JP2009501521A - 炎症応答を診断および処置する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本研究は、National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Healthからの助成金(Number PO1 HL076540)により援助された。米国政府は、それゆえに、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、炎症応答を診断および処置する分野に関する。
第一局面において、本発明は、検査被験体から単離された試料におけるsFlt-1発現または活性のレベルを分析する段階を含む、検査被験体(例えば、ヒト)において炎症応答(例えば、重度敗血症または敗血症性ショック)を診断する方法であって、非罹患被験体に見出されるレベルと比較した、試料におけるsFlt-1発現または活性の増加したレベルが、検査被験体が炎症応答を有することを示す方法を提供する。本方法はさらに、VEGF、PlGF、TNF-α、IL-6、D-ダイマー、E-セレクチン、P-セレクチン、ICAM-1、VCAM-1、Cox-2、またはPAI-1の少なくとも1つのレベルを分析する段階を含みうる。
本発明は、敗血症、重度敗血症、または敗血症性ショックのような炎症応答を診断および処置する方法を含む。本発明はさらに、炎症応答の処置に有用な候補化合物についてスクリーニングする方法を含む。これらの方法は、VEGF、PlGF、およびsFlt-1の循環レベルが敗血症の動物およびヒトモデルにおいて時間依存的様式で敗血症で上昇するという発見、VEGFおよびPlGFの増加したレベルが敗血症の病態に結びつけられるという発見、ならびにsFlt-1での処置が敗血症、重度敗血症、および敗血症性ショックの重症度を減少させる、またはこれらを予防するという発見に由来する。
sFlt-1、VEGF、およびPlGF、ならびに炎症応答
リポ多糖(LPS)誘導性内毒血症マウスモデルおよび盲腸結紮穿刺(CLP)マウスモデルの両方における血漿VEGFおよびPlGFレベルの顕著な上方制御が観察される(図4a〜4b)。マウスにおけるリポ多糖(LPS)の腹腔内投与は、結果として、血漿VEGFおよびPlGF濃度における時間依存性増加を生じ、ピークレベル(それぞれ、477pg/mlおよび4311pg/ml)は24 hに起きた(図4a)。対照的に、IL-6およびTNF-αの循環レベルは、測定された最も早い時点(6 h)で最大であった。敗血症のCLPモデルにおいて、VEGF(137.26pg/ml)およびPlGF(71.25pg/ml)のピークレベルは、それぞれ、24 hおよび12 hに起きた(図4b)。大腸菌(Escherichia coli)肺炎のマウスモデルにおいて、血漿VEGFレベルは有意には変化しなかったが、PlGFレベルは6 hに増加した(23.01pg/ml)(図4c)。
ヒト被験体において、LPSの全身投与は、結果として、VEGFおよびPlGFの上昇した循環レベルを生じ(図4d)、それぞれ1.5 hおよび2.5 hにピークに達したTNF-αおよびIL-6(データ非呈示)とは対照的に、ピークレベル(それぞれ、70pg/mlおよび23.5pg/ml)は4 hに起こった。VEGFおよびPlGFの血漿中レベルは、重度敗血症をもつ10人の患者および10人の健康なボランティアにおいて測定された。研究の着手時、患者におけるVEGFレベル(平均およびSD=46.49±46.17pg/ml)は、健康なボランティア(平均およびSD=3.83±3.16pg/ml)においてより有意に高かった(P=0.009)。同様に、研究着手時点での患者におけるPlGFレベル(平均およびSD=13.52±14.55pg/ml)は、健康なボランティア(平均およびSD=0.18±0.58pg/ml)と比較して有意に高かった(P=0.009)。たいていの場合(8/10)、VEGFおよびPlGFレベルは、彼らのICU滞在中(一部の場合では、最高29日間)、上昇し続けた。最大VEGFおよびPlGFレベルは、それぞれ、367pg/mlおよび96pg/mlであった(図4e)。
VEGFレベルは、内毒血症の重症度と有意に相関する。マイル(mile)アッセイは、非感染マウスと比較して、肺感染後の肺、肝臓、および腎臓組織における有意な血液漏出を示す(図5)。PlGFおよびIL-6は両方とも、非感染マウスと比較して、肺感染によって増加しており(図6)、PlGFと炎症応答の間の関連を示している。内毒血症モデルにおける生理学的測定により、年齢をマッチさせた対照マウスと比較して、低下した心拍出量、血圧、および体温が明らかにされた。これらの結果は、被験体におけるVEGFおよびPlGFの検出が敗血症の診断となること、ならびに敗血症の重症度が被験体において検出されたVEGFまたはPlGFの量と相関することを示す。
可溶性Flt-1(sFlt-1)タンパク質による循環VEGFの全身性遮断がLPS誘発性内毒血症症状を防ぐことは、以下の手順を用いて実証された(図7)。sFlt-1は、遊離VEGF-A、VEGF-B、およびPlGFに結合し、それに従って、細胞表面受容体とのそれらの相互作用をブロックする細胞表面受容体Flt-1の天然のスプライシングバリアントである(Kendall et al., Biochem Biophys Res Commun 226:324-328, 1996)。以前の研究は、Ad-sFlt-1がインビボで肝臓肝細胞に形質導入し、結果として、注入後最高2週間、sFlt-1の高い循環レベルを生じることを示している(Kuo et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:4605-4610, 2001; Maynard et al., J Clin Invest 111:649-658, 2003)。
PlGFの上方制御もまた、LPS処理後、心臓、肺、腎臓、および脳に観察され、増加はsFlt-1処置によって正常化される(図17a〜17f)。LPSで処理されたTNFおよびIL-1受容体ノックアウトマウスもまた、LPSで処理されなかったマウス(野生型マウスおよびTNF/IL-1受容体ノックアウトマウスの両方)と類似したVEGFおよびPlGFのレベルを有するが、LPS処理された野生型マウスはVEGFおよびPlGFの両方における増加を示す(図18aおよび18b)。
