WO2022173008A1 - 乳酸菌検出プライマーセットおよびそのプライマーセットを用いた検出方法 - Google Patents

乳酸菌検出プライマーセットおよびそのプライマーセットを用いた検出方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2022173008A1
WO2022173008A1 PCT/JP2022/005426 JP2022005426W WO2022173008A1 WO 2022173008 A1 WO2022173008 A1 WO 2022173008A1 JP 2022005426 W JP2022005426 W JP 2022005426W WO 2022173008 A1 WO2022173008 A1 WO 2022173008A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
oligonucleotide
nucleotide sequence
pair
base sequence
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/005426
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
明彦 小笠原
正弘 岩佐
Original Assignee
日本ベルム株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日本ベルム株式会社 filed Critical 日本ベルム株式会社
Priority to KR1020237022760A priority Critical patent/KR20230145317A/ko
Publication of WO2022173008A1 publication Critical patent/WO2022173008A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting specific lactic acid bacteria. Specifically, it relates to a detection primer set for Enterococcus faecalis strain EF-2001 and a detection method using the primer set.
  • Lactic acid bacteria are known to have various actions, and in recent years, as probiotics, they have various health maintenance effects such as an intestinal regulation effect, an immunity improvement effect, and an anti-tumor effect by improving the bacterial flora in the gastrointestinal tract. Therefore, it is used as a useful microbial resource deeply related to human health.
  • Enterococcus faecalis a type of lactic acid bacterium, also contains bacteria that are known to cause opportunistic infections. It can cause a variety of illnesses, including life-threatening infections such as meningitis. Therefore, it is extremely important to distinguish between bacteria that can be used as probiotics and those that are pathogenic.
  • the EF-2001 strain one of Enterococcus faecalis, has been reported to have various bioregulatory activities, including anti-inflammatory and immunomodulatory activities, and is widely used as a probiotic in supplements and functional foods.
  • the present invention provides a primer set that can specifically identify the lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EF-2001 strain quickly and simply, and a detection method using the primer set.
  • the present disclosure provides: (Item 1) A primer set for specifically detecting a nucleic acid derived from the lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EF-2001 strain, A pair of an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 2 or 3, a pair of an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 and an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6; A pair of an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 7 and an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 8 or 9, a pair of an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of
  • a method for specifically detecting a nucleic acid derived from the lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EF-2001 strain comprising: A method comprising the steps of: amplifying a nucleic acid fragment using the primer set according to item 1 or 2; and detecting the nucleic acid fragment obtained in the amplifying step.
  • a lactic acid bacteria composition A pair of an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 2, a pair of an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 and an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5; A pair of an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 7 and an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 8, A pair of an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 10 and an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 11; a pair of an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 and an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence
  • composition of item 5 comprising a nucleic acid fragment amplified by a primer set of oligonucleotides comprising: (Item 7) 7.
  • the composition according to item 5 or 6 comprising a lactic acid bacterium heat-treated product obtained by heat-treating the lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EF-2001 strain at at least about 70°C.
  • (Item 8) 8.
  • a method for producing a lactic acid bacteria composition A step of heating a lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EF-2001 strain to obtain a plurality of heat-treated lactic acid bacterium lots; extracting a nucleic acid fragment from one of the lots of the heat-treated product of lactic acid bacteria; Amplifying the nucleic acid fragment using at least one of the primer sets according to item 1 or 2; a step of detecting the nucleic acid fragment obtained in the step of amplifying; and selecting a lot of heat-treated lactic acid bacteria from which the nucleic acid fragment was detected.
  • (Item 10) 10. The method of item 9, wherein said heating is at least about 70 ⁇ 0>C. (Item 11) 11.
  • the nucleic acid fragment is A pair of an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 3, A pair of an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 4 and an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 6, A pair of an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 7 and an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 9, A pair of an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 10 and an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 12, a pair of an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 and an oligonucleot
  • a polynucleotide characterized by being amplified with a primer set for detecting the lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EF-2001 strain A polynucleotide represented by SEQ ID NO: 31, amplified with a primer set consisting of a pair of oligonucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
  • the lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EF-2001 strain can be detected simply and rapidly without recognizing strains closely related to the lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EF-2001 strain. possible and very useful.
  • FIG. 1 is the result of electrophoresis showing the results of nucleic acid detection using the primer set according to one embodiment of the present invention, using the DNAs of the lactic acid bacterium EF-2001 strain and various Enterococcus faecalis subspecies as templates.
  • A Lactic acid bacterium strain EF-2001 and Enterococcus faecalis subsp.
  • G E. faecalis NBRC100483
  • H E. faecalis NBRC100484.
  • FIG. 2 is the result of electrophoresis showing the result of nucleic acid detection using the primer set according to one embodiment of the present invention with the DNA of lactic acid bacterium EF-2001 strain and various other lactic acid bacteria as templates.
  • B E. faecium Aus0004,
  • C E. gallinarum LMG13129,
  • D Lactobacillus rhamnosus NBRC3425,
  • E L. plantarum NBRC15891,
  • F L. paracasei NBRC15906
  • G L. lactis NBRC102622.
  • FIG. 3 is an electrophoresis showing the results of detecting viable and dead bacteria using the primer set (long and short) according to one embodiment of the present invention using the DNA of the production process solution of the lactic acid bacterium EF-2001 strain as a template. This is the result.
  • A Culture solution (viable bacteria)
  • B Liquid after heat treatment (killed bacteria)
  • C Product bulk powder (killed bacteria).
  • FIG. 4 shows the results of electrophoresis using the lactic acid bacterium EF-2001 strain to confirm disappearance of the band of the primer set of the present invention due to heat treatment.
  • FIG. 5 is a graph confirming changes in the amount of TNF- ⁇ produced by the lactic acid bacterium EF-2001 strain due to heat treatment.
  • the primer set of the present invention is capable of amplifying a chromosomal DNA region having a nucleotide sequence specific to the lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EF-2001 strain by PCR (polymerase chain reaction). It is possible to specifically recognize and detect the lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EF-2001 strain without recognizing strains closely related to the EF-2001 strain.
  • the primer set of the present invention was designed by the following method. First, the full-length genome of Lactobacillus strain EF-2001 was sequenced using a hybrid assembly approach using Short Reads from ThermoFisher IonPGM and Long Reads from Oxford Nanopore MinION. When determining the Draft Genome sequence obtained from this Short Read, gene fragments of 1 kbp or more that did not match with the 42 strains in Table 1 below were narrowed down as EF-2001-specific gene sequences. is.
  • a PCR primer that yields a PCR product with a length of about 100 to about 250 bp and a PCR primer that yields a PCR product with a length of about 500 to about 600 bp with a common forward primer were prepared. . Using genomic DNAs prepared from EF-2001 strain and comparative strains as templates, PCR is performed with the primers, and the desired PCR product is obtained only in EF-2001 strain, and the DNA of other strains is used as a template. A primer set was selected from which no PCR product was obtained.
  • the primer set of the present invention can contain the following.
  • the primer set of the present invention can contain the following.
  • the primer set that can be used in the detection method of the present invention also includes a primer set consisting of oligonucleotides having nucleotide sequences substantially homologous to the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 30, depending on the nucleotide length, PCR conditions, and the like. included.
  • substantially homologous means having a fragment length and homology sufficient to function as a PCR primer or the like, preferably having about 90% or more sequence identity.
  • the primer set of the present invention does not necessarily have 100% homology with the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 30, depending on the purpose and conditions of use. A few bases may differ in the vicinity. Even if such primers are used, it is possible to appropriately amplify the target DNA fragment by considering the annealing temperature and the like.
  • a completely homologous sequence site (nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 30) is used, and only such a sequence is used. PCR conditions without annealing may be selected. On the other hand, if conditions with relatively low specificity are allowed, a sequence that differs from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 30 by a few bases (for example, a sequence that has a sequence identity of about 90% or more) is used, And the PCR conditions can be selected such that they still anneal.
  • the primer set of the present invention can be synthesized by a conventional DNA synthesis method well known to those skilled in the art, for example, using a DNA synthesizer.
  • the primers of the present invention can also be obtained by entrusting synthesis to a DNA synthesizer.
  • PCR is performed using the chromosomal DNA of the test bacterium contained in the sample as a template, and the presence or absence of an amplified product is determined to detect the lactic acid bacterium EF-2001 strain in the sample.
  • a PCR reaction specific to the sequences of the primers occurs, a region (target region) sandwiched between sequences corresponding to the sequences of the paired primers in the chromosomal DNA of the lactic acid bacterium EF-2001 strain is amplified.
  • the test bacterium is identified as the lactic acid bacterium EF-2001 strain, or at least the test bacterium contains the lactic acid bacterium EF-2001 strain. is determined.
  • the determination of the presence or absence of the amplification product may include determination of the length of the amplification product.
  • Amplification products of about 500 to about 600 bp each are usually obtained.
  • SEQ ID NOs: 1 and 3 SEQ ID NOs: 4 and 6, SEQ ID NOs: 7 and 9, SEQ ID NOs: 10 and 12, SEQ ID NOs: 13 and 15, SEQ ID NOs: 16 and 18, SEQ ID NOs: 19 and 21, SEQ ID NOs: 22 and 24 , SEQ ID NOs: 25 and 27, or SEQ ID NOs: 28 and 30.
  • the test bacterium does not contain lactic acid bacterium EF-2001 strain.
  • amplification products of about 100 to about 250 bp each are usually obtained.
  • Amplification products obtained when the primer set for detection of lactobacillus strain EF-2001 containing the oligonucleotides of the present invention are used are as follows.
  • SEQ ID NO: 31 Amplification product amplified with a primer set consisting of a pair of oligonucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • SEQ ID NO: 33 containing an oligonucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 4 and the base sequence of SEQ ID NO: 5
  • Amplification product amplified with a primer set consisting of a pair of oligonucleotides containing Amplification product SEQ ID NO: 49 Amplification product amplified with a primer set consisting of a pair of oligonucleotides containing an oligonucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28 and an oligonucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 50: The base of SEQ ID NO: 28
  • each of the base sequences of SEQ ID NOS: 31-50 is part of any one of the base sequences of SEQ ID NOS: 51-60.
  • Each primer sequence of SEQ ID NOS: 1 to 30, and the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 31 to 50 and the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 51 to 60 are sequences specific to the lactic acid bacterium EF-2001 strain. It is also possible to perform FISH, Southern hybridization, dot hybridization, etc. using the sequence as a DNA probe.
  • the detection of the lactic acid bacterium EF-2001 strain means detecting whether or not the lactic acid bacterium EF-2001 strain is present in the sample, and when the test bacterium is a single species, the same test bacterium is the lactic acid bacterium EF-2001 strain.
  • the sample used for detecting lactic acid bacterium EF-2001 strain may be any sample in which lactic acid bacterium EF-2001 strain is present or may be present.
  • mixed cultures of lactic acid bacteria, alcoholic beverages such as miso, soy sauce, wine, fermented foods containing microorganisms such as pickles, yogurt, cheese, laboratory animals such as mice and rats, human feces, soil, etc. and bacteria that cause The test bacterium may be an isolated single species or a mixture containing multiple bacterial species.
  • DNA when dead bacteria are used as bacteria to be tested, DNA may be directly prepared from the sample and used for PCR. PCR may be performed after isolating the test bacterium and preparing DNA from the test bacterium.
  • Methods for extracting nucleic acids from these samples include highly versatile kits such as Kaneka Easy DNA Extraction Kit version 2 that can extract nucleic acids from cultured cells such as animal cells, plant cells, and microorganisms, or general After decomposing the cell wall with an enzyme such as Lysozyme or physically destroying it with beads, etc., a commercially available extraction kit (DNeasy Blood & Tissue kit (manufactured by QIAGEN), Isogen, etc.) is used. It is also possible to do, and it is not particularly limited.
  • the method for detecting the lactic acid bacterium EF-2001 strain of the present invention comprises the steps of (1) amplifying a nucleic acid fragment using the primer set of the present invention; A step of detecting the nucleic acid fragment can be included.
  • the detection method of the present invention include PCR, FISH, Southern hybridization, dot hybridization, and the like.
  • the PCR method is preferred.
