WO2013100810A2 - МЕТОД ВИДОВОЙ И ШТАММОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛАКТОБАЦИЛЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНОВ СИСТЕМ ТОКСИН-АНТИТОКСИН II ТИПА СУПЕРСЕМЕЙСТВ ReIBE и MazEF - Google Patents

МЕТОД ВИДОВОЙ И ШТАММОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛАКТОБАЦИЛЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНОВ СИСТЕМ ТОКСИН-АНТИТОКСИН II ТИПА СУПЕРСЕМЕЙСТВ ReIBE и MazEF Download PDF

Info

Publication number
WO2013100810A2
WO2013100810A2 PCT/RU2012/001048 RU2012001048W WO2013100810A2 WO 2013100810 A2 WO2013100810 A2 WO 2013100810A2 RU 2012001048 W RU2012001048 W RU 2012001048W WO 2013100810 A2 WO2013100810 A2 WO 2013100810A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
strain
oligonucleotides
species
genes
lactobacillus
Prior art date
Application number
PCT/RU2012/001048
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2013100810A3 (ru
Inventor
Мария Георгиевна АЛЕКСЕЕВА
Ксения Михайловна КЛИМИНА
Валерий Николаевич ДАНИЛЕНКО
Original Assignee
Автономная Некоммерческая Организация "Научно-Исследовательский Центр Биотехнологии Антибиотиков И Других Биологически Активных Веществ "Биоан"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Автономная Некоммерческая Организация "Научно-Исследовательский Центр Биотехнологии Антибиотиков И Других Биологически Активных Веществ "Биоан" filed Critical Автономная Некоммерческая Организация "Научно-Исследовательский Центр Биотехнологии Антибиотиков И Других Биологически Активных Веществ "Биоан"
Publication of WO2013100810A2 publication Critical patent/WO2013100810A2/ru
Publication of WO2013100810A3 publication Critical patent/WO2013100810A3/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the invention relates to biotechnology, in particular to medical microbiology, as well as to the production of starter cultures for fermented milk products and can be used to identify lactobacilli strains in human microbiota, food products and in the chain of their manufacture.
  • Bacteria of the genus Lactobacillus make up a small part of the microbiota of the intestine of an adult, approximately 0.01-0.6% of all inhabitants of the gastrointestinal tract, however, they actively carry out regulatory functions within the population of intestinal bacteria and are representatives of the normal intestinal microflora of healthy people.
  • Lactobacilli are an important biotechnological object; they are used as starter cultures in the production of fermented milk products (yogurt, yogurt, fermented baked milk, and cheese). Lactobacilli are widely used as part of medicinal probiotic preparations for the prevention of intestinal disorders and viral diarrhea, the treatment of inflammatory bowel diseases, as well as dietary supplements, functional food products for humans and animal feed additives.
  • fermented milk products yogurt, yogurt, fermented baked milk, and cheese
  • Lactobacilli are widely used as part of medicinal probiotic preparations for the prevention of intestinal disorders and viral diarrhea, the treatment of inflammatory bowel diseases, as well as dietary supplements, functional food products for humans and animal feed additives.
  • Gaur IP Kaur IP, Kuhad A, Garg A, Chopra K. Probiotics: delineation of prophylactic and therapeutic benefits. J Med Food. 2009, 12 (2), 219-35; Guarino A, Lo Vecchio A, Canani RB. Probiotics as prevention and treatment for diarrhea. Cur
  • lactobacilli as biomarkers for testing the early stages of various human diseases. It has been established that the probiotic properties of lactobacilli are strain-specific.
  • the genus Lactobacillus has about 140 species, many of which are commensals in the human microbiota and have similar phenotypic and physiological characteristics, but their genomes vary greatly in GC composition, which complicates the identification of this genus.
  • the nucleotide sequences of the 16S rRNA genes have developed rhodo-, group- and species-specific primers, amplification of which in some cases can be carried out simultaneously in a common reaction mixture (the so-called multiplex PCR).
  • This method is usually used to determine the type of microorganisms, but is not applicable for the identification of closely related species and strains. (Song, Y., Kato, N., Liu, C, Matsumiya, Y., Kato, H., Watanabe, K.
  • strain-specific identification are not universal and easy to use and do not allow strain-specific identification, since the nucleotide sequences of genes used for group and species identification are completely identical for different strains of the same species.
  • strain-specific identification methods For strains of the species L.ramnosus, strain-specific identification methods have not yet been developed.
  • the technical result of the present invention is a method that provides universal and fast molecular genetic identification of phylogenetic groups, species and strains of lactobacilli in the human microbiota (gastroenterological tract, vaginal cavity, etc.), as well as in the acid chain of acid full-time products.
  • the claimed invention provides a method for species and strain identification of lactobacilli based on a combination and polymorphism of genes of the toxin-antitoxin (TA) system types II of the MazEF and RelBE superfamilies.
  • TA toxin-antitoxin
  • the components of the toxin-antitoxin (TA) systems are usually two genes located one after another (sometimes overlapping), equipped with at least one promoter, and forming an operon.
  • the toxin gene causes the formation of a long-lasting product that "poisones" the bacterium, and the antitoxin gene causes a labile product that can neutralize this toxin by binding to it (or preventing its formation).
  • the antitoxin gene causes a labile product that can neutralize this toxin by binding to it (or preventing its formation).
  • the authors of the present invention conducted a computer search of the genes of MazEF and RelBE superfamilies in the genomes of all 4 groups of lactobacilli differing in GC composition using the National Center for Biotechnology Information (NCBI) programs (http: //www.ncbi.nlm.nih. gov /) and UniProt (http://www.uniprot.org/).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • a comparative analysis of the sequences of the detected genes was performed using the Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) and CLUSTAL W programs
  • Lactobacillus acidophilus (L. acidophilus; L. helveticus; L. amylovorus; L. crispatus)
  • no 1 module of the MazEF system was found, from 1 to 4 relE toxin genes and from 1 to 2 relB antitoxin genes.
  • strains of all species belonging to this group contain 1 relB antitoxin gene, which can be used to identify this group of lactobacilli.
  • the strains belonging to the species L. helveticus contain one more highly homologous antitoxin gene relB. This gene can be used to identify the species L. helveticus.
  • Lactobacillus plant arum (L. pi ant arum; L. pentosus), no 1 mazF toxin gene was found, which can also be used to identify this group of lactobacilli.
  • Lactobacillus casei (L.casei; L.paracasei; L.rhamnosus)
  • 1 to 2 modules of the MazEF system and 1 to 2 modules of the RelBE system were found, moreover, the mazF toxin gene is present in all strains of this group and can be used to identify this group of lactobacilli. All other genes have species and strain specificity.
  • Lactobacillus acidophilus group includes L. acidophilus species; L. helveticus; L. amylovorus; L. crispatus. Since all strains of this group contain the relB antitoxin gene, oligonucleotides for group identification were constructed based on the nucleotide sequences of this gene.
  • sequence 1.1 (see the list of sequences) a comparative analysis of the nucleotide sequences of the antacotoxin relB L.acidophilm genes is presented (ATCC 4796, NCFM, 30SC strains); L. helveticus (strains DPC 4571, MTCC 5463, NJ, DSM 20075); L. amylovorus (strains GRL 1 1 12, GRL1118); L. crispatus (strains JV-V01, 125-2-CHN, MV-1A-US, MV-3A-US, 214-1).
  • LacN and LacC oligonucleotides were developed to identify the L. acidophilus group.
  • Lactobacillus plantarum group includes species L.plantarum and L. pentosus. Since all strains of this group contain the mazF toxin gene, oligonucleotides for group identification were constructed based on the nucleotide sequences of this gene.
  • sequence 1.3 (see the list of sequences) a comparative analysis of the nucleotide sequences of the mazF L. plantarum toxin genes (strains ATCC 14917, WCFS1, JDM1, ST-III); L. pentosus (strains IG1, MP-10). Based on a comparative sequence analysis, oligonucleotides LplN and LplC were developed to identify the L. plantarum group.
  • the Lactobacillus casei group includes the species L.casei, Lparacasei, L. rhamnosus. Since all strains of this group contain the mazF toxin gene, oligonucleotides for group identification were constructed based on the nucleotide sequences of this gene.
  • LcsN and LcsC oligonucleotides for the identification of the L.casei group were developed.
  • the largest number of antitoxin genes is present in the genome of the LMS2-1 strain: 2 MazEF system modules (MazEF2 and MazEF3) and an additional 1 mazFl toxin gene, 1 RelBE system module (RelBE2) and an additional 1 relEl toxin gene and 1 geHZ antitoxin gene.
  • strain 1x705 contains: 1 module of the MazEF system (MazEF2) and, in addition, 1 mazFl toxin gene, 1 module of the RelBE system (RelBE2), and an additional 1 relEl toxin gene and 1 gES antitoxin gene.
  • the ATCC 8530 strain genome contains: 1 module of the MazEF system (MazEF2) and an additional 1 mazFl toxin gene, 1 module of the RelBE system (RelBE2) and an additional 1 relEl toxin gene.
  • the genome of the GG strain contains: 1 mazFl toxin gene, 1 RelBE system module (RelBEl).
  • the method of the present invention is based on a combination of genes of MazEF and RelBE superfamily toxin-antitoxin systems.
  • the proposed method includes a set of pairs of oligonucleotides to identify groups and individual types of lactobacilli.
  • the proposed method includes a set of pairs of oligonucleotides for strain identification L.rhamnosus
  • a lactobacilli culture was grown on MPC for 48 hours at 37 ° C under anaerobic conditions in a HiAnaerobicTM anaerostat (HiMedia Company (India)), after which genomic DNA was isolated.
  • Cells from 20 ml of overnight culture were pelleted by centrifugation at 4000 g for 10 min and resuspended in 10 ml of buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM 3flTA-Na 2 , pH 8.0).
  • the resulting suspension was centrifuged under the same conditions and the pellet was resuspended in 500 ⁇ l above the indicated buffer, then the suspension was transferred to a 2 ml centrifuge tube and 50 ⁇ l of chloroform was added.
  • the mixture was vigorously shaken with a vortex (5 times for 10 seconds), 100 ⁇ l of lysozyme solution (60 mg / ml) was added and incubated for 30 min at 37 ° C.
  • the mixture was incubated for 30 minutes at room temperature and centrifuged at 12000g for 20 minutes.
  • the DNA pellet was washed three times with 0.5 ml of 75% ethanol each by centrifugation for 5 minutes at 12000 g and dissolved in 100 ⁇ l of water.
  • Amplification of DNA is carried out using the Amplification kit of Dialat Ltd company on the Tertsik instrument (DNA technology).
  • Composition of the PCR mixture (per 100 ⁇ l): 10 ⁇ l JhPCR buffer, 10 ⁇ l of a mixture of 2.5 mM IdNTPs, 4 ⁇ l of 50 mM MgCl 2 , 0.3 ⁇ g of genomic DNA and 0.8 ⁇ l of Taq polymerase enzyme.
  • Oligonucleotide primers are added at a concentration of 20 pmol per 100 ⁇ l of the mixture.
  • Parameters of PCR reaction 95 ° ⁇ for 5 min (cell lysis and genomic DNA denaturation); then 30 cycles of amplification - 94 ° C - 1 min (denaturation), 60 ° C for 1 min (annealing of oligonucleotides), 72 ° C - 1 min (completion (extension) of the chain); final elongation of fragments at 72 ° ⁇ - 10 min, storage at 4 ° ⁇ .
  • the results of the study are taken into account by analyzing the amplification products of the test samples by electrophoresis in 1% agarose gel. After amplification is completed, 1/5 of the 6X DNA Loading Dye (Fermentas) solution is carefully added under oil to the tubes with the test samples, after amplification, they are mixed, and 8 ⁇ l of the obtained sample is added to the wells of the agarose gel. Electrophoresis is carried out in a SE-2 horizontal electrophoresis chamber (Helikon Company) with an Elf-4 power source (DNA technology) at a voltage of 120 volts for 60 minutes.
  • amplification with genomic DNA is carried out using oligonucleotides shown in table 2. PCR analysis products zoned in 1% agarose gel. The size of the obtained fragment is determined using the GeneRuler TM DNA marker 100+ bp ("Fermentas").
  • the studied strain belongs to the group L. acidophilus in the case of producing fragments using oligonucleotides LacN and LacC; in the case of PCR products using oligonucleotides LhvlN and LhvlC, to the species L. helveticus.
  • the studied strain belongs to the L. plantarum group in the case of producing fragments using oligonucleotides LplN and LplC.
  • the studied strain belongs to the L.casei group in the case of producing fragments using oligonucleotides LcsN and LcsC; in the case of PCR products using oligonucleotides LcslN and LcslC to the species L.casei; RelERIN and RelERIC - to the species L. rhamnosus.
  • amplification with genomic DNA is carried out using the oligonucleotides shown in Table 3.
  • the PCR products are analyzed on a 1% agarose gel. The size of the obtained fragment was determined using the GeneRuler TM DNA marker 100+ bp. ("Fermentas").
  • the studied strain is identical to the strain L.ramnosus GG in the case of producing fragments using oligonucleotides RelBRlN-RelBRlC. When using the remaining oligonucleotides, there should be no PCR products.
  • the studied strain is identical to the strain L.ramnosus Lc705 in the case of PCR products only when using the oligonucleotides RelBR2N-RelBR2C and RelBR3N-RelBR3 C.
  • the studied strain is identical to the strain L.ramnosus HN001 in the case of PCR products only when using the oligonucleotides RelBRlN-RelBRlC and RelBR2N-RelBR2C.
  • the studied strain is identical to the L.ramnosus LMS2-1 strain in the case of PCR products using the RelBR2N-RelBR2C and RelBR3N-RelBR3C oligonucleotides, as well as when using the MazFR3N-MazFR3C and MazER3N-MazER3C oligonucleotides.
  • the studied strain is identical to the L.ramnosus ATCC 8530 strain in the case of PCR products only when using the RelBR2N-RelBR2C oligonucleotides.
  • strain identification of the species L. rhamnosus was performed. Based on the composition of genes of the MazEF and RelBE superfamily toxin-antitoxin systems among 15 L. rhamnosus strains, the strain variety of lactobacilli from the Russian collection was shown. Thus, this approach allows us to identify strain specificity within the species L. rhamnosus.
  • Oligonucleotides for the identification of groups and individual species of lactobacilli are Oligonucleotides for the identification of groups and individual species of lactobacilli.
  • H10 - ATGGCAGAAAAAACAACAGGACTTTATGTCAGAATGAATCCAGAAAAGAAG 51
  • GRL 1112 ATGG ⁇ AGAAAAAACAACAGGACTTTATGTSAGAATGAATCCAGAAAAGAAG 51
  • JV-V01 ATGG ⁇ AGAAAAAACAACAGGACTTTATGTSAGAATGAATCCAGAAAAGAAG 51
  • GRL 1112 GAAAAGGCAGAAGCTATTCTGAAAAAGCTGGGGTTAAATTCAGCTACGGCAATTAACATG 111
  • DPS 4571 TTCTATGATCAGATTATTCTTCATAATGGTATTCCTTTCAGAGTAGAGATTCCAAATGCA 171
  • MTCC 5463 TTCTATGATCAGATTATTCTTCATAATGGTATTCCTTTCAGAGTAGAGATTCCAAATGCA
  • GRL 1112 TTCTATGATCAGATTATTCTTCATAATGGTATTCCTTTCAGAGTAGAGATTCCAAATGCA 171
  • GRL 1118 TTCTATGAT ⁇ AGATTATT ⁇ TT ⁇ ATAATGGTATTCCTTT ⁇ AGAGTAGAGATTCCAAATGCA 171
  • JV-V01 TTCTATGATCAGATTATTCTTCATAATGGTATTCCTTTCAGAGTAGAGATTCCiAATGCA 171
  • GRL 1112 TGGGATAATTTGGATCAAATGAATAAGTATGAATACGCCAAACTGCTTGACGAGCGCCTG 231
  • GRL 1118 TGGGATAATTTGGATCAAATGAATAAGTATGAATA GCCAAACTGCTTGACGAGCGCCTG 231
  • DPS 4571 AACACATTGAICGGAAGGGAAGATTTACTTGGAGATATCGCCAAGAGGCTTGATGCGGAA 291
  • GRL 1112 AACACATTGA
  • GRL 1118 AACACATTGACCGGAAGGGAAGATTTACTTGGAGATATCGCCAAGAGGCTTGATGCGGAA 291
  • JV-V01 AACACATTGAGCGGAAGGAAAGATTTSCTTGGAGATGTCGCCAAGAGGCTTGATGCGGAA 291
  • JDM1 ATGGCCGCAGCTGACATTAAGCGTGGTGACATCTTTTATGCAGATTTATCACCAGTCGTA 60
  • JDM1 GGCTCCGAACAAGGAGGCATGCGTCCAGTACTAATCGTGCAAAATAATGTCGGTAACCAT 120
  • JDM1 TACAGTCCCACAGTGATTGTCGCGGCAATCACTGCTAAGGTTCAAAAAGCGAAGATGCCA 180
  • JDM1 CAGACGATGCGCCGAGTTGA AATGCGTTACAGATTAGTATTGGGTTAGCTGT ⁇ GAACA 360
  • ATcc 334 ATGGATGTGTCCGTAAAACGCGGCGATGTTTTTTTTCGCCGATCTGTCTCCGGTTGTCGGC 60
  • ATcc 25302 ATGGATGTGTCCGTAAAACGCGGCGATGTTTTTTTTCGCCGATCTGTCTCCGGTTGTCGGC 608700: 2 GTGTCCGTAAAACGCGGCGATGTTTTTTTCGCCGATCTGTCTCCGGTTGTG
  • AAAATGGCAGC GT
  • GC (
  • AAG B HNOOl AAAATGGCAGC
  • AAG 360 LMS2-1 AAAATGGCAGC
  • GC (
  • HN001 ATGCCCACCTCCCTGCCCCTCATCGAACAATCCCGCTTCAAAAAACATCTCAAACAACTC 60
  • HN001 ATGGCAAAAGAATCCCGTATCCGCAATTGGATTAACACAATAACCAGAAAACGAGCTCTC 60
  • HN001 CATGTTCTTAATCGTCTGGGACTAGAGAGATATTCTCGGCTATTAACATGTATTGGAAACGG 120
  • Lc 705 ATGGAAGCAACGAATTATAGTGATTTCCGCCGCAACCTTAAGCATTATATGAGTCAAGTC 60
  • HN001 ATGGAAGCAACGAATTATAGTGATTTCCGCCGCAACCTTAAGCATTATATGAGTCAAGTC 60
  • HN001 ATGAGGACTAATGACTTAGTCAGCCTATACGTTAGTTTTTGTAGAAACTAACGGTGG ⁇ AAG 60 LMS2-1 ATGAGGACTAATGACTTAGTCAGCCTATACGTTAGTTTTTGTAGAAACTAACGGTGGCAAG 60
  • HN001 AGTCAGTATGAAAAGAAGTCGGCTTATATCAAGCAACAATATTATCCGATTCAAGATTGG 180
  • HN001 CAATCCGCTGGGTTGAAGAAACCTTCCTGGGTCGATCTTGGTAATATTTATCGCTTTCCCC 240
  • LMS2-1 CAATCCGCTGGGTTGAAGAAACCTTCCTGGGTCGATCTTGGTAATATTTATCGCTTTCCCC 240
  • HN001 AATAAAAACGATCGGCCTAGTTATTAG 507
  • HN001 ACCGAAGCAATTTTAAGCGAATTGGGCTTAAATCCAACCACGGCCATTAACATGTTTTAC 120
  • HN001 AAGCGGATTGTTGCTAATGGTGCTTTACCTTTTAATGCGTCTTTAAGCGAAGAAGAAAGA 180
  • HN001 GCTAATTTACGCTTTTTATAAGGTGACCGAAGGGACACCAGTCACCGAGTTCAAAGACGCT 240