抗PlGF抗体およびPlGFの遺伝的欠損の敗血症死亡率への効果もまた、生存に関して評価された。研究は、17mg/kg LPS処理された野生型マウスおよびPlGFヌルマウスにおいて、ならびに20mg/kg LPS処理されたマウスにおいて対照IgGまたは抗PlGF抗体を用いて、行われた。野生型マウスにおいて、7/16(43.7%)マウスが内毒血症で死んだ(図10h)。PlGF欠損は結果として、死亡率の有意な増加を生じた(14/17動物が死んだ;p=0.0179)。同様に、抗PlGF抗体処理は、結果として、対照IgG処理群(12/18(66.7%)マウスがLPS誘発性内毒血症で死んだ)と比較して、死亡率における顕著な増加(100%死亡率;p=0.0301)を生じた(図10i)。
上昇した増殖因子濃度の源を決定するために、VEGFおよびPlGFレベルをELISAを用いて様々な組織においてアッセイした。マウスにおけるLPSの全身投与は、結果として、肝臓(3.8倍)、腎臓(1.9倍)、および心臓(3.7倍)において6 hに増加したVEGFタンパク質レベルを生じたが、脳、肺、および脾臓において減少したレベルを生じた(図19)。PlGFタンパク質は、脳(4.8倍)、肺(7.1倍)、心臓(71.8倍)、肝臓(35.2倍)、腎臓(28.5倍)、および脾臓(28.4倍)を含む調べられたすべての組織において増加した(図19)。LPS処理されたマウスまたは対照マウスの血漿と比較して、血清におけるVEGFタンパク質に差がなく、内毒血症における血漿VEGFレベルへの血小板の有意な寄与(データ非呈示)と相反した。これらの所見に基づいて、敗血症は、VEGFおよびPlGFの増加した発現および循環レベルと明らかに関連している。
外因性sFlt-1は、内毒血症中に誘導された血漿サイトカインの最初の6 hピークへ効果を生じなかった(図20a〜20i)。しかしながら、サイトカインレベルは、対照アデノウイルスと比較して、Ad-sFlt-1を受けた動物においてより急速に減少した。Ad-sFlt-1は、12 hおよび/または24 hにおいてTNF-α、IL-1β、およびIL-6、ならびにD-ダイマーのLPS媒介性誘導を有意に鈍らせた(図20a〜20f)。IL-1RIおよび2つのTNF-α受容体、TNFR1およびTNFR2についてヌルの三重突然変異体マウスにおけるLPS投与は、結果として、24 hに、野生型対照と比較してVEGFおよびPlGFの有意に低い誘導を生じた(図20g〜20i)。合わせると、これらの所見は、VEGFおよびPlGFが、一般的に結びつけられる敗血症誘発性サイトカインの下流に位置することを示唆している。
炎症応答の診断
本発明は、VEGF、PlGF、およびsFlt-1の血清中レベルが炎症応答において増加しているという発見に基づいて、敗血症、重度敗血症、および敗血症性ショックのような炎症応答の診断に有用なアッセイを提供する。従って、炎症応答の診断は、被験体から採取された試料におけるVEGF、PlGF、およびsFlt-1の発現または活性のレベルを測定することにより行われうる。この発現または活性のレベルは、その後、対照試料、例えば、対照被験体から採取された試料、と比較されることができ、対照に対するVEGF、PlGF、またはsFlt-1における増加は、炎症応答の徴候、または炎症応答を発生するリスクがある、もしくは性向を有すると解釈される。
本発明はまた、診断検査キットを提供する。例えば、診断検査キットは、VEGF、PlGF、またはsFlt-1に対する抗体、ならびに、抗体と、VEGF、PlGF、またはsFlt-1ポリペプチドとの間の結合を検出するための、および評価するための手段を含みうる。検出について、VEGF、PlGF、またはsFlt-1ポリペプチド-抗体の相互作用が、抗体とVEGF、PlGF、またはsFlt-1ポリペプチドの間での結合後、基質に付着した標識の量を測定することにより確立されうるように、抗体かまたはVEGF、PlGF、またはsFlt-1ポリペプチドかのいずれかが標識され、抗体かまたはVEGF、PlGF、またはsFlt-1ポリペプチドかのいずれかが基質に結合する。通常のELISAは、抗体-基質相互作用を検出するための当技術分野において公知の一般的な方法であり、本発明のキットで提供されうる。VEGF、PlGF、またはsFlt-1ポリペプチドは、限定されるわけではないが、尿、血清、血漿、唾液、羊水、または脳脊髄液を含む事実上任意の体液において検出されうる。正常な対照に存在するレベルのような参照に対するVEGF、PlGF、またはsFlt-1ポリペプチドのレベルにおける変化を測定するキットは、本発明の方法における診断キットとして有用である。
候補化合物の同定のためのスクリーニング方法
本発明はまた、VEGF、PlGF、もしくはsFlt-1に結合する、またはこれらの発現もしくは活性を調節する、敗血症、重度敗血症、または敗血症性ショックのような炎症応答の処置に有用でありうる化合物の同定のためのスクリーニング方法を提供する。有用な化合物は、VEGFの発現もしくは活性を減少させる、PlGFの発現もしくは活性を増加もしくは減少させる、またはsFlt-1の発現もしくは活性を増加させる。
VEGF発現もしくは活性を減少させる、PlGF発現もしくは活性を増加もしくは減少させる、またはsFlt-1発現もしくは活性を増加させる化合物を同定するためのスクリーニングアッセイは標準方法により行われる。スクリーニング方法は、高処理量技術を含みうる。加えて、これらのスクリーニング技術は、培養細胞または非ヒト生物体において行われうる。これらの生物体におけるスクリーニングは、ヒトVEGF、PlGF、またはsFlt-1に相同的なポリヌクレオチドの使用を含みうる。例えば、マウスにおけるスクリーニングは、候補化合物のマウスVegfaもしくはPgf遺伝子の発現または活性への効果を測定する段階を含みうる。
