JP2017042158A - 乳酸菌ラクトバチルス・カゼイグループの種間関係および種内関係を識別する方法 - Google Patents
乳酸菌ラクトバチルス・カゼイグループの種間関係および種内関係を識別する方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】乳酸菌からDNA試料を抽出。特定のヌクレオチド配列を有するプライマー対を使用してDNA試料を増幅することで、DNAミスマッチ修復蛋白質(mutL)遺伝子のヌクレオチド配列の部分フラグメント及び/又はヒートショック蛋白質(dnaJ)遺伝子のヌクレオチド配列の部分フラグメントを取得。増幅された部分フラグメントの配列を決定し、決定された配列と、Lb.カゼイグループの2以上の基準株の対応する遺伝子配列とを比較して乳酸菌の類縁分類群を同定する方法。
【選択図】なし
Description
(a)乳酸菌からDNA試料を抽出する工程と、
(b)本明細書に開示のプライマー対又は組成物を使用してDNA試料を増幅することで、mutL遺伝子のヌクレオチド配列の部分フラグメント及び/又はdnaJ遺伝子のヌクレオチド配列の部分フラグメントを取得する工程と、
(c)増幅された部分フラグメントの配列を決定する工程と、
(d)決定された配列と、Lb.カゼイグループの2以上の基準株の対応する遺伝子配列とを比較して各基準株に対するパーセント類似性及び/又は同一性を得ることにより、その乳酸菌が最も高いパーセント類似性及び/又は同一性を有するLb.カゼイグループの基準株と同じ種として乳酸菌を同定する工程と、
を含む、方法を提供することである。
(a)乳酸菌からDNA試料を抽出する工程と、
(b)本明細書に開示のプライマー対又は組成物を使用してDNA試料を増幅することで、mutL遺伝子のヌクレオチド配列の部分フラグメント及び/又はdnaJ遺伝子のヌクレオチド配列の部分フラグメントを取得すると、
(c)増幅された配列フラグメントの配列を決定する工程と、
(d)ハプロタイプ分析を行って、決定された配列と、同じ種であるが異なる株の他の2以上の乳酸菌の各対応する遺伝子配列とを比較する工程と、
を含み、分析された配列が互いに異なる場合に、比較された乳酸菌が異なるハプロタイプであることを表す、方法を提供することである。
試料収集
1.乳酸菌株
参照株(基準株及び単離株を含む)はいずれもIndustry Research And Development InstituteのBioresources Collection and Research Center(BCRC)より提供された(表1参照)。
MRSアガー(Oxoid、イギリスのベイジングストーク)を標準固形培地として使用し、全ての株を30℃で嫌気的にインキュベートした。その細菌を30℃で48時間インキュベートした後、少量の新鮮な細菌試料を採取し、1.5mL容のエッペンドルフに添加した。細胞のDNAをDNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen、アメリカ合衆国)を使用して抽出および精製した後、適量の脱イオン水に溶解した。少量のDNA溶液を採取し、1%アガロースゲルの電気泳動によってDNAの質を測定した。上記溶液の残部は更なる使用のため−20℃で保存した。
1.縮重プライマーの設計
Lb.カゼイ(AP012544;当初ラクトバチルス・カゼイ亜種カゼイATCC393と命名された)、Lb.パラカゼイ(CP000423;当初ラクトバチルス・カゼイATCC334と命名された)、及びLb.ラムノサスATCC8530(CP003094)のmutL遺伝子の配列をGenBankからダウンロードした。mutL遺伝子が最も保存された領域に基づいて、縮重プライマーであるLcagp−mutlF3(5’−ATTGAYCARCTATCKGCMAC−3’(配列番号1))及びLcagp−mutlR4(5’−GAGCCRTAACCGGCAATMA−3’(配列番号2))(式中、YはC又はTであり、RはA又はGであり、KはG又はTであり、MはA又はCである)を設計した。
Lb.カゼイ、Lb.パラカゼイ及びLb.ラムノサスのmutL遺伝子の部分フラグメント(約809bp)を、上記の縮重プライマーを使用してPCRにより増幅した。PCR反応条件は、94℃で5分間、94℃で1分間、60℃で1分間及び72℃で5分間を30サイクルし、更に最終伸長工程が72℃で7分間であった。得られたアンプリコンをQIAquick PCR Purification Kit(Qiagen、アメリカ合衆国)を使用して精製した後、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems、アメリカ合衆国カリフォルニア州)及びPRISM 3730 Sequencer(Applied Biosystems)により配列決定した。