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской микробио- логии, а также к производству заквасок для кисломолочных продуктов питания и может быть использовано для идентификации штаммов лактобацилл в микробиоте человека, продуктах питания и в цепочке их изготовления. Изобретение включает новый метод идентификации филогенетических групп и отдельных видов лактобацилл, штаммов лактобацилл вида Lactobacillus ramnosus, основанный на комбинации и полиморфизме генов систем токсин-антитоксин (ТА) II типа суперсемейств MazEF и RelBE. Олигонуклеотиды, подобранные к таким генам можно использовать для характеристики штамма, для выявления штаммового разнообразия в исследуемой экологической нише. Разнообразные методы ПЦР (мультилокусный, в ре- альном времени идр.) с последующим секвенированием, в том числе в системе MiSeq (Illumina, США) с использованием предлагаемых пар олигонуклеотидов можно пред- ставить как диагностический методический подход для определения исследуемого штамма в клинических пробах или молекулярного отслеживания штамма в коммерческих препаратах.

Description

Метод видовой и шта мовой идентификации лактобацилл с использованием генов систем токсин-антитоксин II типа суперсемейств RelBE и MazEF
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской микробио- логии, а также к производству заквасок для кисломолочных продуктов питания и может быть использовано для идентификации штаммов лактобацилл в микробиоте человека, продуктах питания и в цепочке их изготовления.
Бактерии рода Lactobacillus составляют незначительную часть микробиоты ки- шечника взрослого человека, приблизительно 0,01-0,6% от всех обитателей желудочно- кишечного тракта, однако активно осуществляют регуляторные функции внутри попу- ляции кишечных бактерий и являются представителями нормальной микрофлоры ки- шечника здоровых людей. (Jones B.V., Sun F., Marchesi J.R. Comparative metagenomic analysis of plasmid encoded functions in the human gut microbiome BMC Genomics 2010, 1 1 :46; Saulnier DM, Kolida S, Gibson GR. Microbiology of the human intestinal tract and ap- proaches for its dietary modulation. Curr Pharm Des. 2009, 15 (13), 1403-1414.).
Лактобациллы являются важным биотехнологическим объектом, они использу- ются в качестве заквасок при производстве кисломолочных продуктов питания (йогурт, простокваша, ряженка и сыры). Лактобациллы широко применяются в составе лекарст- венных пробиотических препаратов для профилактики кишечных расстройств и вирус - ной диареи, лечения воспалительных заболеваний кишечника, а также в качестве биоло- гически активных добавок, продуктов функционального питания для человека и кормо- вых добавок для животных. (Gupta V, Garg R. Probiotics. Indian J Med Microbiol. 2009, 27 (3), 202-9; Kaur IP, Kuhad A, Garg A, Chopra K. Probiotics: delineation of prophylactic and therapeutic benefits. J Med Food. 2009, 12 (2), 219-35; Guarino A, Lo Vecchio A, Canani RB. Probiotics as prevention and treatment for diarrhea. Curr Opin Gastroenterol. 2009, 25 (1), 18-23.).
В последние годы обнаружена корреляция между состоянием пробиотического компонента микрофлоры человека и некоторыми заболеваниями, в том числе болезнью
Крона и онкозаболеваниями. (Edwards LA, Lucas М, Edwards ЕА, Torrente F, Heuschkel
RB, Klein NJ, Murch SH, Bajaj-Elliott M, Phillips AD. Aberrant response to commensal
Bacteroides thetaiotaomicron in Crohn's disease: an ex vivo human organ culture study. Inflamm Bowel Dis. 201 1 May; 17(5): 1201 -8; Cain AM, Karpa KD. Clinical utility of probiot- ics in inflammatory bowel disease. Altern Ther Health Med. 2011 Jan-Feb; 17(l):72-9.).
Поэтому актуальной задачей является использование лактобацилл в качестве биомаркеров для тестирования ранних стадий различных заболеваний человека. Уста- новлено, что пробиотические свойства лактобацилл являются штаммоспецифическими.
Род Lactobacillus насчитывает около 140 видов, многие из которых являются комменсалами в составе микробиоты человека и имеют сходные фенотипические и фи- зиологические характеристики, но их геномы сильно различаются по GC-составу, что усложняет идентификацию данного рода. Выделяют 4 наиболее распространенные и имеющие практическое значение филогенетические группы лактобацилл, различаю- щихся по GC-составу: группа L.acidophilus (32 - 37%), группа L. plantarum (44 %), группа L.casei (46%), группа подвидов L.delbrueckii (49 - 51%). (Singh S, Goswami P, Singh R, Heller K.J. Application of molecular identification tools for Lactobacillus, with a fo- cus on discrimination between closely related species: A review LWT - Food Science and Technology, 2009, 42, 448-^57; Felis GE, Dellaglio F. Taxonomy of Lactobacilli and Bifidobacteria. Ciirr Issues Intest Microbiol. 2007 Sep; 8(2):44-61.).
В настоящее время для идентификации вида, филогенетической группы и рода Lactobacillus применяются следующие методы:
1. Амплификация специфических для конкретного вида лактобацилл фрагментов генов 16S и 23 S рРНК, также и с последующим DGGE- или TTGE-электрофорезом. (Ward L. J. Н., Timmins М. J. Differentiation of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus by polymerase chain reaction. Letters in Applied Microbiology, 1999, 29, 90-92; Dobson C. M., Chaban В., Deneer, H., Ziola B. Lactobacillus casei, Lacto- bacillus rhamnosus, and Lactobacillus zeae isolates identified by sequence signature and immunoblot phenotype. Canadian Journal of Microbiology, 2004, 50, 482^488; Vasquez, A, Ahrne S., Pettersson В., Molin, G. Temporal temperature gradient gel electrophoresis (TTGE) as a tool for identification of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus zeae and Lactobacillus rhamnosus. Letters in Applied Microbiology, 2001 , 32, 215-219; Walter J., Tannock G. W., Tilsala-Timisjarvi A., Rodtong S., Loach D. M., Munro K., et al. Detection and identification of gastrointestinal Lactobacillus species by DGGE and species-specific PCR primers. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66, 297-303; Kullen, M. J., Sanozky-Dawes, R. В., Crowell, D. C, & Klaenhammer, T. R. Use of the DNA sequence of variable regions of the 16S rRNA gene for rapid and accurate identification of bacteria in the Lactobacillus acidophilus complex. Journal of Applied Microbiology, 2000, 89, 51 1-516; Berthier F., Ehrlich S. D. Rapid species identification within the groups of closely related Lac- tobacilli using PCR primers that target the 16S/23S rRNA spacer region. FEMS Microbiology Letters, 1998, 161, 97-106; Nissen H., Dainty R. H. Comparison of the use of rRNA probes and conventional methods in identifying strains of Lactobacillus sake and L. curvatus isolated from meat. International Journal of Food Microbiology, 1995, 25, 311-315.).
По нуклеотидным последовательностям генов 16S рРНК разработаны родо-, группо- и видоспецифичные праймеры, амплификация с которыми в ряде случаев может проводиться одновременно в общей реакционной смеси (так называемая мультиплексная ПЦР - multiplex PCR). Данный метод обычно используется для определения вида микро- организмов, однако неприменим для идентификации близкородственных видов и штаммов. (Song, Y., Kato, N., Liu, С, Matsumiya, Y., Kato, H., Watanabe, К. Rapid identi- fication of 1 1 human intestinal Lactobacillus species by multiplex PCR assays using group and species-specific primers derived from the 16S-23S rRNA intergenic spacer region and its flanking 23S rRNA. FEMS Microbiology Letters, 2000, 187, 167-173; Lee J., Jang J., Kim В., Kim J., Jeong G., Han H. Identification of Lactobacillus sakei and Lactobacillus curvatus by multiplex PCR-based restriction enzyme analysis. Journal of Microbiological Methods, 2004, 59, 1-6.).
2. RAPD - амплификация с использованием случайных праймеров. Данный метод позволяет различить штаммы микроорганизмов, однако результаты не всегда воспроиз- водимы в разных лабораториях, метод плохо поддается стандартизации. (Ward L. J. Н., Timmins М. J. Differentiation of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and Lactobacil- lus rhamnosus by polymerase chain reaction. Letters in Applied Microbiology, 1999, 29, 90- 92; Rodas A. M., Ferrer, S., Pardo, I. Polyphasic study of wine Lactobacillus strains, taxonom- ic implications. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2005, 55, 197-207; Torriani S., Felis G. E., Dellaglio F. Differentiation of Lactobacillus plantarum, L. pentosus and L. paraplantarum by rec A gene sequence analysis and multiplex PCR assay with recA gene derived primers. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67, 3450-3454; Berthier F., Ehrlich, S. D. Genetic diversity within Lactobacillus sakei and Lactobacillus curvatus and design of PCR primers for its detection using randomly amplified polymorphic DNA. International Journal of Systematic Bacteriology, 1999, 49, 997-1007; Andrighetto C, Zampese L., Lombardi A. RAPD-PCR characterization of lactobacilli isolated from artisanal meat plants and traditional fermented sausages of Veneto region (Italy). Letters in Applied Mi- crobiology, 2001, 33, 26-30.).
