CN114058692A - circ_RELB作为分子标记物在制备诊断糖尿病视网膜病变血管新生产品上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了circ_RELB作为分子标记物在制备诊断糖尿病视网膜病变血管新生产品上的应用，属于分子生物学领域。本发明通过研究circ_RELB对DR血管新生中的作用，circ_RELB/miR‑7‑5p/RELB在DR新生血管中的作用以及eIF4A3结合circ_RELB影响DR血管新生的作用，发现，可以将circ_RELB作为诊断糖尿病视网膜病变血管新生的分子标记物，为阻遏DR新生血管的临床应用提供新思路，具有重要的转化价值。

Description

circ_RELB作为分子标记物在制备诊断糖尿病视网膜病变血 管新生产品上的应用

技术领域

本发明涉及circ_RELB作为分子标记物在制备诊断糖尿病视网膜病变血管新生产品上的应用，属于分子生物学领域。

背景技术

糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)是糖尿病性微血管病变中最严重的并发症之一，已成为当前全球重要的致盲眼病。DR的发病主要是微血管病变，表现为视网膜微动脉瘤的形成，视网膜出血、渗出、视网膜新生血管形成、玻璃体积血及玻璃体视网膜增殖，最终可导致患者视功能不可逆的丧失。新生血管的产生是增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative Diabetic Retinopathy,PDR)的标志，也是影响视力预后的重要原因。临床上主要通过全视网膜光凝术(panretinal photocoa gulation,PRP)及眼部注射干预血管新生相关分子(靶点)药物达到缓解DR病程的作用，但尚缺乏有效控制DR发生发展的治疗方法。由于DR发病机制受多种基因和信号通路的调节，因此至今尚未完全阐明。已有研究表明，高血糖引起的基因调控失衡，导致视网膜微血管内皮细胞(Retinal microvascularendothelial cells，RMECs)功能障碍是诱导DR视网膜新生血管的产生的重要原因。因此，深入探讨高血糖环境诱导RMECs功能障碍的关键新分子(靶点)，将对有效控制DR新生血管的产生提供新的应用方向。

近年来环状RNA在人类疾病中对下游基因的调控已经得到极大的关注。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类被鉴定和分类的新的调控型非编码RNA，主要由外显子和(或)内含子构成，由前体mRNAs剪接形成的单链RNA，广泛表达于哺乳动物组织中并通过MRE(miRNA应答元件)作为microRNA(miRNA，另一类22nt左右的非编码RNA)的海绵(sponge)或者结合蛋白发挥功能，其中circRNA在血管新生中的发挥促进或者抑制作用的研究已有报导：如circRNA-MYLK吸附miR-29a调控VEGFA/VEGFR2信号通路和血管新生促进膀胱癌进展；在动脉粥样硬化中，circ_0003575参与氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的血管新生；在视网膜病变的研究中，circZNF609则通过吸附miR-615调控METRN表达发挥调控视网膜神经胶质细胞增殖的作用，另外circZNF609同样可吸附miR-615-5p并上调MEF2A的表达从而起到抑制血管形成的作用。因此，circRNAs可作为鉴定疾病机制和开发用于精确诊断和有效治疗DR的新方法的关键生物学标记。此外，环状RNA还可以充当RNA结合蛋白螯合剂或核转录调节剂来调节基因表达。研究表明CircRNA源自其母基因，可能与其母基因具有调节关系。

NF-κB(核因子激活的B细胞的κ-轻链增强)是一种蛋白质复合物，其控制转录的DNA，细胞因子产生和细胞存活。NF-κB几乎存在于所有动物细胞类型中，并参与细胞对刺激的反应，如应激，细胞因子等。有研究表明高糖环境可激活核因子κB(NF-κB)并促进细胞凋亡，它在糖尿病的血管并发症中起着重要作用。在糖尿病相关的血管并发症中，NF-κB明显增加，并且是其靶基因转录激活所必需的。在对非增殖性及增殖性糖尿病视网膜病变患者进行研究中发现，在增殖性糖尿病视网膜病变患者中NF-κB和VEGFA明显上调，这表明NF-κB参与糖尿病视网膜血管新生的病理过程。NF-kB家族有5个成员，包括NF-kB1(p50)、NF-kB2(p52)、RelA(p65)、RelB和c-Rel，通常所说的NF-kB蛋白，是指p65/p50亚单位形成的NF-KB1二聚体蛋白，以及RelB/p52亚单位形成NF-kB2二聚体蛋白。