全ての株のDNA配列をClustal X(1.83)プログラム(Thompson et al., 1997)によってアラインし、配列間の同一性をMatGAT 2.02ソフトウェア(Campanella et al., 2003)によって算出した。表2は、Lb.カゼイ、Lb.パラカゼイ及びLb.ラムノサスのmutL遺伝子の全ての増幅された部分フラグメントの同一性を示す。近隣結合法(Saitou and Nei, "The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees." Mol Biol Evol;1987; 4:406-425)を使用して、乳酸菌の系統樹を構築した。図1の系統樹に示されるように、異なる種は異なるクラスターに分布される。
DnaSP v.5.0ソフトウェア(Librado and Rozas, 2009)をハプロタイプ分析に使用した。その結果は、被験株Lb.パラカゼイBCRC 12248T、BCRC 12193、BCRC 17482、BCRC 16100、BCRC 17005、BCRC 18853、BCRC 18854、BCRC17484、BCRC 17488、BCRC 17489、BCRC 14023、BCRC 16094、BCRC 17002及びBCRC 17457が14の異なるハプロタイプに同定され、被験株Lb.ラムノサスBCRC 10940T、BCRC 80666、BCRC 16095、BCRC 17490、BCRC 16000、BCRC 80663及びBCRC 14029が7つの異なるハプロタイプに同定されたことを示す。したがって、乳酸菌のmutL遺伝子を増幅した配列をLb.パラカゼイ及びLb.ラムノサスの株の種内関係の識別に使用することができる。例えば、Lb.パラカゼイ又はLb.ラムノサスと同定された被験細菌のmutL遺伝子を増幅した配列を、Lb.パラカゼイ又はLb.ラムノサスの異なる株のmutL遺伝子の各々の対応する配列と比較して、それらが同じハプロタイプか否かを判定することができる。
1.縮重プライマーの設計
Lb.カゼイ(AP012544;当初ラクトバチルス・カゼイ亜種カゼイATCC 393と命名された)、Lb.パラカゼイ(AP012541;当初ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイJCM 8130と命名された)、及びLb.ラムノサスATCC 8530(CP003094)のdnaJ遺伝子の配列をGenBankからダウンロードした。dnaJ遺伝子が最も保存された領域に基づいて、縮重プライマーであるLcasDnaJ−F1 5’−TCTGAAYTTVGTYTGRCTTTG−3’(配列番号3)、及びLcasDnaJ−R1 5’−GTGGTGCVCARGCKAATC−3’(配列番号4)(式中、YはC又はTであり、VはG、A又はCであり、RはA又はGであり、KはG又はTである)を設計した。
Lb.カゼイ、Lb.パラカゼイ及びLb.ラムノサスのdnaJ遺伝子の部分フラグメント(約620bp)を上記の縮重プライマーを使用してPCRにより増幅した。PCR反応条件は、94℃で5分間、94℃で1分間、60℃で1分間及び72℃で5分間を30サイクルし、更に最終伸長工程が72℃で7分間であった。得られたアンプリコンをQIAquick PCR Purification Kit(Qiagen、アメリカ合衆国)を使用して精製した後、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems、アメリカ合衆国カリフォルニア州)及びPRISM 3730 Sequencer(Applied Biosystems)により配列決定した。
全ての株のDNA配列をClustal X(1.83)プログラム(Thompson et al., 1997)によってアラインし、配列間の類似性をMatGAT 2.02ソフトウェア(Campanella et al., 2003)によって算出した。表3は、被験Lb.カゼイ、被験Lb.パラカゼイ及び被験Lb.ラムノサスのdnaJ遺伝子の全ての増幅された部分フラグメントの類似性を示す。近隣結合法(Saitou and Nei, 1987)を使用して、乳酸菌の系統樹を構築した。図2の系統樹に示されるように、異なる種は異なるクラスターに分布される。