3. Анализ последовательностей консервативных генов «домашнего хозяйства», в том числе recA, tuf. Т.н. метод MLST (multi locus sequencing typing) идентифицирует нуклеотидную последовательность и ее вариации для ряда генов «домашнего хозяйст- ва»; эти данные позволяют выделить внутри вида конкретные штаммы. Метод универ- сален, однако достаточно сложен и трудоемок. В настоящее время базы данных по MLST существуют только для двух видов лактобацилл - L.casei и L.salivarius (Raftis EJ, Salvetti E, Torriani S, Felis GE, O'Toole PW, Genomic diversity of Lactobacillus salivarius, Appl Environ Microbiol. 2011 77(3):954-65); Cai H., Rodeigez B.T., Zhang W., Broadbent J.R., Steele J.L. Genotypic and phenotypic characterization of Lactobacillus casei strains iso- lated from different ecological niches suggests frequent recombination and niche specificity. Microbiology, 2007, V.153, 2655-2665; Chavagnat F., Haueter M., Jimeno J., Casey M. G. Comparison of partial tuf gene sequences for the identification of lactobacilli. FEMS Microbi- ology Letters, 2002, 217, 177-183; Felis G. E., Dellaglio F., Mizzi L., Torriani S. Comparative sequence analysis of a rec A gene fragment brings new evidence for a change in the taxonomy of the Lactobacillus casei group. International Journal of Systematic and Evolutionary Micro- biology, 2001, 51, 2113-2117; Torriani S., Felis G. E., Dellaglio F. Differentiation of Lacto- bacillus plantarum, L. pentosus and L. paraplantarum by rec A gene sequence analysis and multiplex PCR assay with recA gene derived primers. Applied and Environmental Microbiol- ogy, 2001, 67, 3450-3454).
4. Типирование с использованием рестриктаз EcoRI, EcoRI/Pstl, Bfal и Msel. (Ryu C. S., Czajka J. W., Sakamoto M., Benno Y. Characterization of Lactobacillus casei group and the Lactobacillus acidophilus group by automated ribotyping. Microbiology and Immunology, 2001, 45, 271-275; Giraffa G., DeVecchi P., Rossetti L. Identification of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus and subspecies lactis dairy isolates by amplified rDNA re- striction analysis. Journal of Applied Microbiology, 1998, 85, 918-924; Miteva V., Boudakov I., Ivanova-Stoyancheva G., Marinova В., Mitev V., Mengaud J. Differentiation of Lactobacil- lus delbrueckii subspecies by ribotyping and amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA). Journal of Applied Microbiology, 2001, 90, 909-918; Lick S., Brockmann E., Hel- ler K. J. Identification of Lactobacillus delbrueckii and subspecies by hybridization probes and PCR. Systematic and Applied Microbiology, 2000, 23, 251-259; Rodas, A. M., Ferrer, S., Pardo, I. Polyphasic study of wine Lactobacillus strains, taxonomic implications. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2005, 55, 197-207). Однако перечисленные выше методы в основном применимы для типирования групп и отдельных видов лактобацилл, известные методы штаммоспецифичной иден- тификации не являются универсальными и простыми в использовании и не позволяют проводить штамм-специфическую идентификацию, поскольку нуклеотидные последо- вательности генов, используемых для групповой и видовой идентификации, полностью идентичны для разных штаммов одного вида.
Для типирования штаммов L.delbrueckii разработан так называемый мультило- кусный метод, основанный на RFLP - ПЦР трех белок-код ирующих генов: β- галактозидаза, лактоза пермеаза и пролин дипептидаза. (Giraffa G., Lazzi С, Gatti М, Rossetti L., Mora D., Neviani, E. Molecular typing of Lactobacillus delbrueckii of dairy origin by PCR-RFLP of protein-coding genes. International Journal of Food Microbiology, 2003, 82, 163-172.).
Для штаммов вида L.ramnosus до настоящего времени не разработаны методы штамм-специфической идентификации .
Техническим результатом настоящего изобретения является метод, обеспечи- вающий универсальную и быструю молекулярно-генетическую идентификацию фило- генетических групп, видов и штаммов лактобацилл в микробиоте человека (гастроэнте- рологический тракт, вагинальная полость и др.), а также в пищевой цепочке кисломо- л очных продуктов.
В заявленном изобретении предложен метод видовой и штаммовой идентифика- ции лактобацилл, основанный на комбинации и полиморфизме генов систем токсин- антитоксин (ТА) II типа суперсемейств MazEF и RelBE. (Yamaguchi Y, Park JH, Inouye M. Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea. Annu Rev Genet. 201 1, Dec 15;45:61-79; Прозоров A.A., Даниленко B.H. Системы "токсин-антитоксин" у бактерий: инструмент апоптоза или модуляторы метаболизма? Микробиология. 2010. Т.79. Ν°2. С. 147-159).
Компонентами систем токсин-антитоксин (ТА) обычно являются два гена, распо- лагающиеся один за другим (иногда перекрываясь), снабжённые, по крайней мере, од- ним промотором, и образующие оперон. Ген токсина обуславливает образование дол- гоживущего «отравляющего» бактерию продукта, а ген антитоксина - лабильного про- дукта, способного нейтрализовать этот токсин, связываясь с ним (или препятствуя его образованию). (Engelberg-Kulka Н, Amitai S, Kolodkin-Gal I, Hazan R. Bacterial pro- grammed cell death and multicellular behavior in bacteria. PLoS Genet. 2006, 2 (10): 1518- 1526.)
1. Биоинформатический анализ наличия генов систем токсин-антитоксин су- персемейств MazEF и RelBE у лактобацилл.
Авторами настоящего изобретения был проведен компьютерный поиск генов су- персемейств MazEF и RelBE в геномах всех 4 групп лактобацилл, различающихся GC- составом, с использованием программ National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и UniProt (http://www.uniprot.org/). Сравнительный анализ последовательностей обнаруженных генов проводили с использованием про- грамм Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) и CLUSTAL W
(www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html).
В результате биоинформатического анализа для 3 групп лактобацилл обнаруже- ны существенные различия по наличию генов систем токсин-антитоксин данных супер- семейств.
У штаммов филогенетической группы Lactobacillus acidophilus (L.acidophilus; L. helveticus; L. amylovorus; L. crispatus) обнаружено no 1 модулю системы MazEF, от 1 до 4 генов токсина relE и от 1 до 2 генов антитоксина relB. Причем штаммы всех видов, относящихся к данной группе, содержат 1 ген антитоксина relB, который может быть использован для идентификации данной группы лактобацилл. Штаммы, относящиеся к виду L. helveticus содержат еще по 1 высокогомологичному гену антитоксина relB. Дан- ный ген может быть использован для идентификации вида L. helveticus.
У штаммов филогенетической группы Lactobacillus plant arum (L. pi ant arum; L.pentosus) обнаружено no 1 гену токсина mazF, который также может быть использо- ван для идентификации этой группы лактобацилл.
У штаммов филогенетической группы Lactobacillus casei (L.casei; L.paracasei; L.rhamnosus) обнаружено от 1 до 2 модулей системы MazEF и от 1 до 2 модулей систе- мы RelBE, причем ген токсина mazF присутствует у всех штаммов данной группы и может быть использован для идентификации данной группы лактобацилл. Все осталь- ные гены имеют видовую и штаммовую специфичность.
Для штаммов вида L.rhamnosus обнаружены существенные различия по наличию генов систем токсин-антитоксин суперсемейств MazEF и RelBE (см. табл.1), что позво- ляет разработать метод штамм-специфической идентификации, основанный на комби- нации генов.
2. Разработка олигонуклеотидов для идентификации филогенетических групп и отдельных видов лактобацилл
2.1. Идентификация филогенетической группы Lactobacillus acidophilus
К группе Lactobacillus acidophilus относятся виды L. acidophilus; L. helveticus; L. amylovorus; L. crispatus. Поскольку все штаммы этой группы содержат ген антиток- сина relB, на основании нуклеотидных последовательностей этого гена были сконст- руированы олигонуклеотиды для групповой идентификации.
На последовательности 1.1. (см. перечень последовательностей) представлен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов антитоксина relB L.acidophilm (штаммы АТСС 4796, NCFM, 30SC); L. helveticus (штаммы DPC 4571 , МТСС 5463, НЮ, DSM 20075); L. amylovorus (штаммы GRL 1 1 12, GRL1118); L. crispatus (штаммы JV-V01, 125-2-CHN, MV-1A-US, MV-3A-US, 214-1).
На всех представленных нуклеотидных последовательностях отличия выделены красным цветом. Гомология нуклеотидных последовательностей данного гена для штаммов разных составляет от 95 до 100%.
На основании сравнительного анализа последовательностей разработаны олиго- нуклеотиды LacN и LacC для идентификации группы L. acidophilus.
Поскольку в геномах штаммов L. helveticus присутствует дополнительно еще 1 ген антитоксина relB, проведен сравнительный анализ данного гена, представленный на последовательности 1.2., и разработаны олигонуклеотиды LhvNl и LhvCl для видовой идентификации L. helveticus.
2.2. Идентификация филогенетической группы Lactobacillus plantarum
К группе Lactobacillus plantarum относятся виды L.plantarum и L.pentosus. По- скольку все штаммы этой группы содержат ген токсина mazF, на основании нуклеотид- ных последовательностей этого гена были сконструированы олигонуклеотиды для групповой идентификации.
На последовательности 1.3. (см. перечень последовательностей) представлен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов токсина mazF L.plantarum (штаммы АТСС 14917, WCFS1, JDM1, ST-III); L.pentosus (штаммы IG1, МР- 10). На основании сравнительного анализа последовательностей разработаны олиго- нуклеотиды LplN и LplC для идентификации группы L.plantarum.