本项目拟将circ_RELB作为DR新生血管生成中的分子标记物，并为阻遏DR新生血管的临床应用提供新思路，具有重要的转化价值。

发明内容

在前期研究中，高糖调节下RMECs的全转录组测序结果中发现circ_RELB明显上调，表现出最高的倍数变化(图1)。因此，本发明选择它作为研究对象。RELB作为circ_RELB的母基因。为了分析它们的潜在作用，本发明进一步检测了RELB和circ_RELB在DR患者和正常样品中的表达水平。DR组织和细胞系中RELB和circ_RELB的都明显上调(图1)。这些结果提示circRNA可能与其母基因相互作用，在转录水平调控母基因表达中发挥关键作用。

由于本发明研究的对象RELB是NFκB的亚基，发明人推测在高糖条件下，circ_RELB被诱导高表达，进而转录活化RELB表达，激活NFκB通路和上调VEGFA，促进血管生成。本发明通过CircInteractome(https://circinteractome.nia.nih.gov/)数据库对circ_RELB可能结合的miRNA进行预测，circ_RELB含有miR-7-5p的MRE，而RELB为miR-7-5p的靶基因。因此circ_RELB可能通过吸附miR-7-5p促进RELB mRNA表达。

综合以上前期研究工作和文献报道，高糖导致circ_RELB表达上调，circ_RELB通过转录上调NFKB通路亚基RELB表达，活化NFKB通路(RELB是NFKB的关键亚基之一)，上调促血管生成因子(VEGFA)，最终导致糖尿病视网膜病变血管新生。

本发明提供了circ_RELB作为分子标记物在制备诊断糖尿病视网膜病变血管新生产品上的应用。

进一步地，所述circ_RELB在糖尿病视网膜病变血管新生过程中表达上调。

进一步地，所述产品包括检测个体患有糖尿病视网膜病变的试剂盒。

本发明还提供了包含circ_RELB作为分子标记物的药剂或试剂盒。

进一步地，所述药剂或试剂盒用于检测个体患有糖尿病视网膜病变。

本发明方法取得的有益效果：circ_RELB可作为DR发病中的分子标记物，有利于检测个体患有糖尿病视网膜病变。

附图说明

图1RNA序列分析结果：(A)火山图显示HG和LG环境之间的失调循环。蓝色点(最右侧)代表HG组中显著上调的CircRNA，紫色点(最左侧)代表HG组中显著下调的CircRNA。(B)散点图显示HG和LG组之间circRNA表达的变化。X轴和Y轴上的值表示标准化的circRNA信号值(log2标度)。红点(上方虚线上方)是上调的CircRNA，绿点(下方虚线下方)是下调的CircRNA。(C)样本间相关性热图显示HG组和LG组之间的差异circRNA表达水平。皮尔逊的相关系数以色阶表示。强度从蓝色(相关性相对较低)增加到红色(相关性相对较高)。通过显著差异circRNA表达水平的Pearson相关系数评估相关性，可见HG组中circ_0008590的表达水平显著升高。(D)在HG或LG环境中培养的HREC中检测到circ_0008590/RELB mRNA和miR-1243的表达水平。(E)在NPDR患者(n＝20)、PDR患者(n＝22)和正常对照组(n＝20)的房水样本中检测到circ_0008590/RELB mRNA和miR-1243的表达水平*P<0.05，**P<0.01。构建逻辑回归模型和ROC曲线：circ_0008590(正常与NPDR和正常与PDR)的AUC分别为0.900和0.998，RELB mRNA(正常与NPDR和正常与PDR)的AUC分别为0.914和1.000，miR-1243(正常与NPDR和正常与PDR)的AUC分别为0.061和0.979。