  • in the detection method of the lactic acid bacterium EF-2001 strain by the PCR method in addition to using the primer set of the present invention, it is possible to use commonly used PCR reagents and equipment such as DNA polymerase, and it is particularly limited. not a thing
  • the DNA polymerase used for PCR is not particularly limited, but examples include KOD FX Neo (manufactured by Toyobo) and ExTaq (manufactured by Takara Bio). , KOD DNA polymerase (manufactured by Toyobo), KOD-plus-polymerase (manufactured by Toyobo) and the like are preferred.
  • the PCR reaction conditions can be appropriately set according to the optimum temperature of the DNA polymerase to be used, the length and type of DNA to be synthesized, and the like.
  • (Heat denaturation/dissociation) ⁇ 55 to 60°C for 5 to 30 seconds
  • (annealing) ⁇ 65 to 80°C for 30 to 60 seconds (synthesis/elongation)”, and a total of 20 to 40 cycles can be performed.
  • 25 cycles of “98° C. for 10 seconds ⁇ 60° C. for 30 seconds ⁇ 68° C. for 30 seconds” can be performed.
  • the temperature used for the primer design can be used as the annealing temperature, but for example, when using KOD FX Neo as the polymerase, depending on the primer size (for example, 20mer or more), the two-step reaction without the annealing temperature can also be
  • the quantitative ratio of template DNA and primers for example, 0.3 ⁇ M of each primer can be used for 200 ng of template DNA in the case of viable bacteria, and the amount of template DNA can be increased in the case of killed bacteria according to the heat treatment conditions. can also make the bands more distinct during electrophoresis.
  • the presence or absence of amplification products obtained by PCR and their sizes can be determined by conventional nucleic acid detection methods. For example, after electrophoresis by agarose electrophoresis, the amplified product can be detected by staining with ethidium bromide or SYBR Green I. Also, the amount of amplification product can be determined by fluorescence intensity, and the molecular weight can be determined by comparison with molecular weight markers. The presence or absence of an amplification product can also be confirmed by measuring the base sequence and length using a DNA sequencer after cycle sequencing the PCR product. Moreover, according to the real-time PCR method, the amplification reaction can be detected over time.
  • the primer set of the present invention can be combined with other elements to form a detection kit for lactic acid bacterium EF-2001 strain.
  • Other elements include, for example, any one or more of the reagents necessary for nucleic acid extraction, PCR, and amplification product detection.
  • this kit for detecting lactic acid bacterium EF-2001 strain has, as a positive control, a DNA fragment that has a part of the chromosomal DNA sequence of lactic acid bacterium EF-2001 strain and can be amplified by the primer set of the present invention, and/or As a negative control, a DNA fragment corresponding to the primer set of the present invention but having a base sequence with one or several base mismatches may be included.
  • the primer set of the present invention can be used to detect the lactic acid bacterium EF-2001 strain, as described above.
  • it is possible to easily measure the number of bacteria and manage the fermentation state when industrially producing lactic acid bacterium EF-2001 strain cells or foods and drinks containing the same bacteria. can be done.
  • the lactic acid bacterium composition of the present invention can contain a heat-treated lactic acid bacterium obtained by heating live bacteria of the lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EF-2001 strain.
  • the lactic acid bacteria composition of the present invention preferably comprises SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 and 5, SEQ ID NO: 7 and 8, SEQ ID NO: 10 and 11, SEQ ID NO: 13 and 14, SEQ ID NO: 16 and 17, SEQ ID NOS: 19 and 20, SEQ ID NOS: 22 and 23, SEQ ID NOS: 25 and 26, and/or lactic acid bacterium EF-2001 strain detection primer set containing oligonucleotides consisting of each combination of SEQ ID NOS: 28 and 29 SEQ ID NOs: 1 and 3, SEQ ID NOs: 4 and 6, SEQ ID NOs: 7 and 9, SEQ ID NOs: 10 and 12, SEQ ID NOs: 13 and 15, sequence Of the primer set for detecting lactobacillus strain EF-2001 containing oligonucleotides consisting of combinations of numbers 16 and 18, SEQ ID NOS: 19 and 21, SEQ ID NOS: 22 and 24, SEQ ID NOS: 25 and 27, or SEQ ID NOS:
  • the nucleic acid fragment is not amplified or "the band disappears” means that the nucleic acid fragment of the lactic acid bacterium EF-2001 strain is amplified using the primer set for detecting lactic acid bacterium EF-2001 strain of the present invention.
  • the amplification efficiency or amount is less than about 30% compared to the amplification efficiency or amount of an untreated (eg, no heat treatment) nucleic acid fragment derived from the EF-2001 strain of lactic acid bacteria.
  • the nucleic acid fragment is not amplified” or "the band disappears” means that the nucleic acid fragment of lactic acid bacterium EF-2001 strain is amplified using the primer set for detecting lactic acid bacterium EF-2001 strain of the present invention. In addition, less than about 20%, preferably less than about 10%, or more preferably less than about 5%, compared to the amplification efficiency or amount of nucleic acid fragments derived from untreated (e.g., no heat treatment) lactic acid bacterium strain EF-2001. It means that
  • the lactic acid bacteria composition of the present invention can be heated to kill cells, and can be freeze-dried, spray-dried, or dried in a drum dryer to form powdery dry cells. This makes it possible to improve safety and preservability, and it can be used for all kinds of foods. Heating of the lactic acid bacterium strain EF-2001 can be carried out at any time and temperature at which dead cells can be obtained. ° C. or higher, about 100 ° C. or higher, about 110 ° C. or higher, or about 120 ° C.
  • the lactic acid bacteria composition of the present invention when obtaining the lactic acid bacteria composition of the present invention, the lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EF-2001 strain is heated at the temperature and time as described above, and a plurality of lactic acid bacteria heat treatments are performed. A lot of the product is obtained, and a nucleic acid fragment is extracted from this heat-treated product of lactic acid bacteria. This nucleic acid fragment is then amplified using at least one of the primer sets of the invention described elsewhere herein.
  • a lot of the heat-treated lactic acid bacterium in which the amplified nucleic acid fragment is detected can be selected, and the heat-treated lactic acid bacterium contained in this lot can be used as the lactic acid bacterium composition of the present invention.
  • Heating and nucleic acid amplification can employ equipment and techniques that are commonly used in this field, such as equipment and techniques that can be used in the detection methods described elsewhere herein.
  • a first class pressure vessel equipped with a stirrer can be used, and depending on the temperature, a second class pressure vessel can also be used.
  • a small pressure vessel or the like can be used.
  • a continuous sterilizer using plates or tubes as heat conductors can be used.
  • the lactic acid bacteria composition of the present invention can be made to have an increased TNF- ⁇ production amount by heating and stabilizing it.
  • the lactic acid bacteria composition of the present invention is SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 and 5, SEQ ID NO: 7 and 8, SEQ ID NO: 10 and 11, SEQ ID NO: 13 and 14, SEQ ID NO: 16 and 17, SEQ ID NO: 19 and 20, SEQ ID NOs: 22 and 23, SEQ ID NOs: 25 and 26, and/or SEQ ID NOs: 28 and 29 Any one of the primer sets for detecting lactic acid bacterium EF-2001 strain containing oligonucleotides, or SEQ ID NOs: 1 and 3, SEQ ID NOs: 4 and 6, SEQ ID NOs: 7 and 9, SEQ ID NOs: 10 and 12, SEQ ID NOs: 13 and 15, SEQ ID NOs: 16 and 18, Any one of a primer set for detecting lactic acid bacterium EF-2001 strain containing an oligonucleotides, or
  • whether or not the TNF- ⁇ production amount of the lactic acid bacteria composition of the present invention has increased is indicated by the fact that the band of the primer set for detecting long disappears and the band of the primer set for detecting short remains.
  • the primer set (long) of SEQ ID NOs: 16 and 17 that amplifies a part of the base sequence of contig16 does not amplify the nucleic acid fragment, but the primer set (short) of SEQ ID NOs: 16 and 18 amplifies the nucleic acid fragment.
  • the heat-treated lactic acid bacteria composition of the present invention showing such amplification results can be regarded as having increased TNF- ⁇ production.
  • the lactic acid bacteria composition of the present invention is placed in a state where individual cells are isolated, thereby preventing aggregation when each cell is added to food etc. and absorbs water.
  • Any diluent can be mixed.
  • the diluent is preferably not only in the form of a fine powder, but also as fluid as possible.
  • polysaccharides and proteins are preferable in consideration of the safety when added to food and the influence on the flavor and properties of food. , microcrystalline cellulose, starch, natural polysaccharides such as galactomannan, and enzyme-treated hydrolysates thereof. Any two or more of these can also be used in combination.
  • Example 1 Detection of lactic acid bacterium EF-2001 strain 1 (comparison with Enterococcus faecalis subspecies)
  • Test strains As test strains, (A) lactic acid bacterium EF-2001 strain and Enterococcus faecalis subspecies (B) E. faecalis NBRC3971, (C) E.faecalis NBRC3989, (D) E.faecalis NBRC12970, ( E) E. faecalis NBRC100480, (F) E. faecalis NBRC100482, (G) E. faecalis NBRC100483, (H) E. faecalis NBRC100484 were used.
  • PCR reaction was performed according to the method. Assuming that the total volume of the PCR reaction solution is 50 ⁇ L, 25.0 ⁇ L of the 2 ⁇ PCR buffer supplied with the kit, 10.0 ⁇ L of 2 mM dNTPs, 1.0 U of DNA polymerase, 0.2 ⁇ L of the primer mixture, and 10 to 200 ng of template DNA (of viable bacteria). ), or 10 to 400 ng (in the case of killed bacteria), using a Thermal cycler GenAtlas (ASTEC), preheated at 94 ° C. for 10 seconds, denatured at 98 ° C. for 10 seconds, and annealed for 60 seconds. 25 cycles of 30 seconds at 68°C and 30 seconds of elongation at 68°C.
  • ASTEC Thermal cycler GenAtlas
  • primers F: SEQ ID NO: 61, R: SEQ ID NO: 62
  • a positive control band of about 284 bp was observed for all subspecies of Enterococcus faecalis used here, but only when EF-2001 strain DNA was used, a band of about 100 to about 250 bp. and a band of about 500 to about 600 bp was observed (Fig. 1(A)), confirming that the primer set of the present invention can specifically detect only the lactic acid bacterium EF-2001 strain among Enterococcus faecalis subspecies.
  • Example 2 Detection of lactic acid bacteria EF-2001 strain 2 (comparison with other lactic acid bacteria)>
  • A lactic acid bacterium EF-2001 strain and other lactic acid bacteria
  • B E. faecium Aus0004,
  • C E. gallinarum LMG13129,
  • D Lactobacillus rhamnosus NBRC3425,
  • E L. plantarum NBRC15891,
  • F L. paracasei NBRC15906 and
  • G L. lactis NBRC102622 were used in the same manner as in Example 1. The results are shown in FIG.
  • a positive control band of about 284 bp, a band of about 100 to about 250 bp, and a band of about 500 to about 600 bp were observed only when DNA of lactic acid bacterium EF-2001 strain was used (FIG. 2).
  • A no band was observed in lactic acid bacteria other than the lactic acid bacterium strain EF-2001. This confirms that the primer set of the present invention can specifically detect only the lactic acid bacterium EF-2001 strain among other lactic acid bacteria.
  • Example 3 Detection of lactic acid bacteria EF-2001 strain 3 (live bacteria and heated bacteria)>
  • Test strain Using lactic acid bacterium EF-2001 strain as a test strain, live bacteria (Fig. 3 (A) culture solution), dead bacteria (Fig. 3 (B) solution after heat treatment), dead bacteria (Fig. 3 (C) Nucleic acid was detected using DNA extracted from three types of bacterial cells of the product bulk powder as a template.
  • (2) DNA preparation, PCR conditions, and PCR primers were the same as in Examples 1 and 2. The results of agarose electrophoresis performed under the same conditions as in Examples 1 and 2 are shown in FIG.
  • Example 4 Loss of band by heating> Lactobacillus strain EF-2001 was used as a test strain, and disappearance of the band of the primer set of the present invention due to heat treatment was confirmed. In addition to untreated ones (viable bacteria), lactic acid bacteria strain EF-2001 heat-treated at 70°C, 90°C and 110°C was used.
  • primers of SEQ ID NOs: 16 and 17 and SEQ ID NOs: 16 and 18, which amplify part of the nucleotide sequence of contig16, were used under the same PCR conditions as in Example 1 to examine the ability to amplify a nucleic acid fragment. .
  • the results are shown in FIG.
  • Example 5 Measurement of TNF- ⁇ production> Using lactic acid bacterium EF-2001 strain as a test strain, changes in TNF- ⁇ production amount of lactic acid bacterium EF-2001 strain due to heat treatment were confirmed. Untreated (viable) and lactic acid bacterium EF-2001 strain heat-treated at 110° C. were used.
  • RAW264.7 cells were used to induce TNF- ⁇ .
  • a RAW264.7 cell solution adjusted to 1.0 ⁇ 10 6 cells/mL was dispensed into 96 wells in an amount of 100 ⁇ L per well, and cultured in a 5% CO 2 incubator at 37° C. for 24 hours. After removing the culture supernatant and washing with RPMI-1640 medium containing no FBS, 100 ⁇ L of the sample solution was added and allowed to react in a 37° C. 5% CO 2 constant temperature bath for 6 hours.
  • Samples were prepared from a 1mg/mL EF-2001 solution in RPMI-1640Medium with L-glutamine and sodium bicarbonale, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture (R8758-500ML; SIGMA) without FBS, and diluted appropriately. adjusted.
  • the method of the present invention enables easy, rapid and specific detection of the lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EF-2001 strain. A wide range of applications can be expected, such as speculation and the development of functional foods and supplements using the genes.
  • SEQ ID NO: 1 forward primer in contig1 SEQ ID NO: 2: reverse primer (long) in contig1 SEQ ID NO: 3: reverse primer (short) in contig1 SEQ ID NO: 4: forward primer in contig4 SEQ ID NO: 5: reverse primer (long) in contig4 SEQ ID NO: 6: reverse primer (short) in contig4 SEQ ID NO: 7: forward primer in contig7 SEQ ID NO: 8: reverse primer (long) in contig7 SEQ ID NO: 9: reverse primer (short) in contig7 SEQ ID NO: 10: forward primer in contig11 SEQ ID NO: 11: reverse primer (long) in contig11 SEQ ID NO: 12: reverse primer (short) in contig11 SEQ ID NO: 13: forward primer in contig13 SEQ ID NO: 14: reverse primer (long) in contig13 SEQ ID NO: 15: reverse primer (short) in contig13 SEQ ID NO: 16: forward primer in contig16 SEQ ID NO: 17: reverse primer (long)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、乳酸菌ＥＦ－２００１株を特異的に識別できるプライマーセットおよび該プライマーセットを用いた検出方法を提供。　本発明によれば、配列番号１および配列番号２、配列番号４および５、配列番号７および８、配列番号１０および１１、配列番号１３および１４、配列番号１６および１７、配列番号１９および２０、配列番号２２および２３、配列番号２５および２６、及び／または配列番号２８および２９の各組み合わせからなるオリゴヌクレオチド、または配列番号１および配列番号３、配列番号４および６、配列番号７および９、配列番号１０および１２、配列番号１３および１５、配列番号１６および１８、配列番号１９および２１、配列番号２２および２４、配列番号２５および２７、及び／または配列番号２８および３０の各組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを含む、乳酸菌ＥＦ－２００１株検出用プライマーセットが提供される。