一般的に、炎症応答(例えば、敗血症、重度敗血症、または敗血症性ショック)を処置する能力がある化合物は、当技術分野において公知の方法に従って、天然産物もしくは合成(または半合成)抽出物の両方の大きなライブラリー、または化学ライブラリーから同定される。薬物発見および開発の分野における業者は、試験抽出物または化合物の正確な源が本発明のスクリーニング手順にとって重大な意味をもたないことを理解していると思われる。従って、事実上、化学抽出物または化合物のいくつでも、本明細書に記載された方法を用いてスクリーニングされうる。そのような抽出物または化合物の例は、限定されるわけではないが、植物、真菌、原核生物、または動物に基づいた抽出物、発酵ブロス、および合成化合物、加えて既存の化合物の改変を含む。多数の方法もまた、限定されるわけではないが、糖、脂質、ペプチド、およびポリヌクレオチドに基づいた化合物を含む化学化合物のいくつものランダムまたは定方向の合成(例えば、半合成または全合成)を生じるために利用できる。合成化合物ライブラリーは市販されている。または、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形をとる天然化合物のライブラリーが市販されている。加えて、天然ライブラリーおよび合成製造されたライブラリーは、必要に応じて、当技術分野において公知の方法に従って、例えば、標準抽出および分画方法により、作製される。さらになお、必要に応じて、任意のライブラリーまたは化合物は、標準化学的、物理的、または生化学的方法を用いて容易に改変される。
炎症応答の処置
本発明はまた、敗血症、重度敗血症、または敗血症性ショックのような炎症応答をもつ被験体を処置する方法を提供する。処置方法は、炎症応答(例えば、敗血症、重度敗血症、または敗血症性ショック)をもつ被験体においてsFlt-1もしくはPlGFの量または活性を増加させる、またはVEGFもしくはPlGFの量または活性を低下させる化合物の投与を含む。
敗血症、重度敗血症、または敗血症性ショックのような炎症応答をもつ被験体の処置は、sFlt-1またはPlGFの投与により達成されうる。投与は、本明細書に記載された任意の経路によりうる;しかしながら、非経口投与が好ましく、静脈内投与がより好ましい。投与は、sFlt-1の濃度がFltの基底(すなわち、未処置の)レベルに対して2〜50倍、例えば5〜10倍、増加するような量でありうる。同様に、PlGFの投与は、基底に対して1.1〜200倍、例えば、10〜100倍、基底(すなわち、未処置の)に対してPlGFのレベルを増加させうる。さらに、投与されるsFLt1-1またはPlGFポリペプチドは、翻訳後修飾(例えば、グリコシル化、リン酸化)、または他の化学修飾、例えば、被験体内のsFlt-1もしくはPlGFの分布を変化させる、またはsFlt-1もしくはPlGFの分解および/もしくは排泄の速度を変化させるように設計される修飾、のような修飾を含みうる。
炎症応答をもつ被験体の処置はまた、VEGFまたはPlGFタンパク質を特異的に結合する抗VEGFまたは抗PlGF抗体(例えば、モノクローナル抗体)の投与により達成されうる。例えば、U.S.P.N. 6,884,879に記載されているような、抗VEGF抗体が、本発明の処置方法に用いられうる。他の有用な抗VEGF抗体はベバシツマブ(bevacizumab)(Avastin, Genentech, South San Francisco, Calif.)を含む。VEGFおよびPlGF抗体はまた、R & D Systems, Minneapolis, Minnから入手できる。他のVEGF抗体は、HuMV833, 2C3(Peregrine Pharmaceuticals, Tustin, Calif.)およびVEGF-trap(Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, N.Y.)を含む。
炎症応答(例えば、敗血症、重度敗血症、または敗血症性ショック)を処置するためのもう一つのアプローチは、VEGFまたはPlGFの受容体を特異的に結合する阻害性化合物(例えば、抗体)で被験体を処置することによりうる。VEGF受容体は、VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)、VEGFR-3、およびニューロピリン-1を含む;PlGF受容体はVEGFR-1(Flt-1)およびニューロピリン-1を含む。そのような抗体は当技術分野において公知である(例えば、Flk-1およびFlt-1を特異的に結合する抗体(R&D Systems);2C7、ヒト化抗VEGFR-2モノクローナル抗体)、または当技術分野において標準の方法を用いて作製され、VEGFもしくはPlGF受容体(例えば、本明細書に記載されたもの)を直接的にかもしくは間接的にかのいずれかで結合するそれらの能力について試験されうる。これらの抗体は、それらをヒト投与にとってより適切にするように何らか改変されうる。例えば、それらは一本鎖抗体またはヒト化抗体でありうる。この場合もやはり、これらの抗体は、任意の経路、剤形、頻度により、または炎症応答の処置に十分なインビボ濃度を達成する任意の用量で、投与される。上記のように、処置のための抗体は、同様に当技術分野において標準の方法により作製されうる。
VEGFまたはVEGF活性を阻害する任意の化合物もまた、本発明の処置方法に有用である。VEGFを阻害するピリジン誘導体および類似体は、例えば、U.S.P.N. 6,706,731に記載されている。VEGFに高親和性で結合するオリゴヌクレオチドは、例えば、U.S.P.N. 6,696,252に記載されている。VEGF受容体阻害剤として働く2-アミノ-ニコチンアミド誘導体は、例えば、U.S.P.N. 6,624,174および6,878,714に記載されている。VEGF活性を阻害するペプチドは、米国特許第6,559,126号、第5,861,484号、第6,383,486号、第6,100,071号、第6,270,993号、第6,777,534号に記載されている。
sFlt-1もしくはPlGF発現または活性における増加、またはVEGFもしくはPlGF発現または活性における減少はまた、被験体への遺伝子ベクターの導入を通して達成されうる。VEGFのような内皮細胞分裂促進因子を血管傷害の部位へ発現する能力がある核酸(DNAまたはRNA)の送達が、傷害された血管の増殖および再内皮化を誘導する。本発明は血管傷害に関連しておらず、VEGFレベルを低下させようと努力しているが、これらの研究に用いられるsFlt-1およびPlGFのような内皮細胞分裂促進因子をコードする核酸の送達のための技術はまた、本発明に用いられうる。これらの技術は、米国特許第5,830,879号および第6,258,787号に記載されており、参照により本明細書に組み入れられている。
