼠P-选择蛋白抗体(Chemicon International，Temecula，CA)、兔多克隆抗小鼠PAI-1抗体(Innovative Research Inc，Southfield，MI)、兔多克隆抗小鼠Cox-2抗体(Cayman Chemical，Ann Arbor，MI)、大鼠单克隆抗小鼠E-选择蛋白抗体(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)、大鼠单克隆抗小鼠VCAM-1抗体(Chemicon International)和大鼠单克隆抗小鼠ICAM-1抗体(Serotec Ltd，Oxford，UK)。与FITC缀合的抗大鼠IgG抗体和与Cy3缀合的抗兔IgG抗体(ZYMED Laboratories，South San Francisco，CA)被用作为二抗。为进行共定位研究，将大鼠单克隆抗小鼠CD31抗体(BDBiosciences Pharmingen)与兔多克隆抗体(P-选择蛋白、PAI-1和Cox-2)一起用于双免疫荧光染色中；兔多克隆抗小鼠vWF抗体(Abcam Inc，Cambridge，MA)与大鼠单克隆抗小鼠抗体(E-选择蛋白、VCAM-1和ICAM-1)组合。
细胞培养
在EGM培养基(Cambrex Bio Science，Walkersville，MD)中培养HUVEC。一旦细胞达到70％汇合，在0.5％FBS EGM中对它们进行20小时的血清饥饿，然后用0.1ng/ml TNF-α、100ng/ml VEGF和200ng/mlPlGF单独或组合孵育4小时。按照上文所述，为了RNA收获细胞并对其进行加工。
存活研究
在LPS注射或CLP三天前，用对照(GFP)-腺病毒、sFlt-1腺病毒、PlGF腺病毒和/或VEGF-A腺病毒来处理C57BL/6雄性小鼠。或者，按照上文所述，动物获得抗Flk-1抗体、抗Flt-1抗体或sFlt-1肽。在LPS注射(20mg/kg重量)或CLP后24、48、72和96小时时对存活进行评估。
在一些流程中，在20mg/kg脂多糖(LPS)(SIGMA，St.Louis，Mo.)施用(i.p.注射)之前20小时，用1mg小鼠PLGF-2中和抗体或对照IgG对八周龄的C57BL/6雄性小鼠进行静脉内注射。八周龄的PlGF-/-)雄性小鼠(FVB背景)和年龄相衬的野生型同窝出生仔畜也被用于存活研究。对小鼠静脉内注射17mg/kg LPS。在4天内的不同时间点对小鼠存活率加以监测。
统计分析
在小鼠细胞因子和基因表达研究中，用学生t检验来进行统计分析。用ANOVA对心脏生理学数据进行统计分析。用General Linear Model(GLM)Repeated Measures来评估人受试者组之间(安慰剂对内毒素)的差异。适当的时候应用对自由度的Greenhouse-Geisser校正。在显著性条件(significant condition)或交互作用效应的情况下，用简单的对比来说明相互之间显著不同的时间点。通过构建Kaplan-Meier图以及使用时序检验来分析存活数据。
本申请文件中提到的所有专利、专利申请和公开文本，包括提交于2005年7月13日的美国临时申请60/698,997都通过引用并入本文，其程度与特别、单独地指明每份独立专利、专利申请或公开文本通过引用并入本文的程度相同。

Claims (74)

1.在测试受试者中诊断炎性应答的方法，所述方法包括分析从所述测试受试者分离的样品中的sFlt-1表达或活性水平，其中，所述样品中sFlt-1表达或活性水平相对未受影响的受试者中发现的水平而言增加则表明所述测试受试者具有所述炎性应答。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括分析VEGF、PlGF、TNF-α、IL-6、D-二聚体、E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM-1、VCAM-1、Cox-2或PAI-1中至少一种的水平。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述受试者是人。
4.如权利要求1所述的方法，其中，待诊断的所述炎性应答是严重败血症或败血症性休克。
5.鉴定可用于对具有炎性应答的受试者进行治疗的候选化合物的方法，所述方法包括：
(a)将sFlt-1与化合物接触；以及
(b)测量所述sFlt-1的活性，其中，在存在所述化合物时的sFlt-1活性相对不存在所述化合物时的sFlt-1活性增加，则将所述化合物鉴定为用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述测量步骤(b)包括测量VEGF或PlGF中的至少一种与sFlt-1的结合。
7.如权利要求5所述的方法，其中，所述化合物选自化学物质文库。
8.鉴定可用于对具有炎性应答的受试者进行治疗的候选化合物的方法，所述方法包括：
(a)将包括编码sFlt-1的多核苷酸的细胞或细胞提取物与化合物接触；以及