Description

乳酸菌検出プライマーセットおよびそのプライマーセットを用いた検出方法
　本発明は、特定の乳酸菌の検出方法に関する。具体的には、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株の検出用プライマーセットおよび該プライマーセットを用いた検出方法に関する。
　乳酸菌は、様々な作用を有することが知られており、近年はプロバイオティクスとして消化管内の細菌叢の改善による整腸効果、免疫力向上効果、抗腫瘍効果などの種々の健康保持効果を有することから、人類にとって健康に深く関わる有用な微生物資源として利用されている。
　一方で乳酸菌の一種であるエンテロコッカス・フェカリスの中には日和見感染を引き起こすことが知られている菌体も存在し、日和見病原体として、尿路感染症をはじめ、細菌血症、心内膜炎、髄膜炎などの生命を脅かす感染症まで、さまざまな病気を引き起こす可能性がある。そのため、プロバイオティクスとして利用できる菌体と病原性の菌体とを区別することは極めて重要である。
　エンテロコッカス・フェカリスの１つであるＥＦ－２００１株は抗炎症および免疫調節を含むさまざまな生物調節活性を有することが報告されており、サプリメントや機能性食品のプロバイオティクスとして広く利用されている。本発明は、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株を特異的に迅速かつ簡便に識別できるプライマーセットおよび該プライマーセットを用いた検出方法を提供する。
　したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）
　乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株に由来する核酸を特異的に検出するためのプライマーセットであって、
　配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２または３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号５または６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号８または９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１１または１２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１４または１５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１７または１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２０または２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号２２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２３または２４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号２５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２６または２７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、または
　配列番号２８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２９または３０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
を含む、プライマーセット。
（項目２）
　乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株に由来する核酸を特異的に検出するためのプライマーセットであって、
（ａ）配列番号５１の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１）：
　フォワードプライマーCGAAAAGGATGTAGTCAGCGG（配列番号１）
　リバースプライマーCCGAAGGCGAAACAGAGGAT（配列番号２）
（ｂ）配列番号５１の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（２）：
　フォワードプライマーCGAAAAGGATGTAGTCAGCGG（配列番号１）
　リバースプライマーCCCAGACATAATCGCATGGC（配列番号３）
（ｃ）配列番号５２の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（３）：
　フォワードプライマーGCGGCTGCACAATTTATTGC（配列番号４）
　リバースプライマーAGAATACTTGGGCGGTCGTG（配列番号５）
（ｄ）配列番号５２の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（４）：
　フォワードプライマーGCGGCTGCACAATTTATTGC（配列番号４）
　リバースプライマーAATTCAGCTTCGCTAGATAAGGC（配列番号６）
（ｅ）配列番号５３の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（５）：
　フォワードプライマーCGCGTATGACTTGCAATCGA（配列番号７）
　リバースプライマーAGGATTGTTTGACGGTGCAA（配列番号８）
（ｆ）配列番号５３の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（６）：
　フォワードプライマーCGCGTATGACTTGCAATCGA（配列番号７）
　リバースプライマーACATGAGATAGTTGGGGTAGACA（配列番号９）
（ｇ）配列番号５４の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（７）：
　フォワードプライマーCTTCAGAGAGCTGGGCGAAG（配列番号１０）
　リバースプライマーTACTTTTTAGCTGCCCGCCC（配列番号１１）
（ｈ）配列番号５４の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（８）：
　フォワードプライマーCTTCAGAGAGCTGGGCGAAG（配列番号１０）
　リバースプライマーGGGTTGTAGCCCTACCCGAT（配列番号１２）
（ｉ）配列番号５５の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（９）：
　フォワードプライマーCGTAACGTGACATTGCGGAC（配列番号１３）
　リバースプライマーATGCCAGTACGTCGCGTTAA（配列番号１４）
（ｊ）配列番号５５の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１０）：
　フォワードプライマーCGTAACGTGACATTGCGGAC（配列番号１３）
　リバースプライマーCGATTGTCAACTAATTGTGCCGA（配列番号１５）
（ｋ）配列番号５６の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１１）：
　フォワードプライマーCATGGCTTGCCGTTTCACAA（配列番号１６）
　リバースプライマーACCGCAACAACTACATACTACCA（配列番号１７）
（ｌ）配列番号５６の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１２）：
　フォワードプライマーCATGGCTTGCCGTTTCACAA（配列番号１６）
　リバースプライマーACCAAAAGGAACGCTACCAGT（配列番号１８）
（ｍ）配列番号５７の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１３）：
　フォワードプライマーTCAGCATAATCCCCAGACGT（配列番号１９）
　リバースプライマーAATGAACGCCCTTCAGCAGA（配列番号２０）
（ｎ）配列番号５７の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１４）：
　フォワードプライマーTCAGCATAATCCCCAGACGT（配列番号１９）
　リバースプライマーGGCTCCTCTACCTGAACAAACT（配列番号２１）
（ｏ）配列番号５８の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１５）：
　フォワードプライマーGCGTTCAAACTGTTCTGGTGT（配列番号２２）
　リバースプライマーTACAAGGCTTGCGAGGTAGC（配列番号２３）
（ｐ）配列番号５８の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１６）：
　フォワードプライマーGCGTTCAAACTGTTCTGGTGT（配列番号２２）
　リバースプライマーGCTGCAATGGAAAGCAAATCG（配列番号２４）
（ｑ）配列番号５９の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１７）：
　フォワードプライマーAGGCATATGGGTCATCTGCT（配列番号２５）
　リバースプライマーGAGCATCACAGAGCCTCGAA（配列番号２６）
（ｒ）配列番号５９の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１８）：
　フォワードプライマーAGGCATATGGGTCATCTGCT（配列番号２５）
　リバースプライマーAGAGATTTTTCAGTATTGCTGGGT（配列番号２７）
（ｓ）配列番号６０の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１９）：
　フォワードプライマーCGTTGGGTGTGCAGAAATGG（配列番号２８）
　リバースプライマーTGTACCGTCAACCTCGTTCG（配列番号２９）または
（ｔ）配列番号６０の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（２０）：
　フォワードプライマーCGTTGGGTGTGCAGAAATGG（配列番号２８）
　リバースプライマーAACGGGTTGCGACTCTTTTT（配列番号３０）
からなる群から選択される、プライマーセット。
（項目３）
　項目１または２に記載のプライマーセットを含むことを特徴とする、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株検出用キット。
（項目４）
　乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株に由来する核酸を特異的に検出する方法であって、
　項目１または２に記載のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程と
　増幅する工程で得られた核酸断片を検出する工程と
を含む、方法。
（項目５）
　乳酸菌組成物であって、
　配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号２２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号２５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、及び／または
　配列番号２８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対
からなる群より選択される１または複数のプライマーセットによって増幅されず、かつ、
　配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号２２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号２５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、及び／または
　配列番号２８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号３０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対
からなる群から選択される１または複数のプライマーセットによって増幅される核酸断片を含む、乳酸菌組成物。
（項目６）
　配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのプライマーセットによって増幅されず、かつ配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのプライマーセットによって増幅される核酸断片を含む、項目５に記載の組成物。
（項目７）
　乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株を少なくとも約７０℃にて加熱処理した乳酸菌加熱処理物を含む、項目５または６に記載の組成物。
（項目８）
　乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株を少なくとも約９０℃にて加熱処理した乳酸菌加熱処理物を含む、項目５～７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
　乳酸菌組成物を製造する方法であって、
　乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株を加熱して、複数の乳酸菌加熱処理物のロットを得る工程と、
　前記乳酸菌加熱処理物のロットの１つにおいて核酸断片を抽出する工程と、
　項目１または２に記載のプライマーセットのうちの少なくとも１つを用いて前記核酸断片を増幅する工程と、
　増幅する工程で得られた核酸断片を検出する工程と、
　前記核酸断片が検出された乳酸菌加熱処理物のロットを選択する工程と
を含む、方法。
（項目１０）
　前記加熱が少なくとも約７０℃での加熱である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
　前記加熱が少なくとも約９０℃での加熱である、項目９または１０に記載の方法。
（項目１２）
　前記核酸断片が、
　配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号２２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号２５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、及び／または
　配列番号２８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号３０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対
からなる群から選択される１または複数のプライマーセットによって増幅され、かつ
　配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号２２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号２５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、及び／または
　配列番号２８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対
からなる群より選択される１または複数のプライマーセットによって増幅されない、項目９～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
　乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株検出用プライマーセットで増幅されることを特徴とするポリヌクレオチドであって、