1)本明細書に記載された処置方法(例えば、化合物および核酸で処置することであって、化合物はVEGFを阻害し、核酸はsFlt-1発現を増加させる)の2つもしくはそれ以上を組み合わせること、または2)本明細書に記載された処置方法を炎症応答についての既存の処置と共に用いることにより、行われうる併用療法もまた、本発明により提供される。既存の処置方法は、抗菌剤(例えば、ペニシリン、アンピシリン、バシトラシン、カルバペネム、セファロスポリン、メチシリン、オキサシリン、バンコマイシンのような広域抗生物質)、流体、昇圧剤、コルチコステロイド、活性化プロテインC(Xigris, Eli Lily and Co.)の投与、および糖とインスリン投与;機械的人工換気;透析;ならびに鎮静を含む。
本明細書に記載された(例えば、VEGF抗体およびsFlt-1)、または本発明の方法を用いて同定された任意の化合物の投与は、炎症応答を処置する化合物の濃度を結果として生じる任意の適した手段によりうる。化合物は、任意の適した担体物質に任意の適切な量で含まれることができ、一般的に、組成物の総重量の重量で1〜95%の量で存在する。組成物は、経口、非経口(例えば、静脈内にまたは筋肉内に)、直腸、皮膚的(cutaneous)、鼻、膣、吸入、皮膚(skin)(パッチ)、眼、または頭蓋内投与経路に適している剤形で供給されうる。従って、組成物は、例えば、錠剤、カプセル、丸薬、粉末、顆粒、懸濁液、乳濁液、溶液、ヒドロゲルを含むゲル、ペースト、軟膏、クリーム、硬膏剤、水薬、浸透圧送達装置、坐剤、浣腸剤、注射可能物質、インプラント、スプレー、またはエアゾールの形をとりうる。通常の薬務に従って製剤化されうる(例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000, ed. A.R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, およびEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J.C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York参照)。
本明細書に記載された、または本発明の方法を用いて同定された化合物を含む組成物は、通常の非毒性の薬学的に許容される担体および補助剤を含む、剤形、製剤における、または適した送達装置もしくはインプラントを介しての、注射、注入、または埋め込み(皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内など)により非経口に投与されうる。そのような組成物の製剤および調製は、製剤分野の業者にとって周知である。
徐放性非経口組成物は、水性懸濁液、ミクロスフェア、マイクロカプセル、磁性ミクロスフェア、油溶液、油懸濁液、乳濁液の形をとりうる。組成物はまた、生体適合性担体、リポソーム、ナノ粒子、インプラント、または注入装置に組み入れられうる。
経口使用のための製剤は、非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物において活性成分を含む錠剤を含み、そのような製剤は当業者に公知である(例えば、参照により本明細書に組み入れられている、U.S.P.N.: 5,817,307, 5,824,300, 5,830,456, 5,846,526, 5,882,640, 5,910,304, 6,036,949, 6,036,949, 6,372,218)。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤または増量剤(例えば、スクロース、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶性セルロース、ジャガイモデンプンを含むデンプン、炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム);造粒剤および崩壊剤(例えば、微結晶性セルロースを含むセルロース誘導体、ジャガイモデンプンを含むデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギナート、またはアルギン酸);結合剤(例えば、スクロース、グルコース、ソルビトール、アラビアゴム、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、α化デンプン、微結晶性セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、またはポリエチレングリコール);ならびに、平滑剤、流動促進剤、および付着防止剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油、またはタルク)でありうる。他の薬学的に許容される賦形剤は、着色料、着香料、可塑剤、保湿剤、緩衝剤などでありうる。
経口使用のための徐放性組成物は、例えば、化合物の溶解および/または拡散を制御することにより化合物を放出するように構築されうる。
本明細書に記載された、または本明細書に記載された方法を用いて同定された、任意の化合物の用量は、以下を含むいくつかの因子に依存する:投与方法、処置されるべき炎症応答、炎症応答の重症度、炎症応答が処置されることになっているのかまたは予防されることになっているのか、ならびに処置されるべき被験体の年齢、体重、および健康状態。
以下の方法および材料は上記の実験を行うために用いられた。
LPS注入、CLP、および肺炎モデルは、雄8週齢のC57BL/6(22〜24グラム体重)において行われた。内毒血症モデルについて、マウスに、通常の生理食塩水(対照)、または大腸菌(Escherichia coli)血清型0111:B4(Sigma, St. Louis, MO)由来のLPS(18mg/kg体重)を腹腔内(IP)注射した。指示された所に、LPSは、TNF受容体1(TNFR1)、TNFR2、およびI型IL-1受容体(IL1RI)についてヌルの三重突然変異体(TM)マウス、または一致したC57BL/6x129/Svバックグランドにおける野生型(WT)へ投与された。TMマウスを、特定病原体未感染の条件下で完全バリア施設に維持した(Mizgerd et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 286:L1302-1310)。CLPは、わずかな改変を加えて以前に記載されているように行われた(Rice et al., J Infect Dis 191:1368-1376, 2005)。簡単には、マウスをイソフルオランで麻酔した。