图2RELB影响HREC的增殖、凋亡和迁移，其中，(A)CCK-8分析显示RELB基因敲除抑制了HREC的增殖。(B)流式细胞术分析显示，转染siRELB后，hRECs中的凋亡显著增加。(C)如Transwell分析所示，RELB的敲除抑制了HREC的迁移。(D)和(E)siRELB转染减少了伤口愈合过程。(F)和(G)siRELB减少了管的形成过程。误差条表示至少三次试验的平均值±SD*p<0.05，**p<0.01。(H)RELB、p100、p52、Bax和Bcl-2蛋白水平的Western印迹分析。转染siRELB后，RELB蛋白水平降低，p100蛋白水平升高，p52蛋白水平降低；对于典型凋亡途径中的蛋白质，Bcl-2降低，Bax水平升高。

图3DR小鼠模型中人RELB mRNA与miR-1243的相互作用，(A)伊文思蓝试验用于检测视网膜血管渗漏。(B)视网膜胰蛋白酶消化用于计数无细胞毛细血管、HREC和周细胞的数量(无细胞毛细血管用红色箭头标记，周细胞用蓝色箭头标记；标尺＝60μm)；(C)将视网膜超薄切片固定在四氧化锇中，嵌入环氧树脂中，并测量基底膜的厚度(基底膜用红色箭头标记；标尺＝10μm)；计算渗漏面积(D)、10个区域的脱细胞毛细血管数量(E)、1mm2(F)的HREC/周细胞比率以及10个区域的基底膜厚度(G)(3只小鼠，每组6只眼睛)。误差条表示至少三次试验的平均值±SD*p<0.05，**p<0.01。

图4RELB和miR-1243的相互抑制，其中，(A)qRT-PCR分析显示relbmrna的过度表达导致miR-1243的抑制，反之亦然；类似地，RELB mRNA的敲除导致miRNA-1243的上调，反之亦然。(B)CCK-8分析显示miR-1243模拟物抑制HREC的增殖，并且RELB的过度表达可以逆转这种现象。(C)和(D)miR-1243模拟物或siRELB转染显著增加了凋亡的HREC的比例，并且RELB的过度表达逆转了miR-1243的作用。此外，miR-1243显著抑制(E)迁移，(F)和(G)伤口愈合，以及(H)和(I)HREC中的管形成；然而，RELB的过度表达显著逆转了这些趋势。误差条表示至少三次试验的平均值±SD*p<0.05，**p<0.01。

图5Circ_0008590逆转miR-1243的作用，其中，(A)circ_0008590的过表达增加了RELB mRNA的水平并抑制了miR-1243的水平，而circ_0008590的敲除导致了RELB mRNA的减少和miR-1243的增加。miR-1243模拟物抑制RELB mRNA和circ_0008590的水平，而miR-1243抑制剂产生相反的效果。在(B)CCK-8、(C)和(D)FCM、(E)Transwell、(F)和(G)伤口愈合以及(H)和(I)试管形成试验中，敲除circ_0008590对HREC中的增殖、凋亡、迁移和试管形成具有与RELB mRNA相似的作用。此外，circ_0008590的过度表达也逆转了miR-1243模拟物对HREC的影响。误差条表示至少三次试验的平均值±SD*p<0.05，**p<0.01。

图6Circ_0008590和RELB mRNA 3′-UTR是miR-1243的靶点，(A)circ_0008590和miR-1243之间的结合区。(B)含有野生型(WT circ_0008590)或突变型circ_0008590(MUTcirc_0008590)序列的荧光素酶报告构建体分别与miR-1243模拟物或相应的阴性对照物共转染。(C)RELB mRNA 3'-UTR和miR-1243之间的结合区。(D)含有野生型(WT-RELB mRNA 3′-UTR)或突变型(MUT-RELB mRNA 3′-UTR)序列的荧光素酶报告构建物分别与miR-1243模拟物或相应的阴性对照物共转染。进行了三个独立的实验。误差条显示至少三次重复实验的平均值±SD*P<0.05，**P<0.01。

具体实施方式

实施例1

本发明首先通过基因芯片技术筛选出差异表达的circ_RELB，并在高糖和低糖环境下培养RMECs，检测其对细胞增殖、迁移和血管新生的影响，然后建立糖尿病大鼠(STZ)模型，在体内实验中验证circ_RELB对DR血管新生表型的影响。