　配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３１で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３２で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３３で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３４で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３５で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３６で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号１０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３７で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号１０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３８で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号１３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３９で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号１３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４０で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４１で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４２で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４３で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４４で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号２２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４５で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号２２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４６で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号２５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４７で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号２５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４８で表されるポリヌクレオチド、
　配列番号２８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４９で表されるポリヌクレオチド、または
　配列番号２８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号３０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号５０で表されるポリヌクレオチド。
　本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
　本発明により、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株を簡便かつ迅速に、かつ乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株に近縁の菌株を認識することなく、検出することが可能となり、非常に有用である。
図１は、本発明の一実施形態に係るプライマーセットを用いて乳酸菌ＥＦ－２００１株と、種々のEnterococcus　faecalis亜種のＤＮＡを鋳型に核酸を検出した結果を示す電気泳動の結果である。（Ａ）乳酸菌ＥＦ－２００１株と、Enterococcus　faecalis亜種である（Ｂ）E.faecalis　NBRC3971、（Ｃ）E.faecalis　NBRC3989、（Ｄ）E. faecalis　NBRC12970、（Ｅ）E.faecalis　NBRC100480、（Ｆ）E.faecalis　NBRC100482、（Ｇ）E. faecalis　NBRC100483、（Ｈ）E.faecalis　NBRC100484。 図２は、本発明の一実施形態に係るプライマーセットを用いて乳酸菌ＥＦ－２００１株、種々の他の乳酸菌のＤＮＡを鋳型に核酸を検出した結果を示す電気泳動の結果である。（Ｂ）E.faecium　Aus0004、（Ｃ）E. gallinarum　LMG13129、（Ｄ）Lactobacillus　rhamnosus　NBRC3425、（Ｅ）L.plantarum　NBRC15891、（Ｆ）L.paracasei　NBRC15906、（Ｇ）L. lactis　NBRC102622。 図３は、本発明の一実施形態に係るプライマーセット（ロングおよびショート）を用いて乳酸菌ＥＦ－２００１株の製造工程液のＤＮＡを鋳型に生菌と死菌を検出した結果を示す電気泳動の結果である。（Ａ）培養液（生菌）、（Ｂ）加熱処理後液（死菌）、（Ｃ）製品原末（死菌）。 図４は、乳酸菌ＥＦ－２００１株を用いて、加熱処理による本発明のプライマーセットのバンドの消失について確認した電気泳動の結果である。 図５は、加熱処理による乳酸菌ＥＦ－２００１株のＴＮＦ－α産生量の変化を確認したグラフである。
　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
　本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。
　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
　本発明のプライマーセットは、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株に特異的な塩基配列を有する染色体ＤＮＡ領域をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅することができ、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株に近縁の菌株を認識することなく、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株を特異的に認識して検出することが可能である。
　本発明のプライマーセットは、以下の方法で設計した。
　まず、乳酸菌ＥＦ－２００１株の完全長ゲノムの配列を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＩｏｎＰＧＭからのＳｈｏｒｔ　ＲｅａｄとＯｘｆｏｒｄＮａｎｏｐｏｒｅ　ＭｉｎＩＯＮからのＬｏｎｇ　Ｒｅａｄを使用したハイブリッドアセンブリアプローチを用いて決定した。このＳｈｏｒｔ　Ｒｅａｄから得られたＤｒａｆｔ　Ｇｅｎｏｍｅ配列を決定する際に、以下の表１の４２株と比較してマッチングしなかった１ｋｂｐ以上の遺伝子断片をＥＦ－２００１に特異的な遺伝子配列であるとして絞り込んだ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　これらのそれぞれの配列から、約１００～約２５０ｂｐの長さのＰＣＲ産物が得られるＰＣＲプライマーと、フォワードプライマーを共通として、約５００～約６００ｂｐの長さのＰＣＲ産物が得られるＰＣＲプライマーを作製した。ＥＦ－２００１株、および比較菌株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、当該プライマーによるＰＣＲを行ない、ＥＦ－２００１株のみにおいて目的のＰＣＲ産物が得られ、他の菌株のＤＮＡを鋳型に用いてもＰＣＲ産物は得られないプライマーセットを選抜した。
＜本発明のプライマーセットについて＞
　本発明の一つの局面において、本発明のプライマーセットは以下のものを含むことができる。
　配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２または３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号５または６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号８または９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１１または１２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１４または１５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１７または１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２０または２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号２２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２３または２４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号２５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２６または２７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
　配列番号２８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２９または３０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対
　また本発明の他の局面において、本発明のプライマーセットは以下のものを含むことができる。
（ａ）配列番号５１の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ１）の一部を増幅するためのプライマーセット（１）（ｃｏｎｔｉｇ１ロング）：
　フォワードプライマーCGAAAAGGATGTAGTCAGCGG（配列番号１）
　リバースプライマーCCGAAGGCGAAACAGAGGAT（配列番号２）
（ｂ）配列番号５１の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ１）の一部を増幅するためのプライマーセット（２）（ｃｏｎｔｉｇ１ショート）：
　フォワードプライマーCGAAAAGGATGTAGTCAGCGG（配列番号１）
　リバースプライマーCCCAGACATAATCGCATGGC（配列番号３）
（ｃ）配列番号５２の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ４）の一部を増幅するためのプライマーセット（３）（ｃｏｎｔｉｇ４ロング）：
　フォワードプライマーGCGGCTGCACAATTTATTGC（配列番号４）
　リバースプライマーAGAATACTTGGGCGGTCGTG（配列番号５）
（ｄ）配列番号５２の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ４）の一部を増幅するためのプライマーセット（４）（ｃｏｎｔｉｇ４ショート）：
　フォワードプライマーGCGGCTGCACAATTTATTGC（配列番号４）
　リバースプライマーAATTCAGCTTCGCTAGATAAGGC（配列番号６）
（ｅ）配列番号５３の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ７）の一部を増幅するためのプライマーセット（５）（ｃｏｎｔｉｇ７ロング）：
　フォワードプライマーCGCGTATGACTTGCAATCGA（配列番号７）
　リバースプライマーAGGATTGTTTGACGGTGCAA（配列番号８）
（ｆ）配列番号５３の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ７）の一部を増幅するためのプライマーセット（６）（ｃｏｎｔｉｇ７ショート）：
　フォワードプライマーCGCGTATGACTTGCAATCGA（配列番号７）
　リバースプライマーACATGAGATAGTTGGGGTAGACA（配列番号９）
（ｇ）配列番号５４の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ１１）の一部を増幅するためのプライマーセット（７）（ｃｏｎｔｉｇ１１ロング）：
　フォワードプライマーCTTCAGAGAGCTGGGCGAAG（配列番号１０）
　リバースプライマーTACTTTTTAGCTGCCCGCCC（配列番号１１）
（ｈ）配列番号５４の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ１１）の一部を増幅するためのプライマーセット（８）（ｃｏｎｔｉｇ１１ショート）：
　フォワードプライマーCTTCAGAGAGCTGGGCGAAG（配列番号１０）
　リバースプライマーGGGTTGTAGCCCTACCCGAT（配列番号１２）
（ｉ）配列番号５５の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ１３）の一部を増幅するためのプライマーセット（９）（ｃｏｎｔｉｇ１３ロング）：
　フォワードプライマーCGTAACGTGACATTGCGGAC（配列番号１３）
　リバースプライマーATGCCAGTACGTCGCGTTAA（配列番号１４）
（ｊ）配列番号５５の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ１３）の一部を増幅するためのプライマーセット（１０）（ｃｏｎｔｉｇ１３ショート）：
　フォワードプライマーCGTAACGTGACATTGCGGAC（配列番号１３）
　リバースプライマーCGATTGTCAACTAATTGTGCCGA（配列番号１５）
（ｋ）配列番号５６の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ１６）の一部を増幅するためのプライマーセット（１１）（ｃｏｎｔｉｇ１６ロング）：
　フォワードプライマーCATGGCTTGCCGTTTCACAA（配列番号１６）
　リバースプライマーACCGCAACAACTACATACTACCA（配列番号１７）
（ｌ）配列番号５６の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ１６）の一部を増幅するためのプライマーセット（１２）（ｃｏｎｔｉｇ１６ショート）：
　フォワードプライマーCATGGCTTGCCGTTTCACAA（配列番号１６）
　リバースプライマーACCAAAAGGAACGCTACCAGT（配列番号１８）
（ｍ）配列番号５７の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ２２）の一部を増幅するためのプライマーセット（１３）（ｃｏｎｔｉｇ２２ロング）：
　フォワードプライマーTCAGCATAATCCCCAGACGT（配列番号１９）
　リバースプライマーAATGAACGCCCTTCAGCAGA（配列番号２０）
（ｎ）配列番号５７の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ２２）の一部を増幅するためのプライマーセット（１４）（ｃｏｎｔｉｇ２２ショート）：
　フォワードプライマーTCAGCATAATCCCCAGACGT（配列番号１９）
　リバースプライマーGGCTCCTCTACCTGAACAAACT（配列番号２１）
（ｏ）配列番号５８の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ２５）の一部を増幅するためのプライマーセット（１５）（ｃｏｎｔｉｇ２５ロング）：
　フォワードプライマーGCGTTCAAACTGTTCTGGTGT（配列番号２２）
　リバースプライマーTACAAGGCTTGCGAGGTAGC（配列番号２３）
（ｐ）配列番号５８の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ２５）の一部を増幅するためのプライマーセット（１６）（ｃｏｎｔｉｇ２５ショート）：
　フォワードプライマーGCGTTCAAACTGTTCTGGTGT（配列番号２２）
　リバースプライマーGCTGCAATGGAAAGCAAATCG（配列番号２４）
（ｑ）配列番号５９の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ３１）の一部を増幅するためのプライマーセット（１７）（ｃｏｎｔｉｇ３１ロング）：
　フォワードプライマーAGGCATATGGGTCATCTGCT（配列番号２５）
　リバースプライマーGAGCATCACAGAGCCTCGAA（配列番号２６）
（ｒ）配列番号５９の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ３１）の一部を増幅するためのプライマーセット（１８）（ｃｏｎｔｉｇ３１ショート）：
　フォワードプライマーAGGCATATGGGTCATCTGCT（配列番号２５）
　リバースプライマーAGAGATTTTTCAGTATTGCTGGGT（配列番号２７）
（ｓ）配列番号６０の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ４３）の一部を増幅するためのプライマーセット（１９）（ｃｏｎｔｉｇ４３ロング）：
　フォワードプライマーCGTTGGGTGTGCAGAAATGG（配列番号２８）
　リバースプライマーTGTACCGTCAACCTCGTTCG（配列番号２９）
（ｔ）配列番号６０の塩基配列（ｃｏｎｔｉｇ４３）の一部を増幅するためのプライマーセット（２０）（ｃｏｎｔｉｇ４３ショート）：
　フォワードプライマーCGTTGGGTGTGCAGAAATGG（配列番号２８）
　リバースプライマーAACGGGTTGCGACTCTTTTT（配列番号３０）
　また、本発明の検出方法において使用できるプライマーセットは、塩基長やＰＣＲ条件等に依存して、配列番号１～３０の塩基配列と実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットも含まれる。ここで、実質的に相同とは、ＰＣＲ用プライマー等として機能し得る程度の断片長と相同性を有することを意味し、好ましくは約９０％以上の配列同一性を有する。