腹部を剪毛した後、2cm正中切開を無菌状態下で作り、盲腸および隣接する腸を露出させた。盲腸の約25〜30%を、4-0vicyrl縫合糸で回盲弁に対して末梢側を結紮し、その後、21ゲージ針で穿刺した。盲腸をその後、せん孔部位の開通性を保証するために、優しく絞って、少量の糞便を押し出し、腹膜腔へ戻した。マウスは、閉鎖の時点に輸液蘇生法として1mlの生理食塩水をIPに、および苦痛を最小限にするために12時間おきに0.1mg/kgブプレノルフィンをSCに受けた。肺炎モデルについて、マウスを、塩酸ケタミン(100mg/kg)、マレイン酸アセプロマジン(5mg/kg IM)、およびアトロピン(0.1mg/kg IM)の筋肉内(IM)注射により麻酔した。気管を外科的に露出させ、大腸菌(American Type Culture Collection; Manassas, VAからの菌株19138)を、血管カテーテルを介して気管を通って左気管支へ106CFU/マウスで気管内に投与した。6時間または24時間後、マウスをハロタン吸入により屠殺した。
簡単には、被験体は、包括的スクリーニングを受け、彼らが、精神医学的、神経学的、免疫の、心臓血管の、もしくは睡眠の障害の現在または過去の病歴を有しない;最近の6ヶ月間、喫煙を含む薬物依存/乱用の履歴を有しない;正常な血液化学(完全かつ示差血液計数、T細胞サブセット、グルコース、クレアチニン、ナトリウム、カリウム、甲状腺刺激ホルモン)ならびに陰性血液および尿毒性を有する場合には、含まれた。被験体は、プラシーボかまたは2ng/kg大腸菌内毒素(O:113, Lot EC-5)での宿主応答攻撃のいずれかの静脈内注射を受けた。ヒト敗血症研究は、Research Ethics Board of the Hamilton Health Science (Henderson General Hospital, Hamilton, ON)により認可された。重度敗血症をもつ患者は、以前に記載されているように(Liaw et al., Blood 104:3958-3964, 2004)試験対象および除外基準を用いてHenderson General Hospital, St. Joseph's HealthcareおよびHamilton General Hospital(Hamilton, Ontario, Canada)の集中治療室において同定された。Xigrisを受けた患者は分析から除外された。人口学的情報、急性生理学および慢性健康状態評価(acute physiology and chronic health evaluation)(APACHE II)入院スコア、多臓器機能不全(MOD)スコア、共存症、臓器機能、感染の部位および型、ならびに血液学的検査を含む患者の基本特性が収集された(下記の表参照)。
TNF-αおよびIL-1は血清において測定された。IL-6、VEGF、およびPlGFは血漿において測定された。マウスから血漿を単離するために、血液試料を、心臓穿刺によりヘパリン化チューブへ収集し、遠心分離し、上清を血漿として取っておいた。マウス血清を得るために、血液試料を4℃で一晩インキュベートし、遠心分離し、上清を血清として取っておいた。ヒト内毒血症研究において、血液試料をEDTAチューブに定期的に採取し、2600gでの遠心分離の前に5分間、氷上に置き、その後、血漿をアリコートへピペッティングし、次のアッセイまで-80℃で保存した。重度敗血症をもつ患者において、血液を、重度敗血症の定義に合ってから24時間以内に収集した。血液を、最初の7日間、毎日、その後は、ICUでの患者の滞在の期間中、週に1回、収集した。静脈血(9mL)を、患者から留置カテーテルを介して採取した。対照として、静脈血(9mL)を健康な成人ボランティアから静脈穿刺により採取した。各患者またはボランティアについて、収集された血液の4.5mLを、すぐに0.5mL 0.105M緩衝クエン酸三ナトリウム(pH5.4)を含む15mLのポリプロピレンチューブへ移し、残りの4.5mLを、0.5mL 0.105M緩衝クエン酸三ナトリウム(pH5.4)および1MベンズアミジンHClの100μL(20mMベンズアミジン最終)を含む15mLのポリプロピレンチューブへ移した。血液を20℃で1500g、10分間、回転させ、血漿を-80℃でアリコートとして保存した。マウス臓器組織可溶化液を調製するために、マウスを、2mM EDTAを含むPBSで灌流した。臓器を摘出し、液体窒素中で急速凍結した。凍結組織を、50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、および0.05%プロテアーゼインヒビターカクテル(Sigma)を含む可溶化物緩衝液にホモジナイズし、その後、遠心分離して、上清(組織可溶化液)を得た。マウスsFlt-1、VEGF、TNF-α、IL-6、IL-1α、およびIL-1βを、Quantikine ELISAキット(R&D systems Inc.)を用いてアッセイした。マウスD-ダイマーを、Asserachrom DI-D、D-ダイマーの酵素イムノアッセイ(Diagnostica Stago, France)を用いて測定した。ヒト血漿PlGF、VEGF-Aを、ヒトPlGFおよびVEGF Quantikine ELISAキット(R&D Systems Inc, Minneapolis, MN)を用いて測定した。クエン酸/ベンズアミジン血漿試料を、以前に記載された(Liaw et al., J Thromb Haemost 1:662-670, 2003)方法を用いるAPCアッセイに用いた。
マウスに、Ad過剰発現GFP(対照、2x108pfu)、マウスsFlt-1(1x108pfu)、マウスVEGF-A(アイソフォーム120)(2x108pfu)、またはマウスPlGF-2(2x108pfu)を静脈注射した。これらのウイルスの構築は、以前に記載されている(H.A. von Recum et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:4605-4610, 2001; Maynard et al., J Clin Invest 111:649-658, 2003; Luttun et al., Nat Med 8:831-840, 2002)。Ad-sFlt-1、Ad-VEGF、およびAd-PlGFの用量を漸増して、約10〜25ng/mlの血漿中レベルを達成した。マウスsFlt-1、VEGF、およびPlGFを測定する市販のQuantakine ELISAキット(R&D Systems Inc)は、マウス血漿由来のこれらのサイトカインの循環レベルをアッセイするために用いられた。