①circRNA芯片筛选差异表达的circ_RELB

通过circRNA芯片表达分析，发明人筛选出正常组织和高糖组织中表达差异最明显(表达上调)的circRNA—circ_RELB；通过生物信息学分析、PCR分析和Sanger测序，检测circ_RELB结构；并通过RT-qPCR证明DR患者及正常人群眼内液中circ_RELB的表达水平(图1E)。

研究者在对高糖条件下，转录组学分析出高糖环境下高表达的基因，挑选出环状RNA-circ_RELB和RELB，高糖和低糖条件下，检测RNA-circ_RELB和RELB均高表达(图1A,1B)。通过生物信息学分析、PCR分析和Sanger测序可知，circ_RELB的基因序列图6A，其结构属于环状RNA。

②circ_RELB的基本特性及与DR相关性研究

circ_RELB在人、大鼠、小鼠等物种中的保守性分析；RACE扩增circ_RELB全长及分析其反式剪接位点、不同转录本circRNA的相对表达丰度；RNA FISH与细胞质核分离后qPCR确定circ_RELB在细胞内定位及分布比例；检测circ_RELB的在眼、肝脏、脑、心脏等组织以分布的特异性。临床收集DR患者，及其他视网膜疾病患者眼组织纤维膜和正常捐献眼检测circ_RELB，分析其表达量和疾病的相关性。

图1根据RNA序列分析：(A)火山图显示HG和LG环境之间的失调循环。蓝色点(最右侧)代表HG组中显著上调的CircRNA，紫色点(最左侧)代表HG组中显著下调的CircRNA。(B)散点图显示HG和LG组之间circRNA表达的变化。X轴和Y轴上的值表示标准化的circRNA信号值(log2标度)。红点(上方虚线上方)是上调的CircRNA，绿点(下方虚线下方)是下调的CircRNA。(C)样本间相关性热图显示HG组和LG组之间的差异circRNA表达水平。皮尔逊的相关系数以色阶表示。强度从蓝色(相关性相对较低)增加到红色(相关性相对较高)。通过显著差异circRNA表达水平的Pearson相关系数评估相关性，可见HG组中circ_0008590的表达水平显著升高。(D)在HG或LG环境中培养的HREC中检测到circ_0008590/RELB mRNA和miR-1243的表达水平。(E)在NPDR患者(n＝20)、PDR患者(n＝22)和正常对照组(n＝20)的房水样本中检测到circ_0008590/RELB mRNA和miR-1243的表达水平*P<0.05，**P<0.01。构建逻辑回归模型和ROC曲线：circ_0008590(正常与NPDR和正常与PDR)的AUC分别为0.900和0.998，RELB mRNA(正常与NPDR和正常与PDR)的AUC分别为0.914和1.000，miR-1243(正常与NPDR和正常与PDR)的AUC分别为0.061和0.979。

③RELB对RMECs细胞增殖、迁移和血管新生的影响

方法及实验条件设定采用研究者既往研究报道(Shao J et al.,Mol Vis.2016；22:1188-1197)。构建RELB过表达质粒和针对splice junction位点设计好siRNA后，经过RNase R处理、RT-qPCR检测表达和FISH实验验证过表达和敲低circ_RELB的效果符合预期，实验分组情况：RELB分组：对照组pcDNA3.1-GFP；沉默组RELBsiRNA。通过CCK8方法检测RMECs的增殖能力，通过划痕及transwell迁移小室实验，研究RMECs的迁移能力；通过Matrigel成管实验统计新生血管管腔形成的面积。

图2RELB影响HREC的增殖、凋亡和迁移，其中，(A)CCK-8分析显示RELB基因敲除抑制了HREC的增殖。(B)流式细胞术分析显示，转染siRELB后，hRECs中的凋亡显著增加。(C)如Transwell分析所示，RELB的敲除抑制了HREC的迁移。(D)和(E)siRELB转染减少了伤口愈合过程。(F)和(G)siRELB减少了管的形成过程。误差条表示至少三次试验的平均值±SD*p<0.05，**p<0.01。(H)RELB、p100、p52、Bax和Bcl-2蛋白水平的Western印迹分析。转染siRELB后，RELB蛋白水平降低，p100蛋白水平升高，p52蛋白水平降低；对于典型凋亡途径中的蛋白质，Bcl-2降低，Bax水平升高。