DnaSP v.5.0ソフトウェア(Librado and Rozas, 2009)をハプロタイプ分析に使用した。その結果は、被験株Lb.パラカゼイBCRC 12248T、BCRC 12188、BCRC 14001、BCRC 16100、BCRC 17001、BCRC 17005、BCRC 17475、BCRC 17483、BCRC 17484、BCRC 17488、BCRC 17489及び単離株275が12の異なるハプロタイプに同定され、被験株Lb.ラムノサスBCRC 10940T、BCRC 14029、BCRC 16000、BCRC 16095、BCRC 17004、BCRC 17490及びBCRC 80666が7つの異なるハプロタイプに同定されたことを示す。したがって、乳酸菌のdnaJ遺伝子を増幅した配列をLb.パラカゼイ及びLb.ラムノサスの株の種内関係の識別に使用することができる。例えば、Lb.パラカゼイ又はLb.ラムノサスと同定された被験細菌のdnaJ遺伝子を増幅した配列を、Lb.パラカゼイ又はLb.ラムノサスの異なる株のdnaJ遺伝子の各々の対応する配列と比較して、それらが同じハプロタイプか否かを判定することができる。
Claims (18)
- 5’−ATTGAYCARCTATCKGCMAC−3’(配列番号1)(式中、Y=C又はT、R=A又はG、K=G又はT、及びM=A又はC)として示されるヌクレオチド配列を含む第1のプライマー混合物と、
5’−GAGCCRTAACCGGCAATMA−3’(配列番号2)(式中、R=A又はG、及びM=A又はC)として示されるヌクレオチド配列を含む第2のプライマー混合物と、
を含む、プライマー対。 - 5’−TCTGAAYTTVGTYTGRCTTTG−3’(配列番号3)(式中、Y=C又はT、V=G、A又はC、及びR=A又はG)として示されるヌクレオチド配列を含む第1のプライマー混合物と、
5’−GTGGTGCVCARGCKAATC−3’(配列番号4)(式中、V=G、A又はC、R=A又はG、及びK=G又はT)として示されるヌクレオチド配列を含む第2のプライマー混合物と、
を含む、プライマー対。 - 請求項1に記載の第1のプライマー混合物及び/又は第2のプライマー混合物と溶媒とを含む組成物。
- 請求項2に記載の第1のプライマー混合物及び/又は第2のプライマー混合物と溶媒とを含む組成物。
- ラクトバチルス・カゼイグループにおける乳酸菌の種を識別する方法であって、
(a)前記乳酸菌からDNA試料を抽出する工程と、
(b)請求項1に記載のプライマー対又は請求項3に記載の組成物を使用して前記DNA試料を増幅することでmutL遺伝子のヌクレオチド配列の部分フラグメントを取得、及び/又は請求項2に記載のプライマー対又は請求項4に記載の組成物を使用して前記DNA試料を増幅することでdnaJ遺伝子のヌクレオチド配列の部分フラグメントを取得する工程と、
(c)増幅された前記部分フラグメントの配列を決定する工程と、
(d)決定された前記配列と、Lb.カゼイグループの2以上の基準株の対応する遺伝子配列とを比較して前記各基準株に対するパーセント類似性及び/又は同一性を得ることにより、前記乳酸菌が最も高いパーセント類似性及び/又は同一性を有するLb.カゼイグループの基準株と同じ種として前記乳酸菌を同定する工程と、
を含む、方法。 - 工程(b)が、請求項1に記載のプライマー対又は請求項3に記載の組成物を使用して前記DNA試料を増幅し、mutL遺伝子のヌクレオチド配列の部分フラグメントを取得する、請求項5に記載の方法。
- 工程(b)が、請求項2に記載のプライマー対又は請求項4に記載の組成物を使用して前記DNA試料を増幅し、dnaJ遺伝子のヌクレオチド配列の部分フラグメントを取得する、請求項5に記載の方法。
- Lb.カゼイグループの前記2以上の基準株が、Lb.カゼイBCRC 10697T(ATCC 393)、Lb.パラカゼイBCRC 12248T(ATCC 25302)、及びLb.ラムノサスBCRC 10940T(ATCC 12116)、又はそれらの任意の組合せである、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
- Lb.カゼイグループにおける乳酸菌と、同じ種であるが異なる株のLb.カゼイグループにおける他の2以上の乳酸菌が同じハプロタイプか否かを判定する方法であって、
(a)前記乳酸菌からDNA試料を抽出する工程と、
(b)請求項1に記載のプライマー対又は請求項3に記載の組成物を使用して前記DNA試料を増幅することでmutL遺伝子のヌクレオチド配列の部分フラグメントを取得、及び/又は請求項2に記載のプライマー対又は請求項4に記載の組成物を使用して前記DNA試料を増幅することでdnaJ遺伝子のヌクレオチド配列の部分フラグメントを取得する工程と、