LPS投与の16時間前に、マウスに、800μg抗マウスFlk-1抗体(DC101)、1200μgの抗マウスFlt-1抗体(MF-1)、または対照PBSの注入をIP注射した。両方の抗体は、親切にもImClone Systems Incorporated(New York, NY)により提供された。
マウスに、1μgのヒト組換え可溶性Flt-1ドメインD1〜3(Cell Sciences, Inc, Canton, MA)または等容量PBS(対照)を、LPS投与またはCLPから1時間後に始めて12時間、3時間ごとに静脈注射した。
マウスの心エコー検査は以前に記載されているように(McMullen et al., Proc Natl Acad Sci USA 100:12355-12360, 2003; Shioi et al., EMBO J 19:2537-2548, 2000)行われた。簡単には、マウスをケタミンHCl(50mg/kg)およびキシラジン(10mg/kg)のIP注射で麻酔した。12MHzトランスデューサを備えたHewlett-Packard(Andover, MA)Sonos 1500セクタースキャナーは、左室(LV)壁厚さ、LV容積、および左室内径短縮率を評価するために2次元誘導M様式トレーシングを記録するために用いられる。心電図(ECG)の記録は、麻酔されたマウスにおいて多チャンネル増幅器で得られ、分析のためにデジタルシグナルへ変換された(PowerLab system; ADInstruments, Colorado Springs, CO)。
マウスを、0.5ml AvertinのIP注射により麻酔した。1% Evans青色色素(PBS中)の100μlを尾静脈へ注射した。40分後、マウスを、2mM EDTAを含むPBSで心臓穿刺を介して20分間、灌流した。臓器(脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓)を採取し、Evans青色色素を溶出するために3日間、ホルムアミド中でインキュベートした。ホルムアミド溶液のODは620nm波長を用いて測定された。
組織RNAを、Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA)およびRNAミニ調製キット(Qiagen, Germany)を用いて単離した。定量的リアルタイムPCRについて、全RNAを、DNアーゼI処置を含むRNeasy RNA抽出キットを用いて、製造会社の使用説明書に従って(Qiagen, Germany)、調製した。cDNAを生成するために、三連の試料のそれぞれからの全RNA(100ng)を混合し、ランダムプライマーおよびSuperscript III逆転写酵素(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてcDNAへ変換した。すべてのcDNA試料を等分し、-80℃で保存した。プライマーを、Primer Expressオリゴデザインソフトウェア(Applied BioSystems, Foster City, CA)を用いて設計し、Integrated DNA Technologies(Coralville, IA)により合成した。すべてのプライマーセットは、偽遺伝子または関連遺伝子内の相同ドメインに対する潜在的な相克的転写産物一致を同定するために厳密なデータベース検索に供した。プライマーセットから産生された単位複製配列を、Applied BioSystemsにより供給された一次導関数プライマー融解曲線ソフトウェアを用いて融点温度について分析した。SYBR Green IアッセイおよびABI Prism 7500配列検出システムが、マスター鋳型を用いて逆転写されたcDNA試料からのリアルタイムPCR産物を検出するために用いられた。各試料についてのPCR反応は、二連で行われ、コピー数は以前に記載されているように測定された。標的遺伝子発現のレベルは、各試料において18S rRNAに対して標準化され、データは、106個の18S rRNAコピーあたりのmRNAコピーとして提示された。
免疫組織化学法は、以前に記載されているように、対照およびLPS処理されたマウスの心臓、脳、ならびに肺からの5μm凍結切片で行われた。抗体は、ウサギポリクローナル抗マウスP-セレクチン抗体(Chemicon International, Temecula, CA)、ウサギポリクローナル抗マウスPAI-1抗体(Innovative Research Inc., Southfield, MI)、ウサギポリクローナル抗マウスCox-2抗体(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI)、ラットモノクローナル抗マウスE-セレクチン抗体(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)、ラットモノクローナル抗マウスVCAM-1抗体(Chemicon International)、およびラットモノクローナル抗マウスICAM-1抗体(Serotec Ltd, Oxford, UK)を含んだ。FITCと結合した抗ラットIgG抗体およびCysと結合した抗ウサギIgG抗体(ZYMED Laboratories, South San Francisco, CA)は二次抗体として用いられた。共局在化研究について、ラットモノクローナル抗マウスCD31抗体(BD Biosciences Pharmingen)が、ウサギポリクローナル抗体(P-セレクチン、PAI-1、およびCox-2)との二重免疫蛍光染色に用いられた;ウサギポリクローナル抗マウスvWF抗体(Abcam Inc, Cambridge, MA)は、ラットモノクローナル抗マウス抗体(E-セレクチン、VCAM-1、およびICAM-1)と組み合わせられた。
HUVECはEGM培地(Cambrex Bio Science, Walkersville, MD)において培養された。いったん細胞が70%集密に達したならば、それらを、0.5%FBS EGMにおいて20時間、血清飢餓にさせ、その後、0.1ng/ml TNF-α、100ng/ml VEGF、および200ng/ml PlGFの単独または組み合わせて、4時間、インキュベートした。細胞をRNAのために収集し、上記のように、処理した。