④circ_RELB对动物表型的影响：

⑴糖尿病大鼠模型的建立：采用研究者实验团队既往研究报道的方法(Man Wanget al.,Diabetologia 2019,62(2):335-348)即采用链脲霉素(Streptozotocin，STZ)腹腔内注射建立糖尿病大鼠动物模型。

⑵糖尿病大鼠玻璃体腔内注射：参考文献病毒合成(X-X Wang et al.,TranslPsychiatry.2017,7(9):e1228.)分别构建circ_RELB沉默或过表达的AAV腺相关病毒。采用文献(Kun et al.,Circulation.2017,136:1629-1642).方法对STZ大鼠进行玻璃体腔内注射，每只眼睛注射5μl。

⑶眼底评估及观察：饲养3个月开始观察眼底至6个月，通过Phoenix micron IV小动物活体视网膜显微成像系统拍照观察血管形态和出血情况、伊文思蓝(EB)，糖原染色(PAS)及HE染色进行形态观察，统计新生血管数量和面积。分别确定circ_RELB和RELB对STZ大鼠视网膜新生血管的影响。(结果见图3)

图3DR小鼠模型中人RELB mRNA与miR-1243的相互作用，(A)伊文思蓝试验用于检测视网膜血管渗漏。(B)视网膜胰蛋白酶消化用于计数无细胞毛细血管、HREC和周细胞的数量(无细胞毛细血管用红色箭头标记，周细胞用蓝色箭头标记；标尺＝60μm)；(C)将视网膜超薄切片固定在四氧化锇中，嵌入环氧树脂中，并测量基底膜的厚度(基底膜用红色箭头标记；标尺＝10μm)；计算渗漏面积(D)、10个区域的脱细胞毛细血管数量(E)、1mm2(F)的HREC/周细胞比率以及10个区域的基底膜厚度(G)(3只小鼠，每组6只眼睛)。误差条表示至少三次试验的平均值±SD*p<0.05，**p<0.01。

实施例2.circ_RELB/miR-1243/RELB在DR新生血管中的作用

circ_RELB的基本特性及与DR相关性研究，并对circ_RELB调控miR-7-5p和RELB进行初步探索，及通过荧光素酶报告基因及Rip验证circ_RELB调控miR-7-5p和RELB的直接结合。并体内外实验挽救实验证明三者之间的调控关系。

circ_RELB调控miR-1243和RELB的初步探索

⑴初步验证miR-1243下调RELB表达

通过qPCR检测高糖及对照组RMECs中miR-7-5p和RELB的表达水平和相关性；构建miR-1243过表达病毒或质粒，转染RMECs，通过qPCR分别检测miR-1243和RELB的表达情况。图4表明RELB和miR-1243的相互抑制。具体的，(A)qRT-PCR分析显示relbmrna的过度表达导致miR-1243的抑制，反之亦然；类似地，RELB mRNA的敲除导致miRNA-1243的上调，反之亦然。(B)CCK-8分析显示miR-1243模拟物抑制HREC的增殖，并且RELB的过度表达可以逆转这种现象。(C)(D)miR-1243模拟物或siRELB转染显著增加了凋亡的HREC的比例，并且RELB的过度表达逆转了miR-1243的作用。此外，miR-1243显著抑制(E)迁移，(F)和(G)伤口愈合，以及(H)和(I)HREC中的管形成；然而，RELB的过度表达显著逆转了这些趋势。误差条表示至少三次试验的平均值±SD*p<0.05，**p<0.01。

⑵circ_RELB对miR-1243的表达调控

高糖及对照组条件培养RMECs，circ_RELB基因沉默与过表达病毒或质粒转染RMECs，通过qPCR检测miR-1243和RELB在各组表达的表达水平，明确circ_RELB对miR-1243的表达的调控。图5Circ_0008590逆转miR-1243的作用，(A)circ_0008590的过表达增加了RELB mRNA的水平并抑制了miR-1243的水平，而circ_0008590的敲除导致了RELB mRNA的减少和miR-1243的增加。miR-1243模拟物抑制RELB mRNA和circ_0008590的水平，而miR-1243抑制剂产生相反的效果。在(B)CCK-8、(C)和(D)FCM、(E)Transwell、(F)和(G)伤口愈合以及(H)和(I)试管形成试验中，敲除circ_0008590对HREC中的增殖、凋亡、迁移和试管形成具有与RELB mRNA相似的作用。此外，circ_0008590的过度表达也逆转了miR-1243模拟物对HREC的影响。误差条表示至少三次试验的平均值±SD*p<0.05，**p<0.01。