2.3. Идентификация филогенетической группы Lactobacillus casei
К группе Lactobacillus casei относятся виды L.casei, Lparacasei, L.rhamnosus. По- скольку все штаммы этой группы содержат ген токсина mazF, на основании нуклеотид- ных последовательностей этого гена были сконструированы олигонуклеотиды для групповой идентификации.
На последовательности 1.4. (см. перечень последовательностей) представлен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов токсина mazF L.casei (штаммы АТСС 14917, WCFS1, JDM1, ST-III); Lparacasei (штаммы АТСС 14917, WCFS1, JDM1, ST-III), L.rhamnosus (штаммы АТСС 14917, WCFS1, JDM1 , ST-III).
На основании сравнительного анализа последовательностей разработаны олиго- нуклеотиды LcsN и LcsC для идентификации группы L.casei, олигонуклеотиды LcsNl и LcsCl для видовой идентификации L.casei.
Для штаммов вида L.rhamnosus проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов токсина relE и разработаны олигонуклеотиды RelERIN и RelERIC для видовой идентификации L.rhamnosus (см. последовательность 1.5.).
3. Идентификация штаммов вида L.rhamnosus
С увеличением числа доступных секвенированных геномов лактобацилл появи- лась возможность идентифицировать участки ДНК, специфичные для каждого конкрет- ного штамма.
Как было сказано выше, для штаммов вида L.rhamnosus обнаружены существен- ные различия в комбинации генов систем токсин-антитоксин MazEF и RelBE.
Наибольшее количество генов антитоксина присутствует в геноме штамма LMS2-1 : 2 модуля системы MazEF (MazEF2 и MazEF3) и дополнительно 1 ген токсина mazFl, 1 модуль системы RelBE (RelBE2) и дополнительно 1 ген токсина relEl и 1 ген антитоксина геШЗ.
В геноме штамма 1x705 присутствуют: 1 модуль системы MazEF (MazEF2) и до- полнительно 1 ген токсина mazFl, 1 модуль системы RelBE (RelBE2) и дополнительно 1 ген токсина relEl и 1 ген антитоксина геШЗ.
В геноме штамма HN001 присутствуют: 1 модуль системы MazEF (MazEF3) и дополнительно 1 ген токсина mazFl, 2 модуля системы RelBE (RelBEl и RelBE2).
В геноме штамма АТСС 8530 присутствуют: 1 модуль системы MazEF (MazEF2) и дополнительно 1 ген токсина mazFl, 1 модуль системы RelBE (RelBE2) и дополни- тельно 1 ген токсина relEl.
В геноме штамма GG присутствуют: 1 ген токсина mazFl, 1 модуль системы RelBE (RelBEl).
Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей всех выяв- ленньгх генов систем токсин-антитоксин суперсемейств MazEF и RelBE штаммов L.rhamnosus (см. последовательности 2.1. - 2.5.), на основании которого разработаны олигонуклеотиды для штаммовой идентификации.
Таким образом:
1) Метод по настоящему изобретению, основан на комбинации генов систем токсин-антитоксин суперсемейств MazEF и RelBE.
2) Предлагаемый метод включает набор пар олигонуклеотидов для идентифика- ции групп и отдельных видов лактобацилл.
3) Предлагаемый метод включает набор пар олигонуклеотидов для штаммовой идентификации L.rhamnosus
Осуществление изобретения
Культуру лактобацилл выращивают на среде МРС в течение 48 часов при 37°С при анаэробных условиях в анаэростате HiAnaerobicTM (Компания "HiMedia" (Индия)), после чего выделяют геномную ДНК.
Клетки из 20 мл ночной культуры осаждают центрифугированием при 4000g в течение 10 мин и ресуспендируют в 10 мл буфера (10 мМ Трис-НС1, 10 мМ 3flTA-Na2, рН 8,0). Полученную суспензию центрифугируют в тех же условиях и осадок ресуспен- дируют в 500 мкл выше указанного буфера, затем суспензию переносят в 2-мл центри- фужную пробирку и добавляют 50 мкл хлороформа. Смесь энергично встряхивают с помощью вортекса (5 раз по 10 сек), вносят 100 мкл раствора лизоцима (60 мг/мл) и ин- кубируют 30 мин при 37°С. Добавляют 6 мкл РНКазы А (10 мг/мл) и инкубируют еще 30 мин при 37°С. Для лизиса клеток к суспензии добавляют 200 мкл 10% SDS и 200 мкл 5М NaCl, осторожно перемешивают и инкубируют 16 ч при 65°С. Полученный лизат клеток остужают до комнатной температуры, добавляют 1 мл смеси фенол/хлороформ (1 :1) и перемешивают путем переворачивания пробирки в течение 5 мин до состояния гомогенной эмульсии. Затем смесь центрифугируют при 12000g в течение 15 мин. Вод- ную фазу, содержащую ДНК, отбирают в новую 1,5-мл пробирку и смешивают с 600 мкл изопропанола. Смесь инкубируют 30 мин при комнатной температуре и центрифу- гируют при 12000g в течение 20 мин. Осадок ДНК трижды промывают порциями по 0,5 мл 75% этанола с центрифугированием по 5 мин при 12000g и растворяют в 100 мкл во- ды.
Амплификацию ДНК проводят с использованием набора «Амплификация» фир- мы «Dialat Ltd» на приборе «Терцик» («ДНК-технология»). Состав смеси для ПЦР (на 100 мкл): 10 мкл ЮхПЦР буфера, 10 мкл смеси 2,5mM IdNTPs, 4 мкл 50тМ MgCl2, 0,3 мкг геномной ДНК и 0,8 мкл фермента Taq-полимеразы. Олигонуклеотидные праймеры добавляют в концентрации 20 пмоль на 100 мкл смеси.
Параметры ПЦР реакции: 95°С в течение 5 мин (лизис клеток и денатурация ге- номной ДНК); затем 30 циклов амплификации - 94°С - 1 мин (денатурация), 60°С в те- чение 1 мин (отжиг олигонуклеотидов), 72°С - 1 мин (достройка (элонгация) цепи); фи- нальная элонгация фрагментов при 72°С - 10 мин, хранение при 4°С.
Результаты исследования учитывают путем анализа продуктов амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в 1% агарозном геле. В пробирки с ис- следуемыми образцами после завершения амплификации вносят аккуратно под масло 1/5 объема раствора 6Х DNA Loading Dye («Fermentas»), перемешивают и 8 мкл полу- ченного образца вносят в лунки агарозного геля. Электрофорез проводят в камере для горизонтального электрофореза "SE-2" (Компания «Хеликон») с источником питания " Эльф-4 " («ДНК-технология») при напряжении 120 вольт в течение 60 мин. Результаты электрофореза учитывают в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254 нм на тран- силлюминаторе ТСР-20 МС («Vilber Lourmat», Франция). В качестве контроля размера полученного фрагмента используют ДНК маркер Gene uler™ 100+ п.н. («Fermentas»).
Примеры идентификации по настоящему изобретению.
Пример 1.
Идентификация групп и отдельных видов лактобацилл
Для идентификации групп L. acidophilus, L. plantarum и L.casei, видов L. acidophilus, L. helveticus и L.rhamnosus проводят амплификацию с геномной ДНК с использованием олигонуклеотидов, представленых в таблице 2. ПЦР продукты анали- зируют в 1% агарозном геле. Размер полученного фрагмента определяют с помощью ДНК-маркера GeneRuler™ 100+ п.н. («Fermentas»).
Исследуемый штамм относится к группе L. acidophilus в случае наработки фраг- ментов при использовании олигонуклеотидов LacN и LacC; в случае наличия ПЦР про- дуктов с использованием олигонуклеотидов LhvlN и LhvlC - к виду L. helveticus.
Исследуемый штамм относится к группе L. plantarum в случае наработки фраг- ментов при использовании олигонуклеотидов LplN и LplC.
Исследуемый штамм относится к группе L.casei в случае наработки фрагментов при использовании олигонуклеотидов LcsN и LcsC; в случае наличия ПЦР продуктов с использованием олигонуклеотидов LcslN и LcslC к виду L.casei; RelERIN и RelERIC - к виду L.rhamnosus.
Пример 2.
Идентификация штаммов Lactobacillus ramnosus.
Для штамм-специфической идентификации проводят амплификацию с геномной ДНК с использованием олигонуклеотидов, представленых в таблице 3. ПЦР продукты анализируют в 1% агарозном геле. Размер полученного фрагмента определяют с помо- щью ДНК-маркера GeneRuler™ 100+ п.н. («Fermentas»).
Исследуемый штамм идентичен штамму L.ramnosus GG в случае наработки фрагментов при использовании олигонуклеотидов RelBRlN-RelBRlC. При использова- нии остальных олигонуклеотидов не должно быть ПЦР-продуктов.
Исследуемый штамм идентичен штамму L.ramnosus Lc705 в случае наличия ПЦР-продуктов только при использовании олигонуклеотидов RelBR2N-RelBR2C и RelBR3N-RelBR3 С .
Исследуемый штамм идентичен штамму L.ramnosus HN001 в случае наличия ПЦР-продуктов только при использовании олигонуклеотидов RelBRlN-RelBRlC и RelBR2N-RelBR2C .
Исследуемый штамм идентичен штамму L.ramnosus LMS2-1 в случае наличия ПЦР-продуктов при использовании олигонуклеотидов RelBR2N-RelBR2C и RelBR3N- RelBR3C, а также при использовании олигонуклеотидов MazFR3N-MazFR3C и MazER3N- MazER3C.
Исследуемый штамм идентичен штамму L.ramnosus АТСС 8530 в случае наличия ПЦР-продуктов только при использовании олигонуклеотидов RelBR2N-RelBR2C. Пример 3.
Идентификация штаммов лактобактерий, выделенных из микробиоты жи- телей России.
С использованием сконструированных праймеров для генов систем токсин- антитоксин MazEF и RelBE проведена идентификация групп штаммов лактобактерий из коллекции лаборатории генетики микроорганизмов Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, выделенных из микробитоы практически здоровых людей Цен- трального региона России.
В коллекции обнаружены штаммы, принадлежащие к видам L. plantarum, L. rhamnosus, L.casei и L. helveticus.
На втором этапе проводили штаммовую идентификацию вида L. rhamnosus. Ис- ходя из композиции генов систем токсин-антитоксин суперсемейств MazEF и RelBE среди 15 штаммов L. rhamnosus показано штаммовое разнообразие лактобацилл из Рос- сийской коллекции. Таким образом, данный подход позволяет идентифицировать штаммовую специфичность в пределах вида L. rhamnosus.