(c)増幅された前記部分フラグメントの配列を決定する工程と、
(d)ハプロタイプ分析を行って、決定された前記配列と、同じ種であるが異なる株の他の2以上の乳酸菌の各対応する遺伝子配列とを比較する工程と、
を含み、分析された前記配列が互いに異なる場合に、比較された前記乳酸菌が異なるハプロタイプであることを表す、方法。 - 工程(b)が、請求項1に記載のプライマー対又は請求項3に記載の組成物を使用して前記DNA試料を増幅し、mutL遺伝子のヌクレオチド配列の部分フラグメントを取得する、請求項9に記載の方法。
- 工程(b)が、請求項2に記載のプライマー対又は請求項4に記載の組成物を使用して前記DNA試料を増幅し、dnaJ遺伝子のヌクレオチド配列の部分フラグメントを取得する、請求項9に記載の方法。
- 同じ種のLb.カゼイグループにおける前記2以上の乳酸菌がLb.パラカゼイにおいて異なる株である、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- Lb.パラカゼイの前記株が、Lb.パラカゼイBCRC 12248T、Lb.パラカゼイBCRC 12188、Lb.パラカゼイBCRC 14001、Lb.パラカゼイBCRC 16100、Lb.パラカゼイBCRC 17001、Lb.パラカゼイBCRC 17005、Lb.パラカゼイBCRC 17475、Lb.パラカゼイBCRC 17483、Lb.パラカゼイBCRC 17484、Lb.パラカゼイBCRC 17488、Lb.パラカゼイBCRC 17489、Lb.パラカゼイBCRC 12193、Lb.パラカゼイBCRC 18853、Lb.パラカゼイBCRC 18854、Lb.パラカゼイBCRC 14023、Lb.パラカゼイBCRC 16094、及びLb.パラカゼイBCRC 17002から選択される1又は複数の株である、請求項12に記載の方法。
- 同じ種のLb.カゼイグループにおける前記2以上の乳酸菌がLb.ラムノサスにおいて異なる株である、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- Lb.ラムノサスの前記株が、Lb.ラムノサスBCRC 10940T、Lb.ラムノサスBCRC 14029、Lb.ラムノサスBCRC 16000、Lb.ラムノサスBCRC 16095、Lb.ラムノサスBCRC 17004、Lb.ラムノサスBCRC 17490、Lb.ラムノサスBCRC 80663、及びLb.ラムノサスBCRC 80666から選択される1又は複数の株である、請求項14に記載の方法。
- 請求項1に記載のプライマー対若しくは請求項3に記載の組成物、及び/又は請求項2に記載のプライマー対若しくは請求項4に記載の組成物を含むキット。
- Lb.カゼイグループにおける少なくとも1つの乳酸菌のmutL遺伝子及び/又はdnaJ遺伝子の配列情報を含むコンピュータ可読媒体を更に含む、請求項16に記載のキット。
- Lb.カゼイグループにおける前記少なくとも1つの乳酸菌が、Lb.カゼイBCRC 10697T、Lb.カゼイBCRC 17487、Lb.カゼイBCRC 17942、Lb.カゼイBCRC 80156、Lb.カゼイBCRC 17647、Lb.パラカゼイBCRC 12248T、Lb.パラカゼイBCRC 12188、Lb.パラカゼイBCRC 14001、Lb.パラカゼイBCRC 16100、Lb.パラカゼイBCRC 17001、Lb.パラカゼイBCRC 17005、Lb.パラカゼイBCRC 17475、Lb.パラカゼイBCRC 17483、Lb.パラカゼイBCRC 17484、Lb.パラカゼイBCRC 17488、Lb.パラカゼイBCRC 17489、Lb.パラカゼイBCRC 12193、Lb.パラカゼイBCRC 18853、Lb.パラカゼイBCRC 18854、Lb.パラカゼイBCRC 14023、Lb.パラカゼイBCRC 16094、Lb.ラムノサスBCRC 10940T、Lb.ラムノサスBCRC 14029、Lb.ラムノサスBCRC 16000、Lb.ラムノサスBCRC 16095、Lb.ラムノサスBCRC 17004、Lb.ラムノサスBCRC 17490、Lb.ラムノサスBCRC 80663、Lb.ラムノサスBCRC 80666及びそれらの任意の組合せから選択される、請求項17に記載のキット。
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