circ_RELB调控miR-1243和RELB的直接验证

⑴验证miR-1243与RELB结合：合成荧光素酶报告基因质粒，实验分组：

A:阴性对照组；B:RELB野生序列组；C:RELB结合序列突变组；D:RELB结合序列缺失组；E:miRNA随机序列组。共转染RMECs后，通过荧光素酶报告基因检测试剂盒分别检测各组，通过检测各组RMECs中荧光强度明确miR-1243与RELB的结合和活性调控；由于miRNA与靶基因结合是通过Ago2蛋白介导的，我们将进一步通过Biotin miRNA pull-down和Ago2蛋白的RIP实验进一步验证miR-1243与RELB的结合。

⑵验证circ_RELB与miR-1243的结合和活性调控：通过CircInteractome数据库预测circ_RELB与miR-1243的结合位点，合成荧光素酶报告基因质粒，通过荧光素酶报告基因实验分别检测A:阴性对照组；B:circ_RELB野生序列组；C:circ_RELB结合序列突变组；D:circ_RELB结合序列缺失组；E:miRNA随机序列组，通过检测RMECs中荧光强度明确circ_RELB与miR-1243的具体结合和活性调控。高糖条件及对照条件培养RMECs，通过生物素标记circ_RELB的探针。RMECs过表达circ_RELB后用1％甲醛固定10分钟，裂解并超声处理。离心后，取50μl上清液预留，将剩余部分与circ_RELB特异性探针-链霉抗生物素蛋白dynabeads M-280混合物30℃下孵育过夜。第二天，洗涤M-280dynabeads探针-circRNAs混合物并与200μl裂解缓冲液和蛋白酶K一起温育，以逆转甲醛交联。最后向混合物中加入Trizol用于RNA抽提。

图6Circ_0008590和RELB mRNA 3′-UTR是miR-1243的靶点，(A)circ_0008590和miR-1243之间的结合区。(B)含有野生型(WT circ_0008590)或突变型circ_0008590(MUTcirc_0008590)序列的荧光素酶报告构建体分别与miR-1243模拟物或相应的阴性对照物共转染。(C)RELB mRNA 3'-UTR和miR-1243之间的结合区。(D)含有野生型(WT-RELB mRNA3′-UTR)或突变型(MUT-RELB mRNA 3′-UTR)序列的荧光素酶报告构建物分别与miR-1243模拟物或相应的阴性对照物共转染。进行了三个独立的实验。误差条显示至少三次重复实验的平均值±SD*P<0.05，**P<0.01。

circ_RELB/miR-7-5p/RELB调控轴对DR新生血管生成的影响：

体外实验：高糖及对照组条件下培养RMECs，构建circ_RELB沉默miR-7-5p沉默RELB过表达的病毒或质粒，在circ_RELB沉默组RMECs共转染miR-7-5p沉默或者RELB过表达病毒或质粒；或者在miR-7-5p沉默组RMECs细胞共转染RELB过表达病毒或质粒，通过检测细胞增殖、凋亡和血管生成表型以及RELB，NF-κB等表达进一步确定的作用。

动物实验：合成circ_RELB基因沉默或过表达的AAV病毒及miR-7-5p agomir和antagomir，实验分组：DR，DR+miR7agomir,DR+miR7antagomir,DR+ScrshRNA,DR+circ_RELBshRNA,DR+circ_RELB shRNA+Scr antagomir,DR+circ_RELB shRNA+miR7antagomir。眼玻璃体腔内注射，通过小动物眼底成像系统观察出血情况、统计观察血管芽数量，伊凡氏蓝染色(Evans blue stain，EB)观察新生血管渗漏,视网膜糖原染色(PAS)观察新生血管数量和HE染色组织形态观察新生血管的官腔数目。