12
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Таблица 1.
Распределение генов систем токсин-антитоксин суперсемейств MazEF и
RelBE
в геномах секвенированных штаммов Lactobacillus ramnosus.
Figure imgf000015_0001
13
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Таблица 2.
Олигонуклеотиды для идентификации групп и отдельных видов лактоба- цилл.
Figure imgf000016_0001
14
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Таблица 3.
Олигонуклеотиды для штаммовой идентификации лактобацилл
вида Lactobacillus ramnosus.
Figure imgf000017_0001
15
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Перечень последовательностей
1. Последовательности для идентификации групп и отдельных видов лактоба- цилл
1.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов антитокси- на relB штаммов группы Lactobacillus acidophilus и локализация олигонуклеотидов LacN, LacC.
Pr LacN— *·
ATCC 4796 ATGACGATTATGGCAGAAAAAACAAC§GGACTTTATGTCAGAATGAATCCAGAAAAGAAG 60
NCFM ATGGCAGAAAAAACAACJGGACTTTATGTCAGAATGAATCCAGAAAAGAAG 51
30SC ATGGCAGAAAAAACAACAGGACT TATGTCAGAATG ATCCAGAAAAGAAG 51
DPS 4571 ATGGСAGAAAAAACAACAGGACTTTATGTСAGAATGAATССAGAAAAGAAG 51
MTCC 5463 ATGGCAGAAAAAACAACAGGACTTTATGTCAGAATGAATCCAGAAAAGAAG 51
H10 -: ATGGCAGAAAAAACAACAGGACTTTATGTCAGAATGAATCCAGAAAAGAAG 51
DSM 20075 ; ATGGCAGAAAAAACAACAGGACTTTATGTCAGAATGAAtCCAGAAAAGAAG 51
GRL 1112 — ATGGСAGAAAAAACAACAGGACTTTATGTСAGAATGAATCCAGAAAAGAAG 51
GRL 1118 — ATGGCAGAAAAAACAACAGGACTTTATGTCAGAATGAATCCAGAAAAGAAG 51
JV-V01 ATGGСAGAAAAAACAACAGGACTTTATGTСAGAATGAATCCAGAAAAGAAG 51
125-2-CHN ATGGСAGAAAAAACAACAGGACTTTATGTСAGAATGAATССAGAAAAGAAG 51
MV-1A-US ATGGCAGAAAAAACAACAGGACTTTATGTCAGAATGAATCCAGAAAAGAAG 51
MV-3A-US ATGGCAGAAAAAACAACAGGACTTTATGTCAGAATGAATCCAGAAAAGAAG 51
214-1 ATGGCAGAAAAAACAACAGGACTTTATGTCAGAATGAATCCAGAAAAGAAG 51
***************** . *********************************
ATCC 4796 GAAAAGGC|GAAGCTATT|TGAAAAAGCTGGG|TT|AATTC|GCTACGGCAATTAACATG
120
NCFM GAAAAGGC§GAAGCTATT§TGAAAAAGCTGGGgTT§AATTC|GCTACGGCAATTAACATG 111
30SC GAAAAGGCAGAAGCTATTCTGAAAAAGCTGGGGTTAAATTCAGCTACGGCAATTAACATG 111
DPS 4571 GAAAAGGCAGAAGCTATTCTGAAAAAGCTGGGGTTAAATTCAGCTACGGCAATTAACATG 111
MTCC 5463 GAAAAGGCAGAAGCTATTCTGAAAAAGCTGGGGTTAAATTCAGCTACGGCAATTAACATG 111
H10 GAAAAGGCAGAAGCTATTCTGAAAAAGCTGGGGTTAAATTCAGCTACGGCAATTAACATG 111
DSM 20075 GAAAAGGCAGAAGCTATTCTGAAAAAGCTGGGGTTAAATTCAGCTACGGCAATTAACATG 111
GRL 1112 GAAAAGGCAGAAGCTATTCTGAAAAAGCTGGGGTTAAATTCAGCTACGGCAATTAACATG 111
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 GRL 1118 GAAAAGGCAGAAGCTATTCTGAAAAAGCTGGGGTTAAATTCAGCTACGGCAATTAACATG 111
JV-V01 GAAAAGGCAGAAGCTATTCTGAAAAAGCTGGGGTTAAATTCAGCTACGGCAATTAACATG 111
125-2-CHN GAAAAGGCAGAAGCTATTCTGAAAAAGCTGGGGTTAAATTCAGCTACGGCAATTAACATG 111
MV-IA-US GAAAAGGCAGAAGCTATTCTGAAAAAGCTGGGGTTAAATTCAGCTACGGCAATTAACATG 111
MV-3A-US GAAAAGGCAGAAGCTATTCTGAAAAAGCTGGGGTTAAATTCAGCTACGGCAATTAACATG 111
214-1 GAAAAGGCAGAAGCTATTCTGAAAAAGCTGGGGTTAAATTCAGCTACGGCAATTAACATG 111
******** . ********* . ************* . * * . ***** . ******************
ATCC 4796 [TATGATC |ATTATT|T|CATAATGGTATTCCTTT AGAGT|GAGATTCCAAATGCA
180
NCFM |TATGATCA ATTATT|T|CATAATGGTATTCCTTT|AGAGT|GAGATTCCAAATGCA
171
30SC TTCTATGATCAGATTATTCTTCATAATGGTATTCCTTTCAGAGTAGAGATTCCAAATGCA
171
DPS 4571 TTCTATGATCAGATTATTCTTCATAATGGTATTCCTTTCAGAGTAGAGATTCCAAATGCA 171
MTCC 5463 TTCTATGATCAGATTATTCTTCATAATGGTATTCCTTTCAGAGTAGAGATTCCAAATGCA
171
H10 TTCTATGATCAGATTATTCTTCATAATGGTATTCCTTTCAGAGTAGAGATTCCAAATGCA
171
DSM 20075 TTCTATGATCAGATTATTCTTСATAATGGTATTCCTTТСAGAGTAGAGATТССAAATGC 171
GRL 1112 TTCTATGATCAGATTATTCTTCATAATGGTATTCCTTTCAGAGTAGAGATTCCAAATGCA 171
GRL 1118 TTCTATGATСAGATTATTСTTСATAATGGTATTCCTTTСAGAGTAGAGATTCCAAATGCA 171
JV-V01 TTCTATGATCAGATTATTCTTCATAATGGTATTCCTTTCAGAGTAGAGATTCCiAATGCA 171
125-2-CHN TTCTATGATCAGATTATTCTTCATAATGGTATTCCTTTCAGAGTAGAGATTCCJAATGCA 171
MV-IA-US TTCTATGATCAGATTATTCTTCATAATGGTATTCCTTTCAGAGTAGAGATTCClAATGCA 171
MV-3A-US TTCTATGATCAGATTATTCTTCATAATGGTATTCCTTTCAGAGTAGAGATTCCJAATGCA
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 171
214-1 TTCTATGATCAGATTATTCTTCATAATGGTATTCCTTTCAGAGTAGAGATTCC§|AATGCA
171
* * . ******** . ****** . * . ***************** . ***** · ******** · ******
— Pr LacC
ATCC 4796 TGGGATAAT T TGGAT С AAAT GAATAAG TAT GAATAC|C САЩДТ GCTT GACGA|C G jc т|
240
NCFM TGGGATAATTTGGATCAAATGAATAAGTATGAATAC|CC.H|TGCTTGACGA|CG|CT|
231
30SC TGGGATAATTTGGATCAAATGAATAA TATGAATACGCCAAACTGCTTGACGAGCGCCTG
231
DPS 4571 TGGGATAATTTGGATCAAATGAATAAGTATGAATACGCCAAACTGCTTGACGAGCGCCTG 231
MTCC 5463 TGGGATAATTTGGATCAAATGAATAAGTATGAATACGCCAAACTGCTTGACGAGCGCCTG
231
H10 TGGGATAATTTGGATCAAATGAATAAGTATGAATACGCCAAACTGCTTGACGAGCGCCTG
231
DSM 20075 TGGGATAATTTGGATCAAATGAATAAGTATGAATACGCCAAACTGCTTGACGAGCGCCTG 231
GRL 1112 TGGGATAATTTGGATCAAATGAATAAGTATGAATACGCCAAACTGCTTGACGAGCGCCTG 231
GRL 1118 TGGGATAATTTGGATCAAATGAATAAGTATGAATA GCCAAACTGCTTGACGAGCGCCTG 231
JV-V01 TGGGATAATTT|GATCAAATGAATAAGTATGAATACGCCAAACTGCTTG§CGAGCGCCTG 231
125-2-CHN TGGGATAATTT|GATCAAATGAATAAGTATGAATACGCCAAACTGCTTG|CGAGCGCCTG 231
MV-1A-US TGGGATAATTT|GATCAAATGAATAAGTATGAATACGCCAAACTGCTTG|CGAGCGCCTG 231
MV-3A-US TGGGATAATTT|GATCAAATGAATAAGTATGAATACGCCAAACTGCTTG|CGAGCGCCTG 231
214-1 TGGGATAATTT|GATCAAATGAATAAGTATGAATACGCCAAACTGCTTG|CGAGCGCCTG 231
ATCC 4796 AA|ACBT!AG|GGAAGG1AAGATTTBT|GGAGA PT|GCCAAGMCTTGATG^IGA1
300
NCFM AAMACMT!AGIGGAAGGIAAGATTTMTIGGAGAMTIGCCAAGB CTTGATGWG
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 291
30SC AACACATTGACCGGAAGGGAAGATTTACTTGGAGATATCGCCAAGAGGCTTGATGCGGAA
291
DPS 4571 AACACATTGAICGGAAGGGAAGATTTACTTGGAGATATCGCCAAGAGGCTTGATGCGGAA 291
MTCC 5463 AACACATTGAgCGGAAGGGAAGATTTAATTGGAGATATCGCCAAGAGGCTTGATGCGGAA
291
H10 AACACATTGAICGGAAGGGAAGATTTACTTGGAGATATCGCCAAGAGGCTTGATGCGGAA
291
DSM 20075 AACACATTGAiCGGAAGGGAAGATTTACTTGGAGATATCGCGAAGAGGCTTGATGCGGAA 291
GRL 1112 AACACATTGA|CGGAAGGGAAGATTTACTTGGAGATATCGCCAAGATGCTTGATGCGGAA 291
GRL 1118 AACACATTGACCGGAAGGGAAGATTTACTTGGAGATATCGCCAAGAGGCTTGATGCGGAA 291
JV-V01 AACACATTGAGCGGAAGGAAAGATTTSCTTGGAGATGTCGCCAAGAGGCTTGATGCGGAA 291
125-2-CHN AACACATTGAGCGGAAGGAAAGATTTlCTTGGAGATGTCGCCAAGAGGCTTGATGCGGAA 291
MV-IA-US AACACATTGAGCGGAAGGAAAGATTTlCTTGGAGATGTCGCCAAGAGGCTTGATGCGGAA 291
MV-3A-US AACACATTGAGCGGAAGGAAAGATTTICTTGGAGATGTCGCCAAGAGGCTTGATGCGGAA 291
214-1 AACACATTGAGCGGAAGGAAAGATTTHCTTGGAGATGTCGCCAAGAGGCTTGATGCGGAA 291
ATCC 4796 AA AAAGAAAGABA TAA 318
NCFM AA AAAGAAAGAHABTAA 309
3'OSC AAGAATGAAAAGAAAGACAACTAA 315
DPS 4571 AAGAATGAAAAGAAAGACAACTAA 315
MTCC 5463 AAGAATGAAAAGAAAGACAACTAA 315
H10- AAGAATGAAAAGAAAGACAACTAA 315
DSM 20075 AAGAATGAAAAGAAAGACAACTAA 315
GRL 1112 AAGAATGAAAAGAAAGACAACTAA 315
GRL 1118 AAGAATGAAAAGAAAGACAACTAA 315
JV-V01 AAGAATGAAAAGAAAGACAACTAA 315
125-2-CHN AAGAATGAAAAGAAAGACAACTAA 315
MV-IA-US AAGAATGAAAAGAAAGACAACTAA 315
MV-3A-US AAGAATGAAAAGAAAGACAACTAA 315 214-1 AAG AAT G AAAAG AAAG AC AAC AA 315
1.2. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов антитокси- на relB штаммов вида Lactobacillus helveticus и локализация олигонуклеотидов LhvlN и LhvlC.
Рг LhvlN—
DPS 4571 ATGGATTACAAAGATCAAACTTCGATGCAAAAAACACAACTAAGCATTTCCGTTGATGAA 60
МТСС 5463 AT G GAT Т AC AAAG AT С AAAG T T С G AT G С AAAAAAC AC AAC AAG CATTTCCGTT G AT G AA 60
H10 ATGGATTACAAAGATCAAACTTCGATGCAAAAAACACAACTAAGCATTTCCGTTGATGAA. 60
DS 20075 ATGGATTACAAAGATCAAACTTCGATGCAAAAAACACAACTAAGCATTTCCGTTGATGAA 60
************************************************
DPS 4571 GATTTAGCTAAGGATGTCCAAGAAAAATTAGAAATGCTAGGATTAGATCAAAGTGATTTT 120
MTCC 5463 GATTTAGCTAAGGATGTCCAAGAAAAATTAGAAATGCTAGGATTAGATCAAAGTGATTTT 120
H10 GATTTAGCTAAGGATGTCCAAGAAAAATTAGAAATGCTAGGATTAGATCAAAGTGATTTT 120
DSM 20075 GATTTAGCTAAGGATGTCCAAGAAAAATTAGAAATGCTAGGATTAGATCAAAGTGATTTT 120
***************************************
DPS 4571 TTAATAGGCCTTTTGACTAATATAGCTAATAATAAAAAATTA|CTTTTAGCAAGCTTACT 180
MTCC 5463 TTAATAGGCCTTTTGACTAATATAGCTAATAATAAAAAATTACCTTTTAGCAAGCTTACT 180
H10 TTAATAGGCCTTTTGACTAATATAGCTAATAATAAAAAATTACCTTTTAGCAAGCTTACT 180
DSM 20075 TTAATAGGCCTTTTGACTAATATAGCTAATAATAAAAAATTACCTTTTAGCAAGCTTACT 180
****************************************** . *****************
DPS 4571 AATGAAGAAGAGGAAAAAGCAATATTGGCT|CTAAATTAAGTGCATTAACAACGAGCTGG 240
MTCC 5463 AATGAAGAAGAGGAAAAAGCAATATTGGCTGCTAAATTAAGTGCATTAACAACGAGCTGG 240
H10 AATGAAGAAGAGGAAAAAGCAATATTGGCTGCTAAATTAAGTGCATTAACAACGAGCTGG 240
DSM 20075 AATGAAGAAGAGGAAAAAGCAATATTGGCTGCTAAATTAAGTGCATTAACAACGAGCTGG 240
****************************** , ***************************** — Pr LhvlC
DPS 4571 GGAAATATTCCTGAGTTAAAGAATTTACAACAGTTGAAAGAGTGGCTGAATGAAGAAAJA 300 MTCC 5463 GGAAATATTCCTGAGTTAAAGAATTTACAACAGTTGAAAGAGTGGCTGAATGAAGAAA|A 300 H10- GGAAATATTCCTGAGTTAAAGAATTTACAACAGTTGAAAGAGTGGCTGAATGAAGAAABA 300
DSM 20075 GGAAATATTCCTGAGTTAAAGAATTTACAACAGTTGAAAGAGTGGCTGAATGAAGAAAAA
ИСТ ПРАВИЛО 26 DPS 4571 7AACGATTAA 309
MTCC 5463 AACGATTAA 309
H10 AACGATTAA 309
DSM 20075 AACGATTAA 309
1.3. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов токсина mazF штаммов группы Lactobacillus plantarum и локализация олигонуклеотидов LplN и LpIC.
Pr LplN— ».
АТСС 14917 ATGGCCGCAGCTGACATTAAGCGTGGTGACATCTTTTATGCAGATTTATCACCAGTCGTA 60
WCFS1 ATGGCCGCAGCTGACATTAAGCGTGGTGACATCTTTTATGCAGATTTATCACCAGTCGTA 60