　例えば、本発明のプライマーセットは、使用目的や条件によっては、必ずしも配列番号１～３０の塩基配列と１００％の相同性を有している必要はなく、目的とする領域のプライマーの５’末端付近で数塩基が異なっていてもよい。そのようなプライマーを使用しても、アニーリング温度等を検討することによって目的ＤＮＡ断片を適宜増幅させることは可能である。
　例えば、乳酸菌ＥＦ－２００１株の検出に際し、高い特異性が要求される場合には、完全に相同な配列部位（配列番号１～３０の塩基配列）を使用し、かつ、そのような配列でしかアニーリングしないＰＣＲ条件を選択すればよい。その反面、比較的特異性の低い条件が許容される場合には、配列番号１～３０の塩基配列とは数塩基異なる配列（例えば約９０％以上の配列同一性を有する配列）を使用し、かつ、それでもアニーリングするようなＰＣＲ条件を選択することができる。
　本発明のプライマーセットは、当業者によく知られた通常のＤＮＡの合成法により、例えば、ＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。また、ＤＮＡ合成業者に合成を委託することによっても、本発明のプライマーを得ることができる。
　本発明のプライマーセットを用いて、試料に含まれる被検菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、増幅産物の有無を決定することにより、試料中の乳酸菌ＥＦ－２００１株を検出することができる。すなわち、プライマーの配列に特異的なＰＣＲの反応が起こると、乳酸菌ＥＦ－２００１株の染色体ＤＮＡ内の、対となる各プライマーの配列に相当する配列に挟まれた領域（標的領域）が増幅される。
　したがって、本発明のプライマーセットを用いて増幅産物が得られれば、被検菌は乳酸菌ＥＦ－２００１株であると同定されるか、または少なくとも被検菌に乳酸菌ＥＦ－２００１株が含まれていると判定される。
　また、増幅産物が得られる場合は、増幅産物の有無の決定には、増幅産物の長さの決定が含まれてもよい。例えば、配列番号１および配列番号２、配列番号４および５、配列番号７および８、配列番号１０および１１、配列番号１３および１４、配列番号１６および１７、配列番号１９および２０、配列番号２２および２３、配列番号２５および２６、または配列番号２８および２９の各組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを含む乳酸菌ＥＦ－２００１株検出用プライマーセットを用いた場合、被検菌に乳酸菌ＥＦ－２００１株が含まれていれば、通常は各々約５００～約６００ｂｐの増幅産物が得られる。また配列番号１および配列番号３、配列番号４および６、配列番号７および９、配列番号１０および１２、配列番号１３および１５、配列番号１６および１８、配列番号１９および２１、配列番号２２および２４、配列番号２５および２７、または配列番号２８および３０の各組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを含む乳酸菌ＥＦ－２００１株検出用プライマーセットを用いた場合、被検菌に乳酸菌ＥＦ－２００１株が含まれていれば、通常は各々約１００～約２５０ｂｐの増幅産物が得られる。
　本発明のオリゴヌクレオチドを含む乳酸菌ＥＦ－２００１株検出用プライマーセットを用いた場合に得られる増幅産物は以下のとおりである。
　配列番号３１：配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号３２：配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号３３：配列番号４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号３４：配列番号４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号３５：配列番号７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号３６：配列番号７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号３７：配列番号１０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号３８：配列番号１０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号３９：配列番号１３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号４０：配列番号１３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号４１：配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号４２：配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号４３：配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号４４：配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号４５：配列番号２２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号４６：配列番号２２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号４７：配列番号２５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号４８：配列番号２５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号４９：配列番号２８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　配列番号５０：配列番号２８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号３０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される増幅産物
　また配列番号３１～５０の塩基配列のそれぞれは配列番号５１～６０のいずれかの塩基配列の一部である。
　配列番号１～３０の各プライマー配列、並びに配列番号３１～５０の塩基配列および配列番号５１～６０の塩基配列は、乳酸菌ＥＦ－２００１株に特異的な配列であることから、これらの一部の配列をＤＮＡプローブとしたＦＩＳＨ法やサザンハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーションなどを実施することも可能である。
　本発明において、乳酸菌ＥＦ－２００１株の検出とは、試料中に乳酸菌ＥＦ－２００１株が存在するか否かを検出すること、および被検菌が単一種である場合には、同被検菌が乳酸菌ＥＦ－２００１株であるか否かを同定することを含む。
　本発明の一実施形態において、乳酸菌ＥＦ－２００１株の検出に用いる試料としては、乳酸菌ＥＦ－２００１株が存在する、または存在する可能性のある試料であればどのようなものであってもよく、例えば、乳酸菌の混合培養物、味噌、醤油、ワインなどの酒類、漬物、ヨーグルト、チーズなどの微生物を含む発酵食品、マウスやラットなどの実験動物やヒトの糞便、土壌等の環境中に存在する細菌等を挙げることができる。被検菌は、分離された単一種であってもよく、複数の菌種を含む混合物であってもよい。
　本発明の一実施形態において、被検菌として死菌を用いる場合には、試料からそのままＤＮＡを調製してＰＣＲに用いてもよく、また生菌を用いる場合には、試料からコロニー分離等により被検菌体を分離して、被検菌体からＤＮＡを調製してからＰＣＲに供してもよい。これらの試料から核酸を抽出する方法は、例えば、Kaneka　Easy　DNA　Extraction　Kit　version　2などの動物細胞、植物細胞、微生物などの培養細胞から核酸の抽出が可能な汎用性の高いキットや、または一般的に乳酸菌のゲノムＤＮＡ調製に用いるような、細胞壁をＬｙｓｏｚｙｍｅなどの酵素で分解またはビーズなどで物理的に破壊したのちに、市販の抽出キット（ＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、Ｉｓｏｇｅｎなど）を使用することも可能であり、特に限定されるものではない。
＜本発明の検出方法について＞
　本発明の一局面において、本発明の乳酸菌ＥＦ－２００１株の検出方法は、（１）本発明のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程と、（２）工程（１）で得られた核酸断片を検出する工程を含むことができる。
　本発明の検出方法として、具体的には、例えば、ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、サザンハイブリダイゼーションやドットハイブリダイゼーション等を挙げることができる。中でも、ＰＣＲ法が好ましい。このうち、ＰＣＲ法による乳酸菌ＥＦ－２００１株の検出方法では、本発明のプライマーセットを用いる以外は、通常用いられるＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ試薬および機器を使用することも可能であり、特に限定されるものではない。
　一実施形態において、ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定はされないが、例えば、ＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏ（東洋紡社製）、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製)
、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－ポリメラーゼ（東洋紡社製）等が好ましい。
　一実施形態において、ＰＣＲ反応条件については、用いるＤＮＡポリメラーゼの最適温度、合成するＤＮＡの長さや種類等により適宜設定することができるが、サイクル条件であれば「９０～９８℃で５～３０秒（熱変性・解離）→５５～６０℃で５～３０秒（アニーリング）→６５～８０℃で３０～６０秒（合成・伸長）」を１サイクルとして合計２０～４０サイクル行う条件とすることができ、例えば「９８℃で１０秒→６０℃で３０秒→６８℃で３０秒」で２５サイクル行うこともできる。この場合、アニーリング温度はプライマーの設計に使用した温度を用いることができるが、例えばポリメラーゼとしてＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏを用いる場合にはプライマーサイズに応じて（例えば２０ｍｅｒ以上）、アニーリング温度を省いた２ステップ反応とすることもできる。また、鋳型ＤＮＡとプライマーの量比は、例えば生菌の場合は鋳型ＤＮＡ２００ｎｇに対して各プライマーを０．３μＭ使用することができ、死菌の場合は熱処理の状況に応じて鋳型ＤＮＡを増やすことで電気泳動の際のバンドをより明確にすることもできる。
　ＰＣＲにより得られる増幅産物の有無またはその大きさは、通常の核酸の検出法によって、決定することができる。例えば、アガロース電気泳動によって電気泳動した後、エチジウムブロマイドやＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩで染色することによって、増幅産物を検出することができる。また、蛍光強度によって増幅産物の量を、分子量マーカーとの比較によって分子量を決定することができる。ＰＣＲ産物をサイクルシーケンスした後、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列と長さを測定することによっても、増幅産物の有無を確認することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、経時的に増幅反応を検出することができる。
　本発明の一局面において、本発明のプライマーセットは、他の要素と併せて、乳酸菌ＥＦ－２００１株検出用キットとすることができる。他の要素としては、例えば、核酸の抽出、ＰＣＲ、および増幅産物の検出に必要な試薬類の任意の１種または２種以上が挙げられる。また、この乳酸菌ＥＦ－２００１株検出用キットは、陽性コントロールとして、乳酸菌ＥＦ－２００１株の染色体ＤＮＡの配列の一部を有し、本発明のプライマーセットにより増幅され得るＤＮＡ断片、および／または、陰性コントロールとして、本発明のプライマーセットに対応するが、１塩基または数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有するＤＮＡ断片を含んでいてもよい。
　本発明のプライマーセットは、上記のとおり、乳酸菌ＥＦ－２００１株の検出に用いることができる。また、本発明のプライマーセットを用いることにより、乳酸菌ＥＦ－２００１株菌体または同菌体を含む飲食品等を工業的に製造するに際し、菌数の測定や発酵状態の管理を容易に行うことができる。
＜本発明の乳酸菌組成物について＞
　本発明の一局面において、本発明の乳酸菌組成物は、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株の生菌を加熱して得ることができる乳酸菌加熱処理物を含むことができる。一実施形態において、本発明の乳酸菌組成物は、好ましくは配列番号１および配列番号２、配列番号４および５、配列番号７および８、配列番号１０および１１、配列番号１３および１４、配列番号１６および１７、配列番号１９および２０、配列番号２２および２３、配列番号２５および２６、及び／または配列番号２８および２９の各組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを含む乳酸菌ＥＦ－２００１株検出用プライマーセットのうちのいずれか１つまたは複数を用いた場合に増幅されずに、かつ配列番号１および配列番号３、配列番号４および６、配列番号７および９、配列番号１０および１２、配列番号１３および１５、配列番号１６および１８、配列番号１９および２１、配列番号２２および２４、配列番号２５および２７、または配列番号２８および３０の各組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを含む乳酸菌ＥＦ－２００１株検出用プライマーセットのうちのいずれか１つまたは複数を用いた場合に増幅される核酸断片を含むものである。
　本明細書において、「核酸断片が増幅されない」または「バンドが消失する」とは、本発明の乳酸菌ＥＦ－２００１株検出用プライマーセットを用いて乳酸菌ＥＦ－２００１株の核酸断片を増幅させた場合に、未処理（例えば加熱処理なし）の乳酸菌ＥＦ－２００１株由来の核酸断片の増幅効率または増幅量と比べて、約３０％未満となることをいう。一実施形態において、「核酸断片が増幅されない」または「バンドが消失する」とは、本発明の乳酸菌ＥＦ－２００１株検出用プライマーセットを用いて乳酸菌ＥＦ－２００１株の核酸断片を増幅させた場合に、未処理（例えば加熱処理なし）の乳酸菌ＥＦ－２００１株由来の核酸断片の増幅効率または増幅量と比べて、約２０％未満、好ましくは約１０％未満、またはさらに好ましくは約５％未満となることをいう。
　一実施形態において、本発明の乳酸菌組成物は加熱して死菌体とし、凍結乾燥、噴霧乾燥、またはドラムドライヤで乾燥した粉末状の乾燥菌体とすることができる。これにより安全性や保存性を高めることができ、あらゆる食品に利用することができる。乳酸菌ＥＦ－２００１株の加熱は死菌体を得ることができる任意の時間および温度で行うことができ、例えば約５０℃以上、約６０℃以上、約７０℃以上、約８０℃以上、約９０℃以上、約１００℃以上、約１１０℃以上、または約１２０℃以上などの温度で、例えば約５分以上、約１０分以上、約１５分以上、約２０分以上、約２５分以上、約３０分以上、約４５分以上、または約６０分以上にわたって加熱することができ、加熱によって滅菌ないし死菌体を得ることができるものであればどのような温度と時間の組み合わせであってもよい。
　本発明の一実施形態において、本発明の乳酸菌組成物を得る場合には、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株を上記のような温度および時間で加熱して、複数の乳酸菌加熱処理物のロットを得て、この乳酸菌加熱処理物から核酸断片を抽出する。その後、本明細書の他の箇所で説明した本発明のプライマーセットのうちの少なくとも１つを用いてこの核酸断片を増幅する。そして、増幅された核酸断片が検出された乳酸菌加熱処理物のロットを選択し、このロットに含まれる乳酸菌加熱処理物を本発明の乳酸菌組成物とすることができる。加熱や核酸増幅は本分野に通常用いられる機器や手法を採用することができ、例えば本明細書の他の箇所に記載された検出方法において用いることができる機器や手法を採用することができる。菌体を加熱する際には、一般的には攪拌機が装備された第一種圧力容器を用いることができ、温度によっては第二種圧力容器を用いることもできる。また液量が少なければ小型圧力容器なども用いることができる。他の実施形態において、熱伝導体としてプレートやチューブを利用した連続殺菌機を用いることもできる。