(b)测量sFlt-1在所述细胞或细胞提取物中的表达水平，其中，在存在所述化合物时的sFlt-1的表达水平相对不存在所述化合物时的水平增加，则将所述化合物鉴定为用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述细胞是哺乳动物中的。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述方法还包括在所述接触步骤(a)之前向所述哺乳动物施用脂多糖。
11.如权利要求8所述的方法，其中，所述化合物选自化学物质文库。
12.治疗具有炎性应答的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的、能增加sFlt-1的表达或活性的组合物。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述组合物包括sFlt-1。
14.如权利要求12所述的方法，其中，所述方法还包括施用选自由杀菌剂、流体、血管加压剂、皮质类固醇、活化蛋白C、胰岛素葡萄糖、机械通气、肾替代疗法和镇静构成的组的治疗。
15.如权利要求12所述的方法，其中，所述受试者是人。
16.如权利要求12所述的方法，其中，所述炎性应答是严重败血症或败血症性休克。
17.在测试受试者中诊断炎性应答的方法，所述方法包括分析从所述测试受试者分离的样品中PlGF的表达或活性水平，其中，所述样品中PlGF表达或活性水平相对未受影响的受试者中水平而言有所改变表明所述测试受试者具有所述炎性应答。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述方法还可包括分析VEGF、PlGF、TNF-α、IL-6、D-二聚体、E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM-1、VCAM-1、Cox-2或PAI-1中至少一种的水平。
19.如权利要求17所述的方法，其中，所述受试者是人。
20.如权利要求17所述的方法，其中，待诊断的所述炎性应答是严重败血症或败血症性休克。
21.如权利要求17所述的方法，其中，所述改变是增加。
22.如权利要求17所述的方法，其中，所述改变是减少。
23.鉴定可用于对具有炎性应答的受试者进行治疗的候选化合物的方法，所述方法包括：
(a)将PlGF与化合物接触；以及
(b)测量所述PlGF的活性，其中，在存在所述化合物时的PlGF活性相对不存在所述化合物时的PlGF活性而言有所改变，则将所述化合物鉴定为用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述化合物选自化学物质文库。
25.如权利要求23所述的方法，其中，所述改变是增加。
26.如权利要求23所述的方法，其中，所述改变是减少。
27.鉴定可用于对具有炎性应答的受试者进行治疗的候选化合物的方法，所述方法包括：
(a)将包括编码PlGF的多核苷酸的细胞或细胞提取物与化合物接触；以及
(b)测量PlGF在所述细胞或细胞提取物中的表达水平，其中，在存在所述化合物时的PlGF的表达水平相对不存在所述化合物时的水平而言有所改变，则将该化合物鉴定为用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物。
28.如权利要求27所述的方法，其中，所述细胞是哺乳动物中的。
29.如权利要求28所述的方法，其中，所述方法还包括在所述接触步骤(a)之前向所述哺乳动物施用脂多糖。
30.如权利要求27所述的方法，其中，所述化合物选自化学物质文库。
31.如权利要求27所述的方法，其中，所述改变是增加。
32.如权利要求27所述的方法，其中，所述改变是减少。
33.鉴定用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物的方法，所述方法包括：
(a)将PlGF受体或其PlGF结合片段与化合物接触；以及
(b)测量所述化合物与所述受体的结合，其中，所述化合物与所述PlGF受体或所述其片段的特异性结合表明所述化合物是用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物。
34.如权利要求33所述的方法，其中，所述PlGF受体是神经纤毛蛋白-1或VEGFR-1或其片段。
35.如权利要求33所述的方法，其中，所述化合物选自化学物质文库。
36.治疗具有炎性应答的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的、能改变PlGF的表达或活性的组合物。
37.如权利要求36所述的方法，其中，所述组合物包括PlGF。
38.如权利要求36所述的方法，其中，所述组合物包括编码PlGF的核酸，或其具有PlGF活性的片段。
39.如权利要求36所述的方法，其中，所述受试者是人。
40.如权利要求36所述的方法，其中，所述组合物包括与PlGF特异性结合的抗体或其PlGF结合片段。
41.如权利要求36所述的方法，其中，所述组合物包括干扰编码所述PlGF蛋白的mRNA的RNA。
42.如权利要求36所述的方法，其中，所述改变是增加。