JDM1 ATGGCCGCAGCTGACATTAAGCGTGGTGACATCTTTTATGCAGATTTATCACCAGTCGTA 60
ST-III ATGGCCGCAGCTGACATTAAGCGTGGTGACATCTTTTATGCAGATTTATCACCAGTCGTA 60
IG1 ATGGC|GCAGCTGACATTAAGCGTGGTGA|AT|TT|TATGCAGATTTATCACCAGTCGT| 60
МР-10 ATGGC|GCAGCTGACATTAAGCGTGGTGA|AT|TT|TATGCAGATTTATCACCAGTCGT| 60
*****.***********************.**.**.***********************.
АТСС 14917 GGCTCCGAACAAGGAGGCATGCGTCCAGTACTAATCGTGCAAAATAATGTCGGTAACCAT 120
WCFS1 GGCTCCGAACAAGGAGGCATGCGTCCAGTACTAATCGTGCAAAATAATGTCGGTAACCAT 120
JDM1 GGCTCCGAACAAGGAGGCATGCGTCCAGTACTAATCGTGCAAAATAATGTCGGTAACCAT 120
ST-III GGCTCCGAACAAGGAGGCATGCGTCCAGTACTAATCGTGCAAAATAATGTCGGTAACCAT 120
IG1 GGCTCCGAACA|GG|GGCATGCG|CCAGT|CTAATCGT|CAAAATAATGTCGGTAACCAT 120
МР-10 GGCTCCGAACA|GG|GGCATGCG|CCAGT|CTAATCGT|CAAAATAATGTCGGTAACCAT 120
******* *** . ** . ******** . ***** . ******** . *********************
АТСС 14917 TACAGTCCCACAGTGATTGTCGCGGCAATCACTGCTAAGGTTCAAAAAGCGAAGATGCCA 180 CFS1 TACAGTCCCACAGTGATTGTCGCGGCAATCACTGCTAAGGTTCAAAAAGCGAAGATGCCA 180
JDM1 TACAGTCCCACAGTGATTGTCGCGGCAATCACTGCTAAGGTTCAAAAAGCGAAGATGCCA 180
ST-III TACAGTCCCACAGTGATTGTCGCGGCAATCACTGCTAAGGTTCAAAAAGCGAAGATGCCA 180
IG1 TACAGTCCCAC|GTGATTGT|GC|GCAAT|ACTGC AAGGTTCAAAAAGCGAA|ATGCC| 180
МР-10 TACAGTCCCAC|GTGATTGT|GC|GCAAT§ACTGC|AAGGTTCAAAAAGCGAA|ATGCC| 180
***********.********.**.*****.*****.*****************.*****.
АТСС 14917 ACACATGTTAACATCAACGCTGCCCATACGGGGATTGAAAAAAATTCGGTTGTGTTGTTG 240 CFS1 ACACATGTTAACATCAACGCTGCCCATACGGGGATTGAAAAAAATTCGGTTGTGTTGTTG 240
JDM1 ACACATGTTAACATCAACGCTGCCCATACGGGGATTGAAAAAAATTCGGTTGTGTTGTTG 240
ST-III ACACATGTTAACATCAACGCTGCCCATACGGGGATTGAAAAAAATTCGGTTGTGTTGTTG 240
IG1 AC(CA|GT|AACAT|AACGCTGCCCA ACGGGGATTGAAAAAAATTCGGTTGT TTGTT| 240
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 мр-10 AC§CA|GT|AACAT|AACGCTGCCCASACGGGGATTGAAAAAAATTCGGTTGT|TTGTT| 24
ATCC 14917 GAGCAGATACGAACGATTGATAAGCAACGGCTTAAAGATCGCGTCACTCATTTGGATGAT 300
WCFS1 GAGCAGATACGAACGATTGATAAGCAACGGCTTAAAGATCGCGTCACTCATTTGGATGAT 300
JDM1 GAGCAGATACGAACGATTGATAAGCAACGGCTTAAAGATCGCGTCACTCATTTGGATGAT 300
ST-III GAGCAGATACGAACGATTGATAAGCAACGGCTTAAAGATCGCGTCACTCATTTGGATGAT 300
IG1 GAGCABAT|CGAACGATTGATAAGCAACGGCTTAAAGATCG|GTCAC|CA|TTGGATGA| 300
MP-10 GAGCA|AT|CGAACGATTGATAAGCAACGGCTTAAAGATCG|GTCACiCAfTTGGATGA| 300
***** . ** . ******************************** . ***** . ** . ******** .
4— Pr LplC
ATCC 14917 CAGACGATGCGCCGAGTTGATAATGCGTTACAGATTAGTATTGGGTTAGCTGATCGAACA 360 CFS1 CAGACGATGCGCCGAGTTGATAATGCGTTACAGATTAGTATTGGGTTAGCTGATCGAACA 360
JDM1 CAGACGATGCGCCGAGTTGA AATGCGTTACAGATTAGTATTGGGTTAGCTGTСGAACA 360
ST-III CAGACGATGCGCCGAGTTGATAATGCGTTACAGATTAGTATTGGGTTAGCTGATCGAACA 360
IG1 CA|ACGATGCGCCGAGTTGATAATGCGTTACA|ATTAGTAT|GGGTTAGCTGA|CGAACA 360
MP-10 CA|ACGATGCGCCGAGTTGATAATGCGTTACA|ATTAGTAT|GGGTTAGCTGACGAACA 360
** . ***************************** . ******** . *********** . ******
ATCC 14917 CGACGTCGGCCACAACGCACGTTTCAATCATAG 393
WCFS1 CGACGTCGGCCACAACGCACGTTTCAATCATAG 393
JDM1 СGACGTСGGCСACAACGCACGTTTСAATСA AG 393
ST-III CGACGTCGGCCACAACGCACGTTTCAATCATAG 393
IG1 CGACGiCGGCCACAACGCACGTT|CAATCATAG 393
MP-10 CGACG|CGGCCACAACGCACGTT|CAATCATAG 393
***** . ***************** . *********
1.4. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов токсина mazF штаммов группы Lactobacillus casei.
Pr LcslN p>
ATcc 334 ATGGATGTGTCCGTAAAACGCGGCGATGTTTTTTTCGCCGATCTGTCTCCGGTTGTCGGC 60
BL23 ATGGATGTGTCCGTAAAACGCGGCGATGTTTTTTTCGCCGATCTGTCTCCGGTTGTCGGC 60
Zhang ATGGATGTGTCCGTAAAACGCGGCGATGTTTTTTTCGCCGATCTGTCTCCGGTTGTCGGC 60
LC2W ATGGATGTGTCCGTAAAACGCGGCGATGTTTTTTTCGCCGATCTGTCTCCGGTTGTCGGC 60
BD-II ATGGATGTGTCCGTAAAACGCGGCGATGTTTTTTTCGCCGATCTGTCTCCGGTTGTCGGC 60
ATcc 25302 ATGGATGTGTCCGTAAAACGCGGCGATGTTTTTTTCGCCGATCTGTCTCCGGTTGTCGGC 608700:2 GTGTCCGTAAAACGCGGCGATGTTTTTTTCGCCGATCTGTCTCCGGTTGTCGGC 54
GG ATGGATGTHC|GT|AAACGCGG|GATGT|TTTTTCGCCGAT|T|TC|CCGGTTGTCGG| 60
Lc705 ATGGATGTHC|GT|AAACGCGG|GATGT|TTTTTCGCCGAT|T|TC|CCGGTTGTCGG| 60
HN001 ATGGATGTHC|GT|AAACGCGG|GATGT|TTTTTCGCCGAT|T|TC|CCGGTTGTCGG| 60
LMS2-1 ATGGATGTH|C|GT|AAACGCGG|GATGT|TTTTTCGCCGAT|T|TC|CCGGTTGTCGG| 60
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 ATCC 8530 ATGGATGTAACAGTCAAACGCGGGGATGTATTTTTCGCCGATTTATCGCCGGTTGTCGGG 60
* * ..*.**.********.*****.************.*.**.***********
Pr LcsN —^
ATCC 334 TCCGAACAAGGCGGCAACCGGCCAGTACTTATTATTCAAAACAACGTTGGCAACCATTAC 120
BL23 TCCGAACAAGGCGGCAACCGGCCAGTACTTATTATTCAAAACAACGTTGGCAACCATTAC 120
Zhang TCCGAACAAGGCGGCAACCGGCCAGTACTTATTATTCAAAACAACGTTGGCAACCATTAC 120
LC2 TCCGAACAAGGCGGCAACCGGCCAGTACTTATTATTCAAAACAACGTTGGCAACCATTAC 120
BD-II TCCGAACAAGGCGGCAACCGGCCAGTACTTATTATTCAAAACAACGTTGGCAACCATTAC 120
ATCC 25302 TCCGAACAAGGCGGCAACCGGCCAGTACTTATTATTCAAAACAACGTTGGCAACCATTAC 120
8700:2 TCCGAACAAGGCGGCAACCGGCCAGTACTTATTATTCAAAACAACGTTGGCAACCATTAC 114
GG TC|GAACAAGGCGGCAACCGGCC|GTACTTATTATTCAAAA|AACGTTGG|AA|CA|TA| 120
Lc705 TC|GAACAAGGCGGCAACCGGCC|GTACTTATTATTCAAAA|AACGTTGG|AA|CA|TA| 120
HN001 TC|GAACAAGGCGGCAACCGGCC|GTACTTATTATTCAAAA|AACGTTGG|AA|CA|TA| 120
LMS2-1 TC|GAACAAGGCGGCAACCGGCC|GTACTTATTATTCAAAACAA GTTGGTAACCATTA| 120
ATCC 8530 TC|GAACAAGGCGGCAACCGGCC|GTACTTATTATTCAAAACAA|GTTGGTAACCATTA 120
* * . ******************** . ***************** . * * . ***** . * * · * * · * * .
ATCC 334 AGTCCCACAGTGATTGTGGCAGCCATTACCTCCAAGATTCAAAAACCCAAGATGCCGACG 30
BL23 AGTCCCACAGTGATTGTGGCAGCCATTACCTCCAAGATTCAAAAACCCAAGATGCCGACG 30
Zhang AGTCCCACAGTGATTGTGGCAGCCATTACCTCCAAGATTCAAAAACCCAAGATGCCGACG и 30
LC2 AGTCCCACAGTGATTGTGGCAGCCATTACCTCCAAGATTCAAAAACCCAAGATGCCGACG 30
BD-II AGTCCCACAGTGATTGTGGCAGCCATTACCTCCAAGATTCAAAAACCCAAGATGCCGACG 1ί 30
ATCC 25302 AGTCCCACAGTGATTGTGGCAGCCATTACCTCCAAGATTCAAAAACCCAAGATGCCGACG 30
8700:2 AGTCCCACAGTGATTGTGGCAGCCATTACCTCCAAGATTCAAAAACCCAAGATGCCGACG 174
GG AGTCCCAC|GT|ATTGTGGC|GCCATTACCTCCAA AT|CAAAAACCCAA|ATGCC AC| и 30
Lc705 AGTCCCAC|GT|ATTGTGGC|GCCATTACCTCCAA|AT|CAAAAACCCAA|ATGCC AC| и 30
HN001 AGTCCCAC|GT|ATTGTGGC|GCCATTACCTCCAA|AT|CAAAAACCCAA|ATGCC|AC| и 30
LMS2-1 AG|CCCAC|GT|AT|GTGGC|GCCATTACCTCCAA|AT|CAAAAACCCAA|ATGCC|AC| и 30
ATCC 8530 AG|CCCAC|GT|AT|GTGGC|GCCATTACCTCCAA|AT|CAAAAACCCAA|ATGCC|AC| 1ί 30
**·***** ** **.*****.**************.**.***********.*****.**
ATCC 334 CATGTCGGGTTACGGGCCAAGCAAGATGGCGTTGAACGCAACTC|GTCATTTTACTTGAG 240
BL23 CATGTCGGGTTACGGGCCAAGCAAGATGGCGTTGAACGCAACTCGGTCATTTTACTTGAG 240
Zhang CATGTCGGGTTACGGGCCAAGCAAGATGGCGTTGAACGCAACTCGGTCATTTTACTTGAG 240
LC2 CATGTCGGGTTACGGGCCAAGCAAGATGGCGTTGAACGCAACTCGGTCATTTTACTTGAG 240
BD-II CATGTCGGGTTACGGGCCAAGCAAGATGGCGTTGAACGCAACTCGGTCATTTTACTTGAG 240
ATCC 25302 CATGTCGGGTTACGGGCCAAGCAAGATGGCGTTGAACGCAACTCGGTCATTTTACTTGAG 240
8700:2 CATGTCGGGTTACGGGCCAAGCAAGATGGCGTTGAACGCAACTCGGTCATTTTACTTGAG 234
GG CATGTCGG|TT|CG|GCCAAGCAAGA|GG|GTTGA§CG|AA TC|GTCATTTT|CTTGA| 24 О
Lc705 CATGTCGG|TT|CG|GCCAAGCAAGA|GG|GTTGA|CG|AA|TC|GTCATTTT|CTTGA| 240
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 CATGTCGG|TT|CG|GCCAAGCAAGAJ|GG|GTTGA|CG|AA|TC|GTCATTTT|CTTGA| 24 О CATGTCGG|TT|CG|GCCAAGCAAGA GG|GTTGA|CG AA TC|GTCATTTT|CTTGA 2 0 CATGTCGG|TT|CG|GCCAAGCAAGA|GG|GTTGA|CG|AA§TC|GTCATTTT|CTTGA| 240
ATCC 334 CAAATTCGCACGATTGACAAGCAACGGCTACAAGCCCGCGTGACAGCTCTGTCAAGCACC 300
BL23 CAAATTCGCACGATTGACAAGCAACGGCTACAAGCCCGCGTGACAGCTCTGTCAAGCACC 300
Zhang CAAATTCGCACGATTGACAAGCAACGGCTACAAGCCCGCGTGACAGCTCTGTCAAGCACC 300
LC2W CAAATTCGCACGATTGACAAGCAACGGCTACAAGCCCGCGTGACAGCTCTGTCAAGCACC 300
BD-II CAAATTCGCACGATTGACAAGCAACGGCTACAAGCCCGCGTGACAGCTCTGTCAAGCACC 300
ATCC 25302 CAAATTCGCACGATTGACAAGCAACGGCTACAAGCCCGCGTGACAGCTCTGTCAAGCACC 300
8700:2 CAAATTCGCACGATTGACAAGCAACGGCTACAAGCCCGCGTGACAGCTCTGTCAAGCACC 294
GG CA|ATTCG|AC|ATTGA|AAGCAACGG|TACA|GC|CGCGT|AC|GCTCT|TCAAGH|CC ЗОО
Lc705 CA|ATTCG|AC|ATTGA|AAGCAACGG|TACA|GC|CGCGT|AC|GCTCT|TCAAGHCC ЗОО HNOOl CA|ATTCG|AC|ATTGA|AAGCAACGG|TACA|GC|CGCGT|AC|GCTCT|TCAAGH|CC ЗОО LMS2-1 CA|ATTCG|AC|ATTGA|AAGCAACGG|TACA|GC|CGCGT|AC|GCTCT|TCAAG§|CC ЗОО ATCC 8530 CA|ATTCG|AC|ATTGA|AAGCAACGG|TACA|GC|CGCGT§AC|GCTCT|TCAAGHCC 300
Pr LcslC Pr LcsC
ATCC 334 AAAATGGCAGCAGTCGACCGCGCGTTGGCGATTTCAGTGGGTCTGGTCAGTTTGCCCAAG 360
BL23 AAAATGGCAGCAGTCGACCGCGCGTTGGCGATTTCAGTGGGTCTGGTCAGTTTGCCCAAG 360
Zhang AAAATGGCAGCAGTCGACCGCGCGTTGGCGATTTCAGTGGGHTGGTCAGTTTGCCCAAG 360
LC2W AAAATGGCAGCAGTCGACCGCGCGTTGGCGATTTCAGTGGGTCTGGTCAGTTTGCCCAAG 360
BD-II AAAATGGCAGCAGTCGACCGCGCGTTGGCGATTTCAGTGGGTCTGGTCAGTTTGCCCAAG 360
ATCC 25302 AAAATGGCAGCAGTCGACCGCGCGTTGGCGATTTCAGTGGGTCTGGTCAGTTTGCCCAAG 360
8700:2 AAAATGGCAGCAGTCGACCGCGCGTTGGCGATTTCAGTGGG§|TGGTCAGTTTGCCCAAG 354
GG AAAATGGCAGC|GT|GA|CG|GCHTGGCGAT|TC|GT|GG|CT|GTCAG|TTGCC|AAG З бо
Lc705 AAAATGGCAGC|GT|GA|CG|GC(|TGGCGAT|TC|GT|GG|CT|GTCAG|TTGCC|AAG З бо HNOOl AAAATGGCAGC|GT|GA|CG|GCH|TGGCGAT|TC|GT|GG|CT|GTCAG|TTGCC|AAG 360 LMS2-1 AAAATGGCAGC|GT|GA CG|GC(|TGGCGAT|TC|GT|GG|CT|GTCAG|TTGCC|AAG 360 ATCC 8530 AAAATGGCAGC|GT|GA|CG|GCB|TGGCGAT|TC|GT|GGBCT|GTCAG|TTGCC|AAG 360
* * * * * . * * * * * · * * *
ATCC 334 CCCAAAACATATAATAAGAATTAA 384
BL23 CCCAAAACATATAATAAGAATTAA 384
Zhang CCCAAAACATATAATAAGAATTAA 384
LC2 СCCAAAACATATAATAAGAATTAA 384
BD-II CCCAAAACATATAATAAGAATTAA 384
ATCC 25302 CCCAAAACATATAATAAGAATTAA 384
8700:2 CCCAAAACATATAATAAGAATTAA 378
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 GG CC|AAAACATATAATAA§AA§TAA 3i34
Lc705 CC|AAAACATATAATAA|AA§TAA 3i 34
HN001 CC|AAAACATATAATAA|AA|TAA 3iи
LMS2-1 CC|AAAACATATAATAAIAA|TAA 3i 34