　本発明の一実施形態において、本発明の乳酸菌組成物は、加熱して安定化させることにより、ＴＮＦ－α産生量が増加したものとすることができる。好ましくは本発明の乳酸菌組成物は、配列番号１および配列番号２、配列番号４および５、配列番号７および８、配列番号１０および１１、配列番号１３および１４、配列番号１６および１７、配列番号１９および２０、配列番号２２および２３、配列番号２５および２６、及び／または配列番号２８および２９の各組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを含む乳酸菌ＥＦ－２００１株検出用プライマーセットのうちのいずれか１つまたは複数を用いた場合に増幅されずに、かつ配列番号１および配列番号３、配列番号４および６、配列番号７および９、配列番号１０および１２、配列番号１３および１５、配列番号１６および１８、配列番号１９および２１、配列番号２２および２４、配列番号２５および２７、及び／または配列番号２８および３０の各組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを含む乳酸菌ＥＦ－２００１株検出用プライマーセットのうちのいずれか１つまたは複数を用いた場合に増幅される核酸断片を含むものである。
　一実施形態において、本発明の乳酸菌組成物のＴＮＦ－α産生量が増加したかどうかは、ロングを検出するプライマーセットのバンドが消失し、かつショートを検出するプライマーセットのバンドが残ることを指標として確認することができる。例えば、ｃｏｎｔｉｇ１６の塩基配列の一部を増幅する配列番号１６および１７のプライマーセット（ロング）によっては核酸断片が増幅されず、配列番号１６および１８のプライマーセット（ショート）によって核酸断片が増幅されることを指標として、そのような増幅結果を示す加熱処理がされた本発明の乳酸菌組成物を、ＴＮＦ－α産生量が増加しているものとすることができる。
　本発明の一実施形態において、本発明の乳酸菌組成物は、個々の菌体を隔離した状態に置き、それにより各菌体が食品等に添加されて吸水したときに凝集しないようにするための任意の希釈剤を混合することができる。希釈剤は菌体との均一混合を容易にするため、微粉末状であるだけでなく、なるべく流動性のよいものであることが好ましい。希釈剤としては、食品に添加した場合の安全性や食品の風味や性状に対する影響等を考慮すると、多糖類やタンパク質とすることが好ましく、例えば多糖類としては乳糖、ポリデキストロース、シクロデキストリン、コーンスターチ、微結晶セルロース、でんぷん、ガラクトマンナンなどの天然多糖類や、それらの酵素処理加水分解物などを挙げることができ、またタンパク質としては大豆タンパク質、カゼイン、小麦グルテイン、卵白アルブミンなどを挙げることができ、これらの任意の２種以上を併用することもできる。
　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
（実施例１：乳酸菌ＥＦ－２００１株の検出１（Enterococcus　faecalis亜種との比較））
（１）試験菌株
　試験菌株として、（Ａ）乳酸菌ＥＦ－２００１株と、Enterococcus　faecalis亜種である（Ｂ）E. faecalis　NBRC3971、（Ｃ）E.faecalis　NBRC3989、（Ｄ）E.faecalis　NBRC12970、（Ｅ）E. faecalis　NBRC100480、（Ｆ）E.faecalis　NBRC100482、（Ｇ）E.faecalis　NBRC100483、（Ｈ）E. faecalis　NBRC100484を使用した。
（２）乳酸菌ＤＮＡの調製
　各菌体の培養液から回収した上記菌体にリゾチームなどの酵素を含む緩衝液を加え、細胞膜を分解した。プロテイナーゼおよびＲＮａｓｅで処理した後、酢酸ナトリウムを加えてエタノールで沈殿させた沈殿物をエタノールでリンスした後、乾燥させた。これにＴＥなどの緩衝液を加えて溶解した溶液をＰＣＲ用のＤＮＡ溶液として用いた。また、ＤＮＡ溶液は市販のＤＮＡ抽出キットを用いて調整することもできる。
（３）ＰＣＲ反応
　上記（２）において得た試験菌株のＤＮＡ溶液を鋳型とし、配列番号１および配列番号２（ｃｏｎｔｉｇ１）、配列番号４および５（ｃｏｎｔｉｇ４）、配列番号７および８（ｃｏｎｔｉｇ７）、配列番号１０および１１（ｃｏｎｔｉｇ１１）、配列番号１３および１４（ｃｏｎｔｉｇ１３）、配列番号１６および１７（ｃｏｎｔｉｇ１６）、配列番号１９および２０（ｃｏｎｔｉｇ２２）、配列番号２２および２３（ｃｏｎｔｉｇ２５）、配列番号２５および２６（ｃｏｎｔｉｇ３１）、並びに配列番号２８および２９（ｃｏｎｔｉｇ４３）の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットと、配列番号１および配列番号３（ｃｏｎｔｉｇ１）、配列番号４および６（ｃｏｎｔｉｇ４）、配列番号７および９（ｃｏｎｔｉｇ７）、配列番号１０および１２（ｃｏｎｔｉｇ１１）、配列番号１３および１５（ｃｏｎｔｉｇ１３）、配列番号１６および１８（ｃｏｎｔｉｇ１６）、配列番号１９および２１（ｃｏｎｔｉｇ２２）、配列番号２２および２４（ｃｏｎｔｉｇ２５）、配列番号２５および２７（ｃｏｎｔｉｇ３１）、並びに配列番号２８および３０（ｃｏｎｔｉｇ４３）の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットとを用い、ＰＣＲ反応試薬キットであるＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏ（東洋紡）の方法にしたがってＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の総量を５０μＬとすると、キット付属の２×ＰＣＲ緩衝液２５．０μＬ、２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　１０．０μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ１．０Ｕ、プライマー混合液０．２μＬ、及び鋳型ＤＮＡ１０～２００ｎｇ（生菌の場合）、または１０～４００ｎｇ（死菌の場合）を含む反応液を、Ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ　ＧｅｎＡｔｌａｓ（ＡＳＴＥＣ）を用いて、９４℃で１０秒の予備加熱後、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを６０℃で３０秒、伸長を６８℃で３０秒のサイクルを２５サイクル行った。
　なお、ポジティブコントロールとしては、乳酸菌ＥＦ－２００１株の１６Ｓ　ｒＤＮＡを鋳型として増幅産物が２００～３００ｂｐとなるように設計したプライマー（Ｆ：配列番号６１、Ｒ：配列番号６２）を用いた。
（４）アガロース電気泳動
　ＰＣＲ反応によって得られたＰＣＲ産物を、ＧｅｌＲｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｇｅｌ　Ｓｔａｉｎ（ＦＵＪＩＦＩＬＮ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を含む１．４％アガロースゲルで１００Ｖ、３０分電気泳動した。次に、ＷＳＥ－５４００－ＵＰ　Ｐｒｉｎｔｇｒａｐｈ　Ｃｌａｓｓｉｃ（ＡＴＴＯ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）でＰＣＲ産物の増幅を示すバンドを観察した。結果を図１に示した。
　図１に示すとおり、ここで使用したEnterococcus　faecalisのすべての亜種に約２８４ｂｐのポジティブコントロールのバンドが観察されたが、ＥＦ－２００１株のＤＮＡを使用した場合にのみ約１００～約２５０ｂｐのバンドおよび約５００～約６００ｂｐのバンドが観察され（図１（Ａ））、本発明のプライマーセットにより、Enterococcus　faecalis亜種の中から乳酸菌ＥＦ－２００１株だけを特異的に検出できることが確認された。
＜実施例２：乳酸菌ＥＦ－２００１株の検出２（他の乳酸菌との比較）＞
　試験菌株として、（Ａ）乳酸菌ＥＦ－２００１株と、他の乳酸菌である（Ｂ）E. faecium　Aus0004、（Ｃ）E. gallinarum　LMG13129、（Ｄ）Lactobacillus　rhamnosus　NBRC3425、（Ｅ）L.plantarum　NBRC15891、（Ｆ）L.paracasei　NBRC15906、（Ｇ）L. lactis　NBRC102622を用いたこと以外は、すべて実施例１と同様に行った。結果を図２に示した。
　図２に示すとおり、乳酸菌ＥＦ－２００１株のＤＮＡを使用した場合にのみ、約２８４ｂｐのポジティブコントロールのバンド、約１００～約２５０ｂｐのバンド、および約５００～約６００ｂｐのバンドが観察され（図２（Ａ））、乳酸菌ＥＦ－２００１株以外の乳酸菌では、いずれのバンドも観察されなかった。これにより、本発明のプライマーセットにより、他の乳酸菌の中から乳酸菌ＥＦ－２００１株だけを特異的に検出できることが確認された。
＜実施例３：乳酸菌ＥＦ－２００１株の検出３（生菌と加熱菌）＞
（１）試験菌株
　試験菌株として乳酸菌ＥＦ－２００１株を用い、生菌（図３（Ａ）培養液）、死菌（図３（Ｂ）加熱処理後液）、死菌（図３（Ｃ）製品原末）の３種類の菌体から抽出したＤＮＡを鋳型として核酸を検出した。
（２）ＤＮＡの調製、ＰＣＲ条件、およびＰＣＲプライマーは実施例１及び２と同様にして行った。実施例１及び２と同様の条件でアガロース電気泳動を行った結果を図３に示した。
　図３に示すとおり、乳酸菌ＥＦ－２００１株の生菌および死菌のいずれの場合でも約１００～約２５０ｂｐのバンドが観察され、本発明のプライマーセットは、乳酸菌ＥＦ－２００１株の生菌のみならず加熱処理菌（死菌）に対しても、特異的な検出能を発揮することが明らかとなった。これは、乳酸菌ＥＦ－２００１株の生菌を利用した製品等はもとより、加熱処理した乳酸菌ＥＦ－２００１株を利用した製品等においても、乳酸菌ＥＦ－２００１株を検出できることを意味する結果であり、非常に有用である。
＜実施例４：加熱によるバンド消失＞
　試験菌株として乳酸菌ＥＦ－２００１株を用い、加熱処理による本発明のプライマーセットのバンドの消失について確認した。未処理のもの（生菌）に加え、７０℃、９０℃、１１０℃で加熱処理した乳酸菌ＥＦ－２００１株を用いた。
　一例として、ｃｏｎｔｉｇ１６の塩基配列の一部を増幅する配列番号１６および１７、並びに配列番号１６および１８のプライマーを用い、ＰＣＲ条件などは実施例１と同様にして、核酸断片の増幅能を調べた。結果を図４に示す。
　図４に示したとおり、配列番号１６および１７のプライマーセット（ロング）は加熱温度を上昇させるにつれてバンドが消失することがわかった。加熱処理した乳酸菌ＥＦ－２００１株を利用した製品においては、一定の熱履歴を必要とするため、このロングを検出するプライマーのバンドが消失することは、一定の熱履歴を与えていることを意味する結果であり、非常に有用である。一方で、配列番号１６および１８のプライマーセット（ショート）は１１０℃で加熱した場合でも、電気泳動をした際のバンドを確認することができた。
＜実施例５：ＴＮＦ－α産生量の測定＞
　試験菌株として乳酸菌ＥＦ－２００１株を用い、加熱処理による乳酸菌ＥＦ－２００１株のＴＮＦ－α産生量の変化を確認した。未処理のもの（生菌）と１１０℃で加熱処理した乳酸菌ＥＦ－２００１株を用いた。
　まず、ＲＡＷ２６４．７細胞を使ってＴＮＦ－αを誘導させた。１．０×１０６細胞／ｍＬに調整したＲＡＷ２６４．７細胞溶液を１ｗｅｌｌあたり１００μＬずつ９６ｗｅｌｌに分注し、３７℃の５％ＣＯ２恒温槽で２４時間培養した。培養上清を取り除き、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ－１６４０培地で洗浄した後、サンプル溶液１００μＬを加えて、３７℃の５％ＣＯ２恒温槽で６時間反応させた。サンプルは、１ｍｇ／ｍＬのＥＦ－２００１溶液を、ＦＢＳを含まないRPMI-1640Mediumwith L-glutamine and sodium bicarbonale, liquid, sterile-filterd,suitable forcell culture (R8758-500ML;SIGMA)で作成し、適宜希釈して調整した。
　６時間後、上清を回収し、ＴＮＦ－α測定時まで－８０℃で保管し、サンプルを適宜希釈した後、「Ｍｏｕｓｅ　ＴＮＦ－α　Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬｌＳＡ　Ｋｉｔ」のプロトコルに従って誘導生産されたＴＮＦ－α濃度を測定した。その結果を図５に示した。
　図５に示すとおり、乳酸菌ＥＦ－２００１株に加熱処理（１１０℃）を加えることによって、ＴＮＦ－α産生量が増大したことが確認できた。これは加熱処理した乳酸菌ＥＦ－２００１株を利用した製品においては、ＴＮＦ－α産生量が増大していることを意味する。一定の熱履歴を与えることにより、ロングを検出するプライマーのバンドが消失し、かつショートを検出するプライマーのバンドが残るという実施例４で示された結果と組み合わせることで、ロングを検出するプライマーのバンドが消失し、かつショートを検出するプライマーのバンドが残ることを確認することにより、ＴＮＦ－α産生量が増大した乳酸菌ＥＦ－２００１株が得られたかどうかの指標となり得る可能性が示された。
　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２１年２月１２日に出願された特願２０２１－２１１０２に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。
　本発明の方法によって、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株を簡便かつ迅速に、かつ特異的に検出することが可能になるため、ＥＦ－２００１株の多様な活性に関与する遺伝子の推測や、その遺伝子を用いた機能性食品やサプリメントの開発など幅広い応用が期待できる。
配列番号１：ｃｏｎｔｉｇ１におけるフォワードプライマー
配列番号２：ｃｏｎｔｉｇ１におけるリバースプライマー（ロング）
配列番号３：ｃｏｎｔｉｇ１におけるリバースプライマー（ショート）
配列番号４：ｃｏｎｔｉｇ４におけるフォワードプライマー
配列番号５：ｃｏｎｔｉｇ４におけるリバースプライマー（ロング）
配列番号６：ｃｏｎｔｉｇ４におけるリバースプライマー（ショート）
配列番号７：ｃｏｎｔｉｇ７におけるフォワードプライマー
配列番号８：ｃｏｎｔｉｇ７におけるリバースプライマー（ロング）
配列番号９：ｃｏｎｔｉｇ７におけるリバースプライマー（ショート）
配列番号１０：ｃｏｎｔｉｇ１１におけるフォワードプライマー
配列番号１１：ｃｏｎｔｉｇ１１におけるリバースプライマー（ロング）
配列番号１２：ｃｏｎｔｉｇ１１におけるリバースプライマー（ショート）
配列番号１３：ｃｏｎｔｉｇ１３におけるフォワードプライマー
配列番号１４：ｃｏｎｔｉｇ１３におけるリバースプライマー（ロング）
配列番号１５：ｃｏｎｔｉｇ１３におけるリバースプライマー（ショート）
配列番号１６：ｃｏｎｔｉｇ１６におけるフォワードプライマー
配列番号１７：ｃｏｎｔｉｇ１６におけるリバースプライマー（ロング）
配列番号１８：ｃｏｎｔｉｇ１６におけるリバースプライマー（ショート）
配列番号１９：ｃｏｎｔｉｇ２２におけるフォワードプライマー
配列番号２０：ｃｏｎｔｉｇ２２におけるリバースプライマー（ロング）
配列番号２１：ｃｏｎｔｉｇ２２におけるリバースプライマー（ショート）
配列番号２２：ｃｏｎｔｉｇ２５におけるフォワードプライマー
配列番号２３：ｃｏｎｔｉｇ２５におけるリバースプライマー（ロング）
配列番号２４：ｃｏｎｔｉｇ２５におけるリバースプライマー（ショート）
配列番号２５：ｃｏｎｔｉｇ３１におけるフォワードプライマー
配列番号２６：ｃｏｎｔｉｇ３１におけるリバースプライマー（ロング）
配列番号２７：ｃｏｎｔｉｇ３１におけるリバースプライマー（ショート）
配列番号２８：ｃｏｎｔｉｇ４３におけるフォワードプライマー
配列番号２９：ｃｏｎｔｉｇ４３におけるリバースプライマー（ロング）
配列番号３０：ｃｏｎｔｉｇ４３におけるリバースプライマー（ショート）
配列番号３１：ｃｏｎｔｉｇ１の増幅産物（ロング）
配列番号３２：ｃｏｎｔｉｇ１の増幅産物（ショート）
配列番号３３：ｃｏｎｔｉｇ４の増幅産物（ロング）
配列番号３４：ｃｏｎｔｉｇ４の増幅産物（ショート）
配列番号３５：ｃｏｎｔｉｇ７の増幅産物（ロング）
配列番号３６：ｃｏｎｔｉｇ７の増幅産物（ショート）
配列番号３７：ｃｏｎｔｉｇ１１の増幅産物（ロング）
配列番号３８：ｃｏｎｔｉｇ１１の増幅産物（ショート）
配列番号３９：ｃｏｎｔｉｇ１３の増幅産物（ロング）
配列番号４０：ｃｏｎｔｉｇ１３の増幅産物（ショート）
配列番号４１：ｃｏｎｔｉｇ１６の増幅産物（ロング）
配列番号４２：ｃｏｎｔｉｇ１６の増幅産物（ショート）
配列番号４３：ｃｏｎｔｉｇ２２の増幅産物（ロング）
配列番号４４：ｃｏｎｔｉｇ２２の増幅産物（ショート）
配列番号４５：ｃｏｎｔｉｇ２５の増幅産物（ロング）
配列番号４６：ｃｏｎｔｉｇ２５の増幅産物（ショート）
配列番号４７：ｃｏｎｔｉｇ３１の増幅産物（ロング）
配列番号４８：ｃｏｎｔｉｇ３１の増幅産物（ショート）
配列番号４９：ｃｏｎｔｉｇ４３の増幅産物（ロング）
配列番号５０：ｃｏｎｔｉｇ４３の増幅産物（ショート）
配列番号５１：ｃｏｎｔｉｇ１
配列番号５２：ｃｏｎｔｉｇ４
配列番号５３：ｃｏｎｔｉｇ７
配列番号５４：ｃｏｎｔｉｇ１１
配列番号５５：ｃｏｎｔｉｇ１３
配列番号５６：ｃｏｎｔｉｇ１６
配列番号５７：ｃｏｎｔｉｇ２２
配列番号５８：ｃｏｎｔｉｇ２５
配列番号５９：ｃｏｎｔｉｇ３１
配列番号６０：ｃｏｎｔｉｇ４３
配列番号６１：ポジティブコントロールのフォワードプライマー
配列番号６２：ポジティブコントロールのリバースプライマー