43.如权利要求36所述的方法，其中，所述改变是减少。
44.如权利要求36所述的方法，其中，所述方法还包括施用选自由杀菌剂、流体、血管加压剂、皮质类固醇、活化蛋白C、胰岛素葡萄糖、机械通气、肾替代疗法和镇静构成的组的治疗。
45.如权利要求36所述的方法，其中，所述炎性应答是严重败血症或败血症性休克。
46.治疗具有炎性应答的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的、能改变PlGF受体的活性或表达的组合物。
47.如权利要求46所述的方法，其中，所述PlGF受体是神经纤毛蛋白-1或VEGFR-1。
48.如权利要求46所述的方法，其中，所述方法还包括施用选自由杀菌剂、流体、血管加压剂、皮质类固醇、活化蛋白C、胰岛素葡萄糖、机械通气、肾替代疗法和镇静构成的组的治疗。
49.如权利要求46所述的方法，其中，所述受试者是人。
50.如权利要求46所述的方法，其中，所述改变是增加。
51.如权利要求46所述的方法，其中，所述改变是减少。
52.在测试受试者中诊断炎性应答的方法，所述方法包括分析从测试受试者分离的样品中的VEGF表达或活性水平，其中，所述样品中VEGF表达或活性水平相对未受影响的受试者中发现的水平而言增加则表明所述测试受试者具有所述炎性应答。
53.如权利要求52所述的方法，其中，所述方法还包括分析PlGF、sFlt-1、TNF-α、IL-6、D-二聚体、E-选择蛋白、P-选择蛋白、ICAM-1、VCAM-1、Cox-2或PAI-1中至少一种的水平。
54.如权利要求52所述的方法，其中，所述受试者是人。
55.如权利要求52所述的方法，其中，待诊断的所述炎性应答是严重败血症或败血症性休克。
56.鉴定可用于对具有炎性应答的受试者进行治疗的候选化合物的方法，所述方法包括：
(a)将VEGF与化合物接触；以及
(b)测量所述VEGF的活性，其中，在存在所述化合物时的VEGF活性相对不存在该化合物时的VEGF活性减少则将所述化合物鉴定为用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物。
57.如权利要求56所述的方法，其中，所述化合物选自化学物质文库。
58.鉴定可用于对具有炎性应答的受试者进行治疗的候选化合物的方法，所述方法包括：
(a)将包括编码VEGF的多核苷酸的细胞或细胞提取物与化合物接触；以及
(b)测量所述VEGF在所述细胞或细胞提取物中的表达水平，其中，在存在所述化合物时的VEGF的表达水平相对不存在所述化合物时的水平减少，则将所述化合物鉴定为用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物。
59.如权利要求58所述的方法，其中，所述细胞是哺乳动物中的。
60.如权利要求59所述的方法，其中，所述方法还包括在所述接触步骤(a)之前向所述哺乳动物施用脂多糖。
61.如权利要求58所述的方法，其中，所述化合物选自化学物质文库。
62.鉴定用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物的方法，所述方法包括：
(a)将VEGF受体或其VEGF结合片段与化合物接触；以及
(b)测量所述化合物与所述受体的结合，其中，所述化合物与所述VEGF受体或所述其片段的特异性结合表明所述化合物是用于治疗具有炎性应答的受试者的候选化合物。
63.如权利要求62所述的方法，其中，所述VEGF受体是神经纤毛蛋白-1、VEGFR-1、VEGFR-2或其片段。
64.如权利要求62所述的方法，其中，所述化合物选自化学物质文库。
65.治疗具有炎性应答的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的、能减少VEGF的表达或活性的组合物。
66.如权利要求65所述的方法，其中，所述受试者是人。
67.如权利要求65所述的方法，其中，所述组合物包括与VEGF特异性结合的抗体，或其VEGF结合片段。
68.如权利要求65所述的方法，其中，所述组合物包括能干扰编码VEGF的mRNA的RNA。
69.如权利要求65所述的方法，其中，所述方法还包括施用选自由杀菌剂、流体、血管加压剂、皮质类固醇、活化蛋白C、胰岛素葡萄糖、机械通气、肾替代疗法和镇静构成的组的治疗。
70.如权利要求65所述的方法，其中，所述炎性应答是严重败血症或败血症性休克。
71.治疗具有炎性应答的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的、能减少VEGF受体表达或活性的组合物。
72.如权利要求71所述的方法，其中，所述VEGF受体是神经纤毛蛋白-1、VEGFR-1或VEGFR-2。
73.如权利要求71所述的方法，其中，所述受试者是人。
74.如权利要求71所述的方法，其中，所述方法还包括施用选自由杀菌剂、流体、血管加压剂、皮质类固醇、活化蛋白C、胰岛素葡萄糖、机械通气、肾替代疗法和镇静构成的组的治疗。
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