ATCC 8530 сC|AAAACATATAATAA|AATAA 3i 34
* * . * * * * * * * * * * * * * * . * * . * * *
1.5. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов токсина relEl штаммов Lactobacillus ramnosus.
Pr RelERIN -
GG ATGCCCACCTCCCTGCCCCT|ATCGAACAATCCCGCTTCAAAAAACATCTCAAACAACTC 60
Lc 705 TGCCCACCTCCCTGCCCCTCATCGAACAATCCCGCTTCAAAAAACATCTCAAACAACTC 60
HN001 ATGCCCACCTCCCTGCCCCTCATCGAACAATCCCGCTTCAAAAAACATCTCAAACAACTC 60
LMS2-1 ATGCCCACCTCCCTGCCCCTCATCGAACAATCCCGCTTCAAAAAACATCTCAAACAACTC 60
ATCC 8530 ATGCCCACCTCCCTGCCCCTCATCGAACAATCCCGCTTCAAAAAACATCTCAAACAACTC 60
******************** . ***************************************
GG CT|CAAGCCGG|CGCTTCAC|AAGGCTGACTTTCAGCAAGT|CTTGCTTACTTACAAACC 120
LC 705 CTCCAAGCCGGGCGCTTCACCAAGGCTGACTTTCAGCAAGTCCTTGCTTACTTACAAACC 120
HN001 CTCCAAGCCGG|CGCTTCACCAAGGCTGACTTTCA|CAAGT|CTTGCTTACTTACAAACC 120
LMS2-1 CTCCAAGCCGGGCGCTTCACCAAGGCTGACTTTCAGCAAGTCCTTGCTTACTTACAAACC 120
ATCC 8530 CTCCAAGCCGGGCGCTTCACCAAGGCTGACTTTCAGCAAGTCCTTGCTTACTTACAAACC 120
GG AGCACCCCACTGCCGGAAAAGTATGACGATCACGTGATCAAAAAACGCAAACCAGATCGT 180
Lc 705 AGCACCCCACTGCCGGAAAAGTATGACGATCACGTGATCAAAAAACGCAAACCAGATCGT 180 HN001 AGCAC|CCACTGCCGGAAAAGTATGACGATСACGTGATСAAAAAACGCА ЩССAGATCGI 180 LMS2-1 AGCACCCCACTGCCGGAAAAGTATGACGATCACGTGATCAAAAAACGCAAACCAGATCGT 180 АТСС 85 AGCACCCCACTGCCGGAAAAGTATGACGATCACGTGATCAAAAAACGCAAACCAGATCGT 180 * ** ** · ******************************************** ********* .
«- Pr RelERIC
GG GCTTTGTTCATCAA|GGTAATTGGCTGCTCATTTACCGAGTTGAACCAGACGCGATCCGC 240
Lc 705 GCTTTGTTCATCAAAGGTAATTGGCTGCTCATTTACCGAGTTGAACCAGACGCGATCCGC 240 HN001 GCTTTGTTCATCAA|GGTAATTGGCTGCTCATTTA|CG|GTTGAACCAGACGCGATCCGC 240 LMS2-1 GCTTTGTTCATCAAAGGTAATTGGCTGCTCATTTACCGAGTTGAACCAGACGCGATCCGC 240 ATCC 8530 GCTTTGTTCATCAAAGGTAATTGGCTGCTCATTTACCGAGTTGAACCAGACGCGATCCGC 2 0
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 GG TTGATTGATGT|GGCCGCCATGGCGAGATTTAA 273
Lc 705 TTGATTGATGTTGGCCGCCATGGCGAGATTTAA 273
HN001 TTGATTGATGTTGGCCGCCATGGCGAGA|TTAA 273
LMS2-1 TTGATTGATGTTGGCCGCCATGGCGAGATTTAA 273
ATCC 8530 TTGATTGATGTTGGCCGCCATGGCGAGATTTAA 273
*********** . **************** . ****
2. Последовательности для идентификации штаммов Lactobacillus ramnosus
2.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов антитокси- на relBl штаммов Lactobacillus ramnosus и локализация олигонуклеотидов RelBRIN и RelBRlC.
Pr RelBRI — >
GG ATGGCAAAAGAATCCCGTATCCGCAATTGGATTAACACAATAACCAGAAAACGAGCTCTC 60
HN001 ATGGCAAAAGAATCCCGTATCCGCAATTGGATTAACACAATAACCAGAAAACGAGCTCTC 60
************************************************************
GG CATGTTCTTAATCGTCTGGGACTAGAGAGATTCTCGGCTATTAACATGTATTGGAAACGG 120
HN001 CATGTTCTTAATCGTCTGGGACTAGAGAGATTCTCGGCTATTAACATGTATTGGAAACGG 120
************************************************************
GG ATTGGTGACACCGGTGCATTGCCATTTACACTTGAAATGTCATTCGCCGATCAGCTTCGA 180
HN001 ATTGGTGACACCGGTGCATTGCCATTTACACTTGAAATGTCATTCGCCGATCAGCTTCGA 180
************************************************************
«- Pr RelBRlC
GG TTTGCAGAAGCAGATGTTAAAGCGGGGCGAATAAAAAGCTTCAAGACTGTTGGTGCTTTG 240
HN001 TTTGCAGAAGCAGATGTTAAAGCGGGGCGAATAAAAAGCTTCAAGACTGTTGGTGCTTTG 240
************************************************************
GG ATGAAGGAT T TAT AC AG GAT GTTGACGGT T AA 273
HN001 ATGAAGGATTTATACAGTGATGTTGACGGTTAA 273
*********************************
2.2. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов антитокси- на ге1В2 штаммов Lactobacillus ramnosus и локализация олигонуклеотидов ReIBR2N и RelBR2C.
Pr RelBR2N -»
Lc 705 ATGGAAGCAACGAATTATAGTGATTTCCGCCGCAACCTTAAGCATTATATGAGTCAAGTC 60
HN001 ATGGAAGCAACGAATTATAGTGATTTCCGCCGCAACCTTAAGCATTATATGAGTCAAGTC 60
LMS2-1 ATGGAAGCAACGAATTATAGTGATTTCCGCCGCAACCTTAAGCATTATATGAGTCAAGTC 60
11
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 ATCC 8530 ATGGAAGCAACGAATTATAGTGATTTCCGCCGCAACCTTAAGCATTATATGAGTCAAGTC 60
Lc 705 AACGAAGACGCCGAACCGCTACTGGTTACCGCTAAAGATGATGATGACAATGTGGTGGTT 120 HN001 AACGAAGACGCCGAACCGCTACTGGTTACCGCTAAAGATGATGATGACAATGTGGTGGTT 120 LMS2-1 AACGAAGACGCCGAACCGCTACTGGTTACCGCTAAAGATGATGATGACAATGTGGTGGTT 120 ATCC 8530 AACGAAGACGCCGAACCGCTACTGGTTACCGCTAAAGATGATGATGACAATGTGGTGGTT 120 ************************************************************
Lc 705 ATGAGCAAGCACGATTTTGACGCCATCGAAGAAACCCTGTATTTACTCAGCAATCCCAAG 180 HN001 ATGAGСAAGСACGATTTTGACGCCATСGAAGAAACCCTGTATTTACTСAGСAATСССAAG 180 LMS2-1 ATGAGCAAGCACGATTTTGACGCCATCGAAGAAACCCTGTATTTACTCAGCAATCCCAAG 180 ATCC 8530 ATGAGСAAGСACGATTTTGACGCCATCGAAGAAACCCTGTATTTACTСAGСAATСССAAG 180 ************************************************************
Lc 705 CTGATGGCCAAAATCAAACGTGGTGATGCCCAAATTGCCGCTGGAAAGGCTAAACAGCAC 240 HN001 CTGATGGCCAAAATCAAACGTGGTGATGCCCAAATTGCCGCTGGAAAGGCTAAACAGCAC 240 LMS2-1 CTGATGGCCAAAATCAAACGTGGTGATGCCCAAATTGCCGCTGGAAAGGCTAAACAGCAC 240 ATCC 8530 CTGATGGCCAAAATCAAACGTGGTGATGCCCAAATTGCCGCTGGAAAGGCTAAACAGCAC 2 0 ************************************************************
«- Pr ReIBR2C
Lc 705 GAGTTGTTAACGGACTTCGATCATGATTAA 270
HN001 GAGTTGTTAACGGACTTCGATCATGATTAA 270
LMS2-1 GAGTTGTTAACGGACTTCGATCATGATTAA 270
ATCC 8530 GAGTTGTTAACGGACTTCGATCATGATTAA 270
******************************
2.3. Сравнительный анализ иуклеотидных последовательностей генов антитокси- на ге З штаммов Lactobacillus ramnosus и локализация олигонуклеотидов RelBRJN и RelBR3C.
Pr RelBR3N -»
Lc 705 ATGACCAAAAAATCCCGCATCAGCGTTAGGATTGATACCAAAACTAAAGAACGA 54
L S2-1 ATGААСATGACCAAAAAATCCCGCATСAGCGTTAGGATTGATACCAAAACTAAAGAACGA 60
******************************************************
Lc 705 GCGCTCCATGTTCTTAATAGCATGGGATTAGATATTTCCTCGGCTATTAACATGTACCTG 114
LMS2-1 GCGCTCCATGTTCTTAATAGCATGGGATTAGATATTTCCTCGGCTATTAACATGTACCTG 120
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 Lc 705 AAACGGATTGGTGACACCGGTGCATTGCCATTTACACCTCCAATGTCATTTGTTGATCAG 174
LMS2-1 AAACGGATTGGTGACACCGGTGCATTGCCATTTACACCTCCAATGTCATTTGTTGATCAG 180
************************************************************
Lc 705 CTTCAAGTTGCAGAAGCTGATGTTAAAGCGGGGCGAATAAAAAGCTTCAAGACTGTCGAT 234 LMS2-1 CTTCAAGTTGCAGAAGCTGATGTTAAAGCGGGGCGAATAAAAAGCTTCAAGACTGTCGAT 240 ************************************************************
«- Pr RelBR3C
Lc 705 GCTTTGATGAAGGATTTAT CAGTGATGTTGACGATTAA 273
LMS2-1 GCTTTGATGAAGGATTTATACAGTGATGTTGACGATTAA 279
2.4. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов токсина MazF3 штаммов Lactobacillus ramnosus и локализация олигонуклеотидов MazFR3N и MazFR3C.
Pr MazFR3N— >
HN001 ATGAGGACTAATGACTTAGTCAGCCTATACGTTAGTTTTGTAGAAACTAACGGTGGСAAG 60 LMS2-1 ATGAGGACTAATGACTTAGTCAGCCTATACGTTAGTTTTGTAGAAACTAACGGTGGCAAG 60
************************************************************
HN001 TCTCGACCAGTTTTAACTCGTCGGGTATCAGAACAGACGGTCGAGGCTTTTAAAATTACT 120
LMS2-1 TCTCGACCAGTTTTAACTCGTCGGGTATCAGAACAGACGGTCGAGGCTTTTAAAATTACT 120
************************************************************
HN001 AGTCAGTATGAAAAGAAGTCGGCTTATATCAAGCAACAATATTATCCGATTCAAGATTGG 180
LMS2-1 AGTCAGTATGAAAAGAAGTCGGCTTATATCAAGCAACAATATTATCCGATTCAAGATTGG 180
************************************************************
HN001 CAATCCGCTGGGTTGAAGAAACCTTCCTGGGTCGATCTTGGTAATATTTATCGCTTTCCC 240
LMS2-1 CAATCCGCTGGGTTGAAGAAACCTTCCTGGGTCGATCTTGGTAATATTTATCGCTTTCCC 240
************************************************************
HN001 AAAGCCGGTTTAAACTTTAAAGAAATCGGTCATTTAAGTAAGCTAGATCAAAATAAAATT 300 LMS2-1 AAAGCCGGTTTAAACTTTAAAGAAATCGGTCATTTAAGTAAGCTAGATCAAAATAAAATT 300
HN001 TСAGATTTTACGCTTGACCTAAAATСAAAAAG AGAGGTAAGGGTCAAAAGATAATTСAA 360
LMS2-1 TCAGATTTTACGCTTGACCTAAAATCAAAAAGAAGAGGTAAGGGTCAAAAGATAATTCAA 360
************************************************************
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 HN001 CACCGATCAAGTAAAAGGAAGCACAAAGAAAGTAAAGCAGATCTTACACAAAGAATTCAA 420
LMS2-1 CACCGATCAAGTAAAAGGAAGCACAAAGAAAGTAAAGCAGATCTTACACAAAGAATTCAA 420
<—
HN001 AAACAGTTAAAAGACTTTGСTAAACACAATССAGAAATTAAGССAAAAAACAATССTGAA 480
LMS2-1 AAACAGTTAAAAGACTTTGCTAAACACAATCCAGAAATTAAGCCAAAAAACAATCCTGAA 480
************************************************************
«- Pr MazFR3C
HN001 AATAAAAACGATCGGCCTAGTTATTAG 507
LMS2-1 AATAAAAACGATCGGCCTAGTTATTAG 507
***************************
2.5. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов токсина MazF3 штаммов Lactobacillus ramnosus и локализация олигонуклеотидов MazER3N и MazER3C.
Pr MazFR3N— >
HN001 ATGGCAGTTAAGGAAAAG/.AACGGGTCCAAGTCAAGATTGATAAAGATTTGGCCGATGAT 60
LMS2-1 ATGGCAGTTAAGGAAAAGAAACGGGTCCAAGTCAAGATTGATAAAGATTTGGCCGATGAT 60
************************************************************
HN001 ACCGAAGCAATTTTAAGCGAATTGGGCTTAAATCCAACCACGGCCATTAACATGTTTTAC 120
LMS2-1 ACCGAAGCAATTTTAAGCGAATTGGGCTTAAATCCAACCACGGCCATTAACATGTTTTAC 120 ************************************************************
HN001 AAGCGGATTGTTGCTAATGGTGCTTTACCTTTTAATGCGTCTTTAAGCGAAGAAGAAAGA 180
LMS2-1 AAGCGGATTGTTGCTAATGGTGCTTTACCTTTTAATGCGTCTTTAAGCGAAGAAGAAAGA 180
************************************************************
HN001 GCTAATTTACGCTTTTTAAAGGTGACCGAAGGGACACCAGTCACCGAGTTCAAAGACGCT 240
LMS2-1 GCTAATTTACGCTTTTTAAAGGTGACCGAAGGGACACCAGTCACCGAGTTCAAAGACGCT 240
************************************************************
*- Pr MazER3C
HN001 AAAGAGGTCGCTGATTGGCTCAACGATCCAGATGAGGACTAA 282
LMS2-1 AAAGAGGTСGСTGA TGGСTСAACGATCCAGATGAGGACTΑΆ 282
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26