Claims (13)

  1. 　乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株に由来する核酸を特異的に検出するためのプライマーセットであって、
    　配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２または３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号５または６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号８または９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１１または１２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１４または１５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１７または１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２０または２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号２２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２３または２４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号２５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２６または２７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、または
    　配列番号２８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２９または３０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    を含む、プライマーセット。
  2. 　乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株に由来する核酸を特異的に検出するためのプライマーセットであって、
    （ａ）配列番号５１の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１）：
    　フォワードプライマーCGAAAAGGATGTAGTCAGCGG（配列番号１）
    　リバースプライマーCCGAAGGCGAAACAGAGGAT（配列番号２）
    （ｂ）配列番号５１の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（２）：
    　フォワードプライマーCGAAAAGGATGTAGTCAGCGG（配列番号１）
    　リバースプライマーCCCAGACATAATCGCATGGC（配列番号３）
    （ｃ）配列番号５２の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（３）：
    　フォワードプライマーGCGGCTGCACAATTTATTGC（配列番号４）
    　リバースプライマーAGAATACTTGGGCGGTCGTG（配列番号５）
    （ｄ）配列番号５２の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（４）：
    　フォワードプライマーGCGGCTGCACAATTTATTGC（配列番号４）
    　リバースプライマーAATTCAGCTTCGCTAGATAAGGC（配列番号６）
    （ｅ）配列番号５３の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（５）：
    　フォワードプライマーCGCGTATGACTTGCAATCGA（配列番号７）
    　リバースプライマーAGGATTGTTTGACGGTGCAA（配列番号８）
    （ｆ）配列番号５３の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（６）：
    　フォワードプライマーCGCGTATGACTTGCAATCGA（配列番号７）
    　リバースプライマーACATGAGATAGTTGGGGTAGACA（配列番号９）
    （ｇ）配列番号５４の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（７）：
    　フォワードプライマーCTTCAGAGAGCTGGGCGAAG（配列番号１０）
    　リバースプライマーTACTTTTTAGCTGCCCGCCC（配列番号１１）
    （ｈ）配列番号５４の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（８）：
    　フォワードプライマーCTTCAGAGAGCTGGGCGAAG（配列番号１０）
    　リバースプライマーGGGTTGTAGCCCTACCCGAT（配列番号１２）
    （ｉ）配列番号５５の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（９）：
    　フォワードプライマーCGTAACGTGACATTGCGGAC（配列番号１３）
    　リバースプライマーATGCCAGTACGTCGCGTTAA（配列番号１４）
    （ｊ）配列番号５５の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１０）：
    　フォワードプライマーCGTAACGTGACATTGCGGAC（配列番号１３）
    　リバースプライマーCGATTGTCAACTAATTGTGCCGA（配列番号１５）
    （ｋ）配列番号５６の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１１）：
    　フォワードプライマーCATGGCTTGCCGTTTCACAA（配列番号１６）
    　リバースプライマーACCGCAACAACTACATACTACCA（配列番号１７）
    （ｌ）配列番号５６の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１２）：
    　フォワードプライマーCATGGCTTGCCGTTTCACAA（配列番号１６）
    　リバースプライマーACCAAAAGGAACGCTACCAGT（配列番号１８）
    （ｍ）配列番号５７の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１３）：
    　フォワードプライマーTCAGCATAATCCCCAGACGT（配列番号１９）
    　リバースプライマーAATGAACGCCCTTCAGCAGA（配列番号２０）
    （ｎ）配列番号５７の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１４）：
    　フォワードプライマーTCAGCATAATCCCCAGACGT（配列番号１９）
    　リバースプライマーGGCTCCTCTACCTGAACAAACT（配列番号２１）
    （ｏ）配列番号５８の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１５）：
    　フォワードプライマーGCGTTCAAACTGTTCTGGTGT（配列番号２２）
    　リバースプライマーTACAAGGCTTGCGAGGTAGC（配列番号２３）
    （ｐ）配列番号５８の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１６）：
    　フォワードプライマーGCGTTCAAACTGTTCTGGTGT（配列番号２２）
    　リバースプライマーGCTGCAATGGAAAGCAAATCG（配列番号２４）
    （ｑ）配列番号５９の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１７）：
    　フォワードプライマーAGGCATATGGGTCATCTGCT（配列番号２５）
    　リバースプライマーGAGCATCACAGAGCCTCGAA（配列番号２６）
    （ｒ）配列番号５９の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１８）：
    　フォワードプライマーAGGCATATGGGTCATCTGCT（配列番号２５）
    　リバースプライマーAGAGATTTTTCAGTATTGCTGGGT（配列番号２７）
    （ｓ）配列番号６０の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（１９）：
    　フォワードプライマーCGTTGGGTGTGCAGAAATGG（配列番号２８）
    　リバースプライマーTGTACCGTCAACCTCGTTCG（配列番号２９）または
    （ｔ）配列番号６０の塩基配列の一部を増幅するためのプライマーセット（２０）：
    　フォワードプライマーCGTTGGGTGTGCAGAAATGG（配列番号２８）
    　リバースプライマーAACGGGTTGCGACTCTTTTT（配列番号３０）
    からなる群から選択される、プライマーセット。
  3. 　請求項１または２に記載のプライマーセットを含むことを特徴とする、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株検出用キット。
  4. 　乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株に由来する核酸を特異的に検出する方法であって、
    　請求項１または２に記載のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程と
    　増幅する工程で得られた核酸断片を検出する工程と
    を含む、方法。
  5. 　乳酸菌組成物であって、
    　配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号２２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号２５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、及び／または
    　配列番号２８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対
    からなる群より選択される１または複数のプライマーセットによって増幅されず、かつ、
    　配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号２２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号２５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、及び／または
    　配列番号２８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号３０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対
    からなる群から選択される１または複数のプライマーセットによって増幅される核酸断片を含む、乳酸菌組成物。
  6. 　配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのプライマーセットによって増幅されず、かつ配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのプライマーセットによって増幅される核酸断片を含む、請求項５に記載の組成物。
  7. 　乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株を少なくとも約７０℃にて加熱処理した乳酸菌加熱処理物を含む、請求項５または６に記載の組成物。
  8. 　乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株を少なくとも約９０℃にて加熱処理した乳酸菌加熱処理物を含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 　乳酸菌組成物を製造する方法であって、
    　乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株を加熱して、複数の乳酸菌加熱処理物のロットを得る工程と、
    　前記乳酸菌加熱処理物のロットの１つにおいて核酸断片を抽出する工程と、
    　請求項１または２に記載のプライマーセットのうちの少なくとも１つを用いて前記核酸断片を増幅する工程と、
    　増幅する工程で得られた核酸断片を検出する工程と、
    　前記核酸断片が検出された乳酸菌加熱処理物のロットを選択する工程と
    を含む、方法。
  10. 　前記加熱が少なくとも約７０℃での加熱である、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記加熱が少なくとも約９０℃での加熱である、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 　前記核酸断片が、
    　配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号２２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号２５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、及び／または
    　配列番号２８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号３０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対
    からなる群から選択される１または複数のプライマーセットによって増幅され、かつ
    　配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号２２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、
    　配列番号２５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対、及び／または
    　配列番号２８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対
    からなる群より選択される１または複数のプライマーセットによって増幅されない、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus　faecalis）ＥＦ－２００１株検出用プライマーセットで増幅されることを特徴とするポリヌクレオチドであって、
    　配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３１で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３２で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３３で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３４で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３５で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３６で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号１０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３７で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号１０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３８で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号１３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号３９で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号１３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４０で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４１で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号１６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４２で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４３で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４４で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号２２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４５で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号２２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２４の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４６で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号２５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２６の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４７で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号２５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２７の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４８で表されるポリヌクレオチド、
    　配列番号２８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号４９で表されるポリヌクレオチド、または
    　配列番号２８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号３０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットで増幅される、配列番号５０で表されるポリヌクレオチド。
PCT/JP2022/005426 2021-02-12 2022-02-10 乳酸菌検出プライマーセットおよびそのプライマーセットを用いた検出方法 WO2022173008A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020237022760A KR20230145317A (ko) 2021-02-12 2022-02-10 유산균 검출 프라이머 세트 및 그 프라이머 세트를사용한 검출 방법