LPS注入またはCLPの3日前に、C57BL/6雄マウスは、対照(GFP)-アデノウイルス、sFlt-1アデノウイルス、PlGFアデノウイルス、および/またはVEGF-Aアデノウイルスで処置された。または、動物は、上記のような抗Flk-1抗体、抗Flt-1抗体、またはsFlt-1ペプチドを受けた。生存は、LPS注入(20mg/kg体重)またはCLP後24時間目、48時間目、72時間目、および96時間目に評価された。
スチューデントt検定が、マウスサイトカインおよび遺伝子発現研究における統計学的解析のために用いられた。ANOVAは、心臓生理学データの統計学的解析のために用いられた。一般的線形モデル(GLM)反復測定が、ヒト被験体群間(プラシーボ対内毒血症)の差を評価するために用いられた。自由度のグリーンハウス・ガイザー補正は、適切な場合には、適用された。有意な条件または相互作用効果の場合、単純対比が、どの時点がお互いに有意に異なるかを特定するために用いられた。生存データは、カプラン・マイヤープロットの構築およびログランク検定の使用により解析された。
Claims (74)
- 検査被験体から単離された試料におけるsFlt-1発現または活性のレベルを分析する段階を含む、該検査被験体において炎症応答を診断する方法であって、非罹患被験体に見出されるレベルと比較した、該試料におけるsFlt-1発現または活性の増加したレベルが、該検査被験体が該炎症応答を有することを示す、方法。
- VEGF、PlGF、TNF-α、IL-6、D-ダイマー、E-セレクチン、P-セレクチン、ICAM-1、VCAM-1、Cox-2、またはPAI-1の少なくとも1つのレベルを分析する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 被験体がヒトである、請求項1記載の方法。
- 診断される炎症応答が重度敗血症または敗血症性ショックである、請求項1記載の方法。
- 以下の段階を含む、炎症応答をもつ被験体を処置するのに有用な候補化合物を同定する方法:
(a)sFlt-1を化合物と接触させる段階;および
(b)該sFlt-1の活性を測定する段階であって、該化合物の非存在下におけるsFlt-1活性と比較した、該化合物の存在下におけるsFlt-1活性の増加が、炎症応答をもつ被験体を処置するための候補化合物であると該化合物を同定する、段階。 - 測定段階(b)が、VEGFまたはPlGFの少なくとも1つのsFlt-1への結合を測定する段階を含む、請求項5記載の方法。
- 化合物が化学ライブラリーから選択される、請求項5記載の方法。
- 以下の段階を含む、炎症応答をもつ被験体を処置するのに有用な候補化合物を同定する方法:
(a)sFlt-1をコードするポリヌクレオチドを含む細胞または細胞抽出物を化合物と接触させる段階;および
(b)該細胞または細胞抽出物におけるsFlt-1発現のレベルを測定する段階であって、該化合物の非存在下におけるレベルと比較した、該化合物の存在下におけるsFlt-1発現の増加したレベルが、炎症応答をもつ被験体を処置するための候補化合物であると該化合物を同定する、段階。 - 細胞が哺乳動物中の細胞である、請求項8記載の方法。
- 接触段階(a)の前に哺乳動物にリポ多糖を投与する段階をさらに含む、請求項9記載の方法。
- 化合物が化学ライブラリーから選択される、請求項8記載の方法。
- sFlt-1発現または活性を増加させる組成物の治療的有効量を該被験体に投与する段階を含む、炎症応答をもつ被験体を処置する方法。
- 組成物がsFlt-1を含む、請求項12記載の方法。
- 抗菌剤、流体、昇圧剤、コルチコステロイド、活性化プロテインC、インスリンと共のグルコース、機械的人工換気、腎代替療法(renal replacement therapy)、および鎮静からなる群より選択される処置を施す段階をさらに含む、請求項12記載の方法。
- 被験体がヒトである、請求項12記載の方法。
- 炎症応答が重度敗血症または敗血症性ショックである、請求項12記載の方法。
- 検査被験体から単離された試料におけるPlGF発現または活性のレベルを分析する段階を含む、該検査被験体において炎症応答を診断する方法であって、非罹患被験体におけるレベルと比較した、該試料におけるPlGF発現または活性のレベルの変化が、該検査被験体が該炎症応答を有することを示す、方法。
- VEGF、PlGF、TNF-α、IL-6、D-ダイマー、E-セレクチン、P-セレクチン、ICAM-1、VCAM-1、Cox-2、またはPAI-1の少なくとも1つのレベルを分析する段階をさらに含む、請求項17記載の方法。
- 被験体がヒトである、請求項17記載の方法。
- 診断される炎症応答が重度敗血症または敗血症性ショックである、請求項17記載の方法。
- 変化が増加である、請求項17記載の方法。
- 変化が減少である、請求項17記載の方法。
- 以下の段階を含む、炎症応答をもつ被験体を処置するのに有用な候補化合物を同定する方法:
(a)PlGFを化合物と接触させる段階;および
(b)該PlGFの活性を測定する段階であって、該化合物の非存在下におけるPlGF活性と比較した、該化合物の存在下におけるPlGF活性の変化が、炎症応答をもつ被験体を処置するための候補化合物であると該化合物を同定する、段階。 - 化合物が化学ライブラリーから選択される、請求項23記載の方法。
- 変化が増加である、請求項23記載の方法。
- 変化が減少である、請求項23記載の方法。
- 以下の段階を含む、炎症応答をもつ被験体を処置するのに有用な候補化合物を同定する方法:
(a)PlGFをコードするポリヌクレオチドを含む細胞または細胞抽出物を化合物と接触させる段階;および
(b)該細胞または細胞抽出物におけるPlGF発現のレベルを測定する段階であって、該化合物の非存在下におけるレベルと比較した、該化合物の存在下におけるPlGF発現のレベルの変化が、炎症応答をもつ被験体を処置するための候補化合物であると該化合物を同定する、段階。 - 細胞が哺乳動物中の細胞である、請求項27記載の方法。
- 接触段階(a)の前に哺乳動物へリポ多糖を投与する段階をさらに含む、請求項28記載の方法。
- 化合物が化学ライブラリーから選択される、請求項27記載の方法。
- 変化が増加である、請求項27記載の方法。
- 変化が減少である、請求項27記載の方法。