如图3A和D所示，正常小鼠(8.9％±3.2％)的视网膜血管渗漏明显低于STZ诱导的DR小鼠(32.3％±3.5％)、STZ诱导的NC小鼠(34.8％±4.4％)和用RELB shRNA治疗的小鼠(18.5％±2.0％)，而miR-1243agomir(37.4％±4.0％)导致DR小鼠视网膜血管渗漏无显著差异。小鼠RELB和人RELB的过度表达导致视网膜血管渗漏持续恶化，分别为58.4％±3.1％和55.0％±5.4％；但是用miR-1243-agomir治疗可显著缓解人类RELB过度表达的影响，视网膜血管渗漏降低到34.3％±4.8％。

胰蛋白酶消化后，关于图3B和E，视网膜10个区域的无细胞毛细血管数量从30.7±6.3(正常小鼠)增加到116.7±18.0(DR小鼠)和111.3±11.3(STZ诱导的NC小鼠)；在用RELBshRNA(51.3±9)治疗的小鼠中，脱细胞毛细血管的数量显著减少，而miR-1243agomir(134±15)对DR小鼠的脱细胞毛细血管数量差异无显著影响。小鼠RELB(217.0±23.7)和人类RELB(212.0±16.8)的过度表达导致进一步恶化，而miR-1243agomir(98.2±8.5)治疗仅部分逆转了人类RELB过度表达的影响。

此外，如图3B和F所示，在对照小鼠的视网膜中，每平方毫米的HREC与周细胞的比率为2.6±0.5；由于DR期间周细胞的丢失，STZ诱导的DR小鼠和STZ诱导的NC小鼠的比率分别增加到9.7±0.7和8.9±1.9；RELB shRNA(4.4±0.7)显著降低该比率，而miR-1243agomir(9.9±1.8)在DR小鼠中无显著差异。小鼠RELB(14.6±1.3)和人类RELB(14.9±0.9)的过度表达导致进一步恶化，而miR-1243agomir(10.3±1.0)治疗仅部分逆转了人类RELB过度表达的影响。

与正常小鼠(0.31±0.09μm)相比，STZ诱导的DR小鼠和STZ诱导的NC小鼠基底膜较厚，分别为0.85±0.15和0.84±0.15μm；小鼠RELB shRNA(0.38±0.06μm)显著降低了DR小鼠的厚度，而miR-1243agomir(0.72±0.15μm)对DR小鼠没有显著影响。小鼠RELB(1.95±0.16μm)和人类RELB(1.74±0.19μm)的过度表达导致持续恶化，用miR-1243agomir(0.72±0.15μm)治疗部分逆转了人类RELB过度表达的影响(图3C和G)。

小鼠RELB的过度表达显著促进视网膜血管渗漏和新生血管形成，而小鼠RELB的敲除则产生相反的效果。出乎意料的是，人类RELB的过度表达与小鼠RELB的过度表达产生了相同的效果，尽管这些效果可以通过联合注射miR-1243agomir来挽救。然而，单独注射miR-1243-agomir没有效果，这可能是由于缺乏靶点。

检测结果：选取的另外20例对DR患者血清与对照组扩大样本量验证，检测阳性率达到99％。以上结果再次证明该指标在糖尿病视网膜病变血管新生中普遍高表达。同时对上述样本进行重复3次检验，结果重复性达100％。

在这项工作中，首次报道了在高糖条件下培养的HREC中RELB/circ_0008590与miR-1243相互作用的协同效应，并在体内和体外研究了分子机制。本研究结果可为DR的临床诊断和治疗提供参考。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.circ_RELB作为分子标记物在制备诊断糖尿病视网膜病变血管新生产品上的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述circ_RELB在糖尿病视网膜病变血管新生过程中表达上调。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括检测个体患有糖尿病视网膜病变的试剂盒。

4.包含circ_RELB作为分子标记物的药剂或试剂盒。

5.根据权利要求4所述的药剂或试剂盒，其特征在于，所述药剂或试剂盒用于检测个体患有糖尿病视网膜病变。

6.根据权利要求4所述的药剂或试剂盒，其特征在于，所述药剂或试剂盒包含可以用于制备所述药剂或试剂盒的辅料或辅助部件。

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