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021021102A JP7150359B2 (ja) 2021-02-12 2021-02-12 乳酸菌検出プライマーセットおよびそのプライマーセットを用いた検出方法
JP2021-021102 2021-02-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022173008A1 true WO2022173008A1 (ja) 2022-08-18

Family

ID=82838344

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/005426 WO2022173008A1 (ja) 2021-02-12 2022-02-10 乳酸菌検出プライマーセットおよびそのプライマーセットを用いた検出方法

Country Status (3)

Country Link
JP (2) JP7150359B2 (ja)
KR (1) KR20230145317A (ja)
WO (1) WO2022173008A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008086285A (ja) * 2006-10-04 2008-04-17 Shigeru Fujimura Ｌｇ２１株用プライマー及び該プライマーを用いた検出方法
JP2014064543A (ja) * 2012-09-27 2014-04-17 Snow Brand Milk Products Co Ltd ビフィドバクテリウム・ロンガムの検出および／または定量用オリゴヌクレオチド
KR20190041864A (ko) * 2017-10-13 2019-04-23 연세대학교 원주산학협력단 엔테로코커스 패칼리스를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008086285A (ja) * 2006-10-04 2008-04-17 Shigeru Fujimura Ｌｇ２１株用プライマー及び該プライマーを用いた検出方法
JP2014064543A (ja) * 2012-09-27 2014-04-17 Snow Brand Milk Products Co Ltd ビフィドバクテリウム・ロンガムの検出および／または定量用オリゴヌクレオチド
KR20190041864A (ko) * 2017-10-13 2019-04-23 연세대학교 원주산학협력단 엔테로코커스 패칼리스를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Nucleotide 25 January 2021 (2021-01-25), "Enterococcus faecalis isolate 26975_1#22 genome assembly, chromosome: 1", XP055958811, retrieved from NCBI Database accession no. LR961957.1 *
DATABASE Nucleotide 25 January 2021 (2021-01-25), "Enterococcus faecalis isolate 26975_1#241 genome assembly, chromosome: 1", XP055958828, retrieved from NCBI Database accession no. LR962089.1 *
DATABASE Nucleotide 25 January 2021 (2021-01-25), "Enterococcus faecalis isolate 28157_4#173 genome assembly, chromosome: 1", XP055958267, retrieved from NCBI Database accession no. LR962428.1 *
DATABASE Nucleotide 25 January 2021 (2021-01-25), "Enterococcus faecalis isolate 2815775_4#263 genome assembly, chromosome: 1", XP055958835, retrieved from NCBI Database accession no. LR962827.1 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230145317A (ko) 2023-10-17
JP2022123655A (ja) 2022-08-24
JP7150359B2 (ja) 2022-10-11
JP2022123892A (ja) 2022-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3087198B1 (en) Metagenomic analysis of samples
Boyer et al. Analytical opportunities of quantitative polymerase chain reaction in dairy microbiology
Bagheripoor-Fallah et al. Comparison of molecular techniques with other methods for identification and enumeration of probiotics in fermented milk products
KR101732676B1 (ko) 덤벨 구조를 갖는 핵산 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 장내 유익균 검출방법
Samarzija et al. Application of RAPD analysis for identification of Lactococcus lactis subsp. cremoris strains isolated from artisanal cultures
KR102145408B1 (ko) 락토바실러스 사케이 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도
WO2022173008A1 (ja) 乳酸菌検出プライマーセットおよびそのプライマーセットを用いた検出方法
JP5048622B2 (ja) 乳酸菌検出用ｐｃｒプライマー
Hu et al. Advances of intra‐species molecular typing analysis of aquatic probiotics approved by the Chinese Ministry of Agriculture
JP2023106944A (ja) 乳酸菌ｌｑ８０株を特異的に検出するプライマーセット、該プライマーセットを用いたキット及び検出方法
KR102084862B1 (ko) 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 초산균의 검출 및 정량 방법
JP7252606B2 (ja) 乳酸菌検出プライマーセットおよび該プライマーセットを用いた検出方法
TWI658048B (zh) 檢測美人魚發光桿菌殺魚亞種之特異性引子及其使用方法
Madadgar et al. Evaluation of random amplified polymorphic DNA analysis and antibiotic susceptibility application in discrimination of almonella typhimurium isolates in Iran.
Dimitrov et al. Comparative evaluation of three molecular typing methods in their applicability to differentiate Lactobacillus strains with human origin
Gwak et al. Rapid on-site detection of Leuconostoc citreum in commercially processed products using loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technique
Jebur et al. Isolation and Detection of Cronobacter sakazakii from Infant Dried Milk using PCR and RT-PCR techniques
JP2014064543A (ja) ビフィドバクテリウム・ロンガムの検出および／または定量用オリゴヌクレオチド
KR102597907B1 (ko) 비피더스 균주의 정량을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102655121B1 (ko) 락토바실러스 사케이 k040706 균주 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20150116319A (ko) 케피어 발효유 내 미생물 그룹별 정량적인 실시간 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물 및 그 분석방법
JP2008005779A (ja) ラクトバチルス・ブレビス検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法
JP2017216979A (ja) オリゴヌクレオチド
Dimitrov Development of strain discriminative amplified fragment length polymorpfic DNA for Bifidobacteria. Design of strain-specific markers
Hong et al. Rapid identification of bifidobacteria in dairy products by gene-targeted species-specific PCR technique and DGGE

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22752830

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11202305097U

Country of ref document: SG

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 22752830

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1