Claims

Формула изобретения
1. Метод видовой идентификации лактобацилл, характеризующийся использовани- ем комбинации генов токсин-антитоксин, отличающийся тем, что используют гены систем токсин-антитоксин суперсемейств RelBE и MazEF.
2. Метод видовой идентификации по п.1 отличающийся тем, что для идентифика- ции групп лактобацилл L. acidophilus, L. plantarum и L.casei, видов L. acidophilus, L. helveticus и L.rhamnosus проводят амплификацию с геномной ДНК с использо- ванием олигонуклеотидов, представленьгх в таблице 2, причем ПЦР продукты анализируют в агарозном геле, размер полученного фрагмента определяют с по- мощью ДНК-маркера. Исследуемый штамм относят к группе L.acidophilus в слу- чае наработки фрагментов при использовании олигонуклеотидов LacN и LacC; в случае наличия ПЦР продуктов с использованием олигонуклеотидов LhvlN и LhvlC - к виду L. helveticus, исследуемый штамм относят к группе L. plantarum в случае наработки фрагментов при использовании олигонуклеотидов LplN и LplC, исследуемый штамм относятся к группе L.casei в случае наработки фрагментов при использовании олигонуклеотидов LcsN и LcsC; в случае наличия ПЦР про- дуктов с использованием олигонуклеотидов LcslN и LcslC относят к виду L.casei; в случае наличия RelERI и RelERIC - к виду L.rhamnosus.
3. Метод штаммовой идентификации лактобацилл, характеризующийся использо- ванием комбинации генов токсин-антитоксин, отличающийся тем, что использу- ют гены систем токсин-антитоксин суперсемейств RelBE и MazEF.
4. Метод штаммовой идентификации по п.З отличающийся тем, что для идентифи- кации штаммов L.rhamnosus проводят амплификацию с геномной ДНК с исполь- зованием олигонуклеотидов, представленьгх в таблице 3, причем ПЦР продукты анализируют в агарозном геле, размер полученного фрагмента определяют с по- мощью ДНК-маркера; исследуемый штамм признают идентичным штамму L.ramnosus GG в случае наработки фрагментов при использовании олигонуклео- тидов RelBRlN-RelBRlC, а при использовании остальных олигонуклеотидов не должно быть ПЦР-продуктов; исследуемый штамм признают идентичным штамму L.ramnosus Lc705 в случае наличия ПЦР-продуктов только при исполь- зовании олигонуклеотидов RelBR2N-RelBR2C и RelBR3N-RelBR3C; исследуе- мый штамм признают идентичным штамму L.ramnosus HN001 в случае наличия
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) ПЦР-продуктов только при использовании олигонуклеотидов RelBRlN-RelBRlC и RelBR2N-RelBR2C; исследуемый штамм признают идентичным штамму L.ramnosus LMS2-J в случае наличия ПЦР-продуктов при использовании олиго- нуклеотидов RelBR2N-RelBR2C и RelBR3N-RelBR3C, а также при использова- нии олигонуклеотидов MazFR3N-MazFR3C и MazER3N- MazER3C; исследуе- мый штамм признают идентичным штамму L.ramnosus АТСС 8530 в случае на- личия ПЦР-продуктов только при использовании олигонуклеотидов RelBR2N- RelBR2C.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2012/001048 2011-12-23 2012-12-11 МЕТОД ВИДОВОЙ И ШТАММОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛАКТОБАЦИЛЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНОВ СИСТЕМ ТОКСИН-АНТИТОКСИН II ТИПА СУПЕРСЕМЕЙСТВ ReIBE и MazEF WO2013100810A2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011152586 2011-12-23
RU2011152586/10A RU2526576C2 (ru) 2011-12-23 2011-12-23 Способ идентификации лактобацилл

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2013100810A2 true WO2013100810A2 (ru) 2013-07-04
WO2013100810A3 WO2013100810A3 (ru) 2013-10-31

Family

ID=48698761

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2012/001048 WO2013100810A2 (ru) 2011-12-23 2012-12-11 МЕТОД ВИДОВОЙ И ШТАММОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛАКТОБАЦИЛЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНОВ СИСТЕМ ТОКСИН-АНТИТОКСИН II ТИПА СУПЕРСЕМЕЙСТВ ReIBE и MazEF

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2526576C2 (ru)
WO (1) WO2013100810A2 (ru)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017042158A (ja) * 2015-08-28 2017-03-02 財團法人食品工業發展研究所 乳酸菌ラクトバチルス・カゼイグループの種間関係および種内関係を識別する方法
CN111286550A (zh) * 2019-07-18 2020-06-16 大连民族大学 一种用于扩增副干酪乳杆菌的特异性引物及其应用
CN113981116A (zh) * 2021-11-30 2022-01-28 广州舒客实业有限公司 用于快速鉴定唾液乳杆菌的特异性引物、试剂盒及其应用
CN114058692A (zh) * 2021-11-15 2022-02-18 无锡市人民医院 circ_RELB作为分子标记物在制备诊断糖尿病视网膜病变血管新生产品上的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1740726A2 (en) * 2004-04-28 2007-01-10 Danisco A/S Detection and typing of bacterial strains

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA53337U (ru) * 2010-02-03 2010-10-11 Государственное Предприятие «Центр Иммунобиологических Препаратов» Способ определения штаммов бифидобактерий для создания эталонных образцов пробиотических препаратов

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1740726A2 (en) * 2004-04-28 2007-01-10 Danisco A/S Detection and typing of bacterial strains

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
'«Oligonukleotidy»' METODY, [Online] 02 October 2006, Retrieved from the Internet: <URL:http://molbiol.ru/protocol> [retrieved on 2013-06-18] *
ANU TILSALA-TIMISJARVI ET AL.: 'Strain-Specific Identification of Probiotic Lactobacillus rhamnosus with Randomly Amplified Polymorphic DNA-Derived PCR Primers.' APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY vol. 64, no. 12, December 1998, pages 4816 - 4819 *
PROZOROV A.A. ET AL.: 'Sistemy «toksin-antitoksin» u bakterii: instrument apoptoza ili moduliatory metabolizma?.' MIKROBIOLOGIIA vol. 79, no. 2, 2010, pages 147 - 159 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017042158A (ja) * 2015-08-28 2017-03-02 財團法人食品工業發展研究所 乳酸菌ラクトバチルス・カゼイグループの種間関係および種内関係を識別する方法
US10006094B2 (en) 2015-08-28 2018-06-26 Food Industry Research And Development Institute Methods for discriminating interspecific relationships and intraspecific relationships of lactic acid bacteria of Lactobacillus casei group by using MUTL or DNAJ degenerate primers
CN111286550A (zh) * 2019-07-18 2020-06-16 大连民族大学 一种用于扩增副干酪乳杆菌的特异性引物及其应用
CN114058692A (zh) * 2021-11-15 2022-02-18 无锡市人民医院 circ_RELB作为分子标记物在制备诊断糖尿病视网膜病变血管新生产品上的应用
CN113981116A (zh) * 2021-11-30 2022-01-28 广州舒客实业有限公司 用于快速鉴定唾液乳杆菌的特异性引物、试剂盒及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
RU2526576C2 (ru) 2014-08-27
WO2013100810A3 (ru) 2013-10-31
RU2011152586A (ru) 2013-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sharma et al. Molecular typing tools for identifying and characterizing lactic acid bacteria: a review
Klaenhammer et al. Selection and design of probiotics
Singh et al. Application of molecular identification tools for Lactobacillus, with a focus on discrimination between closely related species: A review
Chagnaud et al. Rapid PCR-based procedure to identify lactic acid bacteria: application to six common Lactobacillus species
Skånseng et al. Comparison of chicken gut colonisation by the pathogens Campylobacter jejuni and Clostridium perfringens by real-time quantitative PCR
US20050026188A1 (en) Methods of identifying, characterizing and comparing organism communities
Karapetsas et al. Rapid detection and identification of probiotic Lactobacillus casei ATCC 393 by multiplex PCR
US20240035098A1 (en) Highly polymorphic and modular extragenic (h.p.m.e.) markers within specific taxa of microorganisms and use thereof for their differentiation, identification and quantification
Vandamme et al. Phylogenetics and systematics
Prosekov et al. Identification of industrially important lactic acid bacteria in foodstuffs
Ward et al. Review of molecular methods for identification, characterization and detection of bifidobacteria
RU2526576C2 (ru) Способ идентификации лактобацилл
Sakata et al. Characterization of the genus Bifidobacterium by automated ribotyping and 16S rRNA gene sequences
Lu et al. A one-step PCR-based method for specific identification of 10 common lactic acid bacteria and Bifidobacterium in fermented milk
Ohadi et al. Transcriptome analysis of biofilm formation under aerobic and microaerobic conditions in clinical isolates of Campylobacter spp.
RU2508406C2 (ru) СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛАКТОБАЦИЛЛ L.casei/paracasei, L.fermentum, L.plantarum И L.rhamnosus
Jena et al. Isolation and species delineation of genus Bifidobacterium using PCR-RFLP of partial hsp60 gene fragment
Mathys et al. PCR and real-time PCR primers developed for detection and identification of Bifidobacterium thermophilum in faeces
Vaugien et al. Bifidobacteria identification based on 16S rRNA and pyruvate kinase partial gene sequence analysis
Berthoud et al. Comparison of partial gene sequences encoding a phosphoketolase for the identification of bifidobacteria
Zavaglia et al. Characterization of Bifidobacterium strains using box primers
Sidarenka et al. Application of molecular methods to classification and identification of bacteria of the genus Bifidobacterium
Tsai et al. Use of specific primers based on the 16S–23S internal transcribed spacer (ITS) region for the screening Bifidobacterium adolescentis in yogurt products and human stool samples
Nakanishi et al. Rapid Species Identification and Partial Strain Differentiation of Clostridium butyricum by PCR Using 16S‐23S rDNA Intergenic Spacer Regions
JP2006149400A (ja) バクテロイデス用プライマー及び該プライマーを用いた検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 04/11/2014)

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12861930

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12861930

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2