- 以下の段階を含む、炎症応答をもつ被験体を処置するための候補化合物を同定する方法:
(a)PlGF受容体またはそのPlGF結合断片を化合物と接触させる段階;および
(b)該化合物の該受容体への結合を測定する段階であって、該化合物の該PlGF受容体またはその該断片への特異的結合が、該化合物が炎症応答をもつ被験体を処置するための候補化合物であることを示す、段階。 - PlGF受容体がニューロピリン-1もしくはVEGFR-1、またはそれらの断片である、請求項33記載の方法。
- 化合物が化学ライブラリーから選択される、請求項33記載の方法。
- PlGFの発現または活性を変化させる組成物の治療的有効量を該被験体に投与する段階を含む、炎症応答をもつ被験体を処置する方法。
- 組成物がPlGFを含む、請求項36記載の方法。
- 組成物が、PlGFをコードする核酸、またはPlGF活性をもつその断片を含む、請求項36記載の方法。
- 被験体がヒトである、請求項36記載の方法。
- 組成物が、PlGFを特異的に結合する抗体、またはそのPlGF結合断片を含む、請求項36記載の方法。
- 組成物が、PlGFタンパク質をコードするmRNAに干渉するRNAを含む、請求項36記載の方法。
- 変化させることが増加させることである、請求項36記載の方法。
- 変化させることが減少させることである、請求項36記載の方法。
- 抗菌剤、流体、昇圧剤、コルチコステロイド、活性化プロテインC、インスリンと共のグルコース、機械的人工換気、腎代替療法、および鎮静からなる群より選択される処置を施す段階をさらに含む、請求項36記載の方法。
- 炎症応答が重度敗血症または敗血症性ショックである、請求項36記載の方法。
- PlGF受容体の発現または活性を変化させる組成物の治療的有効量を該被験体に投与する段階を含む、炎症応答をもつ被験体を処置する方法。
- PlGF受容体がニューロピリン-1またはVEGFR-1である、請求項46記載の方法。
- 抗菌剤、流体、昇圧剤、コルチコステロイド、活性化プロテインC、インスリンと共のグルコース、機械的人工換気、腎代替療法、および鎮静からなる群より選択される処置を施す段階をさらに含む、請求項46記載の方法。
- 被験体がヒトである、請求項46記載の方法。
- 変化させることが増加させることである、請求項46記載の方法。
- 変化させることが減少させることである、請求項46記載の方法。
- 検査被験体から単離された試料におけるVEGF発現または活性のレベルを分析する段階を含む、該検査被験体において炎症応答を診断する方法であって、非罹患被験体に見出されるレベルと比較した、該試料におけるVEGF発現または活性の増加したレベルが、該検査被験体が炎症応答を有することを示す、方法。
- PlGF、sFlt-1、TNF-α、IL-6、D-ダイマー、E-セレクチン、P-セレクチン、ICAM-1、VCAM-1、Cox-2、またはPAI-1の少なくとも1つのレベルを分析する段階をさらに含む、請求項52記載の方法。
- 被験体がヒトである、請求項52記載の方法。
- 診断される炎症応答が重度敗血症または敗血症性ショックである、請求項52記載の方法。
- 以下の段階を含む、炎症応答をもつ被験体を処置するのに有用な候補化合物を同定する方法:
(a)VEGFを化合物と接触させる段階;および
(b)該VEGFの活性を測定する段階であって、該化合物の非存在下におけるVEGF活性と比較した、該化合物の存在下におけるVEGF活性の減少が、炎症応答をもつ被験体を処置するための候補化合物であると該化合物を同定する、段階。 - 化合物が化学ライブラリーから選択される、請求項56記載の方法。
- 以下の段階を含む、炎症応答をもつ被験体を処置するのに有用な候補化合物を同定する方法:
(a)VEGFをコードするポリヌクレオチドを含む細胞または細胞抽出物を化合物と接触させる段階;および
(b)該細胞または細胞抽出物におけるVEGF発現のレベルを測定する段階であって、該化合物の非存在下におけるレベルと比較した、該化合物の存在下におけるVEGF発現の減少したレベルが、炎症応答をもつ被験体を処置するための候補化合物であると該化合物を同定する、段階。 - 細胞が哺乳動物中の細胞である、請求項58記載の方法。
- 接触段階(a)の前に哺乳動物へリポ多糖を投与する段階をさらに含む、請求項59記載の方法。
- 化合物が化学ライブラリーから選択される、請求項58記載の方法。
- 以下の段階を含む、炎症応答をもつ被験体を処置するための候補化合物を同定する方法:
(a)VEGF受容体またはそのVEGF結合断片を化合物と接触させる段階;および
(b)該化合物の該受容体への結合を測定する段階であって、該化合物の該VEGF受容体またはその該断片への特異的結合が、該化合物が炎症応答をもつ被験体を処置するための候補化合物であることを示す、段階。 - VEGF受容体が、ニューロピリン-1、VEGFR-1、VEGFR-2、またはそれらの断片である、請求項62記載の方法。
- 化合物が化学ライブラリーから選択される、請求項62記載の方法。
- VEGFの発現または活性を減少させる組成物の治療的有効量を該被験体に投与する段階を含む、炎症応答をもつ被験体を処置する方法。
- 被験体がヒトである、請求項65記載の方法。
- 組成物が、VEGFを特異的に結合する抗体、またはそのVEGF結合断片を含む、請求項65記載の方法。
- 組成物が、VEGFをコードするmRNAに干渉するRNAを含む、請求項65記載の方法。
- 抗菌剤、流体、昇圧剤、コルチコステロイド、活性化プロテインC、インスリンと共のグルコース、機械的人工換気、腎代替療法、および鎮静からなる群より選択される処置を施す段階をさらに含む、請求項65記載の方法。
- 炎症応答が重度敗血症または敗血症性ショックである、請求項65記載の方法。
- VEGF受容体の発現または活性を減少させる組成物の治療的有効量を該被験体に投与する段階を含む、炎症応答をもつ被験体を処置する方法。
- VEGF受容体が、ニューロピリン-1、VEGFR-1、またはVEGFR-2である、請求項71記載の方法。
- 被験体がヒトである、請求項71記載の方法。
- 抗菌剤、流体、昇圧剤、コルチコステロイド、活性化プロテインC、インスリンと共のグルコース、機械的人工換気、腎代替療法、および鎮静からなる群より選択される処置を施す段階をさらに含む、請求項71記載の方法。
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